Uitbreidingsgeassisteerde hybridisatiekettingreactie-smFISH en immunohistochemie in het brein van Drosophila

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een expansie-ondersteunde HCR-smFISH en immunohistochemie-workflow voor kwantitatieve, celtype-specifieke analyse van RNA- en eiwitexpressie in de Drosophila-hersenen , inclusief beeldvorming met lichtblad- of confocale microscopie en geautomatiseerde kwantificering van nucleaire en cytoplasmatische transcripten.

Samenvatting

Kwantitatieve, ruimtelijk opgeloste analyse van genexpressie is essentieel voor het beoordelen van celtype-specifieke moleculaire profielen. In het visuele systeem van Drosophila openen uitgebreide genetische instrumenten een kader voor directe evaluatie van zowel RNA- als eiwitniveaus in gedefinieerde neuronale populaties. Hier presenteren we een stapsgewijs protocol dat expansie-ondersteunde HCR-smFISH (hybridisatie, kettingreactie, single-molecule fluorescence in situ hybridisatie) combineert met immunohistochemie om kwantitatieve analyse mogelijk te maken van celtype-specifieke moleculaire profielen in genetisch gedefinieerde neuronale typen van het visuele systeem. De workflow is geoptimaliseerd voor cellen die zijn gelabeld met nucleair gelokaliseerde of membraangebonden markers, waardoor het mogelijk is om transcript- en eiwitniveaus in dezelfde neuronen te meten. Na weefselexpansie worden monsters gefotografeerd met lichtbladmicroscopie voor snelle volumetrische acquisitie, waarbij een alternatieve montage- en beeldvormingsworkflow wordt aangetoond voor standaard omgekeerde laserscanning en draaiende schijfconfocale microscopen. Daarnaast bieden we een geautomatiseerd segmentatie-algoritme dat nucleaire en cytoplasmatische transcripten onderscheidt, waardoor analyses van transcriptietoestand en subcellulaire RNA-lokalisatie mogelijk zijn. Praktische richtlijnen worden gegeven over experimentele parameters en veelvoorkomende valkuilen die de signaalkwaliteit, weefselintegriteit en kwantitatieve prestaties beïnvloeden. Representatieve toepassingen zijn onder meer validatie van celtype-specifieke RNA-interferentie door het kwantificeren van overeenkomstige veranderingen in RNA- en eiwitniveaus. Door geïntegreerde RNA- en eiwitniveaumetingen met celtypespecificiteit mogelijk te maken, biedt deze aanpak een schaalbare strategie voor hypothesegedreven moleculaire analyse en, in gerichte contexten, een praktisch alternatief voor single-cell transcriptomische assays. Dit protocol biedt een praktische benadering om celtype-specifieke moleculaire verstoringen te valideren, terwijl de anatomische context van het intacte Drosophila-brein behouden blijft.

Inleiding

Het visuele systeem van Drosophila melanogaster heeft gediend als krachtig model voor het beantwoorden van een breed scala aan vragen in de ontwikkelingsneurowetenschap, waaronder neuronale differentiatie ^1,2, celtypespecificatie ^3,4 en moleculaire logica van hersenbedrading ^5,6,7. Deze vooruitgang is aangedreven door een ongewoon rijk experimenteel gereedschapskist, waaronder grote verzamelingen celtype-specifieke genetische drijflijnen ^8,9,10, recente uitgebreide connectomische reconstructies 10,11,12, en steeds gedetailleerder single-cell transcriptomic ^13,14 en multiomic¹⁵ Datasets. Samen definiëren deze bronnen neuronale types op multimodale wijze en maken precieze genetische manipulaties mogelijk. Als gevolg hiervan kan het vakgebied nu steeds voorspellendere hypothesen genereren over hoe specifieke genen neuronale identiteit, connectiviteit en functie reguleren¹⁶.. Hoewel single-cell RNA-sequencing krachtige inzichten biedt in transcriptietoestanden, voorspelt RNA-abundantie niet altijd eiwitexpressie¹⁷, en veel perturbatie-experimenten vereisen uiteindelijk directe, kwantitatieve meting van zowel RNA als eiwit in dezelfde neuronen.

Single-molecule fluorescentie in situ hybridisatie (smFISH)^18,19 maakt kwantitatieve meting van transcriptabundantie mogelijk met cellulaire en subcellulaire resolutie, terwijl de anatomische context behouden blijft. De combinatie van smFISH met expansiemicroscopie 20,21,22 heeft de bruikbaarheid voor intacte hersenen verder uitgebreid door het weefsel in een zwellbare hydrogel fysiek te vergroten, waardoor moleculaire overbevolking wordt verminderd, de optische toegang verbetert en de effectieve ruimtelijke resolutie wordt verhoogd. In combinatie met hybridisatiekettingreactie (HCR)-gebaseerde signaalversterking²³, maakt expansie-ondersteunde smFISH robuuste detectie van discrete transcripten in dik neuraal weefsel mogelijk en ondersteunt het beeldvorming van de hele hersenen met behulp van lichtblad- of confocale microscopie.

Een reeks in situ RNA-beeldvormingsmethoden is toegepast op de hersenen van Drosophila , wat verschillende experimentele prioriteiten weerspiegelt. Uitbreidingsgeassisteerde iteratieve HCR-FISH heeft whole-brain, ruimtelijk opgeloste^RNA-detectie mogelijk gemaakt. Parallel zijn niet-expansie whole-mount FISH-benaderingen gebruikt voor RNA-metingen in genetisch gelabelde neuronen, waaronder HCR-gebaseerde activiteitskaartstrategieën gericht op directe vroege genen²⁵ en segmentatiegebaseerde transcripttelworkflows met membraangebonden, genetisch gecodeerde markers²⁶. Commerciële probe-gebaseerde methoden zoals RNAscope hebben verder multiplex RNA-detectie in hele hersenen mogelijk gemaakt, vaak gecombineerd met immunohistochemie om doelgerichte celpopulaties te identificeren²⁷. Samen stellen deze benaderingen vast dat ruimtelijk opgeloste RNA-analyse in de vliegenhersenen technisch haalbaar is. Hypothese-gedreven perturbatie-experimenten leggen echter een specifiekere set eisen op die niet volledig worden afgedekt door een enkele bestaande workflow. Veel methoden geven prioriteit aan multiplex discovery-achtige transcriptmapping, activiteitsstatusprofilering of RNA-kwantificatie alleen, waarbij immunokleuring doorgaans dient als celidentificatie in plaats van als een gematchte uitlezing van het verstoorde eiwit, of wordt toegepast zonder genetische celtype-toewijzing²⁸. Daarnaast zouden routinematige applicaties profiteren van compatibiliteit met meerdere imagingplatforms en van geautomatiseerde, schaalbare analysepijplijnen.

Hier presenteren we een geïntegreerde, stapsgewijze workflow voor het visuele systeem van Drosophila dat expansie-ondersteunde HCR-smFISH combineert met immunohistochemie die vóór de expansie is uitgevoerd, waardoor gepaarde metingen van RNA- en eiwitniveaus in dezelfde neuronen binnen hetzelfde biologische monster mogelijk zijn. Voortbouwend op het eerder ontwikkelde FlySeg-raamwerk²⁹ , bieden we een geautomatiseerde kwantificatiepijplijn voor nucleaire segmentatie en transcripttelling die onderscheid maakt tussen nucleaire en cytoplasmatische punta, en ondersteunt zowel total-expressiemetingen als transcriptie-toestand-gevoelige analyses. Het protocol wordt gedemonstreerd op zowel een lichtbladmicroscoop als twee confocale systemen met alternatieve montage- en beeldvormingsworkflows. Tot slot illustreren we het nut van de geïntegreerde RNA–eiwit-uitlezing met een representatief perturbatie-validatie-experiment (d.w.z. RNAi-gemedieerde knockdown van een gedefinieerd doelwit), dat praktische richtlijnen biedt over parameters en valkuilen die de signaalkwaliteit, weefselintegriteit en kwantitatieve prestaties beïnvloeden.

