Een model van piroxicam-versnelde enterocolitis bij interleukine-10 knockoutmuizen voor het bestuderen van door ontsteking veroorzaakte metabole veranderingen

Samenvatting

Dit protocol gebruikt piroxicam om de ontwikkeling van colitis te versnellen in het interleukine (IL-10)-knockout muismodel. Het protocol zorgt voor synchronisatie van colitis, wat resulteert in rigoureuze, reproduceerbare resultaten onafhankelijk van geslacht, achtergrondspanning of vivariumcondities. Het dient als een nuttig model voor het bestuderen van metabole veranderingen tijdens darmontsteking.

Samenvatting

Inflammatoire darmziekte (IBD) is een chronische ontstekingsziekte van het spijsverteringskanaal die wereldwijd meer dan 10 miljoen mensen treft. Hoewel er veel onderzoek is gericht op de immunologische mechanismen en gevolgen achter IBD, is er minder bekend over hoe mucosale ontsteking bijdraagt aan metabole ontregeling, waaronder gewichtsverlies en verminderde eetlust. Hier beschrijven de auteurs een muismodel van piroxicam-accelereerde enterocolitis bij interleukine-10-knockout (IL-10-KO) muizen om ontstekingsgeïnduceerde metabole ontregeling te bestuderen. Het is bekend dat IL-10-KO muizen spontane enterocolitis ontwikkelen en een verhoogde vatbaarheid hebben voor enterocolitis veroorzaakt door infecties of medicijnen. Echter, vivariumcondities en de achtergrond van de stam zijn gerapporteerd als verstorende factoren in de ontwikkeling van colitis in dit model. Piroxicam, een niet-steroïd ontstekingsremmer (NSAID), is aangetoond dat het enterocolitis in diermodellen kan triggeren of versnellen door de slijmvliesblootstelling aan luminale bacteriën te vergroten. In dit protocol kregen mannelijke en vrouwelijke IL-10-KO muizen een piroxicam-verrijkt dieet in plaats van een regulier chow-dieet. Voedselinname en lichaamsgewicht werden dagelijks gemeten om veranderingen in het hele lichaam te weerspiegelen, samen met klinische manifestaties van enterocolitis zoals diarree en rectale bloedingen. Het protocol is efficiënt en reproduceerbaar, veroorzaakt tegelijkertijd enterocolitis bij meerdere muizen en maakt het mogelijk om metabole disregulatie te beoordelen in een inflammatoire darmziektemodel. Verdere studies met dit protocol kunnen de effecten van enterocolitis op andere componenten van metabole disregulatie onderzoeken, zoals energieverbruik en lichaamssamenstelling, en bredere verbanden onthullen tussen inflammatoire darmziekten en gastheermetabolisme.

Inleiding

De ziekte van Crohn en colitis ulcerosa, gezamenlijk bekend als inflammatoire darmziekte (IBD), zijn chronische auto-immuunziekten van het maag-darmkanaal die worden gekenmerkt door ontsteking van het slijmvlies met klinische manifestaties zoals buikpijn, gewichtsverlies, hematochezie en diarree. IBD treft miljoenen mensen wereldwijd, met de hoogste prevalentie in verwesterde samenlevingen¹. In de VS wordt geschat dat meer dan 3 miljoen mensen getroffen zijn ^2,3, met een stijgende incidentie en prevalentie, vooral onder kinderen en jongeren.

De exacte mechanismen achter de pathogenese van IBD zijn nog onvolledig begrepen, maar men denkt algemeen dat de ziekte het gevolg is van een overdreven immuunrespons op de darmmicrobiota bij genetisch gevoelige personen. Cytokines die ontstekingsreacties reguleren spelen een cruciale rol bij het handhaven van de darmhomeostase en bij de ontwikkeling van IBD. Hiervan is interleukine-10 (IL-10) een goed bestudeerd ontstekingsremmend cytokine dat helpt de immunologische homeostase bij mensen te behouden door zowel de aangeboren als de adaptieve armen van de immuunrespons ^6,7 te reguleren. Opmerkelijk is dat polymorfismen in IL-10 en zijn receptor (IL-10RA/B) zijn vastgesteld bij baby's met zeer vroeg beginnende IBD (VEO-IBD), die klassiek binnen de eerste levensmaanden perianale ziekte presenteren⁸. Deze associatie wordt verder ondersteund door grootschalige exoomsequencing van volwassen patiënten met de ziekte van Crohn, waarbij IL-10RA werd geïdentificeerd als een ziektegevoeligheidslocus in niet-monogene IBD⁹. Bovendien is een niet-genetische route beschreven waarbij IL-10 neutraliserende antilichamen worden opgenomen bij VEO-IBD-patiënten, wat het belang van deze route voor het handhaven van mucosale immuunhomeostase¹⁰ verder benadrukt.

