Hoofdhuidacupunctuur in combinatie met beweging induceert PI3K/Akt-activatie en verbetert de synaptische plasticiteit bij spastische ratten na een beroerte

Samenvatting

Deze studie heeft als doel de effecten van hoofdhuidacupunctuur gecombineerd met oefening op de synaptische plasticiteit van de motorische cortex in een rattenmodel van post-beroerte ledemaatspasticiteit te onderzoeken en de associatie tussen PI3K/Akt-padactiviteit en de therapeutische effecten te onderzoeken.

Samenvatting

Effectieve behandelingen voor spasticiteit na een beroerte (PSS) blijven beperkt, en het mechanisme waarmee hoofdacupunctuur gecombineerd met oefening (SAE) PSS verlicht, is niet volledig begrepen. Deze studie onderzocht de effecten van SAE bij ratten met PSS en onderzocht of SAE synaptische plasticiteit reguleert via de PI3K/Akt-route. Er werd een rattenmodel voor de midden-cerebrale arterie occlusie (MCAO) opgezet, en ratten werden willekeurig toegewezen aan vijf groepen: Blank, Sham, MCAO, SAE en Baclofen. Alle interventies werden 7 opeenvolgende dagen toegediend. Neurologische functie, volume van cerebrale infarcten, histopathologie, synaptische ultrastructuur en gerelateerde eiwitexpressie werden vervolgens geëvalueerd. In vergelijking met de MCAO-groep verbeterde SAE neurologische tekorten, verminderde spierhypertonie, verminderde infarctenvolume, verminderde neuronale beschadiging, verhoogde het aantal synapsen en verbeterde de synaptische morfologie. SAE verhoogde ook gliale cellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF), gefosforyleerde PI3K (p-PI3K), gefosforyleerde Akt (p-AKT) en synaptische eiwitten, waaronder synaptofysine (SYN), postsynaptisch dichtheidsproteïne 95 (PSD-95) en groeigeassocieerd eiwit 43 (GAP-43). Immunofluorescentiekleuring suggereerde verder een verbeterde expressie van SYN en p-Akt in de motorische cortex na SAE-behandeling. Deze bevindingen suggereren dat SAE mogelijk gecorreleerd is met de activatie van PI3K/Akt-signalering via upregulatie van GDNF, waardoor de synaptische plasticiteit verbetert en PSS-symptomen worden verlicht. Deze studie onderzocht de effecten van SAE bij ratten met PSS en onderzocht de mogelijke associatie tussen SAE-interventie, PI3K/Akt-padactiviteit en synaptische plasticiteit.

Inleiding

Cerebrale infarct blijft wereldwijd een belangrijke oorzaak van dood en invaliditeit. Ischemie en hypoxie beschadigen neuronen, verstoren het excitatie-inhibitie-evenwicht in motorische circuits en leiden tot motorische disfunctie¹. Spasticiteit na een beroerte uit zich in een verhoogde spiertonus en verminderde gewrichtsmobiliteit, wat de dagelijkse activiteiten belemmert en de last van de verzorger verhoogt². Hoewel antispastische middelen zoals baclofen tijdelijke symptomatische verlichting kunnen bieden, kan langdurig gebruik leiden tot resistentie en bijwerkingen van de geneesmiddelen, en herstelt het de verminderde neurale functie^{niet 3}. Conventionele motorische revalidatie wordt ook beperkt door een trage inzet van het voordeel en een verlengde behandelduur. Daarom zijn er dringender behoefte aan veiligere en effectievere therapeutische strategieën, en de onderliggende mechanismen verdienen verder onderzoek. Neuroplasticiteit is een centraal mechanisme voor functioneel herstel na een beroerte en omvat synaptische remodellering, axonale regeneratie en neuronale overleving⁴. Na een ischemische beroerte sterven neuronen in de infarctkern snel, terwijl lokale ontstekingsreacties weefselschade in de ischemische penumbra verergeren; Samen veroorzaken deze processen hersenletsel ^5,6. Synaptische plasticiteit, een belangrijk onderdeel van neuroplasticiteit, kan worden geëvalueerd met synapse-gerelateerde eiwitten, waaronder presynaptische markers zoals synaptofysine (SYN) en groeigeassocieerd eiwit 43 (GAP-43), evenals postsynaptische dichtheidsproteïne 95 (PSD-95)^7,8,9.