Dit protocol bouwt over het algemeen voort op het eerder beschreven²⁴ EASI-FISH-kader voor de detectie van RNA in de hele hersenen in Drosophila, en behoudt de kernprincipes van RNA-ankering, hydrogelexpansie en HCR-gebaseerde signaalversterking. Het huidige protocol breidt deze aanpak uit en verfijnt deze aanpak door immunohistochemie vóór uitbreiding te integreren om gematchte RNA- en eiwitmetingen in dezelfde neuronen mogelijk te maken, door meerdere verwerkings- en verwerkingsstappen gedurende de workflow te herzien om robuustheid en reproduceerbaarheid te verbeteren, door praktische montage- en beeldvormingsstrategieën te bieden voor zowel light-sheet als conventionele omgekeerde confocale microscopen, en door geautomatiseerde soma-segmentatie en transcriptkwantificatie te integreren, en door geautomatiseerde soma-segmentatie en transcriptkwantificatie te integreren met expliciete scheiding van nucleaire en cytoplasmatische RNA-pools.

Deze workflow is het meest geschikt voor gerichte experimenten waarbij het doel is om gedefinieerde RNA- en eiwituitlezingen in genetisch geïdentificeerde neuronen te kwantificeren, terwijl de anatomische context behouden blijft. Het is vooral nuttig voor het valideren van moleculaire verstoringen wanneer het doel is om up- of downregulatie van een gedefinieerd gen of een kleine set kandidaatgenen te meten, expressie te vergelijken tussen genotypen of ontwikkelingsstadia, of transcriptietoestand te beoordelen via nucleaire versus cytoplasmatische transcriptlocatie. Het is minder geschikt voor onbevooroordeelde transcriptontdekking of high-plex whole-brain expression mapping, waar single-cell sequencing, ruimtelijke transcriptomics of iteratieve multiplexed FISH-benaderingen geschikter kunnen zijn.

Protocol

Ethische verklaring

Dit protocol gebruikt Drosophila melanogaster. Er werden geen gewervelde dieren of menselijke proefpersonen gebruikt. Daarom was goedkeuring van een institutionele commissie voor dierenverzorging en gebruik niet vereist.

OPMERKING: Gebruik de RNase-clean techniek gedurende het hele programma. Draag handschoenen, maak oppervlakken en gereedschap schoon met een RNase-decontaminatieoplossing en bereid alle oplossingen voor met RNase-vrij water.

Figuur 1. Stapsgewijze workflow van het monstervoorbereidingsprotocol (A) Schematische tijdlijn van het protocol, waarin de geschatte dagelijkse voortgang en de incubatiestappen over de nacht worden weergegeven. (B–J) Schematisch overzicht van de belangrijkste monstervoorbereidingsstappen, van hersendissectie en fixatie via immunohistochemie, RNA/eiwit-crosslinking, hydrogel-inbedding, vertering, probehybridisatie en HCR-signaalversterking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Hersendissectie, fixatie en immunohistochemie (Dag 1–3)

OPMERKING: Voer alle stappen uit in een Terasaki-stijl multi-well plaat, tenzij anders vermeld. Gebruik 10 μL per put voor incubaties en wasbeurten. Houd de vochtigheid op peil door een vochtig laboratoriumdoekje in één hoek van de plaat te plaatsen.

VOORZICHTIG: Paraformaldehyde en glyoxale fixatiemiddelen zijn giftig/irriterend. Hanteer het in een dampkap en draag geschikte PBM.

1. Ontleed hersenen in ijskoude S2-insectenmedium. Breng hersenen over in putten, tot 10 hersenen per put (Figuur 1B–C).
   OPMERKING: Voor de representatieve experimenten hier werden 72 h-oude poppenhersenen gebruikt.
2. Vervang S2-medium door 10 μL fixatief per put, vervang één keer.
3. Fix Addax zuurvrije glyoxal met 5% (w/v) sucrose 's nachts bij 4 °C (Figuur 1C).
4. Was hersenen 3× in 10 μL PBST (0,5% Triton X-100 in PBS) gedurende 10 minuten elk op kamertemperatuur.
   VOORZICHTIG: Triton X-100 is een irritant; Vermijd huid- en oogcontact.
5. Incubeer hersenen in een primaire antilichaamoplossing van 10 μL (in PBST, bij de verdunningen die in de Materiaaltabel staan) gedurende 24 uur bij 4 °C. (Figuur 1D).
6. Was hersenen 3× gedurende 10 minuten in 10 μL PBST op 4 °C. Vervang de oplossing halverwege de incubatie (twee keer per wasbeurt twee keer verwisseld).
7. Incubeer hersenen in een secundaire antistofoplossing van 10 μL (in PBST, bij de verdunningen die in de Materiaaltabel staan) gedurende 24 uur bij 4 °C (Figuur 1D).
   OPMERKING: Bescherm monsters tegen licht.
8. Was hersenen 3× gedurende 10 minuten in 10 μL PBST op 4 °C. Vervang de oplossing halverwege de incubatie (twee keer per wasbeurt twee keer verwisseld).
   OPMERKING: Gebruik primaire en secundaire antistofconcentraties die 2–3 keer hoger zijn dan standaard whole-mount immunohistochemieconcentraties
   PAUZEPUNT: Bewaar hersenen in 10 μL 1× PBS bij 4 °C tot 96 uur.

2. Covalente verankering van RNA en eiwitten (Dag 4) (Figuur 1E)

WAARSCHUWING: RNA-ankerende alkylatoren en AcX zijn gevaarlijk (giftig/irriterend; sommige worden vermoedelijk kankerverwekkend gemaakt). Bereid oplossingen voor en hanteer deze in een chemische dampkap met de juiste PBM. Verzamel al het afval als gevaarlijk chemisch afval.

1. Incubeer hersenen in 10 μL van een 20 mM MOPS-buffer (pH 7,7) gedurende 20 minuten bij 37 °C.
2. Bereid een ankeroplossing voor door 49,5% (v/v) 20 mM MOPS, 49,5% (v/v) Melphalan-voorraad (2,5 mg·^mL-1 in DMSO) en 1% (v/v) AcX-voorraad (10 mg·^mL-1 in DMSO) te mengen. Dit levert de uiteindelijke concentraties op van 1,24 mg·^mL-1 melfalan en 0,10 mg·^mL-1 AcX.
3. Vervang MOPS door 7–8 μL verankeringsoplossing per put, vervang de oplossing één keer en breng nacht in het donker op 37 °C.
   OPMERKING: Gebruik 7–8 μL om overflow en cross-well mengen te minimaliseren terwijl de volledige sample-dekking behouden blijft.

3. Gelatie (hersenen inbedden in een hydrogel) en vertering van proteïnase K (dag 5)

VOORZICHTIG: Acrylmonomeren, APS en TEMED zijn irriterend en giftig. Behandel met PBM; Bereid vluchtige/exotherme componenten voor in een dampkap.