Voortbouwend op menselijke studies die IL-10 impliceren bij IBD, zijn interleukine-10-knockout (IL-10-KO) muizen ontwikkeld als model om de rol van IL-10 bij IBD te bestuderen. IL-10-KO muizen staan bekend om het ontwikkelen van spontane enterocolitis met een overdreven CD4+ Th1-respons op prikkels, meestal beginnend bij 8–12 weken van¹¹ jaar. De ontwikkeling van spontane enterocolitis bij IL-10-KO muizen kan echter onvoorspelbaar zijn zonder een versnelde agent 12,13,14, afhankelijk van genetische stam, samenstelling van het microbiota en de huisvestingsomstandigheden ^15,16. Het gebruik van een betrouwbaar protocol om colitis op te wekken is cruciaal voor het praktisch bruikbaar maken van het IL-10-KO-model. Eerdere studies maakten gebruik van niet-steroïde ontstekingsremmers (NSAID's) zoals piroxicam om enterocolitis op te wekken bij IL-10-KO muizen^17,18. Deze studies hebben zich echter vooral gericht op immunologische veranderingen, met relatief weinig nadruk op de effecten van enterocolitis op de stofwisseling of op de rol van geslacht in de ernst van colitis¹⁹. De auteurs beschrijven hierin het gebruik van een met piroxicam verrijkt dieet om enterocolitis te induceren bij IL-10-KO muizen en karakteriseren metabole disregulatie en mucosale ontstekingsreacties in dit model met zowel mannelijke als vrouwelijke muizen. Dit protocol meet lichaamsgewicht en voedselinname om veranderingen in het hele lichaam te weerspiegelen, evenals klinische manifestaties van colitis en histologische en transcriptomische veranderingen die een mucosale ontsteking weerspiegelen. Dit efficiënte en reproduceerbare model biedt een waardevol hulpmiddel om de relatie tussen IBD en gastheermetabolisme te onderzoeken.

Protocol

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met het protocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van het University of Texas Southwestern Medical Center, in overeenstemming met de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" [Goedkeuringsnummer: 2017-102011]. Euthanasie werd uitgevoerd volgens de richtlijnen van de instelling. Er was geen verdoving nodig voor de uitgevoerde procedures. Specifieke details voor materialen worden beschreven in de Tabel van Materiaal.

1. Het vaststellen van het piroxicam-versnelde enterocolitismodel bij IL-10-KO muizen

1. Houd IL-10-KO muizen in een specifieke pathogegeenvrije (SPF) faciliteit op een 12-uur lichtcyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water.
2. Individueel huisvesten muizen van 7–8 weken oude, leeftijds- en geslachtsgematchte muizen in microisolatorkooien. Laat muizen minstens een week voor de start van het experiment wennen aan eenpersoonswoningen en dagelijkse behandeling.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat het lichaamsgewicht >20 g voor reutjes of >17 g voor vrouwtjes is, en dat muizen vrij zijn van gevechtswonden.
3. Wijs muizen toe aan een experimentele groep en een controlegroep. Voor de experimentele groep vervang de standaard chow door piroxicam versterkt chow. Voor de controlegroep bied verse standaardmaaltijden aan. Voeg 50 g voer toe aan elke kooihopper.
   OPMERKING: Verdeel minstens vijf muizen per geslacht per geslacht. De met piroxicam versterkte chow (200 ppm) werd door Teklad bereid met behulp van piroxicam die door de onderzoekers werden geleverd voor de productie van een speciaal laboratoriumdierdieet. Om variabiliteit per batch te minimaliseren, wordt aanbevolen dat alle dieren binnen een bepaald experiment voedsel uit dezelfde productiebatch ontvangen. Waar mogelijk moet dezelfde batch ook in experimenten worden gebruikt om de reproduceerbaarheid te verbeteren.

2. Monitoring van lichaamsgewicht en voedingsgedrag

1. Met een analytische weegschaal noteer je het lichaamsgewicht van elke muis. Weeg elke muis afzonderlijk op hetzelfde tijdstip, elke dag gedurende 7 opeenvolgende dagen. Rapporteer het dagelijkse lichaamsgewicht als percentage van het basisgewicht op dag 0 (ingesteld op 100%).
   OPMERKING: Een gewichtsverlies van meer dan 20% duidt op overmatige stress en risico op nadrijvende overlijden. Muizen moeten worden geëuthanaseerd als deze drempel wordt bereikt.
2. Met een analytische schaal noteer je het initiële gewicht van het met piroxicam versterkte voer en het standaardvoedsel in elke kooi.
3. Meet vervolgens het resterende voedsel in elke kooihopper op hetzelfde tijdstip, elke dag, gedurende 7 opeenvolgende dagen.
4. Bereken de dagelijkse voedselconsumptie door het dagelijkse voedselgewicht af te trekken van het resterende voedsel van de vorige dag.
   OPMERKING: Controleer routinematig de hoeveelheid voedsel en vul deze bij als deze onder de 10 g ligt. De smakelijkheid van piroxicam chow beïnvloedt de inname niet en moet sterk lijken op die van standaard food.

