Netwerkfarmacologie en validatie van Yi Qi Huo Xue-aftreksel van de Lumbale Schijfdegeneratie

Samenvatting

Deze studie gebruikte netwerkfarmacologie, moleculaire docking en een rat caudale schijfpunctie om de potentiële preklinische effecten van Yi Qi Huo Xue Decoctie op lumbale schijfdegeneratie te onderzoeken, met de focus op kandidaatdoelwitten zoals AKT1, BCL2 en STAT3, en routes zoals PI3K-AKT signalering.

Samenvatting

In deze studie werden netwerkfarmacologie, moleculaire koppeling, moleculaire dynamica-simulatie en experimentele validatie gebruikt om de farmacologische basis en mogelijke moleculaire mechanismen van Yi Qi Huo Xue Decocion (YQHXD) bij lumbale schijfdegeneratie (LDD) te onderzoeken. In totaal werden 678 actieve verbinding-gerelateerde doelwitten van YQHXD en 296 potentiële LDD-geassocieerde therapeutische doelen geïdentificeerd. Analyse van eiwit-eiwitinteractienetwerken en topologische analyses identificeerden verschillende kandidaatdoelen, waaronder AKT1, IL6, TNF, BCL2 en STAT3. Verrijkingsanalyses met behulp van Gene Ontology en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes gaven aan dat de kandidaatdoelen gekoppeld waren aan functies zoals eiwitbinding en ATP-binding, met verrijking van de routes die PI3K-AKT signalering omvatte. Moleculaire koppeling voorspelde interacties tussen geselecteerde actieve verbindingen, zoals quercetine, Tetraneurine A en isorhamnetine, en de kerndoelwitten. Moleculaire dynamica-simulaties suggereerden verder dat de laagste-energiecomplexen stabiel bleven. Zeventig mannelijke Sprague-Dawley-ratten werden willekeurig toegewezen aan de controle-, nep-opererende, model-, positieve controle- en laag-, middel- en hoge dosis YQHXD-groepen. Na de oprichting van een coccygeaal intervertebrale schijfpunctuurmodel in de model-, positieve controle- en YQHXD-groepen, kregen ratten 8 weken lang YQHXD of celecoxib toegediend via orale gavage, terwijl de controle- en schijn-opererende groepen normale zoutoplossing kregen. Histopathologische evaluatie toonde aan dat de behandeling van YQHXD in dit model geassocieerd was met verminderde degeneratie van tussenwervelschijf. Enzymgebonden immunosorbentassay, polymerasekettingreactie en western blot-analyses toonden veranderingen in het mRNA- en eiwitexpressieniveau van geselecteerde doelwitten, waaronder AKT1, BCL2 en STAT3. Deze bevindingen suggereren dat YQHXD preklinische beschermende effecten kan uitoefenen bij LDD via multicomponent- en multi-target regulatie met ontstekings- en apoptose-gerelateerde mechanismen. Deze studie levert voorlopig preklinisch bewijs ter ondersteuning van verder onderzoek naar YQHXD voor LDD.

Inleiding

Lumbale schijfdegeneratie (LDD) is een veelvoorkomende leeftijdsgebonden orthopedische aandoening die wordt gekenmerkt door late aanvang, moeilijkheden bij de behandeling, veel reciditief gedrag en invaliditeit. LDD omvat degeneratieve pathologische veranderingen die samenhangen met een disbalans tussen het catabole en het anabole metabolisme van de extracellulaire matrix (ECM) in de tussenwervelschijf (IVD) en is nauw geassocieerd met lage rugpijn (LBP)¹. Epidemiologische studies tonen aan dat LBP een van de belangrijkste oorzaken van invaliditeit in de klinische praktijk^{is 2}.

Van 1990 tot 2017 steeg het aantal wereldwijde gevallen van 42,5 miljoen tot 64,9^miljoen, wat het dagelijks leven beïnvloedde en een aanzienlijke sociale en economische last oplegde. Daarom blijft effectieve behandeling van LDD klinisch belangrijk. In de klinische praktijk wordt LDD vaak behandeld met conservatieve of chirurgische symptomatische behandelingen, die de symptomen kunnen verlichten maar over het algemeen de intervertebrale schijfdegeneratie (IVDD) niet omkeren. Veelgebruikte orale niet-steroïde ontstekingsremmers voor conservatieve behandeling kunnen ook geassocieerd zijn met nier-, maag-darm- en cardiovaat-bijwerkingen.

Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) wordt al lange tijd gebruikt in ziektebeheer⁴. Van kruidenverbindingen en individuele bestanddelen is gerapporteerd dat ze de progressie van IVDD vertragen en^{weefselregeneratie bevorderen}. In de klinische praktijk worden TCM-formules ook gebruikt als onderdeel van conservatieve beheersstrategieën voor degeneratieve bot- en gewrichtsziekten. De medische faculteit van de familie Wu in de regio Suzhou heeft Yi Qi Huo Xue Decoctie (YQHXD) gebruikt als kernrecept voor lumbale IVD-aandoeningen; er is echter verder mechanistisch bewijs nodig om de mogelijke rol ervan in LDD te verduidelijken.

