Deze studie onderzocht of acupotomie kraakbeenvitalliteit bevordert in een konijnenmodel van knieartrose. Vijftig konijnen werden verdeeld over vijf groepen. Acupotomie werd gedurende 4 weken wekelijks toegediend. Gewrichtszwelling, histopathologie, inflammatoire cytokines en markers gerelateerd aan de circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK-as werden beoordeeld om het onderliggende mechanisme te verkennen.
Onderzoeksartikel
Acupotomie reguleert de RIC8A/P38 MAPK-as op basis van het circRNA-steigercomplex om kraakbeenherstel bij knieartrose te bevorderen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Knieartrose (KOA) wordt gekenmerkt door progressieve kraakbeendegeneratie en ontsteking. Deze studie onderzocht de therapeutische effecten van acupotomie in een konijnmodel van KOA en de associatie hiervan met de signaleringsas van circulair RNA fosfodiësterase 4B (circPDE4B)/resistance to inhibitors of cholinesterase 8A (RIC8A)/p38 mitogeen-geactiveerd proteïnekinase (MAPK). Vijftig Nieuw-Zeelandse witte konijnen werden willekeurig toegewezen aan vijf groepen (n = 10 per groep): controle, KOA-model, celecoxib, acupotomie en schijn-acupotomie. KOA werd geïnduceerd met de gemodificeerde Videman-methode. Beginnings 6 weken na de modellering werd acupotomie één keer per week gedurende 4 weken toegediend, terwijl celecoxib gedurende 4 weken dagelijks via sondevoeding in een dosis van 24 mg/kg werd toegediend. Kniezwelling en kraakbeenhistopathologie werden geëvalueerd. Gehaltes van interleukine-1β (IL-1β), tumornecrosefactor-α (TNF-α) en interleukine-6 (IL-6) in homogenaten van kraakbeenweefsel werden gemeten met een enzyme-linked immunosorbent assay. Gen- en eiwitexpressie geassocieerd met het kraakbeenmetabolisme en de circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK-as werden beoordeeld via kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie en Western blotting. In vergelijking met de KOA-modelgroep verminderde acupotomie de kniezwelling, verbeterde de histopathologische scores, verlaagde de gehaltes van inflammatoire cytokinen, downreguleerde matrixmetalloproteïnase-3 (MMP-3), matrixmetalloproteïnase-13 (MMP-13), RIC8A en gefosforyleerd p38 MAPK, en upreguleerde SRY-box transcriptiefactor 9 (SOX9), aggrecaan en relatief circPDE4B. De effecten waren vergelijkbaar met die van celecoxib, terwijl schijn-acupotomie geen significante verbetering teweegbracht. Deze bevindingen wijzen erop dat acupotomie ontsteking en kraakbeendegeneratie bij konijn-KOA verlicht en geassocieerd is met modulatie van de circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK-as.
Inleiding
Knieartrose (KOA) is een veelvoorkomende degeneratieve gewrichtsaandoening die wordt gekenmerkt door progressieve kraakbeendegradatie, synoviale ontsteking, subchondrale botsclerose en osteofytvorming1,2,3. Door de wereldwijde vergrijzing stijgt de incidentie van KOA voortdurend, waardoor het een belangrijke oorzaak is van gewrichtsdisfunctie en chronische pijn bij mensen van middelbare leeftijd en ouderen wereldwijd4,5,6. Huidige klinische behandelingen richten zich primair op symptomatische verlichting via farmacologische middelen, zoals niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) en intra-articulaire corticosteroïdinjecties. Echter, ziekte-modificerende therapieën die in staat zijn om de progressie van de ziekte te stoppen of kraakbeenherstel te bevorderen, blijven beperkt7,8.
Opkomend bewijs heeft de belangrijke regulerende rollen van niet-coderende RNA's (ncRNA's) bij de pathogenese en progressie van KOA benadrukt9,10,11. Onder deze ncRNA's hebben circulaire RNA's (circRNA's) toenemende aandacht gekregen vanwege hun unieke covalent gesloten lusstructuur, die een grotere stabiliteit biedt dan lineaire RNA's, en hun diverse biologische functies12,13. Shen et al. rapporteerden dat circPDE4B fungeert als een moleculaire steiger die de resistentie tegen remmers van de resistance to cholinesterase 8A (RIC8A)/p38 mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) signaleringsroute reguleert, waardoor het metabolisme van de extracellulaire matrix van chondrocyten en ontstekingsreacties worden beïnvloed14. De RIC8A/p38 MAPK-route speelt een belangrijke rol bij de regulatie van ontsteking, katabolisme, apoptose en senescentie in chondrocyten, welke allen bijdragen aan de pathogenese van artrose15.
Acupotomie is een minimaal invasieve therapeutische benadering die de theorie van de traditionele Chinese geneeskunde integreert met moderne anatomische principes en een veelbelovende effectiviteit heeft getoond bij het klinische beheer van KOA16,17. Deze techniek maakt gebruik van een gespecialiseerd naaldmesinstrument om adhesies in zacht weefsel los te maken, de lokale circulatie te verbeteren en de biomechanische balans rondom de aangedane gewrichten te herstellen, waardoor pijn wordt verlicht en de functie bij patiënten met KOA verbetert18. Ondanks deze gerapporteerde klinische voordelen blijven de moleculaire mechanismen ten grondslag aan de therapeutische effecten van acupotomie, in het bijzonder de potentiële regulatie van circRNA-gemedieerde signaleringspaden die betrokken zijn bij kraakbeenherstel, grotendeels onverkend.
Mechanistisch gezien genereert acupotomie lokale mechanische stimuli via het losmaken van periarticulair zacht weefsel. Chondrocyten zijn mechanosensitieve cellen die reageren op biomechanische signalen, en circRNA's zijn aangetoond in de mechanotransductie-responsen van chondrocyten19,20. Hoewel direct bewijs dat acupotomie koppelt aan de regulatie van gewrichtskraakbeenspecifieke circRNA's ontbreekt, is het biologisch plausibel dat mechanische signalen gegenereerd door acupotomie mechanosensitieve circRNA's zoals circPDE4B kunnen moduleren. Deze mogelijkheid vormde de basis voor het huidige onderzoek.
Voortbouwend op eerdere bevindingen over de regulerende rol van circPDE4B in de RIC8A/p38 MAPK-signaleringsas, maakte de huidige studie gebruik van een konijnenmodel van KOA, geïnduceerd door de gemodificeerde Videman-methode, om de hypothese te testen dat acupotomie kraakbeenherstel bevordert door de circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK-signaleringsroute te moduleren. Acupotomie werd voor deze studie verkozen boven andere KOA-interventies om verschillende redenen. Ten eerste biedt acupotomie, in vergelijking met farmacologische middelen zoals nietsteroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) en celecoxib, die primair symptomatische verlichting bieden en worden geassocieerd met beperkte ziekte-modificerende effecten en potentiële langetermijnbijwerkingen7,8, een niet-farmacologische benadering die zowel lokale mechanische factoren als biologische signaleringsroutes aanpakt. Ten tweede richt acupotomie zich, in tegenstelling tot intra-articulaire corticosteroïde- of hyaluronzuurinjecties, die herhaalde intra-articulaire toediening vereisen en risico's op infectie en gewrichtsschade met zich meebrengen, op periarticulaire weke delen en kan langdurige biomechanische en biochemische effecten uitoefenen21. Ten derde heeft klinisch bewijs aangetoond dat acupotomie vergelijkbare of superieure resultaten behaalt dan conventionele therapieën bij het verminderen van pijn en het verbeteren van de gewrichtsfunctie bij patiënten met KOA, en hebben experimentele studies gesuggereerd dat acupotomie ontstekingsreacties en het metabolisme van chondrocyten moduleert21,22. Echter, de specifieke moleculaire routes waarlangs acupotomie zijn chondroprotectieve effecten uitoefent, blijven slecht gekarakteriseerd, met name met betrekking tot circRNA-gemedieerde signalering. Daarom kan het onderzoeken van de associatie tussen acupotomie en de circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK-as nieuwe mechanistische inzichten bieden en het gebruik van acupotomie ondersteunen als een ziekte-modificerende interventie voor KOA16,18. De primaire eindpunten waren zwelling van het kniegewricht, histopathologische kraakbeendegeneratie (Mankin- en Moran-scores), spiegellniveaus van inflammatoire cytokinen (interleukine-1β, tumornecrosefactor-α en interleukine-6), expressie van markers gerelateerd aan het kraakbeenmetabolisme (matrixmetalloproteïnase-3, matrixmetalloproteïnase-13, SRY-box transcriptiefactor 9 en aggrecaan), en expressie van circPDE4B en RIC8A, alsook fosforylering van p38 MAPK. Acupotomie werd gedurende 4 weken één keer per week toegediend op geselecteerde periarticulaire punten met behulp van de vierstappentechniek (longitudinale release, transversale separatie en incisie van noduli). Histopathologische evaluatie, meting van inflammatoire cytokinen en analyses van gen- en eiwitexpressie werden gebruikt om de effecten van acupotomie te karakteriseren en de potentiële moleculaire basis ervan bij KOA te onderzoeken.