Neurotrofische factoren vormen een moleculaire basis voor synaptische plasticiteit. Gliale cellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) is bijzonder belangrijk omdat het de neuronale overleving en reparatie bevordert, ontstekingen onderdrukt en de synaptische^{microomgeving} verbetert. Door te binden aan de Ret-receptor kan GDNF PI3K/Akt-signalering¹¹ activeren. De PI3K/Akt-cascade is een belangrijke pro-survivalroute in het zenuwstelsel, en de activatie ervan remt apoptose terwijl het de eiwitsynthese ondersteunt die nodig is voor synaptische remodellering^12,13. Hoofdhuidacupunctuur gecombineerd met oefening (SAE) is een integratieve revalidatiestrategie die hoofdhuidacupunctuurstimulatie combineert met actieve motorische training. Het algemene doel van deze methode is om tegelijkertijd centrale neurale activiteit te moduleren en taakgerelateerde motorische herstel te bevorderen, waardoor spierhypertonie wordt verminderd en de functionele uitkomsten na een beroerte worden verbeterd. SAE wordt in China veel gebruikt voor de behandeling van spasticiteit na een beroerte (PSS). De reden voor deze gecombineerde aanpak is dat hoofdhuidacupunctuur corticale prikkelbaarheid en cerebrale perfusie kan moduleren, terwijl oefentherapie activiteitsafhankelijke motorische training biedt die functioneel herstel en synaptische remodellering bevordert. In vergelijking met alleen oefentherapie heeft eerder klinisch bewijs aangetoond dat hoofdhuidacupunctuur op hoofdhuidpunten gecombineerd met oefentherapie de spasticiteit van ledematen verder vermindert en de motorische functie en dagelijkse activiteiten verbetert bij patiënten met post-beroerte ledemaatspasme¹⁴.

Een recente systematische review en meta-analyse suggereerde ook dat bewegingsstijl hoofdhuidacupunctuur of verwante gelijktijdige hoofdhuidacupunctuur-oefeningsinterventies grotere verbeteringen bieden in spasticiteit, motorische functie, balans en dagelijkse activiteiten dan single-component of sequentiële interventies, wat het potentiële voordeel van gelijktijdige neuromodulatie en motorische training ondersteunt¹⁵. Preklinische studies hebben aangetoond dat SAE of gerelateerde bewegingsstijl hoofdhuidacupunctuurprotocollen de cerebrale bloedstroom kunnen verbeteren en spasticiteit kunnen verminderen via 5-HT₂A-receptor-gemedieerde spinale KCC2-reactivatie^16,17. Een recente studie suggereert verder dat acupunctuur neuroplasticiteit bevordert via PI3K/Akt^{signalering 18}. Daarom kan SAE bijzonder geschikt zijn voor experimentele en klinische contexten waarin modulatie van post-stroke neurale plasticiteit, motorisch herstel en spasticiteitsvermindering belangrijke therapeutische doelen zijn. De mogelijke associatie tussen SAE, GDNF/PI3K/Akt-signalering en synaptische plasticiteit bij het verlichten van PSS is echter nog slecht begrepen. De huidige studie stelde een rattenmodel van PSS vast om de effecten van SAE op neurologische tekorten en spierspasticiteit te evalueren, en om veranderingen in GDNF-expressie, PI3K/Akt-routeactiviteit en synaptische plasticiteitsgerelateerde eiwitten na interventie te karakteriseren. Deze studie kan experimenteel bewijs leveren om te bepalen of SAE een geschikte rehabilitatiestrategie voor PSS is en om het mogelijke werkingsmechanisme ervan te verduidelijken.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Changchun University of Chinese Medicine (Goedkeuring nr. 20251038) en werden uitgevoerd volgens de richtlijnen voor Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE 2.0) en de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Alle materialen die in deze studie zijn gebruikt, worden weergegeven in de Materiaallijst.

Experimentele procedures
Proefdieren en groepering
Tachtig specifieke pathogenevrije (SPF) volwassen mannelijke Sprague–Dawley-ratten (220–250 g) werden gekocht bij Hongda Animal Breeding Farm (district Kuancheng, Changchun, China). De dieren werden gehuisvest in het Experimenteel Dierencentrum van de Changchun University of Chinese Medicine onder gecontroleerde omstandigheden van 22–25 °C, 50–60% relatieve luchtvochtigheid en een 12-uur licht/donker-cyclus, met vrije toegang tot voedsel en water. Na 1 week acclimatisatie werden ratten willekeurig toegewezen aan een lege groep (n = 12), een Sham-groep (n = 12) en een modelreservegroep (n = 56). De blanco groep werd opgenomen als een normale, onbehandelde controle om basiswaarden te leveren voor gedragsprestaties, histopathologische kenmerken en moleculaire markerexpressie bij gezonde ratten. De Sham-groep onderging dezelfde anesthesie en chirurgische blootstelling als de MCAO-groep, behalve dat er geen arteriële occlusie werd uitgevoerd; Daarom diende deze groep als controlegroep voor de mogelijke effecten van anesthesie en chirurgische manipulatie. De opname van zowel de Blank- als de Sham-groepen maakte het mogelijk de effecten van ischemische schade te onderscheiden van die gerelateerd aan de chirurgische ingreep zelf.