3. Monitoring van ziekteactiviteit

1. Op dag 0 en 7 inspecteer je visueel de ontlastingspellets van individuele muizen en bepaal je de aanwezigheid van bloed in de ontlasting.
2. Als er geen bloed zichtbaar is, voer dan een fecaal occult bloedtest uit door een pellet op de testkaart te smeren en vervolgens het meegeleverde ontwikkelreagens toe te voegen. Scoreresultaten volgens Tabel 1.
3. Op dag 0 en 7 inspecteer je visueel vers geholpen fecale pellets om de consistentie van de ontlasting te beoordelen. Gebruik een platte tang om de consistentie te bepalen. Scoreresultaten volgens Tabel 1.
4. Bepaal op dag 0 en 7 de mate van rectale prolaps door het perianale gebied te inspecteren. Scoreresultaten volgens Tabel 1.
5. Meet het lichaamsgewicht zoals hierboven beschreven. Scoreresultaten volgens Tabel 1.
   OPMERKING: Disease activity Index (DAI) scoring moet door dezelfde onderzoeker gedurende het hele experiment op een geblindeerde manier worden uitgevoerd om consistentie te waarborgen, waarnemersbias te minimaliseren en de betrouwbaarheid van de beoordeling te verbeteren.

4. Oogst van colonisch weefsel

1. Muizen worden geëuthanaseerd door CO2-verstikking en cervicale ontwrichting, zoals elders gerapporteerd²⁰.
2. Plaats de muis in rugligging en spray 70% ethanol op de buikbuik.
3. Til de huid op met een tang en gebruik een chirurgische schaar om langs de middenlijn te knippen. Leg de buikholte bloot en lokaliseer de colon.
4. Maak de dikke darm en het ceum bloot met een stomp dissectie. Verwijder de colon en bloc, inclusief het cekumum en de anale manchet.
5. Plaats de dikke darm op een vlak oppervlak en verwijder eventueel bindweefsel.
6. Meet en registreer de lengte van de dikke darm.
7. Na het meten van de dikke darmlengte verwijder je het ceum door te snijden bij de ceco-colonische overgang.
8. Bereid een 10 mL spuit voor gevuld met fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS) met een bijgevoegde 22-gauge kogeltip herbruikbare stalen gavage-naald. Rijg de naald in de dikke darm en spoel de darminhoud weg.
9. Plaats de doorgespoelde dikke darm in een petrischaal met PBS en spoel af om de resterende inhoud te verwijderen. Zodra het is goedgekeurd, gebruik het voor downstream assays.

5. Histologieanalyse

1. Leg de dikke darm plat op een glazen sparat. Gebruik een tang om het weefsel om zich heen te wikkelen, beginnend aan het distale uiteinde, om een "Swiss roll" te vormen. Op deze manier blijft het distale/anale uiteinde in de binnenste rol, terwijl de meer proximale gebieden zich uitstrekken naar de buitenste rol.
2. Met een naald van 27 gauge pin je de gerolde colon om de rol vast te houden en plaats je deze in een inbeddings-tissue cassette.
3. Om weefsels te herstellen, dompel je de weefselcassettes 16 uur onder in een gebuffreerde formalineoplossing bij 4 °C.
   VOORZICHTIG: 10% formaline is schadelijk bij contact met de huid en kan ernstige huidbrandwonden en oogschade veroorzaken. Ga voorzichtig om met beschermende handschoenen en een wetenschappelijke bril. Restformaline moet op de juiste manier worden afgevoerd volgens institutionele richtlijnen.
4. Na formalinefixatie worden weefsels verwerkt voor paraffine-inbedding en worden deze in secties geplaatst voor montering op glazen glaasjes.
   OPMERKING: Monsters moeten worden ingediend bij een histologielaboratorium met de benodigde apparatuur voor het verwerken van weefselcassettes in paraffine, scrollsectie, diamontage en hematoxyline- en eozinkleuring.
5. Kleurweefselslides met hematoxyline en eosine (HE), volgens vastgestelde protocollen²¹.
6. Met behulp van het histologische scoresysteem beschreven in Tabel 2 evalueer u de volgende histologische kenmerken in elke sectie: weefselschade door enterocolitis, lamina propria inflammatoire celinfiltratie en percentage van het betrokken gebied. Tel de scores in elke sectie samen om een totaalscore te genereren (Tabel 2).
   Totaalscore = Kenmerken × Betrokkenheid (Weefselschade) + Kenmerken × Betrokkenheid (Lamina Propria Inflammatoire Celfilteratie) (1)
7. Representatieve histopathologische beelden van weefselschade en celinfiltratie zijn te vinden in de publicatie van Erben et al.²².
   OPMERKING: Histologische scoring moet op een geblindeerde manier worden uitgevoerd, bij voorkeur door een getrainde patholoog, om consistentie en betrouwbaarheid van de beoordeling te waarborgen.