Protocol
Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren en werden goedgekeurd door het Dierenethische Comité van de Anhui University of Chinese Medicine (goedkeuringsnummer AHUCM-rabbits-2023195). De reagentia, chemicaliën, software en instrumenten die in dit protocol worden gebruikt, zijn opgenomen in de Tabel met Materialen.
1. Experimentele dieren en groepering
Vijftig gezonde volwassen mannelijke Nieuw-Zeelandse Witte konijnen (6 maanden oud, wegend 2,0–2,5 kg) werden verkregen van de Nanjing Pukou District Laifu Breeding Farm (Animal Production License No.: SCXK (Su) 2024-0007). Alle dieren ondergingen een acclimatiseringsperiode van 1 week met voer voorafgaand aan het experiment. De rechterknie werd aangewezen voor de beoordeling van de zwelling en de linkerknie voor de collectie van kraakbeenweefsel als een consistente procedurele conventie, in plaats van gebaseerd op een specifieke experimentele hypothese. Na de acclimatisering werden de konijnen willekeurig toegewezen aan vijf groepen (n = 10 per groep): een controlegroep, die geen modelprocedure of behandeling onderging; een KOA-modelgroep, waarbij KOA werd geïnduceerd met de gemodificeerde Videman-methode; een celecoxib-groep, waarbij de medicamenteuze behandeling 6 weken na modellering werd gestart; een acupotomiegroep, waarbij de acupotomiebehandeling 6 weken na modellering werd gestart; en een sham-acupotomiegroep, waarbij naaldinsertie zonder snijden of losmaken 6 weken na modellering werd gestart.
2. Vestiging van het KOA-model
Alle konijnen, behalve die in de controlegroep, ondergingen de gemodificeerde Videman-procedure om KOA te induceren. De dieren werden 12 h vóór de operatie vastgehouden. Anesthesie werd geïnduceerd door intraveneuze toediening van 3% pentobarbitalnatrium in een dosis van 30 mg/kg via de marginale oorader. Na routinematige voorbereiding van de operatielocatie, desinfectie en steriel afdekken, werd een longitudinale incisie gemaakt langs de mediale zijde van het kniegewricht. Het mediale collateraal ligament en het voorste kruisband werden opeenvolgend doorgesneden en de mediale meniscus werd volledig verwijderd. De incisie werd vervolgens in lagen gesloten.
Om het risico op postoperatieve infectie te verminderen, werd penicilline intramusculair toegediend in een dosis van 40.000 U/kg/dag gedurende 3 opeenvolgende dagen. Na de operatie werden de konijnen teruggeplaatst in hun kooien en kregen zij onbeperkte bewegingsvrijheid zonder immobilisatie van het gewricht.
3. Sham acupotomiebehandeling
Zes weken na de KOA-modellering ondergingen de konijnen in de sham-acupotomiegroep dezelfde palpatie- en puntmarkeerprocedures als bij de actieve acupotomiebehandeling. Een steriele wegwerp-acupotomienaald van 0,35 mm × 25 mm werd loodrecht door de huid ingebracht op elk gemarkeerd punt tot het subcutane weefsel was bereikt. Er werd geen snijden, losmaken, transversale manipulatie of andere mechanische release-manoeuvre uitgevoerd. De naald werd onmiddellijk na inbrengen teruggetrokken zonder weefselmanipulatie. De sham-behandeling werd één keer per week gedurende 4 opeenvolgende weken toegediend.
4. Acupotomiebehandeling
Zes weken na de KOA-modellering werden de konijnen in de acupotomiegroep gefixeerd op een behandeltafel. De periarticulaire weefsels rondom de aangetaste knie werden gepalpeerd, in het bijzonder rond de patella en de mediale en laterale gewrichtsspleten, om koordachtige structuren of harde knopen te identificeren. Op basis van de palpatiebevindingen werden vier tot zes behandelpunten geselecteerd en op de huid gemarkeerd.
Het behandelingsgebied werd geschoren en gedesinfecteerd volgens routinematige steriele procedures. Een steriele wegwerpacupotomienaald van 0,35 mm × 25 mm werd langzaam en loodrecht ingebracht op elk gemarkeerd punt totdat het botoppervlak was bereikt. De procedure werd uitgevoerd volgens de acupotomietechniek in vier stappen. Eerst werd een longitudinale release uitgevoerd, gevolgd door een transversale separatie. Wanneer een harde nodule werd aangetroffen, werd deze ingesneden tot er een duidelijk gevoel van release via de naald-mes werd waargenomen. Na de procedure werd de naald teruggetrokken en werd elke insteekplaats kort samengedrukt met steriel gaas en afgedekt met een adhesieve pleister. De behandeling werd éénmaal per week toegediend gedurende 4 opeenvolgende weken.
5. Medicamenteuze behandeling
Zes weken na de KOA-modellering kregen konijnen in de celecoxib-groep dagelijks één keer 24 mg/kg celecoxib-suspensie via orale gavage gedurende 4 opeenvolgende weken. De suspensie werd elke dag vers bereid in fysiologische zoutoplossing. Leverancier en catalogusinformatie zijn opgenomen in de Tabel met Materialen.
6. Beoordeling van kniegewrichtzwelling
Aan het einde van de interventieperiode, 10 weken na de KOA-modellering, werd de zwelling van het kniegewricht beoordeeld. Een zachte zijden draad werd gewikkeld rond het meest gezwollen gebied van het rechter kniegewricht, doorgaans ter hoogte van het tibiaplateau. De draad werd verwijderd en met een liniaal tot op de dichtstbijzijnde millimeter gemeten, waarbij de geregistreerde lengte werd gedefinieerd als de knieomtrek.
De relatieve zwelingsratio werd berekend met behulp van de volgende vergelijking:
7. Monsterneming
Aan het einde van de interventieperiode werden de konijnen gebenestheed door intraveneuze toediening van 3% pentobarbitalnatrium in een dosis van 30 mg/kg via de marginale oorvin. Het linkerkniegewricht werd geopend met een scalpelmes nr. 23 om de gewrichtsvlakken van het tibiale plateau en de femorale condylen bloot te leggen. Gewrichtskraakbeenweefsel werd uit deze regio's verzameld.