De modelreservegroep onderging MCAO-modellering. De eerste 3 dagen na de operatie werden gedefinieerd als de model-inductieperiode. In deze periode stierven 8 van de 56 ratten, wat overeenkomt met een sterftecijfer van 14,29%, en 12 ratten werden uitgesloten omdat modellering niet succesvol was. De overige 36 ratten met succesvolle modelopbouw werden willekeurig, met behulp van een random-getalle-tabel, toegewezen aan de MCAO-, SAE- en Baclofen-groepen, met 12 ratten in elke groep. Groepsinterventies waren als volgt: (I) Blanco groep: alleen routinevoeding, zonder interventie. (II) Schijngroep: chirurgische blootstelling van de arteria halsslagader gemeenschappelijke halsslagader, interne en externe halsslagaders en nervus vagus, zonder ligaties of filamentinsertie. (III) MCAO-groep: MCAO werd opgericht onder intraperitoneale anesthesie met 3% natrium pentobarbital, zonder verdere behandeling. (IV) SAE-groep: na succesvolle MCAO-modellering en validatie kregen ratten hoofdhuidacupunctuur gecombineerd met oefening. Isoflurane inhalatie-anesthesie van 1,5%–2,0% werd alleen gebruikt tijdens de korte naaldinbrengingsfase. Loopbandtraining werd pas gestart na volledig herstel van bewustzijn en herstel van spontaan loopvermogen. Acupunctuur werd uitgevoerd bij GV20 en bilaterale EX-HN1. Naalden werden tot een diepte van 1 mm ingebracht en behouden tijdens de loopbandtraining. De gestandaardiseerde 30-minuten naaldretentie-/trainingsperiode werd gedefinieerd als de loopbandtrainingsperiode en bestond uit 6 m/min voor 10 minuten, gevolgd door 12 m/min voor 20 minuten bij 0° helling. De interventie werd eenmaal per dag toegediend gedurende 7 opeenvolgende dagen. (V) Baclofengroep: na succesvolle MCAO-modellering en validatie kregen ratten baclofen via intragastrische gavage van 0,4 mg/kg eenmaal daags gedurende 7 opeenvolgende dagen.

Oprichting van het MCAO-model
Het rat MCAO-model werd ontwikkeld met behulp van een aangepaste intraluminale filamentmethode¹⁹. Na 12 uur vasten en watertekort werden ratten verdoofd door een intraperitoneale injectie van 3% natriumpentobarbital en in rugligging geplaatst. Na huiddesinfectie werd een middenlijn-cervicale incisie gemaakt om de rechter arteria carotis (CCA) en aangrenzende zenuwen en spieren bloot te leggen. De arteria carotis external (ECA) werd geïdentificeerd en geligeerd, en de arteria carotis internal (ICA) werd geïsoleerd. Ligaturen werden geplaatst bij de proximale ICA en CCA, en de distale CCA werd tijdelijk vastgeklemd. Daarna werd er een kleine arteriotomie uitgevoerd in de CCA proximaal van de klem. Een nylonfilament van 0,26 mm werd ingebracht en 18–20 mm door de ICA gebracht om de oorsprong van de middelste hersenslagader te blokkeren. De ICA en CCA werden vervolgens geligeerd en de incisie werd gehecht. Na de operatie werden ratten tijdens het herstel warm gehouden en kregen ze een intraperitoneale injectie met penicilline (40.000 U) om infectie te voorkomen. In de Sham-groep werd alleen vasculaire blootstelling uitgevoerd, zonder filamentinsertie; wondsluiting en postoperatieve zorg waren identiek aan die in de MCAO-groep. Succesvolle modelopbouw werd gedefinieerd als een Zea Longa-score ≥ 2 3 dagen na de operatie¹⁹ en een aangepaste Ashworth Scale (MAS) spiertonusscore ≥ graad 1²⁰.