Eerdere studies suggereren dat YQHXD IVDD kan vertragen door cellulaire autofagie te bevorderen en anti-verouderingseffecten^uit te oefenen ^6,7. De farmacologische mechanismen waarmee YQHXD LDD kan beïnvloeden blijven echter onduidelijk, en een systematische analyse van de werkingswijze ontbreekt nog steeds. In deze studie werd netwerkfarmacologie gebruikt om de multicomponent- en multi-target kenmerken van YQHXD in relatie tot LDD te analyseren. Moleculaire koppeling werd gebruikt om interacties tussen verbindingen en doeleiwitten te evalueren, gevolgd door moleculaire dynamica-simulaties. Deze voorspellingen werden vervolgens beoordeeld met behulp van een rat caudale schijfpunctie om mogelijke mechanismen van YQHXD in LDD⁸ te onderzoeken. Zoals weergegeven in Figuur 1, levert deze studie preklinisch bewijs dat YQHXD LDD-gerelateerde processen kan beïnvloeden door genen en eiwitten zoals AKT1, BCL2 en STAT3 te moduleren, waarbij verrijking van de routes PI3K-Akt en andere ziektegerelateerde routecategorieën betrokken is.

Protocol

Alle experimenten zijn goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Nanjing University of Chinese Medicine (Protocolcode: 202501A018) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de National Institutes of Health (NIH) Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Alle experimentele procedures volgden de ARRIVE-richtlijnen.

Experimentele geneesmiddelen
De YQHXD-monsteroplossing bevatte 20 g Astragalus membranaceuswortel , 20 g Angelica sinensis-wortel , 15 g Ligusticum chuanxiong-rhizoom , 6 g Stephania tetrandra-wortel , 15 g Chaenomeles speciosa-fruit en 10 g Sinapis alba-rijpe zaden, met een totaal ruwe medicijngewicht van 86 g per recept. Alle kruidenmaterialen zijn geauthenticeerd volgens de Chinese Farmacopee (editie 2020) door de afdeling Farmacie van het Ruikang Ziekenhuis, aangesloten bij de Guangxi Universiteit voor Chinese Geneeskunde. De YQHXD-monsteroplossing werd bereid met behulp van een wateraftrekmethode. Steriel gedestilleerd water met 8 keer het totale ruwe medicijnvolume werd toegevoegd, en de kruiden werden 30 minuten geweekt tot ze volledig ondergedompeld waren. Het mengsel werd vervolgens gekookt en op laag vuur 30 minuten gedecoceerd voordat het werd gefilterd. De residuen werden opnieuw met hetzelfde volume steriel gedestilleerd water verwijderd volgens dezelfde procedure. De filtraten uit de twee extracties werden gecombineerd en geconcentreerd tot 55,5 mL onder verminderde druk met behulp van roterende verdamping om de YQHXD-voorraadoplossing te verkrijgen. Op basis van het totale ruwe geneesmiddelgewicht was de uiteindelijke ruwe geneesmiddelconcentratie 1,55 g/mL, met een extractieopbrengst van ongeveer 64,5%. De dosis die aan experimentele ratten werd toegediend, werd omgezet van de klinische volwassendosis met behulp van de methode van lichaamsoppervlaktenormalisatie. De conversiecoëfficiënt tussen mensen en ratten was ongeveer 6,3; Daarom werd de ratdosering (mg/kg) berekend als de menselijke dosering (mg/kg) × 6,3. De groep met hoge doses kreeg respectievelijk 15,48 g/kg/dag als referentiedosis, terwijl de groepen met midden- en lage dosis respectievelijk 7,74 g/kg/dag en 3,87 g/kg/dag ontvingen. Voor een gavagevolume van 10 mL/kg waren de overeenkomstige werkconcentraties respectievelijk 1,548, 0,774 en 0,387 g/mL voor de hoge-, middel- en laagdosisgroepen. De voorraadoplossing werd dienovereenkomstig verdund om de streefdosering voor elke experimentele groep vóór toediening te bereiken. Na voorbereiding werden de scoctionen afgekoeld, onder steriele omstandigheden gealiquoteerd en opgeslagen bij −40 °C tot gebruik.