Elk kraakbeenmonster werd in twee delen gesplitst. Eén deel werd gefixeerd in 4% paraformaldehyde voor histopathologisch onderzoek. Het tweede deel werd in cryogene buisjes geplaatst, snel ingevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij −80 °C tot de moleculaire analyses werden uitgevoerd. Direct na voltooiing van alle weefselafnameprocedures werden de konijnen geëuthanaseerd door middel van een luchtembolie via een snelle intraveneuze injectie van lucht in de marginale oorader.
Histologische kleuring en Mankin- en Moran-scoring werden uitgevoerd met kraakbeenmonsters van alle 10 konijnen per groep (n = 10). Representatieve hematoxyline- en eosine- en Safranin O–Fast Green-afbeeldingen werden geselecteerd van drie willekeurig gekozen konijnen per groep. Immunohistochemie en Western blotting werden uitgevoerd met monsters van drie willekeurig gekozen konijnen per groep (n = 3). Kwantitatieve reverse transcription polymerase chain reaction en enzyme-linked immunosorbent assay werden uitgevoerd met monsters van zes willekeurig gekozen konijnen per groep (n = 6). Alle selecties van subgroepen werden willekeurig uitgevoerd zonder voorafgaande kennis van de groepsindelingen.
8. Hematoxyline en eosine-kleuring
Kraakbeenweefsel gefixeerd in 4% paraformaldehyde werd gedecalcificeerd in een 10% ethylendiaminetetra-azijnzuur (EDTA)-oplossing bij pH 7.4 gedurende 4–6 weken. De decalcificatie-oplossing werd elke 3 dagen vervangen. Nadat de decalcificatie was bevestigd door naaldpenetratie, werd het weefsel gedehydrateerd via een oplopende ethanolserie van 70%, 80%, 90%, 95% en 100%, ontkleurd in xyleen en ingebed in paraffine. Het ingebedde weefsel werd met een microtoom gesneden in coupes met een dikte van 5 µm, waarna de coupes op glasplaatjes werden gemonteerd.
Voor kleuring met hematoxyline en eosine werden de coupes 60 min verhit bij 60 °C, gedeparaffiniseerd in xyleen gedurende drie wissels van elk 5 min, en sequentieel gehydrateerd in 100%, 95%, 80% en 70% ethanol, gevolgd door gedestilleerd water. De coupes werden 5 min gekleurd met hematoxyline, 10 min afgespoeld onder stromend kraanwater, gedifferentieerd in 1% zoutzuur bereid in 70% ethanol gedurende 2–3 s, en afgespoeld met gedestilleerd water. De coupes werden vervolgens 2 min gekleurd met eosine, afgespoeld met gedestilleerd water, gedehydrateerd via 70%, 80%, 90%, 95% en 100% ethanol, geklaard in xyleen en gemonteerd met neutrale hars. De kraakbeenmorfologie werd onderzocht en representatieve beelden werden vastgelegd met een lichtmicroscoop.
9. Safranine O–Fast Green kleuring
In paraffine ingebedde kraakbeensecties werden gedeparaffineerd en rehydrateerd zoals beschreven in sectie 8. De secties werden 5 min gekleurd met Weigert ijzer-hematoxyleen en gespoeld met gedestilleerd water. De secties werden vervolgens 3 min gekleurd met een 0,05% Fast Green-oplossing, kortstondig gedurende 10–15 s gespoeld in 1% azijnzuur en 5 min gekleurd met een 0,1% Safranine O-oplossing.
Na de kleuring werden de coupes snel gedehydrateerd in 95% en 100% ethanol, ontkleurd in xyleen en ingebed in neutrale hars. De gekleurde coupes werden onderzocht met een lichtmicroscoop. De intensiteit van de Safranine O-kleuring, die het proteoglycaangehalte weerspiegelt, werd semikwantitatief geanalyseerd met behulp van beeldanalyse-software.
10. Histologische scoring
Twee pathologen, die niet op de hoogte waren van de toewijzing aan de experimentele groepen, evalueerden onafhankelijk de gekleurde coupes met behulp van de Mankin- en Moran-scoringssystemen om de mate van kraakbeendegeneratie te beoordelen. Voorafgaand aan de evaluatie kregen alle coupes willekeurige identificatiecodes toegewezen. De behandelingsallocaties werden pas aan de pathologen bekendgemaakt nadat alle scoring was voltooid23.
11. Enzyme-linked immunosorbent assay
Bevroren kraakbeenweefsel werd gewogen, gecombineerd met fosfaatgebufferde zoutoplossing bij pH 7.4 en grondig op ijs gehomogeniseerd. Het homogenaat werd gecentrifugeerd bij 3,000 × g gedurende 20 min bij 4 °C, waarna de supernatant werd verzameld voor analyse. De concentraties van interleukine-1β (IL-1β), tumornecrosefactor-α (TNF-α) en interleukine-6 (IL-6) in de supernatant van het weefsel werden gemeten met konijn-specifieke enzyme-linked immunosorbent assay-kits volgens de instructies van de fabrikant.
12. Kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit kraakbeenweefsel met behulp van een methode op basis van fenol-chloroform. Kort samengevat werd het weefsel gelyseerd in RNA-extractiereagens en werd chloroform toegevoegd om de waterige en organische fasen te scheiden. De waterige fase werd verzameld en het RNA werd geprecipiteerd met isopropanol, gewassen met 75% ethanol, aan de lucht gedroogd en opgelost in water behandeld met diethylpyrocarbonaat. De RNA-concentratie en -zuiverheid werden gemeten met een spectrofotometer.
Voorafgaand aan de reverse transcriptie werd resident genomisch DNA verwijderd met behulp van een reagens voor de eliminatie van genomisch DNA. Complementair DNA werd vervolgens gesynthetiseerd met een reverse transcriptiekit volgens de instructies van de fabrikant. Kwantitatieve polymerasekettingreactie werd uitgevoerd met een SYBR Green-gebaseerde detectiemethode op een real-time polymerasekettingreactiesysteem. De cycluscondities waren als volgt: initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 1 min, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 20 s en annealing en extensie bij 60 °C gedurende 1 min. Een dissociatiecurve-analyse werd uitgevoerd om de amplificatiespecificiteit te beoordelen.
De expressieniveaus van matrixmetalloproteïnase-3 (MMP-3), matrixmetalloproteïnase-13 (MMP-13), SRY-box transcriptiefactor 9 (SOX9), aggrecaan, RIC8A en circPDE4B werden gemeten. β-actin werd gebruikt als intern referentiegen. De relatieve expressie werd berekend met de methode. De primersequenties zijn opgenomen in Tabel 1.
13. Western blot-analyse
Kraakbeenweefsel werd gelyseerd in radioimmunoprecipitatie-assaybuffer aangevuld met fenylmethylsulfonylfluoride. Het lysaat werd gecentrifugeerd bij 12,000 × g gedurende 15 min bij 4 °C, waarna het supernatant werd verzameld als de totale eiwitfractie. De eiwitconcentratie werd bepaald met een bicinchonininezuur-assay.
Gelijke hoeveelheden eiwit (30 µg per lane) werden gescheiden via 10% sodiumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese en overgebracht op polyvinylideenfluoridmembranen die vooraf waren geactiveerd in methanol. De transfer werd uitgevoerd bij 300 mA bij 4 °C. De transfertijden waren als volgt: aggrecan (250 kDa) gedurende 90 min; MMP-3 (60 kDa), RIC8A (59 kDa), SOX9 (56 kDa) en MMP-13 (52 kDa) gedurende 50 min; en p38 MAPK (41 kDa) en GAPDH (36 kDa) gedurende 40 min. De membranen werden geblokkeerd met 5% vetvrije melkpoeder in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 gedurende 2 u bij kamertemperatuur. De membranen werden vervolgens overnacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen MMP-3 (1:2.000), MMP-13 (1:1.000), SOX9 (1:1.000), aggrecan (1:1.000), RIC8A (1:1.500), gefosforyleerde p38 MAPK (1:1.000) en totale p38 MAPK (1:2.000). GAPDH (1:2.000) werd gebruikt als loading control. Na drie wasbeurten met Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20 (elk 10 min) werden de membranen 1,2 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met horseradishperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:20.000). Na drie aanvullende wasbeurten werden de eiwitbanden gevisualiseerd met behulp van een enhanced chemiluminescence-substraat en vastgelegd met een geldocumentatiesysteem. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ-software en genormaliseerd ten opzichte van GAPDH.