Intervntiemethoden
Hoofdhuidacupunctuur combineert met inspanningsinterventie
Eerdere studies tonen aan dat bij MCAO-ratten neurologische tekorten op dag 3 pieken en binnen 10 dagen na de operatie verhoogd blijven, terwijl de perifere spierweerstand geleidelijk toeneemt van dag 6 tot dag 9²¹. Daarom werd de behandeling gestart op postoperatieve dag 3 en werd deze dagelijks gedurende 7 opeenvolgende dagen voortgezet om de impact van spontane herstel te minimaliseren. Voor het modelleren ondergingen ratten die aan de SAE-groep waren toegewezen 3 dagen adaptieve loopbandtraining op 5 m/min voor 10 minuten/^{dag 22} minuten. Deze adaptieve training werd gebruikt om ratten vertrouwd te maken met lopen op de loopband en om de kans op worstelen, vallen, weigeren om te rennen of stoppen tijdens de formele interventieperiode te verkleinen. Tijdens adaptieve training en formele interventie werden abnormale loopbandgerelateerde gebeurtenissen gedefinieerd als aanhoudend worstelen, vallen van de hardloopbaan, weigeren om langer dan 1 minuut te rennen, of langer dan 1 minuut stoppen tijdens loopbandtraining. Deze gebeurtenissen werden vastgelegd in experimentele logboeken wanneer ze werden waargenomen. Korte aarzeling of voorbijgaande stoppen leidde niet tot uitsluiting als lopen op de loopband na voorzichtig aansturen kon worden hervat. Gegevens werden alleen uitgesloten als een dier de toegewezen dagelijkse loopbandsessie niet kon voltooien vanwege herhaald vallen, aanhoudend weigeren om te rennen of ernstige nood. Na succesvolle modelvalidatie op dag 3 werd de SAE-interventie eenmaal dagelijks toegediend gedurende 7 opeenvolgende dagen.

Voor elke behandelsessie werden ratten verdoofd met 1,5%–2,0% isofluran. De narcose werd direct na het inbrengen van de naald stopgezet. In experimentele praktijk herwonnen ratten meestal binnen ongeveer 1–2 minuten na het onttrekken van isofluraan hun volledige bewustzijn. Loopbandtraining werd niet gestart terwijl ratten onder narcose waren. Acupunkturen werden gevonden door ervaren dieracupuncturisten volgens de Nomenclatuur en Lokalisatie van Algemene Acupunkturen bij Proefdieren, uitgegeven door de China Association of Acupuncture-Moxibustion in 2020. GV20 werd gedefinieerd als het middenpunt van de lijn die de voorste en achterste fontanellen op de schedelmiddenlijn verbindt. Bilaterale EX-HN1-punten bevonden zich 2 mm lateraal aan GV20. Wegwerpnaalden van 0,25 mm × 13 mm werden verticaal ingebracht tot een diepte van 1 mm en gedurende de gestandaardiseerde 30 minuten lopende loopbandtraining behouden. Naalden werden vastgezet met ademend medisch tape om verplaatsing te voorkomen, en schedelpenetratie werd uitgesloten door palpatie om procedurele consistentie te waarborgen. De naaldpositie en de fixatie van het tape werden gecontroleerd vóór de loopbandtraining, tijdens korte pauzes als er abnormaal hardloopgedrag optrad, en direct na het voltooien van de training. Daarnaast werd de naaldpositie elke 5 minuten visueel gecontroleerd tijdens de loopbandtraining, ongeacht het gedrag van de dieren. Naaldverplaatsing werd gedefinieerd als zichtbare lossing, een verandering in naaldhoek, gedeeltelijke terugtrekking of volledige losraking tijdens het lopen op de loopband. Als er lichte losser raakte zonder verlies van de naaldpositie, werd de tape voorzichtig versterkt terwijl de loopband kort werd gepauzeerd. Als een naald gedeeltelijk werd teruggetrokken of volledig losgeraakt, werd de naald tijdens die sessie niet opnieuw ingebracht; De rat voltooide de resterende loopbandtraining zonder extra naaldmanipulatie, en het voorval werd vastgelegd in het experimentele logboek. Dieren werden niet uitsluitend uitgesloten vanwege een enkele naaldverplaatsing, tenzij het gebeurde met het onvermogen om de loopbandtraining te voltooien of tekenen van ernstige nood.

