Methodenartikel

Genoombewerking in primaire zoogdiercellen via elektroporatie van editor-RNA

154 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71449

⸱

31 juli 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Pediatrics, Johns Hopkins University School of Medicine, 5Institute for NanoBioTechnology, Johns Hopkins University

In dit artikel

Samenvatting

De afgifte van genoomredacteuren als RNA's is een bijzonder krachtig middel om de genomen van primaire zoogdiercellen en cellijnen te modificeren. Het doel van dit protocol is om genoomeditoren als mRNA te leveren in primaire zoogdiercellen en cellenlijnen, gevolgd door gerichte Illumina-sequencing en analyse om bewerkingsuitkomsten te kwantificeren.

Samenvatting

CRISPR-editors, waaronder nucleasen, basiseditors en prime editors, kunnen ziekteverwekkende genetische varianten efficiënt corrigeren of doelgenen verstoren. Bewerkingsuitkomsten worden vaak geëvalueerd in gekweekte primaire cellen, patiëntafgeleide cellen of gemodificeerde cellijnen om de impact van genetische variatie te bestuderen of als eerste stap voordat dierstudies of klinische vertaling worden gestart. Het toedienen van editors als mRNA samen met synthetische gids-RNA's in zoogdiercellen kan de bewerkingsefficiëntie verbeteren ten opzichte van plasmide-gebaseerde benaderingen en problemen zoals DNA-integratie of off-target bewerking van langdurige expressie voorkomen. Dit artikel presenteert een workflow om genoomeditor-mRNA voor te bereiden door middel van in vitro-transcriptie (IVT), inclusief co-transcriptionele capping en chemisch gemodificeerde nucleotiden, elektroporaateditor-mRNA en gids-RNA's in primaire menselijke fibroblasten, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) of lymfoblastoïde cellijnen (LCL's), en het kwantificeren van bewerkingsuitkomsten door gerichte ampliconsequencing op een Illumina-platform, gevolgd door analyse met CRISPResso2. Deze workflow maakt kwantitatieve benchmarking van gids-RNA's, elektroporatieparameters en editorvarianten mogelijk, en ondersteunt downstream-toepassingen zoals single-cell cloning, fenotypische assays, preklinische dierstudies en therapieontwikkeling.

Inleiding

Efficiënte genoombewerking in primaire zoogdiercellen ondersteunt de generatie van genetische modellen en de preklinische evaluatie van kandidaat-therapeutische strategieën. Recente ontwikkelingen in CRISPR-gebaseerde technologieën, waaronder basisbewerking en prime editing, maken precieze nucleotidemodificaties mogelijk zonder dubbelstrengs DNA-breuken te introduceren, waardoor de zuiverheid van bewerkingsuitkomsten 1,2 verbetert. Deze technologieën zijn met succes toegepast in ziektemodellering en therapeutische genoombewerkingsstudies, waaronder strategieën om varianten te corrigeren die leiden tot sikkelcelziekte3 en cystische fibrose4.

Een bijzonder efficiënte strategie om genoombewerkingscomponenten aan zoogdiercellen te leveren is elektroporatie van in vitro getranscribeerd (IVT) mRNA dat codeert voor het bewerkingsenzym, gecombineerd met synthetische gids-RNA's (gRNA's). Het afleveren van mRNA maakt tijdelijke expressie van genoomeditoren mogelijk, waardoor langdurige nucleaseactiviteit wordt geminimaliseerd en de kans op off-target bewerkingsgebeurtenissen wordt verminderd. Vooruitgang in IVT-technologie heeft de efficiëntie, opbrengst en kwaliteit van mRNA-synthese verbeterd 4,5,6. Plasmide-DNA-sjablonen en PCR-afgeleide DNA-sjablonen worden elk vaak gebruikt voor in-vitro transcriptie en hebben elk unieke voordelen en beperkingen. In dit protocol hebben PCR-gegenereerde sjablonen de voorkeur om problemen te vermijden die samenhangen met het voortplanten van lange poly(A)-banen in plasmiden, die gevoelig zijn voor recombinatie en lengtevariabiliteit. Het gebruik van PCR-sjablonen zoals beschreven in dit protocol vereist echter wel een dure reverse primer die de 120-nucleotide poly(A)-staart bevat, en PCR kan foutgevoeliger zijn dan bacteriële propagatie van plasmiden voor sequenties die niet in de primers zijn gecodeerd. Als alternatief kunnen commerciële aanbieders zoals Elegen en 4basebio hoogwaardige DNA-sjablonen leveren, wat een betrouwbare, zij het duurdere, optie biedt voor het genereren van transcriptiesjablonen.

Zorgvuldig ontwerp van gids-RNA is een ander cruciaal onderdeel van succesvolle genoombewerkingsexperimenten. Verschillende computationele tools zijn ontwikkeld om onderzoekers te helpen optimale gRNA-sequenties te identificeren op basis van voorspelde on-target efficiëntie en minimale off-target activiteit. Veelgebruikte platforms zijn onder andere CHOPCHOP en CRISPOR, waarmee gidssequenties kunnen identificeren die compatibel zijn met de vereisten van het protospacer-aangrenzende motief (PAM) van Cas-enzymen en scoringsmetrics bieden om kandidaatgidsen met hoge voorspelde activiteit en specificiteit 7,8 te prioriteren. De fundamentele principes en best practices voor het ontwerp van gids-RNA's zijn uitgebreid beschreven in de CRISPR-literatuur9,10,11,12,13.

