Grootschalige productie van extracellulaire vesikels uit hoogdichte 3D-celculturen in holvezelperfusie-bioreactoren

Samenvatting

Er worden instructies gegeven voor het opzetten en gebruiken van een 3D perfusie holvezelbioreactor voor de productie van extracellulaire vesikels uit MSC en andere celtypen. Dit protocol beschrijft een methode om extracellulaire vesikels bij hoge concentraties continu te produceren, terwijl de celdichtheid in holle vezelbioreactoren wordt gecontroleerd.

Samenvatting

De vooruitgang op het gebied van exosoomonderzoek wordt belemmerd door het aantal kleine cellen en de lage productiviteit van afgescheiden exosomen in traditionele 2D-celkweek. Hoogwaardige celculturen in holle vezelbioreactoren (HFBR's) maken continue productie mogelijk van afgescheiden biomoleculen en extracellulaire blaasjes (EV's), uit grote aantallen cellen, over langere periodes, in hoge concentraties in 3D-kweek. Dit protocol beschrijft de verzameling van geconcentreerde afgescheiden exosomen terwijl optimale celmassa en 3D-perfusiecultuurcondities behouden blijven, wat de groei van hoogdichte cellen ondersteunt gedurende enkele weken of maanden van continue productie in een commercieel verkrijgbare HFBR. Het systeem is compact, gesloten, eenmalig te gebruiken, kan cGMP-compatibel zijn, eenvoudig te gebruiken en past in een standaard CO 2-incubator. Bepaalde cellen, zoals mesenchymale stamcellen (MSC's) en menselijke vruchtwaterstamcellen (HAFSC's), kunnen onder deze omstandigheden verminderde proliferatie vertonen, wat mogelijk de differentiatie en het fenotype in de loop van de tijd beïnvloedt. Representatieve resultaten tonen typische EV-opbrengsten en cellevensvatbaarheid over weken of langer van continue productie aan. Deze methode levert reproduceerbare, hoogwaardige EV-oogsten op die geschikt zijn voor zowel onderzoek als klinische toepassingen.

Inleiding

Extracellulaire blaasjes worden steeds meer erkend om hun rol in intercellulaire communicatie en therapeutische toepassingen, waaronder regeneratieve geneeskunde. Traditionele 2D-celkweekmethoden zijn arbeidsintensief en hebben een beperkte opbrengst, soms vereisen ze honderden kweekkolven om voldoende EV's te verkrijgen voor experimenten of dierstudies ^1,2. Klinische vertaalopschaling maakt doorgaans gebruik van traditionele geroerde bioreactoren met behulp van microcarriers of andere ondersteuningen. Deze systemen zijn van nature niet-fysiologisch, inefficiënt en kunnen variabele resultaten hebben. Holle vezelbioreactoren bieden een driedimensionale, perfusie-gebaseerde omgeving die hoogdichtheidscelculturen ondersteunt binnen een compacte voetafdruk en op een schaal die mogelijk geschikt is voor klinische toepassingen ^3,4.

HFBR's bieden een compact, hoogdicht celkweeksysteem dat continue productie van geconcentreerde EV's mogelijk maakt met minder arbeid, tijd en ruimte vergeleken met traditionele 2D-kweek⁵. Ze maken hoogdichte celculturen in een compacte ruimte mogelijk, wat grootschalige EV-productie in elk laboratorium ondersteunt. HFBR's kweken grote aantallen cellen (1X10⁹ tot 1×10¹⁰) in een klein volume (20–60 mL), in een standaard CO2-incubator, en vereisen geen gespecialiseerde apparatuur. Deze systemen maken continu, geconcentreerde EV-oogsten mogelijk over weken of maanden, terwijl het gebruik van verminderd serum of chemisch gedefinieerde media mogelijk wordt. In een HFBR worden cellen vastgehouden in het kleine volume van de extra capillaire ruimte (ECS), gescheiden van het circulerende medium door een semi-permeabel holle vezelmembraan met een gedefinieerde molecuulgewichtsafsnijding (MWCO) (Figuur 1). Kleine moleculen zoals glucose en lactaat kunnen gemakkelijk de vezels passeren, terwijl grotere elementen zoals antilichamen of extracellulaire blaasjes worden vastgehouden en geconcentreerd in het ECS, waar ze kunnen worden geoogst.