1. Bevestig een 0,5 mm dikke siliconen lijmpakking aan een niet-geladen glazen microscoopglaasje (Figuur 1F, linksonder), druk stevig om volledig contact en afdichting te garanderen.
2. Voeg 200 μL poly-L-lysineoplossing toe aan de kamer en verspreid het gelijkmatig om het oppervlak te bedekken, incubeer 5 minuten bij kamertemperatuur, en verwijder de oplossing met een pipet.
3. Laat de poly-L-lysine volledig verdampen totdat het oppervlak zichtbaar droog is.
   OPMERKING: De verdamping van Poly-L-lysine is traag. Voor betrouwbare resultaten bereidt u kamers van tevoren voor en laat u ze een nacht drogen in een stofvrije omgeving. Alternatief kan u droge kamers in een incubator van 37 °C voor ≥ 1 uur op de dag van gebruik gebruiken.
4. Was hersenen 2× in 10 μL 1× PBS gedurende 10 minuten op kamertemperatuur.
5. Bereid een gelmonomeeroplossing voor en voeg direct voor gebruik polymerisatiereagentia toe door een monomeeroplossing te mengen met 4HT, TEMED en APS (vers maken) in een verhouding van 47:1:1:1. De uiteindelijke gelatieoplossing bevat 1 M natriumacrylaat, 14% acrylamide, 0,1% bisacrylamide, 1× PBS, 0,01% 4HT, 0,2% TEMED en 0,2% APS.
6. Vortex kort en houd de uiteindelijke gelatieoplossing op ijs. Gebruik de oplossing onmiddellijk.
7. Incubeer hersenen in 10 μL koude gelatieoplossing gedurende 15 minuten op ijs.
8. Tijdens de pre-equilibratie snijd je met een nieuw scheermesje aan elke kant van de siliconen pakking één smal kanaal om lucht te laten ontsnappen tijdens het vullen (Figuur 1F, linksboven)
9. Met behulp van een pipettip breng je de hersenen over in de voorbereide gelatiekamer, zodat elke hersenen altijd ondergedompeld blijft in gelatieoplossing.
   VOORZICHTIG: Na verankering en evenwicht worden hersenen sterk kleefend en hechten ze zich gemakkelijk aan plastic oppervlakken. Om monsterverlies te voorkomen, gebruik je pipettoppen met brede boring of knip je het uiteinde van een standaardtip af om de opening te verbreden.
10. Verwijder de beschermende voering van de siliconenpakkinglijm en plaats voorzichtig een schone glazen afdekplaat van 1,5 uur over de kamer, zodat er geen luchtbellen opgesloten blijven.
11. Pipette langzaam 200 μL vers gemaakte gelatieoplossing via een van de zijkanalen in de kamer, totdat de kamer volledig gevuld is.
12. Plaats de afgesloten kamer in een donkere container en incubeer bij 37 °C gedurende 2 uur.
    OPMERKING: Plaats met water bevochtigde laboratoriumdoekjes) in de container. Zorg ervoor dat de schuilplaats niet direct in contact komt met vloeibaar water.
13. Bereid een digestiebuffer voor bestaande uit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 500 mM NaCl, 1 mM EDTA en 0,5% (v/v) Triton X-100 in RNase-vrij water.
14. Voeg direct voor gebruik Proteinase K toe op 1:100 uit een 20 mg·^mL-1 voorraad tot een uiteindelijke concentratie van 0,2 mg·^mL-1.
    VOORZICHTIG: Proteïnase K is een irritant en moet met handschoenen worden behandeld; Vermijd inademing en huidcontact.
15. Laat de schuif 5 minuten op kamertemperatuur afkoelen voordat je de dekmantel verwijdert. Knip de gel met een scalpel tot een rechthoekige vorm met enkele, rechte sneden. Minimaliseer het overtollige gelvolume rondom elke hersenen (Figuur 1F, rechtsboven).
16. Plaats elke getrimde gel in een individuele put van een 24-putplaat met 1000 μL verteringsoplossing. Zorg dat gels volledig ondergedompeld zijn.
17. Sluit de plaat af met Parafilm en breng de nacht uit bij kamertemperatuur op een orbitale shaker van 0,11 g (Figuur 1G).

4. DNase-vertering en HCR-smFISH-probe hybridisatie (Dag 6)

1. Aspiraat de verteringsoplossing voorzichtig met een pipet die aan de rand van de put is geplaatst om contact te voorkomen met of vervorming van de gel.
2. Was gels 3× met 500 μL 1× PBS gedurende 15 minuten elk bij kamertemperatuur op een orbitale shaker van 0,11 g.
   PAUZEPUNT: Bewaar gels ondergedompeld in 500 μL 1× PBS bij 4 °C tot 7 dagen voordat je verder gaat.
3. Bereid 500 μL DNase-werkoplossing per gel voor door DNase I-voorraad te verdunnen uit de QIAGEN RNase-vrije DNase-set 1:10 in de RDD-buffer. De uiteindelijke werkoplossing bevat ongeveer 0,27 Kunitz-eenheden·^μL-1.
4. Incubeer gels in 500 μL DNase-werkoplossing gedurende 2 uur bij 37 °C met zachte wieging (Figuur 1H).
5. Was gels 4× met 500 μL RNase-vrije 1× PBS gedurende elk 15 minuten op kamertemperatuur.
6. Evenwichtige gels in een 500 μL voorverwarmde probe-hybridisatiebuffer gedurende 30 minuten bij 37 °C
7. Verdunde HCR smFISH-probe voorraad (1 μM; Moleculaire instrumenten) 1:300 in de probe hybridisatiebuffer tot een uiteindelijke concentratie van ~3,3 nM. Mix door vortexen
8. Vervang de evenwichtsbuffer door 500 μL probe-mix per gel en incubeer een nacht bij 37 °C op een orbitale shaker van 0,11g (Figuur I).
   VOORZICHTIG: Probe-hybridisatiebuffers bevatten formamide, dat giftig is. Gebruik handschoenen en vermijd inademing.

5. Hybridisatiekettingreactie (Dag 7) (Figuur 1J)

1. Wash gels 3× met 500 μL voorverwarmde probe wash buffer voor 30 minuten elk bij 37 °C op een orbitale shaker van 0,11 g.
   VOORZICHTIG: Spoelbuffers bevatten formamide, wat giftig is. Gebruik handschoenen en vermijd inademing.
2. Was gels 3× met 500 μL 1× PBS gedurende 30 minuten elk bij kamertemperatuur op een orbitale shaker van 0,11 g.
3. Laat gels 's nachts op kamertemperatuur in 1 mL 1× PBS op een orbitale shaker op 0,11 g zitten.
   OPMERKING: Een uitgebreide nachtelijke wash verbetert de signaal-ruisverhouding door off-target probebinding en achtergrondpuncta te verminderen. Voor verwerking op dezelfde dag gaat u direct door naar HCR-amplificatie.
   PAUZEPUNT: Na de wasbeurten na de hybridisatie bewaar je gels in 1 mL 1× PBS op kamertemperatuur of 4 °C tot 96 uur voor HCR-versterking.
4. Vervang PBS per put door een versterkingsbuffer van 500 μL (voorheen in evenwicht op kamertemperatuur) en incubeer 30 minuten bij kamertemperatuur op een orbitale shaker van 0,11 g.
5. Voor elke probeset verdun je haarspelden h1 en h2 (3 μM stock; Moleculaire instrumenten) in versterkingsbuffer 1:100 (30 nM eindconcentratie). Bereid per put 350 μL verdund haarspeldmengsel.
6. Warmte-verdunde haarspeldoplossingen in PCR-buizen bij 95 °C gedurende 90 seconden in een thermische cycler of warmteblok. Gebruik 100 μL totaalvolume per buis om een uniforme verwarming en temperatuurbalans te garanderen.
   OPMERKING: HCR-richtlijnen raden vaak aan om de snap-heating hairpin h1 en h2 apart te gebruiken en ze pas na afkoeling te combineren. Alternatief kun je H1 en H2 combineren vóór snap-heating wanneer vereenvoudigde behandeling nodig is.
7. Laat haarspelden 10 minuten in het donker afkoelen tot kamertemperatuur zonder verstoring.
8. Verwijder de versterkingsbuffer en voeg per put een 350 μL haarspeldmix toe.
9. Incubeer gels 2 uur op kamertemperatuur in het donker op een orbitale shaker bij 0,11 g.
10. Was gels 3× met 500 μL 5× SSCT gedurende 10 minuten elk bij kamertemperatuur op een orbitale shaker van 0,11 g.
11. Herwin haarspeldoplossingen na versterking, bescherm ze tegen licht en bewaar ze bij -20 °C voor hergebruik.
12. Geef gels 500 μL 1× PBS en was 3× 30 minuten op kamertemperatuur.
13. Bewaar gels in 500 μL 1× PBS bij 4 °C, beschermd tegen licht.
    PAUZEPUNT: Versterkte gels kunnen tot 2 weken worden opgeslagen vóór beeldvorming met minimaal signaalverlies.