Elektroporatie wordt vaak gebruikt om genoombewerkingsreagentia aan zoogdiercellen te leveren, omdat het een hoge afgifte-efficiëntie kan bereiken in celtypen die doorgaans resistent zijn tegen lipide-gebaseerde transfectiemethoden. Elektroporatie permeabiliseert het celmembraan tijdelijk, waardoor exogene nucleïnezuren zoals mRNA en gRNA's het cytoplasma kunnen binnendringen. Geoptimaliseerde elektroporatieprotocollen zijn ontwikkeld voor meerdere zoogdierceltypen, waaronder primaire cellen, fibroblasten, lymfoblastoïde cellijnen en geïnduceerde pluripotente stamcellen14. Commerciële elektroporatieplatforms zoals de Lonza 4D- en Amaxa-systemen bieden celtype-specifieke programma's en reagentia die zijn ontworpen om de leveringsefficiëntie te verbeteren terwijl de levensvatbaarheid van de cel behouden blijft. Hoog-doorvoer elektroporatiesystemen zoals het Amaxa 96-well Shuttle-platform maken verder schaalbare genoombewerkingsexperimenten mogelijk onder meerdere experimentele omstandigheden. Het Neon-elektroporatiesysteem wordt ook veel gebruikt, maar is niet het onderwerp van dit protocol.

Na het toedienen van genoombewerkingscomponenten worden de uitkomsten van de bewerking doorgaans beoordeeld met gerichte next-generation sequencing (NGS) van het genomische gebied rondom de bewerkingsplaats. Sequencingbibliotheken worden gegenereerd door PCR-amplificatie van de doellocus, gevolgd door indexering en high-throughput sequencing. De resulterende sequencing reads worden geanalyseerd met gespecialiseerde bio-informatische pijplijnen die zijn ontworpen voor genoombewerkingsexperimenten. In dit protocol worden bewerkingsuitkomsten gekwantificeerd met behulp van CRISPResso2, een veelgebruikt computationeel platform dat gedetailleerde analyse van genoombewerkingsuitkomsten uit sequencingdatamogelijk maakt. CRISPResso2 lijnt sequencing-reads af op een referentiesequentie en kwantificeert bewerkingsresultaten, waaronder de algehele bewerkingsefficiëntie, insertion–deletion (indel) frequenties, precieze nucleotidesubstituties en bewerkingsverdelingen over het doelgebied. De software biedt ook grafische visualisaties en statistische samenvattingen die de vergelijking tussen experimentele omstandigheden en optimalisatie van bewerkingsparameters vergemakkelijken.

Samen biedt de integratie van hoogwaardige IVT-mRNA-productie, geoptimaliseerde levering door elektroporatie en high-resolution sequencing-analyse een robuuste workflow voor het evalueren van genoombewerkingsstrategieën in gekweekte cellen (Figuur 1). Deze aanpak maakt iteratieve optimalisatie van bewerkingsefficiëntie, specificiteit en experimentele parameters mogelijk voordat genoombewerkingsstrategieën worden doorgevoerd richting in vivo-studies en potentiële therapeutische toepassingen.

Protocol

Ethische verklaring:
Alle procedures waarbij mens-afgeleide cellijnen betrokken zijn, werden uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen en goedgekeurde protocollen.

1. Lineaire DNA-template genereren met PCR

Let op: Voer alle RNA-stappen uit met RNase-vrije verbruiksmaterialen en werkoppervlakken. Houd rekening met de vermelde mRNA-editors en hun verschillende varianten bij het selecteren van de juiste editor voor de beoogde genomische modificatie (Tabel 1).

  1. Stel de PCR-reactie samen op plasmide-DNA dat uit bacteriën is geëxtraheerd met behulp van een miniprep- of midiprep-kit. Gebruik 20 ng plasmide-DNA per 50 μL PCR-reactie met het enzym NEBNext Ultra II Q5 Master Mix, waarmee de PCR wordt samengesteld zoals beschreven in Tabel 2.
    1. Gebruik een forward primer die de inactieve T7-promotor op het plasmide corrigeert, wat circulaire transcriptie voorkomt.
    2. Gebruik een reverse primer die een 120-nt poly(A)₁₂₀ staart introduceert om efficiënte transcriptie en mRNA-stabiliteit te ondersteunen.
    3. Gebruik N1-methyl-pseudouridine in plaats van uracil en gebruik CleanCap AG om mRNA-translatie te verbeteren en de aangeboren immuunactivatiete verminderen 1,2,3,4 (Figuur 1).
      OPMERKING: Andere nucleotide-analogen en capping-reagentia zijn beschikbaar, maar deze hebben consequent hoge activiteit getoond in genoombewerkings-mRNA's. Nanopartikel-gebaseerde toediening is een geschikt alternatief, maar wordt in dit protocol niet besproken.
  2. Versterk de editor-coderingssequentie met PCR gedurende 30 cycli met primers die een functionele T7-promotor upstream van het coderingsgebied introduceren en een poly(A)-sequentie downstream (Tabel 2 en Tabel 3).
    OPMERKING: De nucleotidesequentie van het IVT-sjabloon is onderstreept in tabel 4.
  3. Verifieer en zuiver het PCR-product
    1. Draai 5 μL van het PCR-product op een 1% agarosegel in TE-buffer bij 180 V gedurende 30 minuten. Bevestig de aanwezigheid van een enkele band bij ongeveer 4000-6500 bp (afhankelijk van de editor die wordt getranscribeerd) voordat je doorgaat met PCR-productzuivering.
    2. Zuiver het PCR-product met een PCR-reinigingskit (Table of Materials).
      OPMERKING: Als meerdere banden of slechte PCR-productkwaliteit worden waargenomen, optimaliseer dan de thermocyclingcondities (Tabel 5 – Probleemoplossingstabel).
    3. Kwantificeer het gezuiverde DNA met een fluorometrische dsDNA-assay. Voor de Qubit dsDNA-analyse bereid je de buffer-dye mastermix voor door 796 μL van de hooggevoelige qubit-werkoplossing te combineren met 4 μL kleurstof, beide meegeleverd in de kit.
    4. In aparte buizen wordt 198 μL van de buffer-dye mastermix gemengd met 2 μL van de lage concentratie standaard S1, hoogconcentratie standaard S2 en het monster. Voeg elke standaard en monster in zoals gevraagd in het Qubit-fluorometerinstrument om de voorraadconcentratie te meten.
      OPMERKING: Als monsters boven het analysebereik liggen, moeten er mogelijk verdunningen worden voorbereid.