Drie fundamentele kenmerken onderscheiden holle vezelcelkweek van andere methoden: 1) de hoge oppervlakte-volumeverhouding (200 cm²/mL) maakt celdichtheden in vivo-achtige 1–2 × 10^{à 8}cellen per mL. 2) De cellen zijn gebonden aan een poreuze ondersteuning, niet aan een niet-poreuze plastic schaal. Celsplitsing is niet vereist³. De moleculaire gewichtsgrens (MWCO) van de vezel kan worden geregeld. Afgescheiden producten worden vastgehouden en geconcentreerd 10–100X in vergelijking met 2D-kolfcultuur binnen het ECS van de cartridge. Ook kunnen specifieke eiwitmatrices, zoals fibronectine of collageen, eenvoudig op het vezeloppervlak worden aangebracht zonder flux over de vezels te beïnvloeden.

HFBR biedt een 3D-perfusie-gebaseerde kweekomgeving die meer in vivo-achtig is dan 2D-kweek⁶ en vermindert op unieke wijze de afhankelijkheid van cellen van serumondersteuning en vereenvoudigt hun mediumbehoefte. Deze kweekomgeving met hoge dichtheid kan verschillen in eiwitverwerking ondersteunen ten opzichte van 2D-kweek, samen met gerapporteerde verhoogde EV-bioactiviteit ^7,8,9. Holvezelbioreactoren zijn "histocentrisch"; Ze proberen de weefselachtige eigenschappen van in vivo celfysiologie¹⁰ na te bootsen. De twee belangrijkste kenmerken van een histocentrische bioreactor zijn 1) hoge celdichtheid, waardoor de cellen hun eigen specifieke microomgeving kunnen genereren, en 2) het splitsen of doorgeven van cellen is niet nodig, waardoor cel-tot-cel interacties en 3D-structuren zoals sferoïden zich organisch in de loop van de tijd kunnen ontwikkelen. Deze methode maakt celdichtheden mogelijk die moeilijk te bereiken zijn met conventionele 2D-kweeksystemen en kan het gebruik van vereenvoudigde, eiwitvrije en chemisch gedefinieerde media vergemakkelijken.

Elk celtype dat in kolven kan worden gekweekt, kan worden gekweekt in een holle vezelbioreactor. Getransformeerde cellijnen zullen^{proliferatief zijn}. De belangrijkste parameter om te monitoren is de glucoseopnamesnelheid. Glucosemonitoring biedt een directe maat voor metabole activiteit, waardoor de oogsttiming en de controle van celdichtheid¹² worden geoptimaliseerd. Het is belangrijk om de celmassa binnen de cartridge te beheersen zodat de glucoseopnamesnelheid de capaciteit van het systeem om zuurstof af te voeren en^CO2 te verwijderen niet overschrijdt. Dit gebeurt door simpelweg celmassa tijdens het oogsten te verwijderen. MSC's en HAFSC's vermenigvuldigen zich niet in de holvezelbioreactor, maar blijven rust. Deze cellen hebben expansie nodig voordat ze in de bioreactor worden geplant. Zodra de cultuur echter is gevestigd, kunnen EV's weken of maanden continu worden geoogst. Het MSC-fenotype verandert niet over 30 dagen kweek, behalve mogelijk bij CD105-expressie, die in deze periode afneemt. Wanneer MSC's uit de bioreactor vervolgens werden geplateerd in een kolf met serumhoudend medium, keerde de CD105-expressie terug naar het initiële niveau¹³. CD105-expressie kan dienen als marker voor 2D-vs. 3D cultuur. Transiënte transfectietechnieken kunnen ook worden gebruikt om een quasi-stabiele transfectant¹⁴ te maken.

Voorbeelden van de meer in-vivo celkweekcondities en voordelen van 3D hollow fiber celkweek zijn volledige en uniforme posttranslationele modificaties over tijd^15,16, vorming van villi door gastrisch epitheel voor cryptosporidiumcultuur¹⁷, 3D lever¹⁸, 3D bloed-hersenbarrière model¹⁹, plasmodium sporozoïet vorming²⁰ en beenmerg/stamcel co-cultivatie²¹.