Netwerkfarmacologieanalyse

Voorspelling van doeleiwitten van het werkzame bestanddeel
Op 24 november 2025 werden actieve stoffen uit de TCMSP-database gehaald met de zoektermen "Huangqi, Angelica, Chuanxiong, Stephania, Mugua en Jiezi." Verbindingen werden gescreend op basis van orale biobeschikbaarheid (OB ≥ 30%) en geneesmiddellijkheid (DL ≥ 0,18)⁹. De reden voor deze drempels is als volgt: de TCMSP-database integreert verbindingsgegevens van gezaghebbende bronnen zoals PubChem, ChEMBL en ChemSpider en biedt ADME-gerelateerde parameters, waaronder orale biobeschikbaarheid. Orale biobeschikbaarheid verwijst naar het aandeel van een oraal toegediende dosis dat onveranderd de systemische circulatie bereikt, en een hoge OB is essentieel voor het identificeren van bioactieve moleculen. Geneesmiddelgelijkheid is een indicator die wordt gebruikt om de drugbaarheid van verbindingen te evalueren en hun oplosbaarheid en stabiliteit te voorspellen. In deze studie werd een strengere OB-drempel (≥30%), die de door de database aanbevolen waarde (≥20%) overschreed, toegepast om kandidaatverbindingen te identificeren met gunstige orale absorptie- en farmacokinetische profielen. Ondertussen werd DL gebruikt om het geneesmiddelachtige potentieel van verbindingen te schatten, en werd een grens van DL ≥ 0,18 aangenomen op basis van de gemiddelde DL-waarde die werd waargenomen in traditionele Chinese geneeskundeverbindingen. De geselecteerde actieve verbindingen werden in SMILS-formaat opgehaald uit de PubChem-database en geïmporteerd in de SwissTargetPrediction-database voor doelvoorspelling, waarbij de soort werd ingesteld op Homo sapiens. Doeleiwitten werden gestandaardiseerd met behulp van officiële gensymbolen, en alleen doelen met waarschijnlijkheidswaarden groter dan 0 werden behouden om de voorspellingsbetrouwbaarheid te verbeteren. Verbindingen zonder voorspelde doelwitten werden uitgesloten van de daaropvolgende netwerkanalyse. Na het samenvoegen van alle doelen werden dubbele vermeldingen verwijderd met behulp van spreadsheetsoftware om ervoor te zorgen dat elk doel slechts één keer werd weergegeven in de uiteindelijke dataset.

Verzameling van sleuteldoelen
Ziektegerelateerde genen werden opgehaald uit de GeneCards¹⁰, OMIM¹¹ en TTD¹² databases met het trefwoord "lumbale schijfdegeneratie." De verzamelde gendoelen werden samengevoegd en dubbele vermeldingen werden verwijderd om een definitieve set ziekte-geassocieerde doelen te verkrijgen.

Potentiële doelwitten van YQHXD voor de behandeling van LDD
Het Venny 2.1.0-platform werd gebruikt om de potentiële doelen van YQHXD in LDD te bepalen. Vervolgens werd er een netwerk gegenereerd om de associaties tussen de actieve componenten en hun voorspelde doelen te tonen. Kernactieve componenten werden geselecteerd op basis van hun graadwaarden in het netwerk.

Netwerkconstructie van geneesmiddelcomponenten en ziektesintersectiedoelen
Actieve ingrediënten, doeleiwitten en LDD-gerelateerde genen uit de TCM-formule YQHXD werden geïmporteerd in de Cytoscape-software¹³ om een geneesmiddelcomponent-doelziekte-netwerkdiagram te construeren.

Constructie van het PPI-netwerk en identificatie van belangrijke kerndoelen
Snijdende doelen werden voorgelegd aan het STRING-platform¹⁴ voor analyse, waarbij het organisme werd ingesteld op Homo sapiens. Om het eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk op te bouwen, werd de interactiescoredrempel ingesteld op >0,4, werden losgekoppelde knopen verborgen en werden alle andere instellingen als standaard gelaten. De resulterende gegevens werden geïmporteerd in de software, waar de NetworkAnalyzer-tool werd gebruikt om topologische eigenschappen te evalueren en knooppunten te berekenen. De top vijf knooppunten, gerangschikt op gradatie, werden geïdentificeerd als belangrijke hubdoelen.

Verrijkingsanalyse van kerndoelen
Kruisende doelen werden geüpload naar de DAVID-database¹⁵ voor Gene Ontology (GO) functionele annotatie en de verrijking van de Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) padverrijking. De achtergrond van het organisme werd ingesteld als Homo sapiens, waarbij de verrijkingsgrens werd gedefinieerd volgens de standaard DAVID-parameters, waaronder een EASE-drempel < 0,1 en een Count-drempel ≥ 2. Het genuniversum was gebaseerd op de standaard volledige genoomachtergrond die door DAVID werd geleverd. Meervoudig testen werd gecorrigeerd met de Benjamini-Hochberg-methode om het valse ontdekkingspercentage (FDR) te beheersen, en de DAVID-resultaten werden op basis hiervan aangepast. Verrijkte paden werden geordend op basis van de Telwaarde in aflopende volgorde. GO- en KEGG-verrijkingsbalkplots werden geproduceerd met behulp van een online bio-informaticaplatform.