2. Transcribeer het mRNA

  1. Bereid de IVT-reactie op ijs voor met T7 RNA-polymerase, NTP's, een cap-analoge voor co-transcriptionele capping, en N1-methyl-pseudouridinetrifosfaat als uridine-vervanger om aangeboren immuunactivatie1˒5˒6 te verminderen.
  2. Bereid het IVT-reactiemengsel voor volgens Tabel 4. Gebruik de geannoteerde sjabloonreeks die in Tabel 4 wordt vermeld. Stel elke transcriptiereactie samen in een eindvolume van 40 μL.
  3. Bereid 5–10 reactiebuizen voor om voldoende mRNA te genereren voor meerdere experimenten. Elke 40 μL-reactie genereert ongeveer 100 μg mRNA. Met 1 μg mRNA voor prime editing elektroporatie en 3 μg mRNA voor base editing electroporation, is dit voldoende voor ~33–100 elektroporaties.
  4. Transcribeer het RNA
    1. Meng de IVT-reactie grondig door te pipetten. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 2 uur.
  5. Zuiver het RNA
    1. Overbrengen naar een buis van 1,5 mL en 7,5 M lithiumchloride (LiCl) oplossing toevoegen aan de IVT-reactie in een volume gelijk aan de helft van het totale reactievolume om een uiteindelijke LiCl-concentratie van 2,5 m te bereiken. Voor een IVT-reactie van 40 μL voeg je 20 μL van 7,5 M LiCl toe. Meng grondig door zacht te pipetten.
    2. Incubeer de reactie bij -20 °C gedurende 30 minuten. Centrifugeer het monster op 16.000 × g bij 4 °C gedurende 15 minuten.
    3. Verwijder het supernatant met een pipet en gooi het weg. Was de pellet met 1 ml 70% ethanol bij 4 °C. Het verstoren van de pellet is niet nodig. Centrifugeer op 16.000 × g bij 4 °C gedurende 5 minuten.
    4. Verwijder ethanol volledig en laat de pellet 1-2 minuten aan de lucht drogen in een RNase-vrije bioveiligheidskast. Droog de pellet niet te lang, want het kan moeilijk zijn om opnieuw te suspensjoneren.
  6. Skort het RNA opnieuw op en kwantificeer het RNA
    1. Sussen het RNA opnieuw in nucleasevrij water. Eerst wordt elke reactie opnieuw opgehangen in 50 μL nucleasevrij water en verder verdund na het meten van de RNA-concentratie. Kwantificeer het RNA met behulp van een fluorometrische RNA-assay zoals de nanodrop.
      Pauzepunt: Na RNA-kwantificatie en aliquotering wordt de mRNA-aliquoten opgeslagen bij -80 °C tot elektroporatie. Vermijd herhaalde vries-dooicycli; Ontdooi elke aliquot slechts één keer voor gebruik.
    2. Bevestig dat de gezuiverde mRNA-opbrengst ongeveer 100-400 μg per 40 μL IVT-reactie bedraagt. Verdun het mRNA tot 2 μg·μL-1 met nucleasevrij water voordat je aliquoteert. Bewaar de aliquots op −80 °C.
      OPMERKING: Vermijd herhaalde vries-dooicycli. Bereid wegwerp-aliquots voor en gooi ongebruikt, ontdooid materiaal weg. Bereid 12,5 μL aliquots voor in PCR-strips voor 8–20 elektroporaties per aliquot.
  7. Beoordeel de integriteit van RNA
    1. Beoordeel de grootte en integriteit van RNA door agarosegelelektroforese of geautomatiseerde elektroforese (Figuur 2)
    2. Bereid een 0,8% agarosegel met 10.000x verdund SYBR Gold. Gebruik een enkelstrengs RNA-ladder, zoals de NEB ssRNA-marker.
    3. Denatureer het mRNA met 2x RNA Gel Loading Dye en verhit monsters tot 65 °C gedurende 10 minuten voordat de monsters op de gel worden geladen.
    4. Bevestig dat het mRNA als een overheersende band verschijnt bij ongeveer 4000-6500 nt, afhankelijk van de te transcriberen editor, met minimale uitsmeering of producten met een laag moleculair gewicht. Verwijder RNA-monsters die aanzienlijke degradatie, uitsmeering of meerdere onverwachte banden vertonen.

3. Ontwerp en voorbereiding van geleide-RNA's

OPMERKING: Identificeer protospacer-aangrenzende motief (PAM)-sequenties binnen het doelgenomische locus en selecteer gids-RNA's die compatibel zijn met de gekozen editor en beoogde genomische modificatie. Gids-RNA-ontwerpplatforms zoals CHOPCHOP, CRISPOR, CRISPRware, IDT Cas9 Checker, Benchling en VectorBuilder kunnen worden gebruikt om gids-RNA's met gunstige voorspelde activiteit en specificiteit 6,7,8,9,10,11,12,13 te prioriteren.