De gestandaardiseerde 30 minuten durende naaldretentie/trainingsperiode begon toen de rat begon met lopen op de loopband na volledig herstel van isoflurane anesthesie en eindigde direct na het voltooien van de loopbandtraining, toen de naalden werden verwijderd. Het korte herstelinterval na het stoppen met isoflurane werd niet opgenomen in de gestandaardiseerde trainingsperiode van 30 minuten. Omdat naalden vóór het herstel werden ingebracht, was de daadwerkelijke fysieke verblijfstijd ongeveer 1–2 minuten langer dan de 30 minuten durende trainingsperiode op de loopband. Deze definitie werd consequent toegepast op alle ratten in de SAE-groep. Een rat werd als voldoende hersteld beschouwd om te beginnen met loopbandtraining wanneer aan de volgende criteria was voldaan: volledig bewustzijnsherstel, vermogen om zelfstandig te staan, vermogen om steady op een vlakke ondergrond te lopen en normale reactie op zachte externe stimulatie. Deze criteria werden gecontroleerd voordat ze op de loopband werden geplaatst.

Tijdens het vasthouden van de naald voerden ratten loopbandoefeningen uit bij 0° helling: 6 m/min gedurende 10 minuten, gevolgd door 12 m/min gedurende 20 minuten. Elektrische schok werd op geen enkel moment tijdens het onderzoek gebruikt. Als een rat tijdens de formele training stopte met rennen of weigerde langer dan 1 minuut te rennen, werd milde, niet-aversieve auditieve stimulatie, zoals licht tikken op de loopbandwand, gebruikt om beweging te stimuleren. Het gebruik van dergelijke aansporing, evenals elk worstelen, vallen, stoppen, weigeren om te rennen of naaldverplaatsing, werd gedocumenteerd in het experimentele logboek wanneer het werd waargenomen. Deze gebeurtenissen werden beschrijvend gemonitord en gedocumenteerd in het experimentele logboek wanneer ze werden waargenomen. De intensiteit van de inspanning werd grondig aangepast op basis van eerder gerapporteerde protocollen waarbij hoofdacupunctuur werd gecombineerd met loopbandtraining^16,23. De SAE-interventie werd eenmaal dagelijks toegediend gedurende 7 opeenvolgende dagen (Figuur 1A).

Baclofeninterventie
Na succesvolle modelvalidatie kregen ratten in de Baclofen-groep baclofenoplossing via intragastrische gavage in een dosis van 0,4 mg/kg. Het medicijn werd eenmaal dagelijks toegediend om 9:00 uur gedurende 7 opeenvolgende dagen.

Uitkomst-betekenis
Algemene observatie
De algemene toestand werd dagelijks gemonitord in alle groepen, inclusief lichaamsgewicht, mentale toestand, voedsel- en waterinname en spontane activiteit.

Neurologische functie en spiertonusbeoordeling
Neurologische tekorten en ledemaatspasticiteit werden beoordeeld op dag 1, 3, 5 en 7 na modelvalidatie met behulp van de Zea Longa-score, de aangepaste neurologische ernstscore (mNSS) en de aangepaste Ashworth-schaal. Alle gedragsbeoordelingen op alle tijdstippen werden onafhankelijk uitgevoerd door twee onderzoekers die gedurende de observatieperiode blind waren voor groepstoewijzing. Gedetailleerde beoordelingscriteria worden weergegeven (Tabellen 1–3).

Bepaling van het volume van cerebrale infarcten
Het volume van het cerebrale infarct werd beoordeeld met behulp van 2,3,5-triphenyltetrazoliumchloride (TTC) kleuring. Na 7 dagen interventie werden drie ratten uit elke groep willekeurig geselecteerd en geëuthanaseerd door een intraperitoneale overdosis natriumpentobarbital, gevolgd door snelle onthoofding voor volledige hersenverzameling. De hersenen werden eerst bevroren bij −20 °C en daarna in 2 mm dikke coronale secties gesneden. De secties werden geïncubeerd in 2% TTC-oplossing bij 37 °C gedurende 30 minuten in het donker, en vervolgens 's nachts gefixeerd in 4% paraformaldehyde bij 4 °C. De volgende dag werden alle secties gefotografeerd met een digitale camera. Normaal hersenweefsel was donkerrood gekleurd, terwijl geïnfarceerd weefsel bleekwit leek. Infarctgebieden werden gekwantificeerd met ImageJ, en infarctvolume werd uitgedrukt als percentage met behulp van de formule:

Infarctvolume (%) = infarctgebied / totale hersensectie X 100%.   (1)