6. Voorbereiding, montage en beeldvorming van uitgebreide monsters (Dag 8) (Figuur 2)

1. Incubeer gels in 1× PBS met DAPI (1:1000) 's nachts bij 4 °C op een orbitale shaker bij 0,11 g.
2. Gebruik korte UV-verlichting om het brein in de gel te visualiseren. Oriënteer het monster en snijd overtollige gel af waar nodig.
   VOORZICHTIG: UV-verlichting wordt gebruikt tijdens het positioneren en monteren van het monster. Draag de juiste oogbescherming.
3. Montagemonsters in 1× PBS aangevuld met DAPI (1:1000) met de juiste configuratie voor het geselecteerde beeldplatform (zie Tabel 1).
4. Laat monsters minstens 1 uur in evenwicht zijn voordat ze worden verzameld.
5. Gebruik wateronderdompelingsobjectieven met voldoende werkafstand om door de uitgebreide gel te fotograferen.
6. Beeldmonsters met behulp van lichtbladmicroscopie, laserscanning confocale microscopie of spinning disk confocale microscopie. Vertegenwoordigende platformspecifieke montage- en acquisitieparameters die in deze studie worden gebruikt, zijn samengevat in Tabel 1.
   OPMERKING: Na beeldvorming kunnen probes en HCR-haarspelden worden verwijderd door DNase-vertering zoals hierboven beschreven. Gels kunnen vervolgens worden onderworpen aan extra rondes van probe-hybridisatie en HCR-amplificatie.

Platform	Voorbeeldvisualisatie, montering en locatie	Objectief / detector	Representatieve acquisitieomgevingen
Zeiss Lightsheet 7	Gebruik korte UV-verlichting om de positie van de hersenen in de gel te visualiseren. Verminder overtollige gel en oriënteer elk brein op het detectiedoel. Plaats 5–6 gels op een 1 × 1 cm poly-L-lysine gecoate deklaag met gels naar buiten gericht (Figuur 2A). Bevestig het dekstuk aan de LS7-monsterhouder met een klein druppeltje UV-uithardbare lijm; Zet de UV-lamp uit voordat je lijm aanbrengt. Monter in de LS7-kamer en lokaliseer hersengebieden met live view in ZEN Black.	20×/1.0 NA wateronderdompelingsdetectieobjectie; 2,5× optische zoom (50× totale vergroting).	z-stap, 0,4 μm bij 2,5× zoom en 2× uitbreiding. Pivot scanning ingeschakeld. Belichting, 50 ms voor alle kanalen. Lasers: 405 nm bij 5%, 488 nm bij 2%, 561 nm bij 8%. Uitstoot: 420–470 nm, 505–545 nm, 570–620 nm.
			(Figuur 2C, links)
Nikon Ti2-E AXR NSPARC laser-scannende confocale	Gebruik korte UV-verlichting om het brein in de gel te visualiseren. Oriënteer een enkele gel zodat de hersenen naar beneden wijzen naar het omgekeerde objectief. Overbrengen naar een schotel met glazen bodem gevuld met 1× PBS + DAPI (Figuur 2B). Lokaliseer de hersenen met een 4× doel, identificeer ROI's met een 20× doel en registreer X-Y-posities in NIS-Elementen. Voeg immersiemedium toe, bekijk geregistreerde ROI's opnieuw en breng ze scherp.	40× langeafstandswateronderdompelingsobjectief (Nikon CFI APO LWD 40× WI, 1,15 NA lambda S, 0,61 mm werkafstand); SPARC-detector in superresolutiemodus.	Galvanometer-scan, 2048 × 2048 pixels, 1,6 μs/pixel, 8,0× zoom. Lasers: 488 nm bij 2%, 640 nm bij 20%. Emissie: 502–546 zeemijl en 666–732 zeemijl.
			(Figuur 2C, midden)
Evident Scientific IXplore IX85 / Yokogawa CSU-W1 draaiende schijf confocaal	Bevestig monsters zoals bij omgekeerde confocale beeldvorming: oriënteer de gel met de hersenen naar het objectief gericht en plaats deze in een glazen bodem met 1× PBS + DAPI (Figuur 2B). Identificeer interessegebieden zoals beschreven voor laser-scannende confocale microscopie met behulp van cellSens-software.	60× langeafstandswateronderdompelingsdoel (Olympus LUMFLN60XW LWD, 1,10 NA, 1,5 mm werkafstand); Hamamatsu ORCA-Fusion BT GenIII camera (2304 × 2304 pixels; 6,5 × 6,5 μm pixelgrootte).	488 nm excitatie bij 75% vermogen, 200 ms belichting; 640 nm excitatie bij 100% vermogen, 800 ms belichting. Uitzending: 500–550 nm en 665–705 nm.
			(Figuur 2C, rechts)

Tabel 1: Representatieve montage, monsterlokalisatie en beeldvormingsparameters over microscopieplatforms. Samenvatting van monstermontagestrategieën, lokalisatiebenaderingen, doelstellingen en acquisitieparameters die worden gebruikt op lichtblad- en confocale microscopieplatforms.

7. Kwantitatieve analyse van RNA- en eiwitexpressie

OPMERKING: Kies de analyseworkflow op basis van het experimentele doel. Een vergelijking van deze benaderingen is te vinden in Aanvullende Tabel 1.