In HFBR zijn EV's sterk geconcentreerd, met verminderde besmetting door intracellulaire eiwitten en membraanfragmenten, omdat cellyse beperkt is. Holle vezelbioreactoren zijn compatibel met elk medium, mits er geen hoog-moleculaire componenten zijn die niet de vezels kruisen. Indien nodig kunnen deze grote moleculen direct aan het ECS van de bioreactor worden toegevoegd. Een medium met een hoog glucosegehalte, zoals DMEM, heeft de voorkeur. Minder complexe, eiwitvrije celkweekmedia kunnen de zuivering vereenvoudigen door de eiwitbelasting te verminderen. Mesenchymale stamcellen en menselijke vruchtwaterstamcellen zijn gekweekt in standaard basale media en FBS, evenals in verschillende commercieel verkrijgbare MSC-mediaformuleringen. HFBR kan gram hoeveelheden exosomen produceren met kant-en-klare patronen. Een holvezelbioreactor is een nuttige methode voor de grootschalige productie van exosomen onder potentiële cGMP-omstandigheden en vertegenwoordigt een paradigmaverschuiving in de vooruitgang van zowel exosoomonderzoek als klinische vertaling.

Het succesvolle gebruik van een holvezelbioreactor voor de productie van extracellulaire vesikels is zeer protocolspecifiek. Manipulatie van de bioreactor, celzaaidichtheid, oogstfrequentie en het gebruikte medium kunnen allemaal bijdragen aan een succesvolle bioreactor. Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde methode om een holvezelbioreactor te gebruiken om extracellulaire vesikels te produceren en te verzamelen uit hoogdichte celculturen. Het doel is om een reproduceerbare aanpak te bieden voor EV-oogst, inclusief begeleiding bij systeemopstelling, celinenting, kweekonderhoud en oogstprocedures. De methode is bedoeld om consistente EV-productie voor onderzoeksdoeleinden te ondersteunen en een kader te bieden dat kan worden aangepast aan verschillende celtypen en experimentele doelstellingen.

Protocol

Alle procedures voldoen aan de standaard richtlijnen van Good Laboratory Practice (GLP) en Good Cell and Tissue Culture Practice.

OPMERKING: De cartridge is vooraf gemonteerd en gamma-gesteriliseerd. Het is dubbel verpakt en er zitten smeerdoppen op elke aansluiting, waardoor het volledig afgesloten is en buiten de zakken steriel blijft. Zie Figuur 2 voor de identificatie van cartridgepoorten. Alle stappen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur in een laminaire stroomkap.

1. Voorbereiding en sterilisatie van de reservoirkap.

1. Verwijder de twee korte stukken slangen uit de dubbel verpakte patroon.
2. Bevestig de buis aan de slangbarbs op de roestvrijstalen buis van de reservoirdop.
3. Wikkel de korte buis en de blootgestelde uiteinden van de roestvrijstalen buis in aluminiumfolie om de steriliteit na het autoclaveren te behouden. Doe de samengestelde onderdelen in een autoclavezak.
4. Autoclaaf gebruikt een droogcyclus bij 121 °C gedurende 15–30 minuten. Laat de dop afkoelen tot kamertemperatuur voordat je het gebruikt.

2. Bevestig de holle vezelpatroon aan de reservoirfles

1. Overbreng 50 ml PBS uit een 1 L fles naar een 50 ml conische buis voor later gebruik.
2. Verwijder de reservoirdop van de autoclavezak en verwijder beschermende folie van de lange stalen buizen.
3. Haal de dop van de PBS-fles en schroef de reservoirdop op zijn plaats. Haal de cartridge uit de binnenste steriele zak.
4. Verwijder de aluminiumfolie van een van de stukken buis bovenop de reservoirdop.
5. Verwijder de smeerdop van een van de lange stukken patroonbuis en bevestig deze aan de reservoirbuis op de reservoirdop. Gebruik een beetje backspin om knikken te voorkomen.
6. Herhaal dit voor de tweede buisverbinding.
7. Knijp voorzichtig in de bruine pompslang om PBS door het systeem te sturen totdat alle luchtbellen zijn verwijderd.