  1. Identificeer PAM-locaties binnen het doelgenomische locus die compatibel zijn met de geselecteerde nucleasevariant, inclusief NGN-compatibele varianten, met behulp van gids-RNA-ontwerptools.
  2. Selecteer gids-RNA's met een hoge voorspelde on-target activiteit en lage voorspelde off-target activiteit. Bevestig het bewerkingsvenster voor het gids-RNA.
  3. Voor basisbewerking of prime editing toepassingen selecteer je guide-RNA's die de beoogde bewerking binnen het optimale activiteitsvenster van de geselecteerde editor positioneren.
  4. Bestel sgRNA of pegRNA met 2'-O-Methyl basenanalogen voor de eerste 3 en laatste 3 nucleotiden, evenals 3' fosforothioaatkoppeling tussen de eerste 3 en laatste 2 basen van de gidsen.
  5. Sussen de geleidings-RNA's opnieuw in nucleasevrij water of TE-buffer (100μM). Bereid 5 μL aliquots voor en bewaar deze aliquots bij −80 °C. Ontdooi en verdun bij gebruik in de elektroporatiebuffer vóór de elektroporatie.

4. Celkweekvoorbereiding

OPMERKING: Beoordeel celintegriteit met microscopie en levensvatbaarheidstests vóór elektroporatie.

  1. Kweek primaire fibroblasten of HEK293T cellen in DMEM aangevuld met 10% FBS, 4,5 g· L-1 glucose, GlutaMAX en 110 mg· L-1 natriumpyruvaat. Plaats de cellen op steriele T75-flessen (TC-oppervlak) met 20% confluentie per kolf. Houd de cellen tussen passages 1-20 in stand. Splits cellen bij 80% confluentie en gebruik cellen bij 70-80% confluentie voor elektroporatie.
  2. Kweek pluripotente stamcellen in mTeSR Plus media. Plat de cellen op steriele T75-flessen die met Geltrex zijn bedekt met 20% confluentie per kolf. Vervang het medium dagelijks en onderhoud de cellen tussen passages 1-20. Voeg CEPT-cocktail toe aan het medium voor de 24 uur na elke passage. Splits cellen bij 80% confluentie en gebruik cellen bij 70-80% confluentie voor elektroporatie.
  3. Houd de cellen op 37 °C in 5% CO₂ totdat de cellen de juiste dichtheid voor elektroporatie bereiken, meestal 70%–80% confluentie.
  4. Verwijder het medium wanneer cellen een geschikt aantal en confluentie voor elektroporatie hebben.
  5. Voeg TrypLE Express Enzyme toe aan de cellen (1 ml voor een T75-kolf) en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten. Pipeper de cellen voorzichtig tegen de kolf om een single-cell suspension te verkrijgen. Stop dissociatie door 3 mL celkweekmedium toe te voegen en controleer de afwezigheid van grote celklonten voordat je telt.
  6. Pellet de cellen op 1.000 × g gedurende 5 minuten, was de cellen één keer met 15 mL Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) en centrifugeer de cellen opnieuw.
  7. Beoordeel de celconcentratie en levensvatbaarheid met behulp van een geautomatiseerde levensvatbaarheidstest zoals de Nucleocounter NC-3000 met Oplossing 13. Combineer 11,4 μL cellen met 0,6 μL Oplossing 13 vóór de meting op de Nucleocounter. Ga alleen door met elektroporatie wanneer de cellevensvatbaarheid minimaal 85% is, en gooi monsters onder deze drempel weg of bereid ze opnieuw voor.
  8. Sussen de cellen opnieuw op een dichtheid van ongeveer 0,5 × 106–2 × 106 cellen·mL-1 in DPBS. Tel de cellen en beoordeel de levensvatbaarheid met een hemocytometer of celteller.
  9. Ga alleen door als de cellevensvatbaarheid ≥ 85% is.
  10. Suspendeer de cellen opnieuw in de elektroporatiebuffer. Sussief 2 × 105 cellen in 5 μL koude elektroporatiebuffer per reactie.
  11. Bereid de elektroporatiebuffer voor met de supplementoplossing volgens de instructies van de fabrikant direct voor gebruik en houd de buffer op ijs.
  12. Houd de cellen koud en ga snel verder. Houd de cellen op ijs en ga direct over tot de elektroporatie-installatie.

5. Elektroporatie

OPMERKING: Bereid bewerkingslading voor in PCR-stripbuizen om multikanaals pipettering te vergemakkelijken. Na elektroporatie worden de cellen opnieuw opgehangen in een medium aangevuld met een CEPT-cocktail om de celoverlevingte verbeteren.