6. Immunofluorescentiekleuring van formaline-gefixeerd paraffine-ingebed weefsel

1. Plaats folie-glaasjes in een slide-rek en plaats ze 1 uur in een dijendroger van 55 °C om paraffine te smelten.
2. Plaats de slides in een beitsrek en dompel het rek achtereenvolgens 3 minuten onder in kleurpotjes met xyleen. Herhaal deze stap drie keer.
3. Doe het kleurrek 3 minuten onder in kleurpotjes met 100% ethanol. Herhaal deze stap drie keer.
4. Dompel het beitsrek 3 minuten onder in de kleurpot met 95% ethanol.
5. Dompel het beitsrek 3 minuten onder in de kleurpot met 80% ethanol.
6. Doe het kleurrek 5 minuten onder in kleurpotten met gedeïoniseerd (DI) water.
   OPMERKING: Alle voorgaande stappen moeten worden uitgevoerd in een geventileerde kap vanwege de xyleendampen. Ga voorzichtig om met beschermende handschoenen en een wetenschappelijke bril. Restxyleen moet correct worden afgevoerd volgens de institutionele richtlijnen.
7. Breng de glaasglaasjes over naar een preparatrek en dompel ze onder in een kleurpotje met 1× citraat-extractieoplossing.
8. Plaats de vlekpot in de steun van de vlekschaal.
9. Plaats de steun van de vlekbak in de snelkookpan.
10. Kook 15 minuten in een snelkookpan.
11. Haal de slides uit de snelkookpan en laat ze afkoelen tot kamertemperatuur.
12. Incubeer glaasjes met een 300 μL blokkeringsbuffer (3,5% geitenserum verdund in PBS) gedurende 1 uur in een bevochtigde kamer. Zorg ervoor dat het weefsel volledig bedekt is met de blokkeringsbuffer.
13. Blootstelling aan de slides aan 300 μL primaire antistof, verdund in blokkeringsbuffer, gedurende 16 uur bij 4 °C, binnen een bevochtigde kamer. Zorg ervoor dat het weefsel volledig bedekt is met het primaire antilichaam. Het volgende primaire antilichaam werd gebruikt: Anti-S100A8/S100A9 (1:500).
    OPMERKING: Antistofverdunningen zijn specifiek voor reagentia en dienen de aanbevelingen van de leverancier te volgen.
14. Spoel de glaasjes af door ze drie keer 5 minuten in PBS te dompelen in een kleurpotje.
15. Blootstelling van slides aan 300 μL van een verdund fluorescerend secundair antilichaam in blokkeringsbuffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, in een bevochtigde kamer. Zorg ervoor dat het weefsel volledig bedekt is met het secundaire antilichaam. Het volgende fluorescerende secundaire antilichaam werd gebruikt: geitenanti-Rabbit Alexa Fluor 555 (1:150 verdunning).
    OPMERKING: Vanaf dat moment moeten preparaten beschermd worden tegen licht om fotobleeken van fluoroforen te voorkomen. Verdunningen van secundaire antilichamen zijn reagentia-specifiek en dienen de aanbevelingen van de leverancier te volgen.
16. Spoel de glaasjes af door ze drie keer 5 minuten in PBS te dompelen in een kleurpotje.
17. Blootstel glaasjes aan nucleaire kleuring door ze 20 minuten in een kleuringspot onder te dompelen in Hoechst-oplossing, verdund 1:5000 in PBS.
18. Spoel de glaasjes af door ze drie keer 5 minuten in PBS te dompelen in een kleurpotje.
19. Veeg voorzichtig eventuele PBS van de dia's met een niet-schurend weefsel. Voeg 50 μL antifade montagemedium en een coverslip toe.

7. RNA-extractie

1. Vries de hele dikke darm of een fragment in vloeibare stikstof en bewaar het vervolgens bij -80 °C. Alternatief dompel je in 1,5 mL RNALater-conserveringsoplossing en bewaar volgens de instructies van de fabrikant.
2. Ontdooi eerder bevroren dikke darm en plaats ze op een vlak oppervlak. Verstoor en homogeniseer het weefsel met een handzame homogenisator.
3. Isoleer RNA met behulp van de kit, volgens de instructies van de fabrikant.
4. Meet de RNA-concentratie met een spectrofotometer. Een₂₆₀/A_{280-verhouding} > 1,8 en A₂₆₀/A_{230-verhoudingen} van 2,0–2,2 duiden op acceptabele RNA-zuiverheid.
5. Ga verder met reverse transcriptie, gevolgd door qPCR met SYBR groene intercalerende kleurstof.
6. Analyseer resultaten met behulp van het kwantificatieplatform of een vergelijkbaar instrument.