14. Immunohistochemie
Paraffine-ingebedde kraakbeensecties werden gedeparaffineerd en gehydrateerd via een gradiënt van ethanol (drie keer xyleen, telkens 5 min; gevolgd door 100%, 95% en 80% ethanol, telkens 3 min). Antigeen-retrieval werd uitgevoerd door de secties te verhitten in EDTA-buffer (pH 9,0) in een snelkookpan. De buffer werd tot kookpunt verhit en na het opbouwen van druk werd de retrieval 2 min voortgezet, gevolgd door afkoeling tot kamertemperatuur. Endogene peroxidaseactiviteit werd geblokkeerd met 3% waterstofperoxide gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Na het wassen werd aspecifieke binding geblokkeerd met geiten serum gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker.
De coupes werden 60 min bij 37 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen gefosforyleerd p38 MAPK (1:800) en gefosforyleerde nucleaire factor kappa B (NF-κB) (1:300). Na drie wasbeurten met fosfaatgebufferde zoutoplossing met Tween 20 werden de coupes 30 min bij 37 °C geïncubeerd met de overeenkomstige met mierikswortelperoxidase geconjugeerde secundaire antilichamen. Na drie aanvullende wasbeurten werd diaminobenzidine gebruikt voor de kleurontwikkeling (gecontroleerd onder een microscoop), gevolgd door tegenkleuring met hematoxyline (2 min), differentiatie in 1% zoutzuur in 70% ethanol en blauwen in een lithiumcarbonaatoplossing (30 s). De coupes werden vervolgens gedehydrateerd, geklaard, gemonteerd en onderzocht met een lichtmicroscoop. De kleuring werd geëvalueerd met ImageJ-software, en de geïntegreerde optische dichtheid werd berekend voor semikwantitatieve analyse.
15. Statistische analyse
Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SEM. Vergelijkingen tussen meerdere groepen werden uitgevoerd met behulp van een eenweg-variantieanalyse, gevolgd door de post hoc-toets van Tukey. Een waarde van P < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
Resultaten
Acupotomie vermindert histologische veranderingen in het gewrichtskraakbeen
Zoals getoond in Figuur 1A,B, waren de knieomtrek en de relatieve zwellingratio significant verhoogd in de KOA-modelgroep vergeleken met de controlegroep. Beide maten waren significant afgenomen na behandeling met acupotomie of celecoxib, terwijl schijnacupotomie geen significante verbetering teweegbracht in vergelijking met de KOA-modelgroep.
Zoals getoond in Figuur 1C,D, was de Mankin-score significant hoger in de KOA-modelgroep dan in de controlegroep en was deze significant verlaagd na behandeling met acupotomie of celecoxib. In de sham-acupotomiegroep werd geen significante verlaging waargenomen. De Moran-score vertoonde het tegenovergestelde patroon.
Kleuringen met hematoxyline en eosine en Safranine O–Fast Green toonden een verdunning en discontinuïteit van het gewrichtskraakbeenoppervlak, met lokale erosie, in de KOA-modelgroep vergeleken met de controlegroep (Figuur 1E,F). Acupotomie en celecoxib verbeterden deze pathologische veranderingen, wat werd aangetoond door duidelijkere kraakbeencontouren en verminderde structurele schade. In contrast hiermee vertoonde de sham-acupotomiegroep pathologische kenmerken die vergelijkbaar waren met die van de KOA-modelgroep. Deze bevindingen wijzen erop dat acupotomie effecten produceerde die vergelijkbaar waren met die van celecoxib bij het verminderen van gewrichtszwelling en kraakbeendegeneratie en het verbeteren van de histologische scores in het KOA-model.
Acupotomie verlaagt de spiegels van inflammatoire cytokinen
Zoals weergegeven in Figuur 2A–C, waren de concentraties van interleukine-1β (IL-1β), tumornecrosefactor-α (TNF-α) en interleukine-6 (IL-6) in homogenaten van kraakbeenweefsel significant hoger in de KOA-modelgroep dan in de controlegroep. Behandeling met acupotomie of celecoxib verlaagde de spiegels van alle drie de inflammatoire cytokinen significant. Daarentegen vertoonde de sham-acupotomiegroep geen significante verlaging in vergelijking met de KOA-modelgroep.
Acupotomie moduleert de RIC8A/p38 MAPK-signaleringsroute op proteïneniveau
Immunohistochemische analyse toonde aan dat de expressie van gefosforyleerde p38 mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (p-p38 MAPK) en gefosforyleerde kernfactor kappa B (NF-κB) significant lager was in de acupotomie- en celecoxib-groepen dan in de KOA-modelgroep (Figuur 3A). Er werd geen significant verschil waargenomen tussen de sham-acupotomie- en KOA-modelgroepen.
Western blot-analyse toonde aan dat de proteineniveaus van matrix metalloproteïnase-3 (MMP-3), matrix metalloproteïnase-13 (MMP-13), resistance to inhibitors of cholinesterase 8A (RIC8A) en p-p38 MAPK significant hoger waren in de KOA-modelgroep dan in de controlegroep, terwijl de niveaus van de kraakbeensynthese-gerelateerde proteïnen SRY-box transcriptiefactor 9 (SOX9) en aggrecaan significant lager waren. In vergelijking met de KOA-modelgroep vertoonden de acupotomie- en celecoxib-groepen een verminderde expressie van MMP-3, MMP-13, RIC8A en p-p38 MAPK en een verhoogde expressie van SOX9 en aggrecaan. De sham-acupotomiegroep vertoonde proteïne-expressiepatronen die vergelijkbaar waren met die van de KOA-modelgroep, zonder significante veranderingen in de gemeten proteïnen (Figuur 3B–I). Deze bevindingen wijzen erop dat de effecten van acupotomie en celecoxib op KOA geassocieerd waren met modulatie van de RIC8A/p38 MAPK-signaleringsroute.
Acupotomie moduleert de RIC8A/p38 MAPK-signaleringsroute op transcriptieniveau
Zoals getoond in Figuur 4A–G, waren de expressieniveaus van MMP-3, MMP-13 en RIC8A significant hoger in de KOA-modelgroep dan in de controlegroep, terwijl de expressie van SOX9 en aggrecan significant lager was. In vergelijking met de KOA-modelgroep verminderden acupotomie en celecoxib de expressie van MMP-3, MMP-13 en RIC8A en verhoogden ze de expressie van SOX9 en aggrecan. De sham-acupotomiegroep vertoonde geen significante verschillen in de gemeten transcriptieniveaus ten opzichte van de KOA-modelgroep.
Acupotomie verhoogde ook de relatieve expressie van circPDE4B, wat aangeeft dat de therapeutische effecten geassocieerd waren met modulatie van de circPDE4B/RIC8A/p38 MAPK-signaleringsas en met verminderde inflammatoire en katabole signalering.
DATABESCHIKBAARHEID :
De ruwe gegevens die de resultaten van deze studie ondersteunen, waaronder ELISA-, H&E-kleuring, immunohistochemie, RT‑qPCR, Safranin O–Fast Green-kleuring en western blot-gegevens, zijn openbaar beschikbaar in de Figshare-repository op https://doi.org/10.6084/m9.figshare.33090935.