  1. Maak de RNA-lading klaar.
    1. Bereid de RNA-lading op ijs voor door het combineren van de editor mRNA en geleidingsRNA(s) in een elektroporatiebuffer.
    2. Voor baseneditors en nucleasen bereid je een definitieve elektroporatieoplossing voor met 1,5 μL (3 μg) mRNA, 0,5 μL (50 pmol) geleide-RNA en 15 μL elektroporatiebuffer per monster.
    3. Voor prime editors bereid een definitieve elektroporatieoplossing voor die 0,5 μL (1 μg) mRNA, 1,5 μL (150 pmol) geleide-RNA's en 15 μL elektroporatiebuffer per monster bevat.
    4. Bereid de RNA-ladingoplossingen voor als een 1,2× mastermix om volumeverlies tijdens overdracht en monsterbehandeling te compenseren. Optimaliseer de reagentenvolumes en verhoudingen voor elke doelsite en editorvariant waar nodig.
  2. Geef de cellen, lading en elektroporate af.
    1. Voeg 5 μL celsuspensie toe aan elke elektroporatieput.
    2. Voeg 17 μL RNA-lading toe in de elektroporatiebuffer aan 5 μL cellen. Meng de suspensie door twee keer te pipetten.
      Let op: Ga snel te werk na het combineren van de cellen en RNA-lading, omdat door de cellen afgescheiden RNases het mRNA van de editor snel kunnen afbreken. Voltooi de elektroporatie binnen 2 minuten na het mengen van de cellen en RNA-lading.
    3. Voer het elektroporatieprogramma uit dat geoptimaliseerd is voor het geselecteerde celtype (Tabel 6; Figuur 2; Figuur 3).
      1. Voor primaire menselijke huidfibroblasten of HEK293T cellen gebruik het Lonza 4D elektroporatiesysteem met buffer SF. Voeg 200.000 cellen per reactie toe aan een 20 μL elektroporatiecuvet. Start programma CM-130. Voeg onmiddellijk 80 μL voorverwarmde DMEM toe + 10% FBS, 4,5 g· L-1 glucose, 4 mM L-glutamine en 110 mg· L-1 natriumpyruvaat. Herstel cellen gedurende 10 minuten voordat je verdunt in 96- of 24-wellplaten.
      2. Voor pluripotente stamcellen gebruik je het Lonza 4D-elektroporatiesysteem met buffer P3. Voeg 200.000 cellen per reactie toe aan een 20 μL elektroporatiecuvet. Voer programma DN-100 uit. Voeg onmiddellijk 80 μL voorverwarmde mTeSR Plus-media toe. Herstel cellen gedurende 10 minuten voordat je ze verdunt in platen met 24 putjes.
    4. Controleer de cellen dagelijks na het plateren om de gezondheid en het herstel van de cellen te monitoren.

6. Extractie van genomisch DNA

OPMERKING: Zorg ervoor dat genomisch DNA van voldoende kwaliteit is en vrij van remmers vóór PCR-amplificatie, aangezien DNA-kwaliteit de voorbereiding van sequencingbibliotheek en nauwkeurige kwantificering van genoombewerkingsuitkomsten kan beïnvloeden 9,10,11.

  1. Was en oogst de cellen.
    1. Verzamel de cellen 2-3 dagen na elektroporatie. Was de cellen één keer met DPBS en ga direct door met genomische DNA-extractie.
    2. Bereid een onvolledige lysisbuffer voor door 10 mL van 1 M Tris-HCl (pH 8,0), 5 mL van 10% (wt/vol) natriumdodecylsulfaat (SDS) oplossing en nucleasevrij water te combineren tot een eindvolume van 1 L. Bewaar de onvolledige lysisbuffer tot 6 maanden bij kamertemperatuur.
    3. Bereid een volledige lysisbuffer voor door proteïnase K met een verdunning van 1:1.000 (vol/vol) toe te voegen aan een aliquot van onvolledige lysisbuffer. Voeg de volledige lysisbuffer toe aan de cellen om de lysie te starten. Voeg 40 μL volledige lysisbuffer toe aan elke put die ongeveer 80.000 cellen bevat in een 96-wellplaat. Pipeper niet op en neer, want dit kan monsterverlies veroorzaken.
  2. Verteer de monsters.
    1. Incubeer de monsters bij 37 °C gedurende 60 minuten om cellyse en proteïnase K-vertering te voltooien.
  3. Inactiveer proteïnase K.
    1. Breng de lysaten over naar PCR-buizen of een 96-put PCR-plaat. Incubeer de monsters bij 80 °C gedurende 30 minuten om de proteïnase K te inactiveren.
  4. Bewaar de lysaten.

Pauzepunt: Bewaar de lysaten bij −20 °C tot PCR-versterking.

7. Gerichte amplicon-sequencing voor montageanalyse

OPMERKING: Verzamel PCR-producten in equimolaire hoeveelheden vóór sequencing. Ongeveer 10.000 sequencing-reads per monster zijn over het algemeen voldoende voor de kwantificering van bulk-uitkomsten van genoombewerking.

  1. Ontwerp locus-specifieke primers om ongeveer 300 bp amplicons te genereren die ten minste 25 bp upstream en 25 bp downstream van de bewerkingssite beslaan (Tabel 7).
  2. Versterk het doelgenomische locus door PCR1 uit te voeren volgens de voorwaarden in Tabel 8, Tabel 9.
  3. Voeg unieke steekproefindices toe via PCR met het PCR1-product als sjabloon, zoals bij primers weergegeven in Tabel 7 van het tabblad "Voorbeeld PCR-indexeringsprimers". Gebruik PCR-condities zoals weergegeven op tabblad 2 van Tabel 8 en Tabel 9.
  4. Gebruik de PCR1- en PCR2-producten op een 1,5% agarosegel om de aanwezigheid van single bands op de verwachte groottes te bevestigen.
  5. Combineer de PCR2-producten in equimolaire hoeveelheden. Maak de gepoolde PCR2-bibliotheek schoon met behulp van de AMPure XP korrel-naar-monster verhouding van 0,65:1 volgens de instructies van de fabrikant. Eluteer de gezuiverde bibliotheek in 30 μL nucleasevrij water en controleer het verwijderen van adapterdimers door gelelektroforese voordat het sequenceert.
  6. Kwantificeer de uiteindelijke gepoolde bibliotheek met een fluorometrische dsDNA-assay. Beoordeel de fragmentgrootteverdeling door capillaire elektroforese.
  7. Sequencen de bibliotheken met single-end 300-cyclus reads op een Illumina MiSeq-instrument. Verdunn de uiteindelijke gepoolde bibliotheek tot 4 nM. Combineer 5 μL de gepoolde 4 nM-bibliotheek met 5 μL 0,1 M NaOH en pipet om te mengen. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur om te denatureren, voeg daarna 990 μL gekoelde HT-buffer toe die bij de MiSeq-kit wordt geleverd om de oplossing te neutraliseren en te verdunnen tot 20 pM. Piek in 15% PhiX-controle. Laad de bibliotheek op een Illumina MiSeq-cartridge en voer single-end 300-cycli sequencing uit met de standaard run-instellingen van de fabrikant. Streef ernaar ongeveer 30.000 reads per sample te genereren, hoewel 10.000 reads per sample voldoende zijn voor bewerkingsanalyse12. MiSeq-sequencing kan per sample worden uitgevoerd bij sommige bedrijven zoals Genewiz of Quintara.