Histopathologisch onderzoek van hersenweefsel
Hematoxyline–eosine (HE) kleuring
Hematoxyline- en eosine kleuring werd gebruikt om histopathologische veranderingen in de peri-infarct cortex te evalueren. Na 7 dagen interventie werden ratten geëuthanaseerd door een intraperitoneale overdosis natriumpentobarbital. Daarna werd een snelle transcardperfusie uitgevoerd met 0,01 M fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om bloed te verwijderen, gevolgd door 250 mL koude 4% paraformaldehyde (4 °C) voor fixatie. Hele hersenen werden verzameld en peri-infarct corticaal weefsel werd geïsoleerd en gefixeerd in 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 24 uur. Weefsels waren paraffine-ingesloten en coronal gesneden op 5 μm. Secties werden op slides gemonteerd, 30 minuten gebakken op 60 °C en gedeparaffiniseerd in xyleen I–III (elk 10 minuten). Daarna werd HE-kleuring uitgevoerd, gevolgd door uitdroging en opruimen. Tot slot werden secties bedekt met neutrale balsem en werden beelden gemaakt met een Nikon-lichtmicroscoop.

Nissl-beitsing
Nissl-kleuring werd gebruikt om de neuronale overleving en de lichaamsdichtheid van Nissl in het peri-infarct gebied te beoordelen. Na 7 dagen interventie werden ratten geëuthanaseerd en transcardiaal geperfuseerd met 0,01 M PBS (37 °C), gevolgd door 250 mL 4% paraformaldehyde (4 °C). Hele hersenen werden verwijderd, en peri-infarct en contralaterale corticale weefsels werden ontleed en 's nachts gefixeerd in 4% paraformaldehyde bij 4 °C. Na paraffine-inbedding werden 5 μm secties voorbereid. Secties werden 10 minuten gedeparaffiniseerd in xyleen, gerehydrateerd via een reeks gegradueerde ethanoloplossingen (95%, 90%, 80%, 70% en 50%; 5 minuten per concentratie), en 30 minuten bij kamertemperatuur gekleurd met Nissl werkoplossing. Na een korte spoeling met gedestilleerd water werden delen gedehydrateerd met gegradueerde ethanol, 2 minuten in xyleen gezuiverd en uiteindelijk gemonteerd met dekmantels. Beelden werden vastgelegd en geanalyseerd onder een lichtmicroscoop.

Western blot-analyse van eiwitexprssie
Western blotting werd uitgevoerd om eiwitten te beoordelen die betrokken zijn bij PI3K/Akt-signalering en synaptische plasticiteit. Na 7 dagen interventie werden ratten geëuthanaseerd met een overdosis natriumpentobarbital, en werd peri-infarct motorisch cortexweefsel verzameld. Weefsels werden volledig gehomogeniseerd in een Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) lysisbuffer op ijs en gecentrifugeerd bij 1610 × g bij 4 °C gedurende 30 minuten om het totale eiwit te extraheren. De eiwitconcentratie werd gekwantificeerd met behulp van een commerciële bicinchonininezuur (BCA) eiwitassaykit. Gelijke hoeveelheden eiwit (50 μg per baan) werden gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en elektrisch overgebracht naar polyvinylidienfluoride (PVDF) membranen. De membranen werden 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% bovine serumalbumine (BSA) oplossing om niet-specifieke binding te elimineren, waarna ze 's nachts geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 °C. Na drie spoelrondes met Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween-20 (TBST) buffer, werden membranen 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met een secundair antilichaam (verdunningsverhouding 1:1000). Eiwitbanden werden gevisualiseerd met versterkte chemiluminescentie (ECL), en bandintensiteit werd gekwantificeerd met ImageJ. Relatieve eiwitexpressie werd berekend als de verhouding van het doeleiwit tot de interne controle. Primaire antilichamen waren als volgt: GAPDH (1:1000), PI3K (1:1000), phospho-PI3K (1:1000), Akt (1:1000), phospho-Akt (1:1000), GAP-43 (1:1000), SYN (1:1000), PSD-95 (1:1000) en GDNF (1:1000).

Synaptische ultrastructuurobservatie
Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) werd gebruikt om het aantal synapsen en de structurele integriteit te beoordelen. Na 7 dagen interventie werden ratten verdoofd en transcardiaal geperfuseerd met een gemengd fixatiemiddel dat 4% paraformaldehyde en 2,5% glutaraldehyde bevatte. Peri-infarct corticale weefselblokken (1 mm × 1 mm × 1 mm) werden verzameld en vastgezet in 2,5% glutaraldehyde gedurende 2 uur, gevolgd door postfixatie met 1% osmiumtetroxide gedurende 1 uur. De monsters werden vervolgens verwerkt met gegradueerde ethanoldehydratie, epoxyhars-inbedding, ultradunne sectie (50 nm dikte) en dubbele kleuring met uranylacetaat en loodcitraat. De synaptische ultrastructuur werd onderzocht met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop. Beelden werden gemaakt op 8.000× voor structurele beoordeling, en synapsen werden geteld op 5.000×. Drie willekeurige neuropilvelden per groep werden geanalyseerd om het gemiddelde synapsegetal te berekenen, en de gegevens werden vergeleken met eenrichtings-ANOVA.