Resultaten

Mannelijke en vrouwelijke IL-10-KO muizen ontwikkelen enterocolitis na een korte blootstelling aan een met piroxicam verrijkt dieet (Figuur 1A–E). Op dag 2 vertoonden muizen die aan piroxicam waren blootgesteld statistisch significant een groter gewichtsverlies dan hun gecontroleerde controles die regelmatig voedsel van hetzelfde geslacht hadden, en er werd vergelijkbaar gewichtsverlies waargenomen tussen de geslachten (Figuur 1B). De schijnbare dagelijkse voedselinname bleef onveranderd tijdens de ontwikkeling van piroxicam en enterocolitis en leek op de inname van standaard voedsel, wat aangeeft dat gewichtsverlies in dit model niet primair wordt veroorzaakt door een verminderde inname, maar door andere factoren die het metabolisme bevorderen (Figuur 1C).

Om de progressie van darmontsteking verder te onderzoeken, werd de ziekteactiviteit beoordeeld aan de hand van een gecombineerde score van gewichtsverlies, bloed in de ontlasting, ontlastingsconsistentie en mate van rectale prolaps. De gemodificeerde ziekte-activiteitsindex (DAI) werd beoordeeld bij de basislijn en dag 7; De scores van dag 7 zijn weergegeven in Figuur 1D. Daarnaast was de ontwikkeling van enterocolitis waargenomen bij piroxicam-blootgestelde muizen geassocieerd met een sterke trend naar een verhoogde sterfte, hoewel dit verschil niet statistisch significant was (p = 0,12; Figuur 1E). In dit model is vroege sterfte secundair aan het bereiken van humane eindpunten (gewichtsverlies > 20%) en treft het bij voorkeur mannetjes (Figuur 1E). Als sterfte een gezochte experimentele eindbestemming is, kan een groter aantal proefdieren dan hier gebruikt worden overwogen. In deze studie gebruikten de auteurs het minimale aantal dieren dat nodig is om statistische kracht te bereiken door het afronden van het onderzoek, waarbij rekening werd gehouden met de verwachte sterfte.

Colonverkorting is een kenmerk dat geassocieerd wordt met de ernst van colitis bij muismodellen. Bij de oogst hadden zowel mannelijke als vrouwelijke IL-10-KO muizen die een piroxicam-dieet kregen kortere darmen dan de muizen die normaal voedsel kregen (Figuur 2A–B). Bij histologische beoordeling toonden de colons van de met piroxicam gevoede groep epitheliale schade en verhoogde infiltratie van immuuncellen, veranderingen die geassocieerd worden met colitis (Figuur 2C). Deze bevindingen vertaalden zich in een hogere histologische score (Figuur 2D). Daarnaast werden transcriptieniveaus van pro-inflammatoire cytokines die betrokken zijn bij humane IBD- en muismodellen van colitis geëvalueerd²³. In overeenstemming met eerdere rapporten vertoonden colons van piroxicam-gevoede IL-10-KO muizen een significante upregulatie van pro-inflammatoire cytokines op transcriptniveau (Figuur 3A–D). Opmerkelijk is dat deze transcriptionele verandering niet werd waargenomen bij IL-10-KO muizen die regelmatig voedsel ontvingen of WT-muizen die piroxicam-verrijkt dieet kregen, wat erop wijst dat de transcriptiesignatur werd veroorzaakt door een combinatie van IL-10-deficiëntie en piroxicam, en niet alleen door een van beide factoren. Ten slotte bevestigden de auteurs dat de transcriptiesignatur die in de dikke darm werd waargenomen bij met piroxicam behandelde muizen geassocieerd was met verhoogde calprotectinekleuring in het darmslijmvlies (Figuur 3E)^24,25.