8. Analyse van genoomeditatie-uitkomsten

Opmerking: CRISPResso2-analyse maakt kwantificatie mogelijk van de algehele bewerkingsefficiëntie, nucleotideconversiefrequenties en insertion/deletion (indel) frequenties, en kan worden gebruikt om bewerkingsuitkomsten te karakteriseren over experimentele omstandigheden15.

  1. Demultiplexen de sequencinggegevens en organiseren de FASTQ-bestanden op basis van genomisch locus en experimentele conditie.
  2. Installeer CRISPResso2 volgens de instructies in de Github-repository (https://github.com/pinellolab/crispresso2).
  3. Voer CRISPResso2 batchanalyse uit met batch.txt bestanden die de invoer FASTQ-bestanden en analyseparameters specificeren (voorbeelden in Tabel 7). Stel de minimale leeskwaliteit score in op 30. Stel de "w"-vensterbreedte in op 20. Bij gebruik van cytosine-baseneditors kunnen sommige indels worden gecentreerd rond de basis-bewerkte nucleotiden naast de nicksite. In dat geval stel je het "wc" venstercentrum aan op -10 in plaats van het standaardcentrum bij de nicksite om deze inels zo goed mogelijk vast te leggen.
  4. Extraheer kwantitatieve outputs, zoals de nucleotideconversiefrequenties, insertion/deletion (indel) frequenties en (indien van toepassing) HDR- of prime bewerkingsfrequenties uit de juiste samenvattende uitvoerbestanden. Deze worden meestal gevonden in bestanden met de namen "CRISPRessoBatch_quantification_of_editing_frequency.txt" en "Nucleotide_percentage_summary.txt", die geopend kunnen worden in Microsoft Excel of andere spreadsheetbewerkingssoftware.
  5. Exporteer de kwantitatieve bewerkingswaarden voor downstream plotten en data-interpretatie, zoals in Figuren 3-4. Gebruik de "alleles_frequency_table_around_sgRNA.pdf"-bestanden (zoals weergegeven in Figuur 5) om de resultaten van allelbewerkingen te beoordelen.

Resultaten

Het gebruik van een efficiënte editor met een gemakkelijk toegankelijke testlocatie, zoals de ABE8e-basiseditor met de HEK3-controlesite, kan vaak resulteren in bewerkingsefficiënties van meer dan 90% als het leveringssysteem goed geschikt is voor de cellen die in het experiment worden gebruikt. Lagere bewerkingsefficiëntie kan ontstaan als er problemen zijn met het editor-mRNA, gids-RNA, de doellocatie of de afleveringsvoorwaarden die het minder geschikt maken voor bewerking. Het gebruik van Cas9-varianten die toegang krijgen tot veelzijdigere PAM-sequenties maar deze minder strak binden, of het richten van editors op nucleotiden die buiten hun ideale bewerkingsvenster vallen, kan de bewerkingsefficiëntie verminderen. Succesvolle door IVT gegenereerde editor-mRNA's verschijnen doorgaans als een enkele overheersende band met minimale uitsmeering of laag-moleculair gewicht afbraakproducten, wat wijst op een hoge transcriptintegriteit die geschikt is voor downstream elektroporatie (Figuur 2).

Na elektroporatie van editor-mRNA en synthetische gids-RNA's herstellen de meeste cellen binnen 24–48 uur en behouden ze hun typische morfologie met geschikte elektroporatieprogramma's (Figuur 3–4). Elektroporatiecondities moeten worden afgestemd op het specifieke celtype, omdat verschillende buffers tot duidelijk verschillende uitkomsten kunnen leiden. Het online Lonza Knowledge Center doet aanbevelingen voor buffer- en elektroporatiecodes voor veelvoorkomende celtypen, en Lonza biedt aparte optimalisatiekits voor cellijnen en primaire cellen. Empirische vergelijking van buffers kan helpen optimale voorwaarden voor efficiënte levering te identificeren. Ongeschikte programma's kunnen leiden tot helemaal geen levering of zeer toxisch zijn voor cellen (meer dan 50% verliezen of het voortzetten van de celcyclus voorkomen). Representatieve optimalisatie-experimenten toonden aanzienlijke verschillen in bewerkingsuitkomsten over elektroporatiecondities, waarbij sommige programma's hoge bewerkingsefficiëntie opleverden terwijl andere minimale bewerkingen produceerden, wat het belang van empirische optimalisatie voor elk celtype benadrukt (Figuur 3–4).