Immunofluorescentie dubbel-labeling assay
Immunofluorescentie dubbellabeling kleuring werd uitgevoerd om de expressie en distributie van SYN en p-Akt in de peri-infarct cortex te beoordelen. Na 7 dagen interventie werden ratten geëuthanaseerd door een intraperitoneale overdosis natriumpentobarbital, en werd het peri-infarct corticaal weefsel snel gedissecteerd. Monsters werden 24 uur vastgezet in 4% paraformaldehyde, ingebed in optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) en gesneden in secties van 10 μm dik. Secties werden 1 uur aan de lucht gedroogd op kamertemperatuur en drie keer gewassen met TBST-buffer om de resterende OCT-verbinding te verwijderen. Secties werden permeabiliseerd met 0,3% Triton X-100 gedurende 20 minuten op kamertemperatuur, afgespoeld met PBS en 1 uur op kamertemperatuur afgedicht met 5% BSA-oplossing. Onder donkere omstandigheden werden secties 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met konijn anti-SYN (verdunning 1:200) en konijn anti-p-Akt (verdunning 1:200) primaire antilichamen. De volgende dag werden secties drie keer gewassen met PBS en in het donker geïncubeerd met een secundair antilichaam (verdunning 1:400) gedurende 50 minuten op kamertemperatuur. Na zes verdere washes met TBST-buffer werden celkernen 5 minuten bij kamertemperatuur tegengekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) werkoplossing. Beelden werden gemaakt onder identieke belichtings- en achtergrondomstandigheden met behulp van een fluorescentiemicroscoop. Representatieve beelden werden gebruikt om expressiepatronen van SYN en p-Akt in de motorische cortex over groepen heen te evalueren.

Statistische analyse
Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van GraphPad Prism 10.1.2 en IBM SPSS Statistics 25. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Gedragsgegevens die op meerdere tijdstippen zijn verzameld, waaronder de Zea Longa-score, de aangepaste Neurologische Severity Score en de aangepaste Ashworth Scale, werden geanalyseerd met behulp van een tweeweg herhaalde metingen (ANOVA) waarbij groep de factor tussen de proefpersonen en de tijd de factor binnen de proefpersonen is. Wanneer significante hoofdeffecten of interacties werden gedetecteerd, werd Sidaks meervoudige vergelijkingstest gebruikt voor post hoc analyse. Andere gegevens werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Sidaks meervoudige vergelijkingstest voor post hoc vergelijkingen. Een tweezijdige p. < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. In staafdiagrammen wordt de statistische significantie aangegeven door asterisken zoals gedefinieerd in de bijbehorende figuurlegendes.

Resultaten

SAE verbetert de neurologische functie en vermindert spierspasticiteit bij PSS-ratten
De therapeutische effecten van SAE op gedragsstoornissen bij ratten met spasticiteit na een beroerte werden geëvalueerd met behulp van de Zea Longa-score, de aangepaste Neurologische Ernstheidsscore en de aangepaste Ashworth Scale op dag 1, 3, 5 en 7 na modelvalidatie (n = 12 per groep). De Zea Longa-score en mNSS werden gebruikt om neurologische tekorten te beoordelen, terwijl de MA...