3. Het vullen van de extra capillaire ruimte (ECS)

1. Trek 20 mL PBS in een steriele spuit met een grote naald van minstens 3,5 cm lang; Een stompe naald heeft de voorkeur voor de veiligheid.
2. Desinfecteer beide smeerkoppelingen aan de zijpoort met alcohol en laat ze drogen.
3. Bevestig de met PBS gevulde spuit aan één zijpoort en een lege steriele spuit aan de tegenovergestelde poort. Sluit beide eindpoorten en open beide zijpoorten.
4. Injecteer langzaam PBS in het ECS terwijl je de cartridge onder een lichte hoek houdt om luchtbellen te minimaliseren. De lege spuit aan de tegenoverliggende poort vult zich met lucht.
5. Als er lucht aanwezig is in de ECS, open dan de rechter eindpoort en trek de vloeistof in de lege spuit totdat de ECS gevuld is met vloeistof (dit trekt PBS uit de reservoirfles, door de vezels en in de ECS).
6. Sluit beide schuifklemmen aan de zijpoort, open beide schuifklemmen aan de eindpoort en controleer de stroming door de pompbuis voorzichtig met je vingers samen te drukken.
7. Laat de lege spuiten aan de zijpoorten als doppen dienen. Vervang de spuiten elke keer dat ze uit de laminaire flow hood zijn gekomen door nieuwe.

4. Coatings van vezels en celinoculatie

OPMERKING: De procedures voor het coaten van vezels met een specifiek matrixeiwit en voor het inoculeren van cellen zijn in wezen hetzelfde. Overtollige vloeistof zal door de vezels stromen en het reservoir binnenkomen, terwijl de cellen of het coatingmateriaal aan de buitenkant van de vezels in de ECS blijven. 1 × 10 à⁸ cellen voor zaaien worden aanbevolen. 100–500 μg matrixeiwit in 20 mL PBS wordt aanbevolen voor de 4.000^cm2 HFBR. Matrixeiwitten die aan vezeloppervlakken zijn gebonden, beïnvloeden MWCO niet

1. Bereid coatingoplossing of celsuspensie voor in een steriele 50 mL conische buis. 1 x 108 cellen in geconditioneerd medium uit expansie van de kolf of 100–500 ug matrixeiwit in PBS. Volume 20 mL.
2. Haal 20 mL cellen of coatingoplossing uit een steriele spuit met een grote naald.
3. Bevestig de spuit met de oplossing aan één zijpoort en een lege steriele spuit aan de andere zijpoort.
4. Sluit beide eindpoorten en open beide zijpoorten.
5. Meng de oplossing voorzichtig door vloeistof tussen de twee spuiten te verplaatsen. Laat de helft van de oplossing in elke spuit zitten. Sluit beide zijpoorten.
6. Open de rechter eindopening en draai de reservoirdop 1/4 keer los.
7. Injecteer de oplossing uit één spuit in het ECS. Sluit de aangesloten zijpoort.
8. Injecteer de oplossing uit de andere spuit. Sluit de aangesloten zijpoort. Open beide eindpoorten.
9. Als je cellen inoculeert, laat je de cartridge 30 minuten horizontaal staan bij kamertemperatuur, draai dan 180° rond de lange as en laat het nog eens 30 minuten staan.
   1. Als je de vezels bedekt met matrixeiwit, laat ze dan een nacht op kamertemperatuur staan.
10. Plaats de cartridge in het Duet-pompsysteem en start de doorstroming op 25.

5. Voorbereiding op oogst (zie Figuur 2)

1. Bevestig een lege steriele spuit met een 3-weg stopkraan en een steriel filter aan de rechter zijpoort.
2. Stel de 3-weg stopkraan in om ventilatie door het steriele filter mogelijk te maken. Bevestig een tweede lege steriele spuit aan de linker poort.