Figuur 1. Acupotomie vermindert kniezwelling en degeneratie van het gewrichtskraakbeen bij konijnen met knieartrose. (A) Knieomtrek. (B) Relatieve ratio van kniezwelling. (C) Mankin histologische score. (D) Moran histologische score. (E) Representatieve met hematoxyline en eosine gekleurde coupes van gewrichtskraakbeen uit de controle-, KOA-model-, celecoxib-, acupotomie- en sham-acupotomiegroepen. (F) Representatieve met Safranin O–Fast Green gekleurde coupes van de vijf experimentele groepen. Histologische scoring (Mankin en Moran) werd uitgevoerd met monsters van alle 10 konijnen per groep (n = 10), terwijl representatieve afbeeldingen voor H&E- en Safranin O–Fast Green-kleuring werden verkregen van 3 willekeurig geselecteerde konijnen per groep. Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SEM. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van eenweg-variantieanalyse gevolgd door de post hoc-test van Tukey. Horizontale balken geven de vergeleken groepen aan. P < 0.05, P < 0.01, en P < 0.001. Schaalbalken, 100 µm. Afkortingen: KOA = knieartrose; SEM = standaardfout van het gemiddelde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Acupotomie vermindert de spiegels van inflammatoire cytokinen bij konijnen met knieartrose. (A) Interleukine-1β-concentratie. (B) Interleukine-6-concentratie. (C) Tumornecrosefactor-α-concentratie. Cytokineconcentraties werden gemeten via een enzyme-linked immunosorbent assay in monsters van zes konijnen per groep (n = 6). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van eenweg-variantieanalyse gevolgd door de post-hoc test van Tukey. Horizontale balken geven de vergeleken groepen aan. P < 0,05, P < 0,01 en P < 0,001. Afkortingen: IL-1β = interleukine-1β; IL-6 = interleukine-6; KOA = knieartrose; SEM = standaardfout van het gemiddelde; TNF-α = tumornecrosefactor-α. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Acupotomie moduleert ontsteking- en kraakbenmetabolisme-gerelateerde eiwitten bij konijnen met knieartrose. (A) Representatieve immunohistochemische beelden die de expressie van gefosforyleerde nuclear factor kappa B en gefosforyleerde p38 mitogen-activated protein kinase tonen in gewrichtskraakbeen van de controle-, KOA-model-, celecoxib-, acupotomie- en sham-acupotomiegroepen. Schaalbalken, 100 µm. (B) Representatieve Western blots die de expressie tonen van SOX9, RIC8A, MMP-13, gefosforyleerde p38 MAPK, totale p38 MAPK, MMP-3, aggrecan en GAPDH. (C) Densitometrische kwantificering van aggrecan genormaliseerd naar GAPDH. (D) Kwantificering van MMP-13 genormaliseerd naar GAPDH. (E) Kwantificering van MMP-3 genormaliseerd naar GAPDH. (F) Kwantificering van totale p38 MAPK genormaliseerd naar GAPDH. (G) Kwantificering van gefosforyleerde p38 MAPK genormaliseerd naar GAPDH. (H) Kwantificering van SOX9 genormaliseerd naar GAPDH. (I) Kwantificering van RIC8A genormaliseerd naar GAPDH. Western blot-analyses werden uitgevoerd met monsters van drie konijnen per groep (n = 3). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van eenweg-variantieanalyse gevolgd door de post hoc-test van Tukey. Horizontale balken geven de vergeleken groepen aan. P < 0,05, P < 0,01 en P < 0,001. Afkortingen: GAPDH = glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase; KOA = knieartrose; MAPK = mitogen-activated protein kinase; MMP-3 = matrix metalloproteïnase-3; MMP-13 = matrix metalloproteïnase-13; NF-κB = nuclear factor kappa B; p-NF-κB = gefosforyleerde nuclear factor kappa B; p-p38 MAPK = gefosforyleerde p38 MAPK; RIC8A = resistance to inhibitors of cholinesterase 8A; SEM = standaardfout van het gemiddelde; SOX9 = SRY-box transcriptiefactor 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Acupotomie moduleert transcripten gerelateerd aan het kraakbeenmetabolisme en de expressie van circPDE4B bij konijnen met knieartrose. (A) Relatieve aggrecan-expressie. (B) Relatieve MMP-3-expressie. (C) Relatieve MMP-13-expressie. (D) Relatieve p38 MAPK-expressie. (E) Relatieve SOX9-expressie. (F) Relatieve circPDE4B-expressie. (G) Relatieve RIC8A-expressie. De expressie werd gemeten via kwantitatieve reverse transcription polymerase chain reaction en genormaliseerd ten opzichte van het referentiegen. Analyses werden uitgevoerd met monsters van zes konijnen per groep (n = 6). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SEM. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van een eenweg-analyse van variantie gevolgd door de post-hoc test van Tukey. Horizontale balken geven de vergeleken groepen aan. P < 0,05, P < 0,01, en P < 0,001. Afkortingen: circPDE4B = circular RNA phosphodiesterase 4B; KOA = knieartrose; MAPK = mitogen-activated protein kinase; MMP-3 = matrix metalloproteinase-3; MMP-13 = matrix metalloproteinase-13; RIC8A = resistance to inhibitors of cholinesterase 8A; SEM = standaardfout van het gemiddelde; SOX9 = SRY-box transcription factor 9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gen | Amplicongrootte | Voorwaartse primer | Omgekeerde primer |
| （bp） | （5'→3'） | （5'→3'） | |
| β-actin | 113 | CAGCCCTCCTTCATCGGTAT | GACATGACGTTGTTGGCGTA |
| MMP-3 | 108 | TGTGAGTTGAAGTGGCTCAT | CCTGTTTGAACACCCGTAAC |
| MMP-13 | 119 | GGCTCCTAGGCAAGTACAAT | GTGTACGCCCATCAGGATAA |
| SOX9 | 85 | GGAGGAAGTCGGTGAAGAAT | GCCTTGAAGATGGCGTTG |
| Aggrecan | 70 | TTGATGAGTGCCTTTCAAGC | CATGTGAAAGAGTCGATGGC |
| RIC8A | 100 | ATAAACTTTCCAGAGAGGAGTTGC | TCGATGACAGAGTACTGGTTG |
| p38 MAPK | 103 | TGTTCAAGGTCTCCCACAAG | TGCAGCTCCCTTATGATCTG |
| CircPDE4B | 174 | GTCATTTTGCCGAACTCCC | CATTATCATCTGCCGTCACTG |
Tabel 1: Primersequenties gebruikt voor kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie. De tabel vermeldt de doelgenen, de verwachte amplicongroottes en de forward- en reversprimersequenties in de 5′ naar 3′-richting. Afkortingen: bp = baseparen; circPDE4B = circulair RNA fosfodiësterase 4B; MAPK = mitogeen-geactiveerd proteïnekinase; MMP-3 = matrix metalloproteïnase-3; MMP-13 = matrix metalloproteïnase-13; RIC8A = resistentie tegen cholinesterase-remmers 8A; SOX9 = SRY-box transcriptiefactor 9.
Discussie
Deze studie evalueerde de therapeutische effecten van acupotomie in een konijnenmodel van knieartrose (KOA) en identificeerde een associatie tussen circPDE4B-expressie en de RIC8A/p38 mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (MAPK) signaleringsas. Acupotomie verminderde gewrichtszwelling en histopathologische veranderingen en beïnvloedde ontstekings- en kraakbeencentraal-metabolisme-gerelateerde markers op zowel transcript- als proteïneniveau.