1. Populatieschaal transcriptkwantificatie met behulp van FlySeg.
   OPMERKING: De analyse is gebaseerd op de bijgewerkte versie van de FlySeg^29-pijplijn . Een schematisch overzicht van de analyseworkflow is te zien in Figuur 3A–B
   1. Installeer FlySeg, een op Python gebaseerd pakket, door een Conda-omgeving te creëren met:
      conda env create -f environment.yml
   2. Activeer de omgeving vóór de analyse met behulp van:
      Conda activeer flyseg
   3. Begin de analyse met:
      python main.py --bestand <input_file>
      Gebruik ondersteunde invoerformaten, waaronder CZI- of NPY-bestanden.
   4. Pas de analyse aan met optionele argumenten indien nodig, waaronder:
      Aantal kanalen (--kanalen)
      Kernkanaal (--nuclei_ch of --nuclei_wavelength)
      Cytoplasmakanaal (--cytoplasm_ch of --cytoplasm_wavelength)
      Kerndetectieparameters (--nuclei_sigma_range, --nuclei_threshold)
      Nucleaire dilatatiefactor (--nuclei_dilation)
      FISH-detectiedrempels (--fish_threshold_range)
      Uitvoerdirectory (--output_dir)
      Visualisatie via Napari (--visualiseer)
   5. Toon alle beschikbare opties met:
      python main.py – help
   6. Inspecteer beeldmetadata met:
      Python main.py --metadata_only.
      Bevestig de grootte van de voxel, het aantal kanalen en de kanaalidentiteit.
   7. Voer de analyse uit met parameters die passend zijn aangepast voor de dataset. Typisch specificeer het totale aantal kanalen, het kernkanaal, het cytoplasmakanaal (indien beschikbaar) en de nucleaire dilatatiefactor.
      OPMERKING: Stel de --nuclei_dilation waarde in die geschikt is voor de gewenste nucleaire/cytoplasmatische grens. Zie Figuur 3C–D voor een voorbeeld.
   8. Houd het verwerkingslogboek in de gaten. Alle uitvoer worden opgeslagen in een map die naar het invoerbestand is vernoemd.
   9. Identificeer de primaire outputs voor downstream analyse, waaronder:
      1. -Nuclei-df.csv
         die per-kern featuremetingen bevat en bijbehorende puncta-tellingen voor elk FISH-kanaal en kwantitatieve gegevens levert voor statistische analyse.
      2. -Nuclei-equivalent-diameter-area-scatter.png
         Dit is een verstrooiingsgrafiek die wordt gebruikt om segmentatie-uitschieters te identificeren op basis van nucleaire grootte en intensiteit; Sluit kernen die als uitschieters zijn gemarkeerd uit van verdere analyse.
   10. Gebruik extra tussenliggende uitvoeren (bijv. segmentatiemaskers, puncta-detectietabellen en samengevoegde FISH-samenvattingsbestanden) voor geavanceerde nabewerking indien nodig.
2. Transcripttelling in individueel identificeerbare cellen met behulp van Imaris
   1. Met het Surfaces-instrument segmenteert u de neuron van belang op basis van een cytoplasmatisch of membraanmerkerkanaal.
   2. Pas de parameters voor oppervlaktegladstrijking en intensiteit aan om ervoor te zorgen dat het resulterende oppervlak de soma nauwkeurig omvat, terwijl aangrenzende structuren worden uitgesloten.
   3. Met behulp van de Spots-detectietool identificeer je transcriptpunten in het FISH-kanaal. Stel de geschatte spotdiameter en intensiteitsdrempel in op basis van puncta-grootte en signaalintensiteit (bijv. 0,25 μM voor 2x weefselexpansie).
   4. Beperk spotdetectie tot het eerder gegenereerde oppervlak om ervoor te zorgen dat alleen puncta binnen de neuron worden geteld.
   5. Extraheren het totale aantal gedetecteerde vlekken binnen het neuronoppervlak met behulp van het Statistiekenpaneel.
   6. Exporteer spottellingen en bijbehorende metingen voor downstream-analyse.
3. ROI-gebaseerde fluorescentiekantifisering met FIJI/ImageJ
   1. Open beeldstacks in FIJI en genereren projecties met maximale intensiteit met behulp van Image > Stacks > Z Project > Maximum Intensity Projection. Gebruik identieke projectie-instellingen voor alle monsters binnen een experiment.
   2. Identificeer de neuronale structuur van belang met behulp van een anatomisch markerkanaal (bijv. membraan- of cytoplasmatische GFP). Gebruik de Freehand- of Polygon Selection-tool om handmatig de ROI te schetsen die overeenkomt met de structuur (bijv. Giant Fiber dendriet).
   3. Schakel over naar het eiwitkanaal en meet de fluorescentieintensiteit binnen het gedefinieerde ROI met Analyze > Measure. Noteer de volgende parameters: Gemiddelde fluorescentieintensiteit; Geïntegreerde dichtheid; ROI-gebied.
   4. Meet de fluorescentieintensiteit in een nabijgelegen achtergrond-ROI van vergelijkbare grootte, die geen specifiek signaal bevat en buiten de gelabelde neuronale structuur ligt. Gebruik dezelfde achtergrond-ROI-strategie voor alle monsters binnen het experiment en trek de achtergrondwaarde af van de ROI-meting.
   5. Gebruik achtergrondgecorrigeerde geïntegreerde dichtheids- of gemiddelde intensiteitswaarden voor kwantitatieve vergelijking tussen genotypen of experimentele omstandigheden. Zorg ervoor dat identieke beeldinstellingen worden gebruikt voor alle te vergelijken monsters.

Resultaten

Om de expansie-ondersteunde HCR-smFISH en immunohistochemie workflow in een biologisch relevante omgeving te valideren, richtten we ons op het dreigende ontsnappingscircuit van het visuele systeem van Drosophila. Dit circuit bestaat uit genetisch gedefinieerde LC4 visuele projectieneuronen^30,31 die dreigende prikkels detecteren en een goed gekarakteriseerde Giant Fiber (GF) dalende neuronen die snelle starts^{aansturen 32,33}, wat een anatomisch stereotiepe systeem biedt voor celtype-specifieke moleculaire metingen in intacte hersenen.

Het Drosophila gap junction eiwit Shaking-B (ShakB)³⁴ is betrokken bij elektrische transmissie binnen meerdere componenten van het GF-circuit, waaronder axonale uitgangssynapsen³⁵ en auditieve ingangen³⁵. Hoewel direct bewijs voor elektrische koppeling bij de GF-dendrieten tijdens dreigende detectie beperkt is, wijst recent onderzoek erop dat LC4-neuronen hoge niveaus van shakB³⁶ tot expressie brengen. Deze observaties motiveerden het gebruik van shakB knockdown- en taggingstrategieën als testcase om te evalueren of het protocol gerichte moleculaire verstoringen op zowel RNA- als eiwitniveau in genetisch gedefinieerde neuronale types kwantitatief kan beoordelen.

We beoordeelden eerst de efficiëntie van shakB knockdown in de GF en LC4 met HCR-smFISH gecombineerd met ShakB-antilichamkleuring. De GF, een enkele neuron per hemibrain, werd gelabeld met een membraanmarker (Figuur 4A). LC4, een populatie van ongeveer 60 neuronen per hemibrein, werd gelabeld met een nucleaire marker om populatieniveau kwantificatie mogelijk te maken (Figuur 4B). In controlehersenen werden shakB-transcripten duidelijk gedetecteerd in zowel de GF- als LC4-neuronen. Expressie van shakB RNAi resulteerde in een significante reductie van shakB mRNA puncta in gerichte neuronen van beide celtypen (Figuur 4C–D). In overeenstemming met de cytoplasmatische plaats van RNA-interferentie was transcriptuitputting het meest uitgesproken in het cytoplasmatisch compartiment. De scheiding van nucleaire en cytoplasmatische puncta met behulp van de op FlySeg gebaseerde kwantificatie toonde een selectieve reductie van cytoplasmatische shakB-transcripten in de LC4-populatie, terwijl nucleaire puncta significant minder beïnvloed waren (Figuur 4D, respectievelijk 69% versus 22% reductie).

We vonden ShakB-antistofkleuring die zich lokaliseert in gebieden waar GF-dendrieten overlappen met de axonen van Giant Commissural Interneurons (GCI), die de twee Giant Fibers verbinden en contralaterale visuele responsen mogelijk maken³⁷ (Figuur 4E). Deze waarnemingen zijn consistent met eerdere studies³⁵ die ShakB-afhankelijke elektrische koppeling tussen de GF en GCI aantonen. ShakB-antistofkleuring werd ook waargenomen in gebieden waar LC4-axonen contact maken met GF-dendrieten, hoewel de lokalisatie in dit gebied minder duidelijk werd opgelost. Ongeacht de precieze subcellulaire lokalisatie was het ShakB-antilichaamsignaal dat geassocieerd is met het GF-dendritische gebied duidelijk verminderd na RNAi-expressie (Figuur 4F).