Figuur 1: Piroxicam-versnelde enterocolitis bij IL-10-KO muizen. (A) Schematisch overzicht van het experimentele protocol. (B) Lichaamsgewicht, (C) voedselinname, (D) dag 7 ziekte-activiteitsindex (DAI), (E) overlevingscurve bij 8 weken oude mannelijke en 8 weken oude vrouwelijke IL-10-KO muizen die een piroxicam-verrijkt dieet of een regulier dieet krijgen. Mannelijke controle: n = 5, mannelijke piroxicam: n = 5, vrouwelijke controle: n = 6, vrouwelijke piroxicam: n = 6 inch (B), (C) en (D). Mannelijke controle: n = 6, mannelijke piroxicam: n = 10, vrouwelijke controle: n = 6, vrouwelijke piroxicam: n = 7 inch (E). * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 door paarwijze vergelijking van mannelijke (bovenste asterisk) en vrouwelijke (onderste asterisk) muizen in (B). Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een tweevoudige, ongepaarde t-test in (B), (C) en (D), en een log-rank test in (E). Gemiddelde waarden en foutbalken die de standaardfout van het gemiddelde (SEM) weergeven, worden weergegeven. In staafdiagrammen worden individuele metingen weergegeven met jitterdiagrammen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Darmverkorting en histologische beoordeling. (A) Representatieve colonmonsters van 8 weken oude mannelijke en vrouwelijke interleukine-10-knockout (IL-10-KO) muizen die een piroxicam-dieet (boven) of een regulier dieet (onder) krijgen gedurende 7 dagen. Weegschaalbalk = 1 cm. (B) Darmlengte op dag 7 (mannelijke controle: n = 5, mannelijke piroxicam: n = 5, vrouwelijke controle: n = 6, vrouwelijke piroxicam: n = 6). (C) Representatieve afbeeldingen van een HE-gekleurde colon. Toonladderbalk = 100 μm. (D) Histologiescore op dag 7. Tweestaartige ongepaarde t-test in (B) en (D). Gemiddelde waarden en foutbalken die SEM voorstellen, worden weergegeven. In staafdiagrammen worden individuele metingen weergegeven met jitterdiagrammen. Niet significant (NS), * p ≤ 0,05, *** p ≤ 0,001, **** p ≤ 0,0001 bij paargewijze vergelijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Ontstekingsveranderingen bij piroxicam-versnelde enterocolitis. Kwantitatieve RT-PCR-resultaten van (A) Tnf, (B) Il6, (C) Il1b en (D) Ifng in colonisch weefsel van 8 weken oude wildtype (WT) en interleukine-10-knockout (IL-10-KO) mannelijke muizen op het moment van oogst. Voor panelen A–D, wt piroxicam n = 7, KO piroxicam n = 6, KO control n = 3. (E) Representatieve calprotectine immunofluorescentiekleuring van colonweefsel van 8 weken oude IL-10-KO muizen bij oogst. Statistische analyses werden uitgevoerd met behulp van een tweehoekige, ongepaarde t-test. Gemiddelde waarden en foutbalken die de standaardfout van het gemiddelde (SEM) weergeven, worden weergegeven. In staafdiagrammen worden individuele metingen weergegeven met jitterdiagrammen. Schaalbalk in (E) = 200 μm. Niet significant (NS), * p ≤ 0,05, ** p ≤ 0,01, *** p ≤ 0,001 bij pargewijze vergelijking. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Domein	Partituur
Gewicht	0 – Ongewijzigd
	1 – Verlies van 1–5%
	2 – Verlies van 6–10%
	3 – Verlies van 11–20%
	4 – ; Verlies meer dan 20%
Stoelgangconsistentie	0 – Normaal ;
	1 - Zacht maar gevormd
	2 – Losse ontlasting (niet waterig)
	4 – Diarree (vloeibare ontlasting)
Bloeden	0 – Geen
	2 – Hematooccult positieve ontlasting
	3 – Zichtbaar bloed op de ontlasting
	4 – Grove bloedingen per rectum
Rectale Prolaps	0 – Afwezig
	1 – heden
Totale score	Totale score: Som van (domeinscores) voor elk domein

Tabel 1: Ziekte-activiteitsscore (DAI). Een scoresysteem om ziekteactiviteit te bepalen op basis van gewichtsverlies, stoelgangconsistentie, bloed in de ontlasting en rectale prolaps. Aangepast van Sifuentes-Dominguez, et al²⁶.

Weefselschade					Lamina propria ontstekingscelinfiltratie
Kenmerken		Betrokkenheid			Kenmerken		Betrokkenheid
0	Geen enkele	1	1–25% van het oppervlak		0	Zelden	1	1–25% van het oppervlak
1	Zelden;	2	26–50% van het oppervlak		1	Verhoogd, sommige neutrofielen	2	26–50% van het oppervlak
2	Mucosale erosies en ulceraties	3	51–75% van het oppervlak		2	Submucosale aanwezigheid van inflammatoire celclusters	3	51–75% van het oppervlak
3	Uitgebreide schade diep in de darmwand	4	76–100% van het oppervlak		3	Transmurale celinfiltraties	4	76–100% van het oppervlak

Tabel 2: Histologisch scoresysteem. Scoresysteem om histologische veranderingen en schade te bepalen. Aangepast van Sifuentes-Dominguez, et al²⁶.

Discussie

Inflammatoire darmziekte is een complexe polygene aandoening waarbij preklinische modellen als onschatbare instrumenten dienen om routes te ontleden die bijdragen aan de pathogenese van IBD en nieuwe diagnostische en therapeutische strategieën te ontwikkelen. Momenteel vertrouwen veel preklinische IBD-modellen op chemische blootstelling, zoals dextransulfaatnatrium (DSS), oxazolon en trinitrobenzeensulfonzuur (TNBS), vanwege hun gebruiksgemak. Genetische modellen die spontane colitis ontwikkelen zijn ook beschikbaar. Hiervan is het IL-10-KO-model bijzonder waardevol omdat genetische variaties in de IL-10-route bekend staan om het veroorzaken van darmontsteking bij mensen, en IL-10-KO-muizen spontane chronische enterocolitis ontwikkelen die lijkt op menselijke ziekten. Een grote beperking van dit model is echter het onvermogen om fenotypische variabiliteit te verklaren. Hoewel enterocolitis spontaan ontstaat, kan het ontstaan variëren afhankelijk van de achtergrond van de spanning en de vivariumomstandigheden²⁷.