De afname van interleukine-1β, tumornecrosefactor-α en interleukine-6 na acupotomiebehandeling was consistent met eerder gerapporteerde immunomodulerende effecten van acupotomie21. Deze cytokinen dragen bij aan kraakbeendegeneratie door matrix-afbrekende enzymen te stimuleren en de synthese van de extracellulaire matrix te onderdrukken22,24,25. De gelijktijdige afname van matrixmetalloproteïnase-3 (MMP-3) en matrixmetalloproteïnase-13 (MMP-13) op transcriptie- en proteïneniveau suggereert verder dat acupotomie de katabole activiteit die geassocieerd is met KOA onderdrukt.
Een opvallende bevinding was de associatie tussen door acupotomie geïnduceerde veranderingen in de expressie van circPDE4B en de modulatie van het RIC8A/p38 MAPK-pad. Abnormale activering van dit pad wordt geassocieerd met ontsteking, oxidatieve stress en degradatie van de extracellulaire matrix. De afnames in de expressie van RIC8A en de fosforylering van p38 MAPK na acupotomie suggereren dat de behandeling kan helpen bij het herstellen van de signaleringsbalans binnen dit pad. De gecoördineerde veranderingen in de relatieve circPDE4B- en RIC8A/p38 MAPK-gerelateerde markers zijn consistent met de hypothese dat circPDE4B kan functioneren als een moleculair steiger-eiwit (scaffold), zoals eerder voorgesteld26,27. De huidige bevindingen zijn echter correlatief en stellen niet vast dat circPDE4B de therapeutische effecten van acupotomie medieert. Loss- en gain-of-function-studies zijn vereist om causaliteit vast te stellen.
De potentiële associatie tussen acupotomie en circRNA-regulatie is een belangrijk aspect van deze studie. Er is aangetoond dat mechanische stimulatie de expressie van circRNA in verschillende weefsels beïnvloedt28,29,30,31. Direct bewijs dat acupotomie-geïnduceerde mechanische stimulatie koppelt aan de regulatie van circRNA's specifiek voor het gewrichtskraakbeen blijft echter beperkt. De waargenomen verandering in de relatieve expressie van circPDE4B na behandeling kan wijzen op een directe reactie op mechanische stimulatie of een indirecte reactie op verminderde ontsteking. Toekomstige studies die gecontroleerde mechanische stimulatie combineren met chondrocytenspecifieke manipulatie van circPDE4B zouden helpen om onderscheid te maken tussen deze mogelijkheden.
Acupotomie en celecoxib vertoonden vergelijkbare trends bij veel van de gemeten uitkomsten, ondanks hun verschillende werkingsmechanismen. Verschillende verklaringen kunnen deze convergentie verklaren. Ten eerste kunnen beide behandelingen inwerken op gedeelde downstream-paden, waaronder de RIC8A/p38 MAPK-as en nucleaire factor kappa B-signalering. Ten tweede kunnen de waargenomen overeenkomsten gemeenschappelijke kenmerken van kraakbeenbescherming weerspiegelen in plaats van padspecifieke effecten. Ten derde kunnen de geselecteerde markers gedeelde eindpunten van ontsteking en kraakbeelsmetabolisme vertegenwoordigen en daarom onvoldoende zijn om onderscheid te maken tussen verschillende upstream-mechanismen. Een vergelijkbare effectiviteit impliceert geen identieke mechanismen, maar suggereert dat beide interventies gemeenschappelijke componenten van het pathologische netwerk van artrose kunnen beïnvloeden26,32,33. Onbevooroordeelde benaderingen, zoals transcriptomische of proteomische profilering, kunnen helpen bij het definiëren van behandelspecifieke moleculaire signaturen.
De vergelijkbare effecten van acupotomie en celecoxib kunnen mogelijk klinische relevantie hebben. Acupotomie kan een niet-farmacologische behandeloptie bieden die periarticulaire mechanische factoren aanpakt, terwijl bepaalde bijwerkingen die geassocieerd worden met langdurig medicijngebruik worden vermeden. Deze interpretatie dient echter met voorzichtigheid te worden benaderd, aangezien het konijnmodel de complexiteit van humane KOA niet volledig weerspiegelt. Verdere translationele en klinische studies zijn noodzakelijk voordat deze preklinische bevindingen een bredere klinische toepassing kunnen ondersteunen.
Verschillende beperkingen moeten worden erkend. Ten eerste is de associatie tussen circPDE4B en de RIC8A/p38 MAPK-as niet getest met loss-of-function- of gain-of-function-experimenten. Ten tweede beperken het konijnenmodel en de behandelperiode van 4 weken de conclusies met betrekking tot menselijke ziekten en langetermijnuitkomsten. Ten derde maakten de moleculaire assays gebruik van relatief kleine subsets van dieren, wat de detectie van subtiele verschillen tussen groepen kan hebben beperkt. Ten vierde is het mogelijk dat het geselecteerde markerpanel geen onderscheid maakt tussen behandelingsspecifieke stroomopwaartse mechanismen. Tot slot vereisen de vergelijkbare reacties op acupotomie en celecoxib verder onderzoek om vast te stellen of de twee interventies werken via convergente of onafhankelijke pathways.
Conclusie
Acupotomie verminderde gewrichtszwelling, ontstekingscytokine-niveaus, kraakbeendegeneratie en de expressie van katabole markers in een konijnmodel van KOA. Deze effecten waren geassocieerd met veranderingen in de relatieve circPDE4B-expressie en modulatie van de RIC8A/p38 MAPK-signaleringsas. Omdat de huidige bevindingen correlatief zijn, is verder mechanistisch onderzoek vereist om vast te stellen of circPDE4B de therapeutische effecten van acupotomie direct medieert.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het in dit artikel beschreven werk kunnen hebben beïnvloed.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (beurznr. 81774436), het Anhui Province Clinical Medical Research Transformation Project (beurznr. 202427b10020136), het Scientific Research Project of the Anhui Provincial Department of Education (beurznr. 2023AH050824), het Health Research Program of Anhui (beurznr. AHWJ2023A30123) en het Anhui Association of Traditional Chinese Medicine Inheritance and Innovation Research Project (beurznr. 2024ZYYXH153).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3% waterstofperoxide | Fuzhou Maixin Biotech | SP kit-A3 | Blokkeert endogene peroxidase-activiteit tijdens immunohistochemie. |
| 4% paraformaldehyde | Biosharp | BL539A | Fixeert kraakbeenweefsel vóór decalcificatie en histologische verwerking. |
| Azijnzuur | Merck | A6283 | Gebruikt voor het bereiden van 1% zoutzuur in 70% |
| Hechtpleisters | Zhejiang Renkang | RK-8802 | Gebruikt na acupotomie. |
| Aggrecaan-antilichaam | Proteintech | 13880-1-AP | Primair antilichaam gebruikt om aggrecaan in kraakbeenproteïne-extracten te detecteren. |
| Watervrij ethanol | Sinopharm Chemical Reagent | 10009228 | Gebruikt voor weefseldehydratie en rehydratatie van coupes tijdens histologische verwerking. |
| BCA-proteïne assay kit | Thermo Fisher Scientific | A55860 | Gebruikt om de proteïneconcentratie te bepalen. |
| Celecoxib | Biochempartner | BCP02156 | Referentie farmacologische behandeling toegediend via orale gavage. |
| Centrifuge | Anhui Jiawen Instruments | JW-3021HR | Gebruikt om weefsellysaten en homogenaten te klaren door centrifugale scheiding. |
| Chloroform | Nanjing Reagent | 67-66-3 | Gebruikt voor fasescheiding tijdens totale RNA-extractie. |