Echter, antistof-gebaseerde detectie maakt het niet ondubbelzinnig mogelijk om ShakB-eiwit aan presynaptische LC4-terminalen toe te wijzen versus postsynaptische GF-dendrieten op contactplaatsen. Daarnaast ^{beperkt de} wijdverspreide expressie van shakB in het visuele systeem^de celtype-specifieke kwantificatie in LC4-neuronen met behulp van anti-ShakB immunokleuring. Om deze beperkingen te overwinnen en direct celtype-specifieke ShakB-lokalisatie te beoordelen, gebruikten we een endogeen getagd shakB-allel dat we eerder^36,38 hebben gegenereerd. Dit maakte selectieve visualisatie van ShakB-eiwit mogelijk specifiek binnen LC4-neuronen. SmGdP-10×V5-gelabelde ShakB was verrijkt in zowel dendrieten (overeenkomend met inputgebieden van upstream visuele neuronen) als axonterminalen die contact maken met de GF-dendrieten (Figuur 4G). Expressie van shakB RNAi resulteerde in een bijna volledige verdwijning van het V5-signaal in zowel dendritische als axonale compartimenten (Figuur 4H). Deze resultaten tonen aan dat het protocol celtype-specifieke en subcellulaire resolutie van endogene eiwitlokalisatie binnen dicht geïnnerveerde neuropil mogelijk maakt.

Als extra kwalitatieve controle testten we niet-uitgebreide FISH gecombineerd met immunohistochemie in geïdentificeerde neuronale populaties (Aanvullende Figuur 1). FISH-signaal van grd overlapte met LC22 somata, wat consistent is met voorspelde expressie uit optic lob scRNA-seq data (Aanvullende Figuur 1A–C)¹³. In Tm3-neuronen die tdTomaat tot expressie brengen, overlappte tdTomato mRNA met het tdTomato-eiwit, terwijl VGlut1 mRNA niet overlapte met Tm3 somata, wat overeenkomt met de cholinerge identiteit van Tm3-neuronen (Aanvullende Figuur 1)¹³. Deze voorbeelden illustreren dat niet-uitgebreide FISH + IHC voldoende is voor kwalitatieve aanwezigheid/afwezigheidsbeoordeling, terwijl uitbreiding nodig is voor betrouwbare kwantificatie van enkele punten.

Succesvolle implementatie van dit protocol wordt aangetoond door duidelijke celtype-specifieke labeling, discrete smFISH-puncta met lage achtergrond, betrouwbare segmentatie van individuele kernen of handmatig gedefinieerde celvolumes, en consistente reductie van doel-RNA of eiwitsignalen na verstoring. Negatieve of laag-signaaluitkomsten moeten ook interpreteerbaar zijn: bijvoorbeeld produceerde shakB RNAi een verminderd shakB mRNA- en ShakB-eiwitsignaal, terwijl niet-uitgebreide FISH een gebrek aan VGlut1-signaal vertoonde in Tm3-somata ondanks duidelijke tdTomato mRNA-detectie. Suboptimale uitkomsten zijn onder andere zwak antistof- of smFISH-signaal, hoge achtergrondpuncta, onvolledige segmentatie, verkeerde toewijzing van puncta of monsterdrift tijdens beeldvorming, die allemaal invloed kunnen hebben op de kwantificatie stroomafwaarts.

Figuur 2. Het monteren en beelden van uitgebreide monsters met behulp van lichtblad- en confocale microscopieplatforms. (A) Visualisatie en trim van uitgebreide hydrogels (1–2), gemeenschappelijk voor alle beeldvormingsplatforms, gevolgd door montage voor lichtbladmicroscopie (3–4; Zeiss Lightsheet 7). (B) Foto van een vergroot monster gemonteerd op een omgekeerde laser-scannende confocale microscoop (Nikon Ti2-E AXR). (C) Representatieve enkele optische secties (enkele Z-vlakken) van een uitgebreid monster van het Drosophila-visueel systeem (LC4-neuronen gelabeld met een fluorescerende nucleaire marker) onderzocht op shakB-mRNA (zie Figuur 4), verkregen via drie beeldvormingsplatforms. Schaalbalken, 10 μm (weefsel na expansie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Kwantitatieve analyse van smFISH puncta met behulp van FlySeg. (A) Schematisch overzicht van de FlySeg-analyseworkflow voor geautomatiseerde segmentatie en puncta-kwantificatie binnen geïdentificeerde cellen. (B) Driedimensionale Voronoi-tessellatie die de kernsegmentatielogica van FlySeg illustreert. Het beeldvolume is opgedeeld in ruimtelijke domeinen (elk weergegeven in een eigen kleur), waarbij elke partitie maximaal één kern mag bevatten, wat zorgt voor een toewijzing van enkele cel. Binnen elk Voronoi-domein wordt de kern gesegmenteerd met een functionele optimalisatieprocedure die het optimale kernoppervlak bepaalt op basis van zowel nucleaire als omliggende cytoplasmatische intensiteitswaarden. (C) Demonstratie van de --nuclei_dilation optie om nucleaire en cytoplasmatische transcripten te onderscheiden Een enkele optische sectie met een GFP-gelabelde kern omgeven door smFISH-puncta, met een diffuus DAPI-signaal dat het cytoplasmatisch compartiment omlijnt na DNase-behandeling. Lijnen geven 0 en 0,5 dilatatiefactoren aan, respectievelijk overeenkomend met nucleaire en cytoplasmatische volumes. (D) Maximale intensiteitsprojectie van (C), wat illustreert dat puncta zowel nucleaire als cytoplasmatische compartimenten lokaliseert. Schaalbalken, 10 μm (weefsel na expansie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Validatie van de kwantitatieve workflow met behulp van RNAi-gemedieerde moleculaire verstoring (A) Lichtbladprojecties (10 μm dikte, niet het volledige celvolume bedekkend) van de Giant Fiber (GF) soma gelabeld met een membraanmarker en onderzocht op shakB mRNA onder controle (boven) en shakB RNAi (onder) condities. Gestreepte groene omlijningen geven de grenzen van soma aan om de uitputting van de cytoplasmatische maar niet nucleaire mRNA-pool te markeren. n, hersenen (één kant per dier). (B) hetzelfde als (A) voor LC4-neuronen gelabeld met een nucleaire marker. (C) Kwantificering van shakB FISH puncta in GF-neuronen (gecombineerde nucleaire en cytoplasmatische pools) onder controle- en shakB RNAi-condities. Stippen stellen individuele neuronen voor (één neuron per hersenen, één zijde per dier). (D) Hetzelfde als (C) voor LC4-neuronen. Stippen stellen individuele hersenen weer (één kant per dier; puncta-telling per cel gemiddeld per brein). (E) Confocale projecties van de GF-dendrieten, gelabeld met een membraanmarker en gekleurd voor ShakB onder controleomstandigheden (boven) en shakB RNAi (onder). (F) Kwantificering van ShakB-eiwitniveaus in de GF-dendrieten, gemeten als gemiddelde fluorescentieintensiteit onder controle en GF>shakB RNAi-condities. n, hersenen (één kant per dier). (G) Confocale projecties van LC4-neuronen gelabeld met een membraanmarker en met smGdP-10xV5-gelabelde ShakB in controle- (boven) en shakB RNAi-condities (onder). Gestippelde groene omtrekken geven gebieden aan met LC4-dendrieten en axonterminalen waarop de ShakB-V5-dichtheid werd beoordeeld (H) Kwantificering van ShakB-smGdP-V5 eiwitniveaus in de LC4-dendrieten en axonterminalen gemeten als gemiddelde fluorescentieintensiteit onder controle en LC4 > shakB RNAi-condities. n, hersenen (één kant per dier). Foutbalken geven gemiddelde ± SEM aan. Alle statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met tweezijdige Welch-t-tests. Schaalbalken, 10 μm in alle afbeeldingen (weefsel na expansie). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Dit protocol combineert expansie-ondersteunde HCR-smFISH, pre-expansie immunohistochemie en segmentatie-gebaseerde transcriptkwantificatie om gematchte RNA- en eiwitmetingen in dezelfde genetisch gedefinieerde neuronen mogelijk te maken. Door deze componenten te integreren in één werkstroom, zou deze methode kwantitatieve, celtype-specifieke moleculaire analyse in het intacte Drosophila-brein moeten faciliteren.