Door chemische blootstelling te combineren met een genetisch model, biedt het hier beschreven protocol een betrouwbaar en reproduceerbaar muismodel van experimentele colitis. Enterocolitis wordt bij IL-10-KO muizen versneld door piroxicam, met het begin van de ziekte binnen 7 dagen na blootstelling aan met piroxicam verrijkt dieet. Dit protocol maakt synchronisatie van de ontwikkeling van colitis mogelijk. Het model herhaalt kenmerken die zijn waargenomen in andere veelgebruikte muismodellen van colitis, waaronder gewichtsverlies, bloed in de ontlasting, diarree, verkorting van de darm, histologische schade en transcriptieveranderingen. Bovendien is dit model reproduceerbaar in de veelgebruikte C57Bl/6J-stam, die het onderzoeken van extra gendefecten die met IBD geassocieerd worden vergemakkelijkt door het relatief eenvoudig maken van muizen met extra mutaties in deze stam.

Het hier beschreven model biedt een nuttig hulpmiddel om metabole veranderingen tijdens darmontsteking te bestuderen. In dit model blijven muizen die aan piroxicam worden blootgesteld en versnelde enterocolitis ontwikkelen, normaal voeden zonder een significante afname van de dagelijkse inname. Dit geeft aan dat gewichtsverlies in dit model niet te wijten is aan een belemmerde voeding, maar aan extra factoren. Verdere studies zijn nodig om te bepalen of deze resultaten het gevolg zijn van een verhoogde calorie-uitgave door ontsteking, overmatig calorieverlies door diarree, of een verstoorde thermogenese. Bovendien vertonen mannelijke en vrouwelijke muizen vergelijkbare patronen van de ernst van de ziekte, een bevinding die contrasteert met eerdere waarnemingen van IL-10-KO en DSS modellen 28,29,30.

Er zijn verschillende belangrijke stappen voor probleemoplossing om reproduceerbaarheid van dit model te waarborgen. Ten eerste moeten muizen gewend raken aan dagelijks hanteren en observeren gedurende een week voordat ze aan piroxicam worden blootgesteld. Dit voorkomt stressgerelateerd gewichtsverlies. Ten tweede mogen kooien niet meer dan drie muizen bevatten, en alleen muizen die harmonieus worden gehuisvest mogen in het experiment worden opgenomen. Muizen die vechtgedrag vertonen of gevechtswonden vertonen, zijn vatbaarder voor het ontwikkelen van colitis en kunnen bezwijken vóór de oogst^31,32. Ten derde, als de voedselinname gedurende het hele experiment moet worden gemonitord, moeten muizen individueel worden gehuisvest om nauwkeurige meting van de voedselconsumptie mogelijk te maken. Daarnaast mogen alleen grote, intacte voerkorrels in de voerthoppers worden geplaatst om te voorkomen dat ze in het beddengoed afbrokkelen, wat de metingen kan beïnvloeden. De hier beschreven methoden voor het kwantificeren van voedselinname zijn in overeenstemming met gepubliceerde richtlijnen voor het consumptie van knaagdieren³³. Tot slot moeten kooiwisselingen tijdens het experiment worden vermeden, omdat plotselinge omgevingsveranderingen de voedselinname 1–2 dagen kunnen verminderen, vooral bij jonge muizen.

Dit protocol heeft verschillende beperkingen. Ten eerste is de beoordeling van metabole veranderingen beperkt tot lichaamsgewicht en voedselinname, terwijl andere maten van systemisch metabolisme, zoals respiratoire uitwisselingsratio (RER), energieverbruik en lichamelijke activiteit, niet zijn geëvalueerd. Daarnaast werden de mechanismen achter gewichtsverlies niet onderzocht; Daarom blijven de relatieve bijdragen van verminderde voedselinname, veranderd energieverbruik, malabsorptie en andere factoren die samenhangen met darmontsteking onduidelijk. Ten tweede werd alleen colonisch weefsel verzameld en geanalyseerd, terwijl andere organen die betrokken zijn bij metabole regulatie, waaronder vetweefsel, lever en skeletspier, niet werden onderzocht. Ten derde is dit protocol ontwikkeld met C57BL/6 IL-10-KO muizen, die mogelijk een andere vatbaarheid voor colitis vertonen dan andere genetische achtergronden. Ondanks deze beperkingen kan het protocol gemakkelijk worden aangepast om extra metabole fenotypering en analyse van extraintestinaal weefsel te bevatten, waardoor onderzoek mogelijk is naar de mechanismen achter gewichtsverlies en de relatie tussen darmontsteking en systemische metabole veranderingen³⁴, of beoordeling van nieuwe ontstekingsremmende nanomaterialen³⁵. Bovendien zou de aanpak toepasbaar moeten zijn op andere IL-10-KO muisstammen, hoewel aanvullende validatiestudies gerechtvaardigd zijn.