6. Verzameling van geconditioneerd medium (oogst)

1. Open de poort aan de rechterkant en houd de steriele ventilatie door het filter in stand.
2. Kantel het rechteruiteinde van de patroon omhoog en haal het geconditioneerde medium (product) uit de linker spuit. Laat de inhoud van de ECS volledig aflopen in de linker spuit.
3. Sluit de poort aan de rechterkant. Sluit de linker poort, verwijder de spuit en verzamel de oogst in een 50 mL kegelvormige buis.
4. Vervang de spuit in de linker poort. Open de linker poort. Open de poort aan het rechter eind.
   Schroef de reservoirdop 1/4 keer los.
5. Kantel het linkeruiteinde van de cartridge omhoog en vul de ECS door de spuit die aan de linkerkant is verbonden te trekken. Vul de ECS volledig totdat de vloeibare meniscus in het midden van de zijpoortbuis staat.
6. Sluit de rechter eindpoort. Open de poort aan de rechterkant en stel de 3-weg stopkraan in om door het filter te ventileren.
7. Open de linker poort. Kantel de cartridge naar rechts en laat de ECS volledig in de linker spuit lopen.
8. Sluit de linker poort. Verwijder de spuit en verzamel het geoogste ECS in de 50 mL conische buis.
9. Plaats de spuit terug in de linker poort. Sluit de poort aan de rechterkant. Open de poort aan de rechterkant
10. Kantel de linkerkant van de patroon omhoog en vul de ECS door de linker spuit terug te trekken. Vul de ECS volledig totdat de vloeibare meniscus in het midden van de zijpoortbuis staat.
11. Sluit de linker poort. Open de linker uiteindpoort. Draai de reservoirdop vast.
12. Bevestig de systeemstroom door handmatig de pompbuis samen te drukken voordat je de cartridge terugbrengt naar de Duet-pomp.

7. Plaats de bioreactor in het pompsysteem.

1. Stel de pompdebiet in op een stand van 25 in de regelbox. De cartridge is makkelijker te installeren terwijl de pomp draait.
2. Pak de rechterrand van de standaard van het stroompad. Schuif de pompslanging in de pompslang.
3. Schuif de basis van het stroompad in de gleuf op de pompbasis. Zorg ervoor dat het rechthoekige register in de uitsparing op de stromingspadstandaard klikt.
4. Plaats de reservoirfles in de indruk aan de zijkant van de pompvoet.
5. Het dunne snoer voor stroom past tussen de pakking van de broedmachine. De besturingskast heeft een magneet om het aan de zijkant van de broedmachine te bevestigen.

8. Controleer de glucosespiegels

1. Met een 1 mL pipet haal je een 1 mL monster van medium uit de reservoirfles.
2. Meet de glucoseconcentratie met een compatibele glucosemeter door een kleine druppel bemonsterd medium op de teststrip van de meter te plaatsen.

9. Berekening van de glucoseopnamesnelheid

OPMERKING: De opnamesnelheid van glucose wordt berekend door de glucosemeting 24 uur later af te trekken van de oorspronkelijke glucosemeting. Aangezien de snelheid afhangt van het reservoirvolume, vermenigvuldig je de daling van de glucoseconcentratie met het reservoirvolume in liters. Als er bijvoorbeeld 250 mL in de reservoirfles zit, vermenigvuldig je met 0,25 (25%). (Glucose1-Glucose2) X (reservoirfles in liters). 250 mL is 0,25 L. Als er meer dan één dag is verstreken, deel dit dan door het aantal dagen. Bijvoorbeeld: Beginnen met glucose 4,5 g/L; meten glucose 24 uur later: 2,7 g/L; reservoirfles: 250 mL. 4,5-2,7=1,8 g. 1,8X,25 (reservoirfles is 0,25 L), 0,45 g glucose verbruikt. De glucoseopname is 450 mg/dag.

10. Levensvatbaarheidscontrole

1. Verzamel een klein monster cellen met behulp van het oogstprotocol.
2. Plaatcellen in een T 25 kweekfles met vers medium dat 10% serum bevat. Beoordeel de hechting en levensvatbaarheid visueel.

11. Dagelijks onderhoud van de patroon en de eerste week van kweek.

OPMERKING: Tijdens de eerste week van kweek zullen proliferatieve cellen zich uitbreiden tot hun streefsnelheid van 1–2 gram glucose per dag.