Verschillende praktische modificaties die hier zijn geïntroduceerd, vormen cruciale stappen voor het combineren van immunohistochemie met expansie-ondersteunde HCR-smFISH in de Drosophila-hersenen ²⁴. Allereerst moet immunohistochemie worden uitgevoerd vóór weefselexpansie en smFISH. Omdat het protocol een Proteïnase K-digestiestap bevat, kan het uitvoeren van immunohistochemie na uitbreiding de integriteit van het epitoop verminderen. Belangrijk is dat pre-expansie antilichaamincubatie (24 uur primair + 24 uur secundair) de RNA-signaalintensiteit niet merkbaar vermindert wanneer de RNase-clean-techniek en covalente RNA-ankering worden gebruikt. Ten tweede moeten de concentraties van primaire en secundaire antistoffen worden verhoogd, meestal 2–3 × ten opzichte van standaard whole-mount IHC, om signaalverlies te compenseren dat samenhangt met de vertering van Proteinase K en weefselexpansie. Ten derde zijn fixatiecondities belangrijk voor het behouden van zowel eiwit- als RNA-signalen. Zuurvrije glyoxale fixatie verbetert het behoud van punctate synaptische eiwitlokalisatie, behoudt de structurele integriteit van neuronale processen en belemmert de kwantitatieve detectie van mRNA-puncta niet. We hebben ook waargenomen dat gelijktijdige verankering van RNA en eiwit compatibel is met zowel downstream HCR-smFISH als immunofluorescentiedetectie. Samen verbeteren deze aanpassingen de compatibiliteit tussen immunohistochemie en expansie-ondersteunde transcriptdetectie.

Uitbreiding voegt een enkele stap van de overnachting toe en is technisch niet complex, maar het gebruik ervan hangt af van het experimentele doel. Zoals aangetoond in Aanvullende Figuur 1, is niet-uitgebreide FISH gecombineerd met immunohistochemie voldoende om te beoordelen of een gen tot expressie komt in een bepaald celtype, terwijl uitbreiding nodig is wanneer individuele smFISH-puncta betrouwbaar moeten worden opgelost, toegewezen aan individuele somata en kwantitatief moeten worden geanalyseerd, vanwege de aanzienlijke toename in effectieve ruimtelijke resolutie. Evenzo zijn Terasaki-stijl multiwell-platen niet strikt vereist, maar ze verminderen het gebruik van reagens, maken het mogelijk om meerdere condities parallel te verwerken en helpen de monsteridentiteit over kleine batches te behouden; Standaard microcentrifugebuizen kunnen ook worden gebruikt wanneer het reagensvolume minder beperkt is. Hoewel lichtplaatmicroscopie snelle volumetrische beeldvorming van uitgebreid weefsel mogelijk maakt, tonen we aan dat standaard omgekeerde laserscanning en draaiende schijfconfocale systemen voldoende zijn voor volledige beeldvorming van de geselecteerde neuronale populaties in het uitgebreide Drosophila-brein . Een veelvoorkomende beperking van confocale microscopie is de korte werkafstand. Omdat het vliegenbrein echter klein is en de monsters ongeveer 2× worden uitgebreid in PBS, bieden wateronderdompelingsobjectieven op lange afstand voldoende penetratiediepte. Voor kwantitatieve vergelijkingen moeten de acquisitie-instellingen identiek blijven tussen de monsters, moeten verzadigde pixels worden vermeden en de voxelgrootte voldoende zijn om individuele smFISH-puncta te onderscheiden. Dit vergroot de toegankelijkheid van het protocol voor laboratoria zonder speciale lichtbladinstrumentatie.

De bijgewerkte FlySeg-implementatie bouwt voort op het eerder gepubliceerde FlySeg-framework en introduceert twee hoofdtoevoegingen voor dit protocol. Ten eerste maakt een configureerbare kerndilatatieparameter het mogelijk om smFISH puncta te classificeren als nucleair of cytoplasmatisch op basis van hun ruimtelijke relatie tot gesegmenteerde kernen. Cytoplasmatische DAPI-kleuring na DNase-behandeling is belangrijk voor deze stap, omdat het een diffus signaal geeft dat het cellichaam omlijnt en betrouwbare nucleaire segmentatie ondersteunt, wat de scheiding van nucleaire en cytoplasmatische transcriptpools ondersteunt. Ten tweede identificeert geautomatiseerde uitschieterdetectie slecht gesegmenteerde kernen, die kunnen worden uitgesloten van de kwantificatie van de downstream. Naast het beoordelen van de moleculaire effecten van celtype-specifieke gen-knockdown, kan het scheiden van nucleaire en cytoplasmatische transcripten informatief zijn wanneer transcriptlokalisatie de voortdurende transcriptieactiviteit weerspiegelt. In de zoogdierhersenen verschijnen activiteit-geïnduceerde directe vroege gentranscripten eerst in de kern en hopen zich vervolgens op in het cytoplasma terwijl mRNA's worden verwerkt en geëxporteerd³⁹, een principe dat wordt gebruikt in catFISH^40-analyse van neuronale activatietijden. Of vergelijkbare transcriptiedynamiek voorkomt in de Drosophila-hersenen is momenteel onbekend, maar dit kan in principe worden onderzocht met de huidige workflow. In andere pulse-chase-experimenten kan het onderscheiden van kern van cytoplasmatische puncta daarom temporele informatie opleveren die verder gaat dan het totale aantal transcripten. Tegelijkertijd is de workflow niet beperkt tot nucleaire segmentatie en kan het worden aangepast aan whole-soma (d.w.z. membraangedefinieerde) celsegmentatie. De huidige kwantitatieve workflow is geoptimaliseerd voor neuronale somata; hoewel neuropil-regio's kunnen worden gefotografeerd, zou de kwantitatieve toewijzing van mRNA-puncta aan individuele axonen of dendrieten extra compartimentspecifieke segmentatiestrategieën vereisen. FlySeg is het meest nuttig voor geautomatiseerde, hoogdoorzettingskwantificatie in dichte neuronale populaties waar populatiestatistieken vereist zijn. Voor individueel identificeerbare neuronen of handmatig gedefinieerde compartimenten zijn andere hulpmiddelen zoals Imaris of FIJI/ImageJ mogelijk geschikter. Een samenvatting van deze kwantificatiestrategieën, inclusief hun belangrijkste toepassingen, voordelen en beperkingen, is te vinden in Aanvullende Tabel 1.