Samenvattend rapporteren de auteurs een efficiënt en reproduceerbaar protocol dat tegelijkertijd enterocolitis induceert bij meerdere IL-10-KO muizen en evaluatie van het voedingsgedrag mogelijk maakt. Verdere studies zijn nodig om de effecten van enterocolitis op energieverbruik en lichaamssamenstelling in dit model te onderzoeken, waardoor bredere verbanden tussen IBD en gastheermetabolisme aan het licht komen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
10% buffered formalin	StatLab	28600-1	1 Galllon
27 G needles	BD	305109
Anti-S100A8 + S100A9 antibody	Abcam	AB288715
Balance	Fisher scientific	S94792D	Fisher Science Education Portable Balances, 300 g
Citrate buffer	Sigma Aldrich	C9999-1000mL
DI water	Fisher scientific	STLSL301
Dissecting forceps	Fisher scientific	22-327379
Ethanol, 100% 200 proof	Fisher scientific	NC1675398	Pharmco Products ETHYL ALCOHOL 200 PROOF
Ethanol, 190 proof, 95%	Fisher scientific	AC615110010
Ethanol, 80%	Fisher scientific	T08204K7
EZ-Quick Slide Staining Dish	IHC world	IW-2511	Staining jar
EZ-Quick Slide Staining Rack	IHC world	IW-2512	Slide rack
Feeding needle	Fisher scientific	NC9924986	22 gauge, 25 mm
Fine scissors	Fisher scientific	14060-11
Flat forceps	Fisher scientific	21-125-109
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 555	Thermo Fisher	AB_2535849
Handheld homogenizer	Fisher scientific	15-340-167
HemoCue	Danlee Medical Products, Inc.	BCK 64151A	Hemoccult Dev/ Single Slide Test Cards - CLIA Waived
Hoechst 33342	Invitrogen	62249
IL-10 KO Mice	The Jason Laboratory	Strain #: 002251	IL10-KO mice, genotype: B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J
IVC mouse caging	Allentown	Mouse 500
Liquid nitrogen	Airgas	NI UHP300
Microscope cover glass	Fisher scientific	12541033
Nanodrop	Thermo Fisher	ND-ONE-W
Normal Goat serum	Vector labs	S-1000-20
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
Petri dishes	Fisher scientific	FB0875713
Piroxicam	Sigma Aldrich	P0847	supply to inotiv for preparation of custom animal diet
Piroxicam-fortified chow	Inotiv	Custom	200 ppm
Primer: Mouse GAPDH forward	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGTCGGTGTGAACGGATTTG 3' forward
Primer: Mouse GAPDH reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA 3' reverse
Primer: Mouse IFN-G forward	Sigma Aldrich	N/A	5' ACTGGCAAAAGGATGGTGAC 3' forward
Primer: Mouse IFN-G reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TGAGCTCATTGAATGCTTGG 3' reverse
Primer: Mouse IL-10 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' CTTGCACTACCAAAGCCACA 3' (common)
Primer: Mouse IL-10 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTATTGTCTTCCCGGCTGT 3' (Wild type reverse)
Primer: Mouse IL-10 reverse (2)	Sigma Aldrich	N/A	5' CCACACGCGTCACCTTAATA 3' (Mutant reverse)
Primer: Mouse IL-1B forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCTGAAAGCTCTCCACCTCA 3' forward
Primer: Mouse IL-1B reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGGCCACAGGTATTTTGTCG 3' reverse
Primer: Mouse IL-6 forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GTTCTCTGGGAAATCGTGGA 3' forward
Primer: Mouse IL-6 reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' TTTCTGCAAGTGCATCATCG 3' reverse
Primer: Mouse TNF forward	Sigma Aldrich	N/A	5' GCAGGTTCTGTCCCTTTCAC 3' forward
Primer: Mouse TNF reverse	Sigma Aldrich	N/A	5' AGTGCCTCTTCTGCCAGTTC 3' reverse
QuantStudio 7 Pro	Thermo Fisher	A43183
RNAlater solution	Invitrogen	AM7020	RNA Stabilization Solution, 100 mL
Rneasy mini kit	Qiagen	74104
SHURDry SD-II Slide Dryer	General data	SD-ll-120
Simport Scientific EasyDip Slide Staining Rack	Fisher scientific	22-038-494	Staining rack
SlowFade Gold antifade reagent	Invitrogen	S36936
Staining dish support	BioSB	BSB7086
Staintray IHC slide staining system	IHC world	M918-1	Humidified chamber for IHC
SuperScript VILO	Invitrogen	11755050
SYBR Green Master mix	Applied Biosystems	A46109
Tintoretriever pressure cooker	BioSB	BSB7008
Tissue cassettes	Fisher scientific	50-197-8152	Research Products International Corp Tissue Processing Cassette, Pink, 500 per Case
Xylene	Pharmco	399000000	1 Gallon