1. Dag 0: Cellen inoculeren, de startconcentratie van de glucose bepalen uit de formulering van het medium. Startreservoirvolume: 125 mL.
2. Dag 1-2: Meet elke dag de glucose. Wanneer de startglucose voor 50% is uitgeput, vervang dan het 125 mL reservoir door 250 mL verse media en verlaag het serum tot 7,5%.
3. Dag 3-4: Glucose meten. Wanneer de startglucose voor 50% is uitgeput, vervang dan het 250 mL reservoir door 500 mL verse media en verlaag het serum tot 5%.
4. Dag 4-5: Meet de glucose. Wanneer de startglucose voor 50% is uitgeput, vervang dan 500 mL door 1L vers medium. Verlaag het serum tot 2,5% en schakel indien gewenst over op chemisch gedefinieerde media.
5. Dag 6+: Glucose meten, ECS oogsten. Controleer de celdichtheid door te oogsten om de glucoseopname tussen 1 en 2 gram per dag te houden.
6. Voor niet-proliferatieve cellen begin je met 125 mL in de reservoirfles en verander je het medium elke 3 dagen.
7. Bij een significante glucoseconsumptie verhoog je het reservoir tot 250 mL. Verwijder het serum uit de ECS op dag 3-4 en vervang het door basaal medium.

Resultaten

Volgens dit protocol verbruikt een 4.000 cm^2-cartridge met proliferaterende cellijnen doorgaans 1–2 g glucose per dag. Dit vertaalt zich in 1 L medium elke 2–3 dagen bij gebruik van een medium met veel glucose zoals DMEM. Cellen bereiken hun maximale dichtheid binnen een week na het zaaien. De oogst moet beginnen na 5–7 dagen of wanneer de glucoseopname 1 g per dag bereikt en dan, indien mogelijk, elke dag worden uitgevoerd. Tijdens deze eerste week van kweek kan het serumhoudende medium in het ECS worden vervangen door serumvrij basaal medium, terwijl het serum in het circulerende medium blijft, indien nodig is. Zodra de glucoseopname 1 g per dag bereikt, kun je gemakkelijk overstappen op een laag serummedium of een ander chemisch gedefinieerd medium. MSC's en HAFSC's verbruiken glucose in een veel lager tempo dan getransformeerde cellijnen, zoals CHO, 293 of hybridomaen. De vorming van sferoïden is typisch voor MSC en HAFSC, samen met andere celtypen (Figuur 3). Dagelijkse glucosemonitoring biedt een betrouwbare maatstaf voor cultuurgezondheid en metabole activiteit. Standaard, commercieel verkrijgbare, xenovrije media zijn met succes gebruikt met MSC en HAFSC. De oogstvolumes bedragen ongeveer 20 mL. Intervallen van 24 uur tussen oogsten zijn optimaal omdat EV-concentraties na 24 uur een maximum bereiken (Figuur 4). Typische exosoomconcentraties in geoogst medium variëren van 1–5 × 10¹² deeltjes/mL, afhankelijk van celtype, celzaadaantallen en andere factoren, en kunnen na centrifugatie zichtbare pellets veroorzaken (Figuur 5). Grote aantallen cellen kunnen worden gezaaid en moeten gebaseerd zijn op het aantal cellen, niet op kweekoppervlak (Figuur 6).

De resultaten tonen aan dat EV-productie correleert met metabole activiteit gemeten aan de glucoseconsumptie, wat een praktische parameter biedt voor het monitoren en optimaliseren van kweekprestaties. Dagelijkse oogst met intervallen van 24 uur maximaliseert de EV-concentratie terwijl de cultuurstabiliteit behouden blijft. Deze bevindingen ondersteunen het gebruik van glucosemonitoring en gecontroleerde oogstfrequentie als belangrijke parameters voor reproduceerbare EV-productie in holle vezelbioreactoren.