Discussie

Eerdere klinische studies hebben aangetoond dat hoofdhuidacupunctuur in combinatie met lichaamsbeweging spastische symptomen kan verlichten bij patiënten met spasticiteit na een beroerte, terwijl het de motorische functie en dagelijkse activiteiten (ADL) verbetert14,24. Deze bevindingen ondersteunen de klinische waarde ervan. De huidige studie bevestigde verder het therapeutisch voordeel van SAE in een rattenmodel met behulp van ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride-kleuringsoplossing	Beyotime	C0651	TTC-kleuring
3MM Filterpapier	Whatman, UK	3030861	Western blot-overdracht
AKT Antilichaam	Affinity	AF0836	Primair antilichaam
Aceton	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10000418	Infiltratie van elektronenmicroscoopspecimens
Adobe Illustrator	Adobe Inc.	Versie 29.5 (64-bits), https://www.adobe.com/products/illustrator.html	64-bits versie, gebruikt voor grafisch bewerken en voorbereiding van wetenschappelijke figuren
Anhydrisch ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	100092683	Deparaffinisatie van paraffinesecties
Anti-fade montagemedium	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1020	dekking
BCA-eiwitbepalingskit	MDL	MD913053	Bepaling van eiwitconcentratie
Blijdingsoplossing	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	Hematoxylinekleuring
Chemiluminescentie-beeldvormingssysteem	CLINX, China	ChemiScope6100	Systeem detecteert doeleiwit
Geconcentreerd normaal geitenserum	Boster Biological Technology	AR1009	serumblokkering
DAPI	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1030	nucleaire kleuring
Diamantmes	Daitome	Ultra 45°	Snijd ultradunne specimens
Differentiatie-oplossing	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2104	HE-kleuring
Droogoven	Tianjin Labory Instruments Equipment Co., Ltd.	GFL-230	Bak gefixeerde weefselsneden
EDTA (pH 9,0) antigeenretrievaloplossing	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C1052	Antigeenretrieval
Fixatiemiddel voor elektronenmicroscopie	ASPEN	AS1063	Fixatie van elektronenmicroscoopspecimens
Elektroforese voeding	Longfang	LF-2000	Biedt elektroforesesspanning
Embed 812 inbeddingsmedium	SPI	90529-77-4	Infiltratie van elektronenmicroscoopspecimens
EndNote X9	Clarivate Analytics (US) LLC	Versie X9, https://endnote.com/	Gebaat voor referentiebeheer en academische citatie-opmaak
Bevriezingsfase	Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd.	JB-L5	Vries ingevroren weefselblokken
GAP-43 Antilichaam	Affinity	Df7766	Primair antilichaam
GAPDH Antilichaam	Affinity	AF7021	Primair antilichaam
GDNF Antilichaam	Biosynthese	Bs-1024r	Primair antilichaam
IJsazijnzuur	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2138	Nissl-kleuring
Glazuren dia's en dekglasjes	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10212432C	Monteer weefselsecties
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC	Versie 10.1.2 (324) voor Windows 64-bits, https://www.graphpad.com/	64-bits versie, gebruikt voor statistische analyse en wetenschappelijke grafieken
Slijpmachine	Beijing Herde	N.9548	Vermaal weefselmonsters
HE-kleuringsoplossing	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C2103	HE-kleuring
HRP-geconjugeerd geiten-anti-muis secundair antilichaam	Servicebio	C030205	Secundair antilichaam
HRP-geconjugeerd geiten-anti-konijn-antilichaam	SeraCare	5220-0336	Secundair antilichaam
Waterstofperoxide (H2O2)	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C5101	bereiding van TSA-reagentia
IBM SPSS Statistics	IBM Corp.	Versie 25, 64-bits, https://www.ibm.com/products/spss-statistics	64-bits versie, gebruikt voor statistische gegevensanalyse en verwerking
Beeldvormingssysteem	Nikon, Japan	Nikon DS-U3	Vang microscopische beelden
Metaalbad	COYOTE	H203-H	Constante temperatuur incubatie
Microgolfoven	Galanz Microwave Electrical Appliance Co., Ltd.	P70D20TL-P4	Antigeenretrieval
NC-membraan (0,22 μm)	GVS, USA	ISEQ00010	Eiwitbloottoepassing
Neutrale balsem	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10004160	uitdroging en dekking
PBS-buffer	Wuhan Baiqiandu Biotechnology Co., Ltd.	C0003	ontkleuring en wassen
PI3K Antilichaam	Affinity	AF6241	Primair antilichaam
PSD-95 Antilichaam	Affinity	Af5283	Primair antilichaam
Pathologische microtoom	Leica Instruments (Shanghai) Co., Ltd.	RM2016	Snij paraffinesecties
Fosfo-AKT Antilichaam	Affinity	Af0832	Primair antilichaam
Fosfo-PI3K Antilichaam	Affinity	Af3241	Primair antilichaam
Pipet	Dragonlab	KE0003087/KA0056573	Kwantitatieve vloeistofoverdracht
Proteaseremmercocktail	Beyotime	P1005	Protease-remming
RIPA-lyseerder (Medium)	Beyotime	P0013C	Weefsellyse
Gekoelde centrifuge	SEILOGEX, China	CF1524R	Laagsnelheidsmonsterscheiding
SDS-PAGE-elektroforesesysteem	Beyotime	MiniProGel™ Gel-afgietsel, Elektroforese en Western Blot-overdrachtssysteem	Eiwitelektroforesescheiding
SDS-PAGE-voorgegoten Gel-kit	MDL	MD91191