Moleculaire koppeling
Om interacties te voorspellen tussen de belangrijkste actieve componenten van YQHXD en de kerndoelen van LDD, werd in deze studie moleculaire koppelingsanalyse uitgevoerd. De top vijf belangrijkste actieve verbindingen, gerangschikt op netwerktopologische graadwaarden en doelrelevantie, werden geselecteerd als liganden, terwijl de bijbehorende kern-doeleiwitten als receptoren werden gebruikt. Ligand SDF-bestanden werden opgehaald van PubChem, en driedimensionale structuren van de doeleiwitten werden gedownload uit de Protein Data Bank (PDB). Dockinganalyse werd uitgevoerd op het CB-Dock2-platform met behulp van het volledig geautomatiseerde blinde dockingprotocol. Na het uploaden van de eiwitstructuren verwijderde het platform automatisch heteroatomen, waaronder kleine moleculen, ionen en watermoleculen, en herstelde vervolgens ontbrekende atomen en waterstofatomen. De Auto Blind Docking-modus werd gebruikt. In deze modus identificeert CB-Dock2 potentiële eiwit-oppervlak bindingspockets met een krommingsgebaseerd holtedetectie-algoritme en voert vervolgens dockingberekeningen uit met de geïntegreerde AutoDock Vina engine¹⁶. Tijdens het dockingproces werden de eiwitten behandeld als stijve structuren, terwijl de liganden als flexibel werden beschouwd en alle dockingparameters werden ingesteld op de standaardwaarden van het platform. De koppelingsresultaten werden onderworpen aan driedimensionale visualisatie en interactie-analyse met behulp van de ingebouwde tools van CB-Dock2¹⁷, en de bindingsenergieën werden berekend om de voorspelde bindingsaffiniteiten tussen de actieve verbindingen en doeleiwitten te schatten.

Moleculaire dynamica-simulatie
Moleculaire dynamica-simulaties werden uitgevoerd voor het doel-eiwit-ligandencomplex met behulp van GROMACS 2022.2. Het eiwit werd gemodelleerd met het Amber14SB-krachtveld, en het oplosmiddelsysteem werd weergegeven met behulp van het TIP3P-watermodel. Ligandenladingen werden berekend met de AM1-BCC-methode geïmplementeerd in Antechamber, gevolgd door de toewijzing van GAFF2-atoomtypes. De resulterende topologiebestanden werden omgezet naar een GROMACS-compatibel formaat met behulp van ACPYPE. Ionenparameters die consistent zijn met het TIP3P-watermodel werden toegewezen op basis van de Joung-Cheatham parameterset. Het startcomplex werd geplaatst in een afgeknotte dodecaëdrische simulatiebox met minstens 1,2 nm tussen het eiwitoppervlak en de rand van de doos. TIP3P-watermoleculen werden toegevoegd om het systeem te solveren, en Na^+- en Cl⁻ -ionen werden geïntroduceerd om de systeemlading te neutraliseren en de ionensterkte te zetten op 0,15 M. Energieminimalisatie werd uitgevoerd met het steilste dalingsalgoritme totdat de maximale kracht onder de 1.000 kJ·mol⁻¹·nm⁻¹ lag. Het systeem werd vervolgens in evenwicht gebracht voor 100 ps onder het NVT-ensemble bij 298 K en 1 bar. Na evenwicht werd een productiesimulatie van 100 ns uitgevoerd onder het NPT-ensemble met een tijdstap van 2 fs. Niet-gebonden interacties werden afgehandeld met het Verlet-cutoff-schema. Elektrostatische interacties werden berekend met behulp van de deeltjesmesh Ewald (PME)-methode, en een 1,2 nm cutoff werd gebruikt voor zowel van der Waals- als Coulomb-interacties. Waterstofhoudende bruggen werden beperkt met het LINCS-algoritme. De temperatuur werd geregeld met de Nosé-Hoover thermostaat en de druk werd geregeld met de Parrinello-Rahman barostaat, waardoor het systeem op 298 K en 1 bar bleef. Trajectorieën werden elke 10 ps opgeslagen. Structurele dynamica en intermoleculaire interacties werden geanalyseerd met ingebouwde GROMACS-tools, VMD en PyMOL. Bindende vrije energie werd geschat met gmx_MMPBSA waar van toepassing.