Figuur 1: Dwarsdoorsnede van de holle vezelbioreactor. Medium stroomt door het binnenste van de vezels en de cellen hechten zich aan hun buitenkant. Componenten met een klein moleculair gewicht, zoals glucose en lactaat, kunnen gemakkelijk de vezels passeren. Afgescheiden producten, zoals EV's, kunnen de vezels niet kruisen en worden sterk geconcentreerd in het gebied buiten de vezels, het zogenaamde ECS (extracapillaire ruimte). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Foto van de cartridge met geïdentificeerde poorten en klemmen. Eenrichtingsterugslagkleppen op het stroompad genereren een circulatiestroom van medium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Mesenchymale stamcellen, stamcellen van het humaan vruchtwater, hartvoorlopers en enkele andere celtypen vormen sferoïden wanneer ze in voldoende aantallen in de cartridge worden geplaatst. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Meting van EV-concentraties na verschillende oogsten in verschillende tijdsintervallen. Na 24 uur bereikt de EV-concentratie een maximale concentratie. Optimale oogst is na 24 uur. (Data met dank aan Paolo Neviani, EV core, Children's Hospital of Los Angeles). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Een week oogst van EV's uit DIFI-cellen gekweekt in de C2011 holle vezelbioreactor. EV's geïsoleerd door differentiële centrifugatie. (gegevens met dank aan Jeff Franklin, Vanderbilt University)^18,19. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Een verrassend groot aantal cellen kan worden ingezaaid in de hole vezelbioreactor. MSC's nemen veel ruimte in in 2D-cultuur; wanneer ze als sferoïden worden gekweekt in 3D-cultuur, nemen ze minder ruimte in. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Holle vezelbioreactoren zijn niet in staat om eiwitten of antilichamen redelijkerwijs in echte commerciële hoeveelheden te produceren. Ze hebben echter een unieke capaciteit om relatief grote aantallen cellen met hoge dichtheid te kweken en een geconcentreerd EV-product op klinisch relevante schaal af te scheiden. Pas in de afgelopen jaren zijn de werkelijke voordelen van een histocentrische bioreactor erkend. De hoogdichtheidsperfusiecultuurcondities resulteren in geconcentreerde EV's, met behulp van cGMP-conform medium, in hoeveelheden die mogelijk geschikt zijn voor onderzoek en potentiële klinische toepassingen. Een enkele oogst van een 4.000 cm² kan 5 × 10¹² tot 1 × 10¹⁴ EV's bevatten in een volume van 10–20 mL. Deze opbrengsten vallen binnen het bereik dat in studies is gerapporteerd naar EV-dosering^{van 22}.

Dagelijkse monitoring van de glucoseopnamesnelheid is een belangrijke parameter voor het beoordelen van kweekprestaties en is een directe indicator van celmetabolisme, celaantal en gezondheid. Over het algemeen hebben ze de voorkeur aan media met een hogere glucose, zoals DMEM, dat een startglucoseconcentratie van 4,5 g/L heeft. Het medium moet worden vervangen door vers medium wanneer de glucose voor 50% is verbruikt. Bepaalde cellen, zoals MSC's, lijken glucose te consumeren en lactaat te produceren bij glucoseconcentraties boven 3 g/L, waarna ze overschakelen op het consumeren van glutamine en ammoniak produceren bij concentraties onder 3 g/L. Volledige metabole profilering van MSC's in 3D-cultuur is nog niet uitgevoerd.

De meest kritieke parameter voor een succesvolle bioreactorkweek is het celinoculatiegetal. Een minimum aantal inoculatiecellen voor een bioreactor van 4.000 cm²C2011 is 1 × 108^cellen . Voor niet-proliferaterende cellen zoals MSC of HAFSC wordt een groter aantal geprefereerd, tot 1 × 10^{9 cellen} in totaal. Het reservoirvolume moet evenredig zijn met het aantal cellen in de cartridge. 1 × 10 à⁸ cellen moeten een reservoir gebruiken van maximaal 125 ml. 1 × 10^×9 cellen moeten een reservoir van maximaal 1 L hebben. Een te groot reservoir kan cellen in de lagfase sturen. Dit wordt gekenmerkt door geen glucose-opname door de cellen, hoewel ze levensvatbaar zijn zoals bepaald door Trypan Blue-kleuring. In dit geval verminder het reservoirvolume of zaad meer cellen. Meerdere celinoculaties kunnen nodig zijn om voldoende celaantallen te verkrijgen voor een effectieve bioreactorkweek. Zaad simpelweg meer cellen bovenop de cellen die al in de cartridge zitten. Let bij het evalueren van de bioreactorprestaties op de grootte van het celinoculum. Een tienvoudige toename van celzaaiing kan resulteren in een tienvoudige toename van EV-productie.