Tussen iPSC's, fibroblasten en LCL's wordt gerichte ampliconsequencing gevolgd door CRISPResso2-analyse gebruikt om de bewerkingsefficiëntie en bijproducten te kwantificeren (Figuur 4). Adeninebasisbewerking van de HEK3-testlocus is hier weergegeven (Figuur 4), wat resulteerde in de beoogde nucleotideconversies met lage indelfrequenties in de geanalyseerde monsters. CRISPResso2-analyse maakt visualisatie mogelijk van bewerkte en niet-bewerkte allelen op de doellocus en faciliteert de kwantificering van beoogde nucleotideconversies, indelfrequenties en andere bewerkingsbijproducten, wat een uitgebreide beoordeling van bewerkingsuitkomsten biedt (Figuur 5). De bewerkingsefficiëntie wordt gekwantificeerd door de frequentie van deze precieze enkelvoudige nucleotidesubstitutie op de doellocatie te meten. De HEK3-locus wordt gebruikt als modellocus vanwege zijn goed gekarakteriseerde bewerkingsprofiel en reproduceerbaarheid over experimentele systemen, wat robuuste evaluatie van basisbewerkingsprestaties onder verschillende omstandigheden mogelijk maakt. We raden aan deze gids te testen als positieve controle in menselijke cellen bij het optimaliseren van nieuwe bewerkingsprocedures. Basisbewerking wordt doorgaans verrijkt voor beoogde nucleotideconversies met lage indelfrequenties, terwijl prime bewerking een mix oplevert van precieze bewerkingen en laagfrequente bijproducten 3,12. De bewerkingsefficiëntie varieerde per conditie, met duidelijke verschillen tussen celtypen en elektroporatieprogramma's (Figuur 3-4). Deze variaties weerspiegelen waarschijnlijk verschillen in cellulaire opname, levensvatbaarheid en DNA-reparatieactiviteit, evenals de invloed van elektroporatieparameters op de afgifte-efficiëntie. Gezamenlijk benadrukken deze bevindingen het belang van celtype-specifieke optimalisatie van elektroporatie-instellingen om consistente en maximale bewerkingsresultaten te bereiken.

figure-results-1
Figuur 1. Voorbereiding van editor mRNA door in vitro transcriptie.
Schematisch overzicht van de mRNA-generatie van editors. (Stap 1) Voorbereiding van plasmidesjabloon met de editorcoderingssequentie en T7-promotor. (Stap 2) PCR-amplificatie om een lineair DNA-sjabloon te genereren. (Stap 3) In vitro transcriptie met T7 RNA-polymerase om geccapte mRNA te synthetiseren. (Stap 4) Zuivering van mRNA om sjabloon-DNA, enzymen en vrije nucleotiden te verwijderen. Het resulterende gekapte mRNA is geschikt voor downstream levering aan zoogdiercellen via elektroporatie of lipidennanodeeltjes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2. Voorbeeldafbeelding van mRNA-gelelektroforese 
Elektroforesebeeld van drie genoomeditor-mRNA's draait op een 1% agarosegel met behulp van SYBR goudkleuring. De ssRNA-ladder van NEB wordt links getoond met groottemarkers aangegeven met hun lengte. Het ontbreken van aanzienlijke uitsmeering of kleine banden wijst erop dat deze mRNA's van geschikte kwaliteit zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Optimalisatie van elektroporatiecondities voor genoombewerking in geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). 
Bewerkingsefficiënties die onder verschillende elektroporatiecondities in iPSC's zijn verkregen, worden getoond. Cellen werden elektroporeerd met meerdere buffers en programmacombinaties, waaronder CB-150 buffer P4, CD-118 buffer P3, DN-100 buffer P3, DC-100 buffer P3, allemaal op het Lonza 4D Nucleofection-apparaat. De montage werd beoordeeld met behulp van het Neon-elektroporatieapparaat met parameters (1600 V, 20 ms, 1 puls). De bewerkingsefficiëntie werd gekwantificeerd door gerichte sequencinganalyse van de bewerkte locus. N=1 per monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Optimalisatie van elektroporatiecondities voor genoombewerking in fibroblasten.
Bewerkingsefficiëntie na elektroporatie met verschillende nucleofectieprogramma's. Fibroblasten werden geëlektrocopteerd met behulp van meerdere Lonza Nucleofector-programma's (CA-137, CM-138, DS-150, EH-100, EN-150, EO-114 en FF-113), en de bewerkingsuitkomsten werden gekwantificeerd door gerichte sequencing. Resultaten worden getoond voor twee replicaten (P2, P3). Een negatieve controle zonder redacteurslevering is inbegrepen. Vergelijking van elektroporatiecodes benadrukt verschillen in bewerkingsefficiëntie tussen elektroporatie-instellingen, waardoor optimale parameters voor fibroblastgenoombewerking kunnen worden geïdentificeerd. N=1 per monster. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. Karakterisering van genoombewerkingsuitkomsten op het beoogde locus. 
Allelfrequentietabel output van CRISPResso2, die de relatieve hoeveelheid bewerkte en onbewerkte allelen rondom het sgRNA-doelgebied toont, bepaald door high-throughput sequencinganalyse na bewerking. Rode annotaties geven het basisbewerkingsvenster aan en het reeds bestaande heterozygote polymorfisme dat aanwezig is in de gebruikte cellijn. De geleide-RNA-spacersequentie is onderstreept in grijs. "Voorspelde splijtingspositie" weergegeven door een stippellijn is verschoven ten opzichte van de typische "PAM min 3" positie voor SpCas9 vanwege de wijziging van het venstercentrum "wc" in ons analysebatchbestand (voorbeeld in Tabel 8). Dit verschuift de werkelijke voorspelde splitsingslocatie niet echt, maar de output wordt op deze manier weergegeven om aan te geven dat indels rondom de stippellijn binnen een venster van 20 nucleotiden worden beoordeeld, waarbij zowel indels die gecentreerd zijn op de werkelijke stiplocatie als die op de gedeamineerde nucleotiden worden vastgelegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1. Bewerkers en sequenties gebruikt in deze studie 
Kolom 1: Genoomredacteuren beschikbaar op AddGene voor in vitro transcriptie. Namen en Addgen-ID's voor beschikbare plasmiden die geschikt zijn voor in vitro transcriptie zoals beschreven in dit protocol. Kolom 2: Sequenties van geleide-RNA-spacers gebruikt in deze studie. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2. PCR-reagentia voor amplificatie van het mRNA-plasmidesjabloon.
De lijst van reagentia en reactiecomponenten die worden gebruikt voor PCR-amplificatie van het plasmidesjabloon om lineair DNA te genereren voor latere toepassingen, evenals de volgorde van de voor- en omgekeerde transcriptieprimers. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3. PCR-cyclische voorwaarden voor amplificatie van het mRNA-sjabloon. 
Deze tabel geeft een overzicht van de thermocyclische condities die worden gebruikt voor PCR-amplificatie van het mRNA-sjabloon uit het plasmide-DNA voorafgaand aan latere toepassingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 4. Reagentia gebruikt voor in vitro transcriptie (IVT) reacties. 
Deze tabel geeft een overzicht van de reagentia en reactiecomponenten die worden gebruikt voor in vitro transcriptie om editor-mRNA te synthetiseren uit het lineaire DNA-sjabloon. Een voorbeeld-sjabloonsequentie (ABE8e) wordt weergegeven met kleurgecodeerde elementen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 5. Handleiding voor probleemoplossing voor belangrijke stappen in de genoombewerkingsworkflow. 
Deze tabel vat veelvoorkomende technische problemen samen die kunnen ontstaan tijdens de mRNA-voorbereiding van editor door in vitro transcriptie (IVT) en MiSeq-sequencinganalyse. Voor elke stap van de workflow worden mogelijke problemen, mogelijke oorzaken en aanbevolen oplossingen gegeven om te helpen bij het optimaliseren van de bewerkingsefficiëntie en het waarborgen van nauwkeurige detectie van bewerkingsresultaten. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 6. Optimale elektroporatieprogramma's voor verschillende zoogdierceltypen. 
Deze tabel geeft een overzicht van de elektroporatieprogrammacodes en buffercondities die worden gebruikt voor efficiënte levering van editor-mRNA en gids-RNA's in verschillende zoogdierceltypen. De vermelde elektroporatieparameters werden getest om condities te identificeren die de efficiëntie van genoombewerkingen maximaliseren terwijl de cellevensvatbaarheid behouden blijft. Hetzelfde programma werkt mogelijk niet voor elke cellijn of bron van primaire cellen, dus het testen van alternatieven uit deze lijst wordt aanbevolen als bewerkingen aanvankelijk niet succesvol zijn. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 7. CRISPResso2-analyseparameters voor kwantificatie van genoomeditie-uitkomsten. 
Het eerste tabblad toont een voorbeeld van het HTS1-primerontwerp dat wordt gebruikt voor versterking van de doellocus. Het tweede tabblad geeft een voorbeeld van de indexeringsprimers die werden gebruikt tijdens de voorbereiding van de bibliotheek. Het derde tabblad illustreert een voorbeeld van de indexeringsopstelling die wordt gebruikt om unieke indices aan elke steekproef toe te wijzen tijdens het sequencen. Het vierde tabblad bevat een voorbeeld van een invoerbatchbestand voor CRISPResso2-analyse, en het vijfde tabblad geeft een extra voorbeeld van een CRISPResso2-analyse-invoerbatchbestand. Let op dat het venstermidden "wc" wordt aangepast voor basiseditors om detectie van indels te vergemakkelijken die gecentreerd zijn op de gedeamineerde bases, naast die op de nuclease-cut of snyplaats. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 8. PCR1 (Tab 1) en PCR2 (Tab 2) reagentia voor de voorbereiding van MiSeq-bibliotheek.
Deze tabel geeft een overzicht van de reagentia en reactiecomponenten die in Tab 1 (PCR1) worden gebruikt om de doelgenomische loci te amplificeren en in Tab 2 (PCR2) om monsterspecifieke indexsequenties en Illumina-sequencingadapters te integreren, waarmee sequencing-klare bibliotheken worden gegenereerd voor MiSeq-analyse. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 9. PCR1 (Tab 1) en PCR2 (Tab 2) cycli-condities voor de voorbereiding van de MiSeq-bibliotheek.