| Citraatbuffer, pH 6.0 | ZSGB-BIO | ZLI-9065 | Gebruikt voor hitte-geïnduceerde antigeen-retrieval vóór immunohistochemie. |
| Cryotubes | NEST Biotechnology | 607001 | Gebruikt voor de opslag van bevroren monsters |
| DAB-substraat | Fuzhou Maixin Biotech | Kit-5230 | Chromogeen substraat gebruikt voor visualisatie van HRP-gelabelde immunohistochemische signalen. |
| DEPC-behandeld water | Generay Biotech | D1007 | RNase-vrij water gebruikt voor RNA-oplossing en moleculaire biologieprocedures. |
| Wegwerpacupotomienaald, 0.35 mm × 25 mm | Ma'anshan Bond Medical Equipment | GB3525R | Steriele naald-mes gebruikt voor acupotomie- en sham-acupotomieprocedures. |
| EDTA | biosharp | BL617A | Gebruikt voor het bereiden van de decalcificatie-oplossing voor kraakbeenbevattend weefsel. |
| Enhanced chemiluminescence substraat | Thermo 340958 | 340958 | Gebruikt om Western blot-banden te visualiseren. |
| Eosine-oplossing | Zhuhai Beso | BA4022 | Tegenkleuring gebruikt bij hematoxyline en eosine-kleuring. |
| Fast Green-oplossing | Solarbio | G1371 | Tegenkleuring gebruikt bij Safranine O–Fast Green-kleuring. |
| GAPDH-antilichaam | Zsbio | TA-08 | Gebruikt als Western blot-loadingcontrole, maar momenteel niet vermeld. |
| Gel-beeldingssysteem | Shanghai Peiqing Technology | JS-1070P | Legt chemiluminescente Western blot-beelden vast. |
| Glazen microscoopdia's | CITOTEST | 188105 | Gebruikt om coupes te monteren |
| Geit anti-muis IgG, HRP-geconjugeerd | ZSGB-BIO | ZB-2305 | HRP-geconjugeerd secundair antilichaam voor muis primaire antilichamen. |
| Geit anti-konijn IgG, HRP-geconjugeerd | ZSGB-BIO | ZB-2301 | HRP-geconjugeerd secundair antilichaam voor konijn primaire antilichamen. |
| Geiten serum | ZSGB-BIO | ZLI-9056 | Blokkeert aspecifieke antilichaambinding tijdens immunohistochemie. |
| GraphPad Prism, versie 10 | GraphPad Software | Niet van toepassing | Gebruikt voor statistische analyse en grafiekbereiding. |
| Hematoxyline-oplossing | Zhuhai Beso | BA4041 | Kernkleuring gebruikt voor hematoxyline en eosine-kleuring en immunohistochemische tegenkleuring. |
| Homogenisator | Witeg | SGCR-5-553-722 | Homogeniseert kraakbeenweefsel voor ELISA en moleculaire assays. |
| Zoutzuur | Merck | 7607 | Gebruikt voor het bereiden van 1% zoutzuur in 70% |
| Image Lab-software | Bio-Rad | Niet van toepassing | Gebruikt voor densitometrische analyse van Western blot-banden. |
| Image-Pro Plus, versie 6.0 | Media Cybernetics | Niet van toepassing | Gebruikt voor semikwantitatieve analyse van de Safranine O-kleuringsintensiteit. |
| Isopropanol | Sinopharm Chemical Reagent | SCR40007960 | Gebruikt om RNA neer te slaan tijdens totale RNA-extractie. |
| Lichtmicroscoop | Olympus | CX41 | Gebruikt om gekleurde kraakbeencoupes te onderzoeken en te fotograferen. |
| Medische marker | edding | 497985 | Gebruikt om behandelpunten te markeren |
| Methanol | Shanghai Suyi | 20180427 | Gebruikt om het PVDF-membraan te activeren |
| Microtoom | Leica | RM2016 | Snijdt paraffine-ingebed weefsel in coupes van 5 µm. |
| MMP-13-antilichaam | Bioss | bs-0575R | Primair antilichaam gebruikt om matrixmetalloproteïnase-13 te detecteren. |
| MMP-3-antilichaam | Bioss | bs-43017R | Primair antilichaam gebruikt om matrixmetalloproteïnase-3 te detecteren. |
| Neutrale hars | Wuxi Jiangyuan | ZLI-9516 | Montagemedium gebruikt voor permanente preparatie van gekleurde weefselcoupes. |
| Nieuw-Zeelandse Witte konijnen (mannelijk, 6 maanden oud, wegend 2.0–2.5 kg) | Nanjing Pukou District Laifu Breeding Farm | SCXK (Su) 2024-0007 | Experimentele dieren gebruikt voor knie-artrosemodellering en behandelingsevaluatie. |
| Nr. 23 scalpelblad | Caisson | SCX08-100PC | Gebruikt tijdens monstername. |
| Vetvrije melkpoeder | Gene | 9999S | Gebruikt als blokkeringsreagens. |
| p38 MAPK-antilichaam | Bioss | bs-0637R | Primair antilichaam gebruikt om totaal p38 MAPK te detecteren. |
| Paraffine-was | Thermo | 8330 | Gebruikt voor weefselinbedding |
| PBS | ZSGB-BIO | ZLI-9062 | Gebruikt voor weefselhomogenisatie, wassen en bereiding van reagentia. |
| Penicilline | Jilin Huamu Animal Health Products | Niet van toepassing | Postoperatief gebruikt bij 40.000 U/kg/dag |
| Pentobarbitalnatrium | Beijing Chemical Reagents | 61222 | Gebruikt voor anesthesie bij 3%, 30 mg/kg. |
| fosfaatgebufferde zoutoplossing | beyotime | ST448 | Gebruikt voor weefselhomogenisatie en wassen tijdens immunohistochemie. |
| Fysiologisch zout | servicevio | G4702 | Gebruikt voor het bereiden van de celecoxib-suspensie |
| PMSF | Beyotime | ST506 | Proteaseremmer toegevoegd aan de lysisbuffer tijdens proteïne-extractie. |
| p-NF-κB-antilichaam | Santa | sc-136548 | Primair antilichaam gebruikt om p-NF-κB in immunohistochemische analyse te detecteren. |
| p-p38 MAPK-antilichaam | Bioss | bs-5476R | Primair antilichaam gebruikt om gefosforyleerd p38 MAPK te detecteren. |
| PrimeScript RT Reagent Kit met gDNA Eraser | TaKaRa | RR047A | Gebruikt voor het verwijderen van genomisch DNA en reverse transcriptie van RNA naar cDNA. |
| PVDF-membraan | Millipore | IPVH00010 | Membraan gebruikt voor proteïne-overdracht tijdens Western blotting. |
| Konijn IL-1β ELISA-kit | Jiyinmei | JYM0011Rb | Kwantificeert konijn interleukine-1β in het geanalyseerde monster. |
| Konijn IL-6 ELISA-kit | Jiyinmei | JYM0006Rb | Kwantificeert konijn interleukine-6 in het geanalyseerde monster. |
| Konijn TNF-α ELISA-kit | Jiyinmei | JYM0003Rb | Kwantificeert konijn tumornecrosefactor-α in het geanalyseerde monster. |
| Real-time PCR-systeem | Thermo Fisher Scientific | PIKOREAL 96 | Voert fluorescentie-gebaseerde kwantitatieve PCR-amplificatie uit. |
| RIC8A-antilichaam | Bioss | bs-11355R | Primair antilichaam gebruikt om RIC8A te detecteren. |
| RIPA-lysisbuffer | Beyotime | P0013B | Extraheert totale proteïne uit kraakbeenweefsel. |
| Safranine O-oplossing | Solarbio | G1371 | Kleurt kraakbeenproteoglycanen bij Safranine O–Fast Green-histologie. |
| SDS-PAGE-reagentia of precast gels | Solarbio | S8010 | Inclusief gelpercentage of product. |
| SOX9-antilichaam | Bioss | bs-4177R | Primair antilichaam gebruikt om SOX9 te detecteren. |
| Spectrofotometer | Nanjing Wuyi Technology | OD1000+ | Meet RNA-concentratie en zuiverheid. |
| Steriel gaas | Zhende | V505463 | Gebruikt voor compressie na het terugtrekken van de naald. |
| SYBR Green Master Mix | Novoprotein | E096-01B | Fluorescent reagens gebruikt voor kwantitatieve PCR. |
| Tris-gebufferde zoutoplossing | Solarbio | T8060 | Gebruikt voor het bereiden van de was- en blokkeringsbuffer voor Western blotting. |
| TRIzol-reagens | Life Technologies | 15596018 | Fenol–guanidinium-reagens gebruikt voor totale RNA-extractie. |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | Niet-ionisch detergens toegevoegd aan Tris-gebufferde zoutoplossing en fosfaatgebufferde zoutoplossing wasvloeistoffen. |
| Weigert ijzer-hematoxyline-oplossing | Merck | 1.15973 | Gebruikt bij Safranine O–Fast Green-kleuring. |
| Xyleen | Sinopharm Chemical Reagent | 10023428 | Gebruikt voor deparaffinering en weefselopklaring. |
Referenties
- Mobasheri A, Batt M. An update on the pathophysiology of osteoarthritis. Ann Phys Rehabil Med. 2016;59(5):333-339.