Wijzigingen aan het protocol kunnen veranderingen in de samenstellingen van media, oppervlaktecoatings, celnummers, oogstvolume, oogstfrequentie of spuitgrootte omvatten, afhankelijk van het celtype en de gewenste opbrengst. Continue cultuur maakt eenvoudige, realtime conditieoptimalisatie mogelijk, aangezien er tijdens de cultuur wijzigingen kunnen worden aangebracht en de resultaten in realtime^worden verkregen. Probleemoplossing moet zich richten op het behouden van steriliteit en het monitoren van de metabole activiteit. Zorg ervoor dat er geen blokkades of knikken in de buis zitten, vooral rond de schuifklemmen. Bacteriële besmetting leidt tot snelle glucoseconsumptie en troebel in de reservoirfles. Schimmelbesmetting wordt aangegeven door een luchtige witte ophoping aan de linkerkant van de cartridge, die de doorstroming blokkeert. Het gebruik van het holvezelbioreactorsysteem vereist vakkundig omgaan en strikte naleving van protocollen. Belangrijke stappen zijn het zaaien van het juiste aantal cellen, het behouden van de steriliteit tijdens de oogst en het zorgvuldig monitoren van de glucoseconsumptie om overgroei of uitputting van voedingsstoffen te voorkomen. De meeste cellen hechten zich aan de vezels, soms afhankelijk van de met fibronectine gecoate eiwitmatrix, die snelle celhechting mogelijk maakt. Sommige cellen, zoals MSC's, HAFSC's en cardiale voorlopers, blijven aan vezels gehecht en vormen 3D-sferoïden.

Het HFBR-systeem ondersteunt hoogdichte, chemisch gedefinieerde en xenovrije culturen van de meeste celtypen, waardoor grootschalige EV-productie^{mogelijk wordt 23}. Dagelijkse glucosemonitoring biedt een betrouwbare maatstaf voor de prestaties van de bioreactor. Het gesloten, perfusie-gebaseerde systeem is compatibel met cGMP-standaarden, en opschaling is mogelijk met grotere cartridges of zelfs meerdere cartridges. Productie van EV's op gramschaal kan mogelijk zijn onder geoptimaliseerde omstandigheden. De holle vezelbioreactor biedt een reproduceerbaar platform voor duurzame EV-productie en -verzameling onder gecontroleerde omstandigheden. Het hier beschreven protocol legt de nadruk op praktische overwegingen, waaronder systeemopstelling, aseptische behandeling en metabole monitoring, om consistente werking en betrouwbare resultaten te ondersteunen. Verdere studies kunnen nodig zijn om EV-eigenschappen en functionele eigenschappen onder verschillende kweekomstandigheden te evalueren en om prestaties te vergelijken met alternatieve productiesystemen.

Deze methode is breed toepasbaar voor onderzoek en klinische EV-productie, inclusief regeneratieve geneeskunde en therapeutische toepassingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
16 gauge 1.5" naald	Stellar Scientific	SOLM-111615
3-weg stopcock, steriele	Cole-Parmer	UX-48523-28
20mL luer lock spuit	Becton Dickenson	302830
25mL serologische pipet, steriele	Stellar Scientific	TC50-TAU-25
25mm spuitfilter, steriele	Thomas Scientific	1162B74
38 mm reservoirdop	FiberCell Systems	A1006
50 mL conische centrifugebuizen	Stellar Scientific	T50-101-PK
500 mL Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D8537-500ML
CVS Steriele Alcohol Prep Pads, 480 STK	CVS Pharmacy	Artikelnr. 376560
Hollow fiber bioreactor	FiberCell Systems	C2011
Human Fibronectin, 1 mg	Corning	354008