Veelvoorkomende probleemoplossingspunten zijn zwak antilichaamsignaal, hoge smFISH-achtergrond, gelschade of monsterverlies, monsterdrift tijdens beeldvorming en slechte segmentatie. Zwakke antistofsignalen kunnen vaak worden verbeterd door de antistofconcentratie verder te verhogen of primaire en/of secundaire antilichaamincubaties te verlengen van 24 uur naar 48 uur. Een hoge smFISH-achtergrond kan vaak worden verminderd door post-hybridisatiewashes te verlengen en verzadigde acquisitie-instellingen te vermijden. Gelschade en monsterverlies worden geminimaliseerd door gebruik te maken van brede boringen, het trimmen van gels met rechte sneden en het snijden van ventilatiekanalen om bubbels tijdens het vullen van de kamer te voorkomen. Monsterdrift tijdens beeldvorming wordt verminderd door gemonteerde gels minstens 1 uur voor de opname in evenwicht te brengen; Als drift aanhoudt, kan de evenwicht worden verlengd tot 2 uur of langer. Slechte segmentatie kan het gevolg zijn van zwakke cytoplasmatische DAPI-kleuring of onvolledige monsterevenwicht, wat het celgrenssignaal kan verminderen of X-Y-Z-verschuivingen tijdens de acquisitie kan veroorzaken; deze moeten worden gecontroleerd voordat je FlySeg-parameters aanpast. In dit protocol worden gels behouden in 1× PBS, wat resulteert in ongeveer 2× isotrope expansie. Als een hogere ruimtelijke resolutie vereist is, kan grotere expansie worden bereikt in verdund PBS of gedeïoniseerd water. Omgekeerd, wanneer het doel alleen is om de aanwezigheid of afwezigheid van expressie in een bepaald celtype te beoordelen, kan niet-uitgebreide FISH gecombineerd met immunohistochemie voldoende zijn, zoals aangetoond in Aanvullende Figuur 1. Het protocol blijft compatibel met iteratieve FISH-workflows. Sondes en HCR-haarspelden kunnen worden verwijderd met DNase-behandeling, waardoor extra rondes van hybridisatie en versterking in hetzelfde exemplaar mogelijk zijn. Toekomstige technische uitbreidingen kunnen onder meer een high-plex iteratieve HCR-smFISH, geautomatiseerde registratie over beeldvormingsrondes, verbeterde whole-cell of neurietsegmentatie en meer gestandaardiseerde analysepijplijnen voor het vergelijken van RNA- en eiwitsignalen tussen experimenten omvatten. Verdere ontwikkeling van compartimentspecifieke segmentatiestrategieën zou de kwantitatieve analyse verder kunnen uitbreiden dan neuronale somaten naar axonen en dendrieten. Samen maken de gecombineerde RNA–eiwituitlesing, compartimentopgeloste transcriptkwantificering en compatibiliteit met standaard beeldvormingsplatforms deze workflow geschikt voor gerichte moleculaire validatie-experimenten in genetisch gedefinieerde neuronen van de intacte Drosophila-hersenen .

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10N Sodium Hydroxide Solution	Fisher Scientific	Cat# SS255-1
1N Sodium Hydroxide Solution	Fisher Scientific	Cat# SS266-1
20X Saline-Sodium Citrate Buffer	Invitrogen	Cat# AM9763
4-Hydroxy-TEMPO	Sigma-Aldrich	Cat# 176141
5M Sodium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	Cat# S5150
Acrylamide	Sigma-Aldrich	Cat# A9099
Acrylic acid	Sigma-Aldrich	Cat# 147230
Acryloyl-X, SE	Invitrogen	Cat# A20770
Adobe Illustrator	Adobe	N/A
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Chicken (1:200)	Jackson ImmunoResearch Labs	Cat# 103-545-155, RRID:AB_2337390
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-21124, RRID:AB_2535766
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG1 (1:200)	Invitrogen	Cat# A-11011, RRID:AB_143157
Ammonium persulfate	Sigma-Aldrich	Cat# A3678
Anhydrous DMSO	Sigma-Aldrich	Cat# 900645-4X2ML
Bondic UV-curing adhesive	Bondic	Bondic starter kit
cellSens imaging software v4.4.1	Evident Scientific	N/A
Chicken Polyclonal Anti-GFP (1:400)	Abcam	Cat# ab13970, RRID:AB_300798
Conda (environment manager)	Anaconda, Inc	N/A
Corning™ Frosted Microscope Slides	Corning	Cat# 2948-75X25
Custom Designed LS7 Sample Holder	Janelia Tech	ID 2021-021
DAPI	Sigma-Aldrich	Cat# D9542
Disposable Stainless Sterile Scalpel	MedPride	MPR-47101
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma-Aldrich	Cat# EDS-100G
Fiji (ImageJ) image analysis software v2.14.0	ImageJ Consortium	N/A
FlySeg (custom pipeline)	https://github.com/avaccari/DrosophilaFISH	N/A
GAF fixative solution	Addax Biosciences	Cat# VI25
GenClone® 24 Well Cell Culture Plates, Non-treated	Genesee Scientific	Cat# 25-102
GMR-86D05-Gal4 (LC4)	Bloomington Stock Center	#41315
Goat Serum Donor Herd	Sigma-Aldrich	Cat# G6767
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Amplifier Buffer	Molecular Instruments	N/A
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Amplifiers:AF546, JF669	Molecular Instruments	N/A
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Probe Hybridization Buffer	Molecular Instruments	N/A
HCR™ RNA-FISH(v3.0) Probe Wash Buffer	Molecular Instruments	N/A
HCR™ RNA-FISH(v3.0) ShakB Probe	Molecular Instruments	N/A
Imaris 10.1	Oxford Instruments	N/A
IXPlore IX85 SpinSR Spinning Disk Confocal Microscope	Evident Scientific	N/A
LS7 Light Sheet Microscope	Carl Zeiss	N/A
Melphalan	Cayman Chemical	Cat# 16665
MOPS Buffer	Fisher Scientific	Cat# BP308-100
Mouse Monoclonal Anti-V5 (SV5-Pk1) (1:100)	Abcam	Cat# ab27671, RRID:AB_471093
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	Cat# T7024
N,N’-Methylenebisacrylamide	Sigma-Aldrich	Cat# M7279
Napari	open-source community	N/A
NIS-Elements Advanced Research imaging software	Nikon Corporation	N/A
Nuclease-Free Water	Qiagen	Cat# 129114
Nunc™ MiniTrays with Nunclon™ Delta surface	Invitrogen	Cat# 163118
PBS (10X), pH 7.4	Gibco	Cat# 70011044
Photo-Flo detergent	Electron Microscopy Sciences	Cat# 74257
Poly-L-Lysine solution	Ted Pella	Cat# 18026
Precision Cover Glasses, #1.5H Thickness	Thorlabs	Cat# CG15CH2
Press-to-Seal™ Silicone Isolator with Adhesive, one well, 20 mm diameter, 0.5 mm deep	Invitrogen	Cat# P24740
Proteinase K	New England  Biolabs	Cat# P8107S
Rabbit Anti-ShakB (1:400)	Gift from Geord Ammer	N/A
RNase AWAY™ Surface Decontaminant	Invitrogen	Cat# 7002
RNase-Free DNase Set	Qiagen	Cat# 79256
Schneider’s Drosophila Medium	Gibco	Cat# 21720001
shakB-KDRT-stop-KDRT-smGdP-V5;;	Frighetto et al., 2025	PMID: 41278920
Sodium azide	Sigma-Aldrich	Cat# S8032
Stemi 508 Stereo Microscope	Carl Zeiss	N/A
SYTO™ 41 Blue Fluorescent Nucleic Acid Stain	Invitrogen