Dierstudies

Dierenfokkerij
Zeventig mannelijke Sprague-Dawley (SD) ratten van 3–8 weken werden willekeurig toegewezen aan zeven experimentele groepen (n = 10 per groep) met behulp van computergegenereerde willekeurige cijfers, zodat er geen statistisch significante verschillen in het basisgewicht tussen groepen waren. Alle dieren werden onder gecontroleerde omstandigheden gehuisvest (22 ± 1 °C, 55 ± 10% relatieve luchtvochtigheid, 12 uur licht/donker cyclus) met vrije toegang tot voedsel en water. Kooiposities werden bij elke kooiwisseling gerandomiseerd om omgevingsbias te minimaliseren. Na 1 week van acclimatisatie ondergingen ratten in de modelgroepen een caudale IVD-punctie om degeneratie te induceren. Lokale infiltratie-anesthesie met bupivacaïne werd preoperatief toegediend om de pijn te verminderen. De dieren werden nauwlettend gevolgd tijdens de operatie en gedurende het herstel na de operatie. Postoperatieve observaties omvatten hersteltijd, herstel van spontane activiteit, voedsel- en waterinname, en veranderingen in lichaamsgewicht. Een week na het opzetten van het model werden twee ratten uit elke groep willekeurig geselecteerd voor postoperatieve digitale radiografie (DR) en hematoxyline- en eosinekleuring (HE). Röntgenanalyse toonde een verminderde hoogte van caudale IVD aan, terwijl HE-kleuring een duidelijke vermindering van nucleus pulposus (NP) notochordale cellen en desorganisatie van de annulus fibrosus lamellaire structuur¹⁸ aantoonde, wat een succesvolle modelvestiging bevestigde. Acht weken na de operatie werden ratten geëuthanaseerd door inhalatie van een overdosis isofluran, en werden er stuitweefsel- en bloedmonsters afgenomen. Na voorlopige validatie werden drie onafhankelijke steekproeven per groep die voldeden aan vooraf gedefinieerde kwaliteitscriteria gebruikt voor de definitieve histologie-, ELISA-, PCR- en western blot-analyses. Histologische secties werden geëvalueerd onder enkelblinde omstandigheden, waarbij de preparaten alleen werden gelabeld met dieridentificatienummers. Voor ELISA-, PCR- en western blot-assays werd geblindeerde codering toegepast tijdens het aliquoteren en labelen van monsters, en werd de testvolgorde van alle monsters gerandomiseerd voorafgaand aan de experimenten. Ruwe gegevens, waaronder absorptiewaarden,_C-t-waarden en bandintensiteiten, werden door een statisticus die niet betrokken was bij experimentele groepering of monsterverwerking gedecodeerd in groepsidentiteiten en vervolgens geanalyseerd door statistisch personeel. Alle statistische analyses werden uitgevoerd door statistici die niet betrokken waren bij experimentele groepering of steekproefverwerking. Eventuele bijwerkingen, waaronder wondinfectie, dehiscentie, bloedingen of ernstige lusteloosheid, werden onmiddellijk geregistreerd en geëvalueerd. Milde aandoeningen werden nauwlettend gevolgd met verbeterde ondersteunende zorg. Humane eindpunten werden toegepast als ratten een gewichtsverlies van meer dan 20% van de basislijn vertoonden, hevige pijn die niet werd verlicht door pijnstillers, verlies van mobiliteit, onvermogen om voedsel of water te krijgen, infectie, necrose, andere ernstige postoperatieve complicaties, ademhalingsproblemen of een levensbedreigende aandoening vertoonden. In zulke gevallen werden dieren op humane wijze geëuthanaseerd door inhalatie van een overdosis isoflurane.

Experimentele modellering
Ratten werden verdoofd met ingeademde isofluraan en op de buik gelegd. De Co6/7, Co7/8 en Co8/9 staart IVD's werden onder röntgenfluoroscopische leiding geplaatst. Een 21 G-naald werd verticaal in de IVD geschuin tot aan de andere kant van de huid, waarna de naaldpunt naar het midden van de staart werd teruggetrokken. Een tweede naald diende als positionele referentie. Om aanhoudende IVD-degeneratie op te wekken, werd de naald 360° gedraaid, 30 seconden op zijn plaats gehouden en daarna verwijderd. In de Sham-groep was de prikdiepte door huid en spier ongeveer 2 mm, zonder de IVD te beschadigen. In de andere groepen werd de naald 5 mm richting het midden van de IVD ingebracht, waarbij bloedvaten werden vermeden. Na het plaatsen werd de naald 360° gedraaid en 30 seconden op zijn plaats gelaten. De prikplek werd gedesinfecteerd, gemarkeerd en beschermd met steriel gaas. Een week na de modellering toonde röntgenbeeldvorming van de staartwervelkolom een afname van de IVD-hoogte. HE-kleuring toonde een significante vermindering van NP-notochordale cellen en desorganisatie van de annulaire lamellastructuur, wat een succesvolle modelvestiging bevestigde. Na succesvolle modellering kregen de groepen die TCM-behandelingen ontvingen en de positieve controle (PC) groep de juiste doses, berekend op basis van de verhouding van lichaamsoppervlakte tussen mensen en ratten.

Groepering en interventie
In dit experiment werden in totaal 70 mannelijke SD-ratten van 3–8 weken gebruikt en verdeeld in zeven groepen:
(1) Controlegroep (Ctrl): Ratten in deze groep werden willekeurig toegewezen op hetzelfde moment en onder dezelfde omstandigheden als de experimentele groepen. Ze werden in individuele kooien gehouden in een dierenfaciliteit op SPF-niveau, met gratis toegang tot standaard voedsel en drinkwater.
(2) Schijngroep: De ratten werden verdoofd door inademing van isoflurane. Nadat de narcose was gevestigd, werd de staarthuid gedesinfecteerd met povidonjodium en werden de ratten op de buik gelegd. De Co6/7- en Co7/8-IVD's werden onder röntgenfluoroscopische begeleiding gelokaliseerd. De naald werd ongeveer 2 mm door de huid en spier gebracht zonder de IVD te beschadigen. Gedestilleerd water (10 mL/kg) werd eenmaal per dag toegediend via gavage gedurende 8 weken.

(3) Modelgroep: De ratten werden verdoofd met ingeademde isoflurane. Nadat de narcose was gevestigd, werd de staarthuid gedesinfecteerd met povidonjodium en werden de ratten op de buik gelegd. Onder röntgenfluoroscopische begeleiding werden de Co6/7, Co7/8 en Co8/9 IVD's gelokaliseerd. Een 21 G naald werd verticaal in de IVD gebracht totdat deze de andere kant van de huid bereikte, waarna de naaldtip naar het midden van de staart werd teruggetrokken.