- Forestier R, et al. Prevalence of generalized osteoarthritis in a population with knee osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2011;78(3):275-278.
- Motta F, Barone E, Sica A, Selmi C. Inflammaging and osteoarthritis. Clin Rev Allergy Immunol. 2023;64(2):222-238.
- Ghouri A, Conaghan PG. Prospects for therapies in osteoarthritis. Calcif Tissue Int. 2021;109(3):339-350.
- Roseti L, et al. Articular cartilage regeneration in osteoarthritis. Cells. 2019;8(11):1305. https://doi.org/10.3390/cells8111305
- Fujii Y, et al. Cartilage homeostasis and osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2022;23(12):6330. https://doi.org/10.3390/ijms23126330
- Kreutzinger V, et al. Limited effects of non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) on imaging outcomes in osteoarthritis: observational data from the osteoarthritis initiative (OAI). BMC Musculoskelet Disord. 2025;26. https://doi.org/10.1186/s12891-025-08245-0
- Migliore A, et al. Low dose NSAIDs and sysadoas in the management of knee osteoarthritis. Aging Clin Exp Res. 2025;37(1):121. https://doi.org/10.1007/s40520-025-03015-6
- Fu M, et al. Expression profile of long noncoding RNAs in cartilage from knee osteoarthritis patients. Osteoarthritis Cartilage. 2015;23(3):423-432.
- Jiang SD, et al. Long noncoding RNAs in osteoarthritis. Joint Bone Spine. 2017;84(5):553-556.
- Xing D, et al. Identification of long noncoding RNA associated with osteoarthritis in humans. Orthop Surg. 2014;6(4):288-293.
- Wu W, Zou J, Yang Y. Studies on the role of circRNAs in osteoarthritis. BioMed Res Int. 2021;2021:6672322. https://doi.org/10.1155/2021/6672322
- Liu X, et al. Identification and comprehensive analysis of circRNA–miRNA–mRNA regulatory networks in osteoarthritis. Front Immunol. 2022;13:1018820. https://doi.org/10.3389/fimmu.2022.1018820
- Shen S, et al. circPDE4B prevents articular cartilage degeneration and promotes repair by acting as a scaffold for RIC8A and MID1. Ann Rheum Dis. 2021;80(9):1209-1219.
- Cao M, et al. A peroxiredoxin-P38 MAPK scaffold increases MAPK activity by MAP3K-independent mechanisms. Mol Cell. 2023;83(17):3140-3154.
- Lu M, et al. Promotion and mechanism of acupotomy on chondrocyte autophagy in knee osteoarthritis rabbits. Chin J Integr Med. 2024;30(9):809-817.
- Chen C, et al. Clinical effects of ultrasound-guided acupotomy in knee osteoarthritis treatment. J Vis Exp. 2024;(208):e66587. https://doi.org/10.3791/66587
- Wang Y, et al. Effect of acupotomy modulation of NLRP3/Caspase-1/GSDMD pathway on chondrocyte pyroptosis in knee osteoarthritis. J Pain Res. 2025;18:4935-4945.
- Zhang J, et al. Whole transcriptome mapping identifies an immune- and metabolism-related non-coding RNA landscape remodeled by mechanical stress in IL-1β-induced rat OA-like chondrocytes. Front Genet. 2022;13:843187. https://doi.org/10.3389/fgene.2022.843187
- Liu Q, et al. Emerging roles of circRNA related to the mechanical stress in human cartilage degradation of osteoarthritis. Mol Ther Nucleic Acids. 2017;7:223-230.
- Guo Y, et al. Acupotomy improves synovial hypoxia, synovitis and angiogenesis in KOA rabbits. J Pain Res. 2023;16:749-760.
- Ma Y, et al. Acupotomy ameliorates KOA related chondrocyte premature senescence through YAP/FOXD1 pathway. J Pain Res. 2025;18:2011-2023.
- Wang Z,et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway, Acupuncture in Medicine. 2025, 43(2025), 164-173.
- Feng S, Cong H, Ji L. Salvianolic acid A exhibits anti-inflammatory and antiarthritic effects via inhibiting NF-κB and p38/MAPK pathways. Drug Des Devel Ther. 2020;14:1771-1778.
- Abdallah AM, et al. Pyrazole derivatives ameliorate synovial inflammation in collagen-induced arthritis mice model via targeting p38 MAPK and COX-2. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 2025;398(1):819-832.
- Alaaeldin E, et al. Topical nano-vesicular spanlastics of celecoxib: enhanced anti-inflammatory effect and down-regulation of TNF-α, NF-кB and COX-2 in complete Freund's adjuvant-induced arthritis model in rats. Int J Nanomedicine. 2021;16:133-145.
- Pamudurti NR, et al. Translation of CircRNAs. Mol Cell. 2017;66(1):9-21.
- Wang Z, et al. Electroacupuncture ameliorates cartilage damage in a rat model of knee osteoarthritis and regulates expression of miRNAs and the TLR4/NF-κB pathway. Acupunct Med. 2025;43(3):164-173.
- Shen J, et al. Circular RNA sequencing reveals the molecular mechanism of the effects of acupuncture and moxibustion on endometrial receptivity in patients undergoing infertility treatment. Mol Med Rep. 2019;20(2):1623-1633. https://doi.org/10.3892/mmr.2019.10386
- Wang Y, et al. Electroacupuncture alleviates perioperative hypothalamus-pituitary-adrenal axis dysfunction via circRNA-miRNA-mRNA networks. Front Mol Neurosci. 2023;16:1152861. https://doi.org/10.3389/fnmol.2023.1152861
- Xiao X, et al. Transcription profiling of a revealed the potential molecular mechanism of Governor Vessel electroacupuncture for spinal cord injury in rats. Neurospine. 2022;19(3):757-769.
- Xu C, Gu K, Yasen Y, Hou Y. Efficacy and safety of celecoxib therapy in osteoarthritis: a meta-analysis. Medicine (Baltimore). 2016;95(20):e3585. https://doi.org/10.1097/MD.0000000000003585
- 33. Jiang D, et al. Efficacy of intra-articular injection of celecoxib in a rabbit model of osteoarthritis. Int J Mol Sci. 2010;11(10):4106-4113.