Een tweede naald werd gebruikt als positionele referentie. De naald werd 360° gedraaid en 30 seconden op zijn plaats gehouden om een continue degeneratie van de IVD te induceren voordat deze werd verwijderd. Gedestilleerd water (10 mL/kg) werd dagelijks toegediend via gavage gedurende 8 weken, en het herstel van de ratten werd na de operatie nauwlettend gevolgd.
(4) PC-groep: De positieve controlegroep werd onderworpen aan dezelfde modelleringsprocedure als de modelgroep en ontving vervolgens orale gavage van celecoxib (20 mg/kg/dag), bereid als suspensie in 0,5% natriumcarboxymethylcellulose (CMC-Na), gedurende 8 opeenvolgende weken, met een gavagevolume van 10 mL/kg lichaamsgewicht.
(5) YQHXD laag-dosis groep [YQHXD(L)]: Modellering werd uitgevoerd zoals in de modelgroep. De ratten kregen YQHXD bij 3,87 g/kg/dag via gavage gedurende 8 weken, met een gavagevolume van 10 mL/kg en een werkconcentratie van 0,387 g/mL.
(6) YQHXD medium-dosis groep [YQHXD(M)]: Modellering werd uitgevoerd zoals in de modelgroep. De ratten kregen YQHXD bij 7,74 g/kg/dag via gavage gedurende 8 weken, met een gavagevolume van 10 mL/kg en een werkconcentratie van 0,774 g/mL.
(7) YQHXD hogedosisgroep [YQHXD(H)]: Modellering werd uitgevoerd zoals in de modelgroep. De ratten ontvingen YQHXD bij 15,48 g/kg/dag via gavage gedurende 8 weken, met een gavagevolume van 10 mL/kg en een werkconcentratie van 1,548 g/mL.

Pathologische veranderingen
Het caudale IVD-weefsel van de rat werd chirurgisch geïsoleerd en er werden veranderingen in de IVD en omliggende spierweefsels waargenomen. Het verzamelde weefsel werd vervolgens verwerkt in pathologische secties, waarbij monsters in longitudinale secties werden voorbereid voor morfologische observatie. De caudale wervel-IVD, gefixeerd in formaldehyde gedurende 96 uur, werd snel ontkalkt met een ontkalkende oplossing, gedehydrateerd via een gegradueerde alcoholreeks en vrijgemaakt met xyleen. Na het inbedden in paraffine werden 5 μm paraffinesecties voorbereid. Na deparaffinisatie met xyleen en uitdroging via een reeks alcoholgradiënten, werden de secties gekleurd met hematoxyline en eosine. Daarna werden ze gedehydrateerd, verwijderd en gemonteerd. De monsters werden onder een optische microscoop onderzocht om morfologische veranderingen in de caudale IVD-structuur tussen de groepen te onderzoeken. Vervolgens werd Massons trichrome beitsing uitgevoerd. De secties werden sequentieel gekleurd met kaliumdichromaatoplossing en hematoxyline gedurende elk 3 minuten, gevolgd door differentiatie met zuur ethanol, en vervolgens 10 minuten gekleurd met Picrosirius Red. Na 10 minuten behandeling met fosfhotungsticazuur werden de secties 5 minuten gekleurd met toluidineblauw. Na uitdroging werden de secties vrijgemaakt met xyleen, gemonteerd en onder een microscoop bekeken om veranderingen in de caudale IVD te onderzoeken.

ELISA-detectie van serumdoeleiwitten
Acht weken na de operatie werden ratten verdoofd met ingeademde isoflurane en werd er abdominaal aortabloed verzameld. De perifere bloedmonsters werden 1 uur op kamertemperatuur bewaard en 10 minuten gecentrifugeerd op 1.400 × g . Serum werd gescheiden en opgeslagen bij −80 °C tot gebruik. Serum AKT1-, STAT3- en Bcl-2-niveaus werden gekwantificeerd met een enzymgebonden immunosorbentassay (ELISA). De assays werden uitgevoerd volgens de protocollen van de fabrikanten. De absorptie werd gemeten bij 450 nm en concentraties werden bepaald aan de hand van standaardcurves. De detectiebereiken voor AKT1, STAT3 en BCL-2 waren respectievelijk 0,625–40 ng/mL, 31,25–1000 pg/mL en 0,16–10 ng/mL, met gevoeligheden van 0,1 ng/mL, 10 pg/mL en 0,1 ng/mL. Alle serummonsters werden zonder verdunning geanalyseerd en alle resultaten vielen binnen de overeenkomstige standaardcurvebereiken. Alle monsters en standaarden werden dubbel getest en normalisatie werd uitgevoerd op basis van gelijke serumvolumes.

PCR-detectie van genexpressieniveaus
Intervertebrale schijfweefsels werden van de staartwervels van ratten ontleed en er werd ongeveer 20 mg van elk monster verzameld. De weefsels werden vermalen in vloeibare stikstof en gelyseerd in 500 μL niet-enzymatische lysisbuffer gedurende 15 minuten. Vervolgens werd totaal RNA geëxtraheerd en de concentratie en zuiverheid werden gemeten met een spectrofotometer. Monsters met A₂₆₀/A_280-waarden van 1,8–2,0 werden geaccepteerd voor analyse, en de RNA-concentraties werden aangepast naar 500 ng/μL. Reverse transcriptie werd uitgevoerd volgens het protocol van de fabrikant. Kwantitatieve PCR (qPCR) werd uitgevoerd op een realtime PCR-systeem om de expressie van Akt1, Bcl-2 en Stat3 mRNA te meten. Primerreeksen zijn weergegeven in Tabel 1. Het PCR-programma bestond uit een initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 30 seconden, gevolgd door 40 cycli van 95 °C voor 5 seconden en 60 °C voor 30 seconden. Smeltcurveanalyse werd uitgevoerd na amplificatie om de productspecificiteit te verifiëren. Gapdh werd gebruikt als referentiegen en alle monsters werden in drievoud geanalyseerd. De primeramplificatie-efficiënties waren 90%–110%. Relatieve genexpressie werd berekend met behulp van de 2^{−ΔΔCt-methode} .

Westerse blotting voor eiwitexpressieniveaus
Het totale eiwit werd geïsoleerd uit ratten-caudale tussenwervelschijfweefsels van elke groep. Weefsels werden gelyseerd in een RIPA-buffer aangevuld met proteaseremmers. De eiwitconcentratie werd gemeten met een BCA-eiwitassaykit en aangepast naar 2 μg/μL. Gelijke eiwithoeveelheden (15 μg per monster) werden gescheiden door 10% SDS-PAGE en overgedragen aan polyvinylidieniedifluoride (PVDF) membranen met een constante stroom van 300 mA gedurende 90 minuten met behulp van een nat transfersysteem. De membranen werden vervolgens 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere melk en 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antistoffen tegen AKT1 (1:5.000), STAT3 (1:6.000), Bcl-2 (1:1.500) en β-actine (1:4.000). Na TBST-wasbeurt werden de membranen geïncubeerd met mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerde secundaire antilichamen met een verdunning van 1:5.000 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Eiwitbanden werden gedetecteerd met een versterkt chemiluminescentie (ECL) reagens, en beelden werden gemaakt met een gelbeeldvormingssysteem onder identieke belichtingsomstandigheden. Bandintensiteiten werden gemeten met ImageJ en genormaliseerd naar β-actine om de relatieve eiwitexpressie te bepalen. Elk experiment werd onafhankelijk in drievoud uitgevoerd, waarbij elk monster werd verkregen van een ander dier.

Statistieken
De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Verschillen tussen groepen werden geëvalueerd door een eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA), gevolgd door de least significant difference (LSD) post hoc-test. Statistische significantie werd gedefinieerd als P < 0,05.

Resultaten

Conclusies afgeleid uit de studie
Deze studie integreerde netwerkfarmacologie, moleculaire koppeling, moleculaire dynamica-simulaties en in vivo-experimenten om de potentiële beschermende effecten van YQHXD tegen LDD te onderzoeken. De resultaten suggereren dat YQHXD ten minste gedeeltelijk kan werken door regulatie van de AKT1/STAT3/BCL-2 signaalas, gekenmerkt door verminderde STAT3-expressie en verhoogde AKT1- en Bcl-2-expressie. Histologische en moleculair...

Discussie

Traditionele Chinese kruidengeneesmiddelen zijn gerapporteerd als farmacologische effecten, waaronder ontstekingsremmende, pijnstillende en bloedcirculatiebevorderende activiteiten¹⁹. Eerdere studies suggereren dat Xiaosui Huhe-aftrek, de voorloperformule van YQHXD, de resorptie van een massale IVD-hernia kan bevorderen door de resorptie van nucleus pulposus (NP) en IVD-absorptie te beïnvloeden²⁰; de onderliggende moleculaire mechanismen bl...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0,5% natriumcarboxymethylcellulose (CMC-Na)	Niet gespecificeerd		Voertuig gebruikt om de celecoxib suspensie voor gave voor te bereiden.
21 G naald	Niet gespecificeerd		Gebruikt voor caudale intervertebrale schijfpunctie.
2 × Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan	G3326	qPCR-amplificatiereagens.
30% acrylamide/bis-acrylamide gel oplossing (29:1)	Solarbio Co., Ltd.		Gelbereidingsoplossing voor SDS-PAGE; vermeld in originele materiaaltabel als 30%/29:1 geloplossing.
3D bevroren molen	Servicebio Technology Co., Ltd., Wuhan		Gebruikt voor weefselhomogenisatie/maalwerk.
4 × SDS-PAGE concentrerende gelbuffer (pH 6,8)	Solarbio Co., Ltd.		Western blot gelbereidingsreagens.
Zure ethanol	Niet gespecificeerd		Gebruikt voor differentiatie van histologische kleuring.
ACPYPE	ACPYPE project		Gebruikt om ligandtopologiebestanden om te zetten in een GROMACS-compatibel formaat.
AKT1 ELISA-kit	Hangzhou UpingBio Technology Co., Ltd.	SYP-R1928	Gebruikt om serum AKT1 niveaus te meten; detectiebereik 0,625–40 ng/mL.
AM1-BCC laadmethode	Antechamber/AMBER Tools		Gebruikt voor berekening van atoomlading van ligand.
Amber14SB krachtveld	AMBER krachtveld		Eiwitkrachtveld gebruikt in moleculaire dynamica simulatie.
Angelica sinensis wortel	Jianshou Pharmacy, Nanning, Guangxi, China	Batchnr. 20250503	YQHXD botanisch component; 20 g per recept.
Watervrij ethanol	Tianjin Aopusheng Chemical Co., Ltd.		Gebruikt in weefselverwerking/dehydratie.
Antechamber	AMBER Tools		Gebruikt voor ladingsberekening en atoomtypologie van ligand.
Anti-AKT1 antilichaam	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Primair antilichaam voor Western blotting; verdunning 1:5.000.
Anti-Bcl-2 antilichaam	Wuhan Sanying Co., Ltd.		Primair antilichaam voor Western blotting; verdunning 1:1.500.
Anti-STAT3 antilichaam	Wuhan Sanying Co., Ltd.	10253-2-AP	Primair antilichaam voor Western blotting; verdunning 1:6.000.
APS reagens	Beyotime/Biyuntian Co.		Western blot gelpolymerisatie reagens.
Astragalus membranaceus wortel	Jianshou Pharmacy, Nanning, Guangxi, China	Batchnr. 20250405	YQHXD botanisch component; 20 g per recept.
Autoclaaf	SANYO, Japan		Sterilisatieapparatuur.
AutoDock Vina-engine	AutoDock/Vina project		Docking-engine gebruikt binnen CB-Dock2.
BCA eiwitbepaling kit	Solarbio Co., Ltd.		Gebruikt om eiwitconcentratie te bepalen vóór Western blotting.
Bcl-2 ELISA-kit	Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.	PMK1545	Gebruikt om serum Bcl-2 niveaus te meten; detectiebereik 0,16–10 ng/mL.
Bupivacaïne	Niet gespecificeerd		Lokaal infiltratieanestheticum gebruikt vooroperatief.
CB-Dock2	CB-Dock2 webserver		Geautomatiseerde blinde moleculaire docking platform.
Celecoxib	Sichuan New Ston Pharmaceutical Co., Ltd.	H20233911	Positief-controledrog; 20 mg/kg/dag door gave.
Chaenomeles speciosa vrucht	Jianshou Pharmacy, Nanning, Guangxi, China	Batchnr. 231001	YQHXD botanisch component; 15 g per recept.
Cytoscape	Cytoscape Consortium	Versie 3.9.0	Gebruikt voor het construeren en analyseren van netwerkdiagrammen.
DAB chromogeen reagenskit (20×)	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Vermeld in bestaande materiaaltabel.
DAVID	National Cancer Institute	Versie 6.8	Database voor Annotation, Visualisatie en Geïntegreerde Ontdekking; gebruikt voor GO en KEGG verrijkingsanalyse.
Decalcificatieoplossing	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Gebruikt voor decalcificatie van caudale vertebrale IVD weefsel.
Ontkleuring shaker	Liu Yi Biotechnology Co., Ltd., Beijing		Laboratorium shaker.
DEPC water	Wuhan Sanying Co., Ltd.		RNA werk/reagensvoorbereiding.
Digitaal radiografie beeldvormingssysteem	Niet gespecificeerd		Gebruikt voor validatie van postoperatief radiografiemodel.
Gedestilleerd water	Niet gespecificeerd		Voertuig/controle gave en YQHXD afkookselvoorbereiding.
ECL chemiluminescentie substraat	Biosharp Co.		Western blot signaaldetectiereagens.
EDTA antigeenretrieval oplossing (pH 8,0)	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology Co., Ltd.		Vermeld in bestaande materiaaltabel.
Elektroforese apparaat	Niet gespecificeerd		Gebruikt voor SDS-PAGE elektroforese.
Elektroforese buffer	Servicebio Co.		Western blot elektroforese oplossing.
FM40 ijsmachine	Changliu Scientific Instruments Co., Ltd., Beijing		Ijsmachine.
Formaldehyde	Niet gespecificeerd		Fixatief gebruikt voor caudale vertebrale IVD weefsel.
GAFF2 atoomtypen	AMBER Tools		Ligand atoomtypen gebruikt voor moleculaire dynamica simulaties.
Gel beeldvormingssysteem	Tianen Scientific, Shanghai		Gebruikt om Western blot beelden vast te leggen.
GeneCards	Weizmann Institute of Science	Versie 5.26	Menselijke gendatabase gebruikt om ziekte-geassocieerde doelen op te halen.
gmx_MMPBSA	gmx_MMPBSA project		Gebruikt voor MM-PBSA binding vrije-energie schatting waar van toepassing.
GraphPad Prism	GraphPad Software	Versie 8.0	Statistisch/grafisch software vermeld in de eerdere manuscriptversie van de auteurs.
Slijpkralen	Servicebio Technology Co