Deze tabel geeft de thermocyclische condities weer die in Tab 1 (PCR1) worden gebruikt om de doelgenomische regio's te amplificeren en in Tab 2 (PCR2) om monsterspecifieke indexsequenties en Illumina-sequencingadapters te integreren, waarmee sequencing-klare bibliotheken worden gegenereerd voor MiSeq-analyse. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

Dit protocol biedt een workflow voor genoombewerking in primaire zoogdiercellen met behulp van elektroporatie van editor-mRNA en synthetische gids-RNA's. Levering als mRNA levert doorgaans efficiëntere bewerking op ten opzichte van plasmideafgifte, en mRNA is doorgaans eenvoudiger en consistenter tussen batches ten opzichte van het editoreiwit of ribonucleoproteïne. Wanneer mRNA- en ribonucleoproteïnevormen van baseneditors in eerdere studies direct aan kop zijn vergeleken, heeft mRNA een betere bewerkingsefficiëntie opgeleverd3. In vergelijking met plasmide- of virale afgiftemethoden maakt mRNA-gebaseerde levering tijdelijke expressie mogelijk en vermindert het risico op genomische integratie, hoewel dit mogelijk optimalisatie vereist voor verschillende celtypen. Naast een lagere redactie-efficiëntie brengt het gebruik van plasmide-DNA voor genoombewerking het risico met zich mee dat het willekeurig wordt geïntegreerd in het genoom van doelcellen en kan het risico op off-target bewerking verhogen door langdurige expressie van de editor. De combinatie van gerichte ampliconsequencing en CRISPResso2 maakt gestandaardiseerde kwantificering van bewerkingsefficiëntie en karakterisering van alle alleluitkomsten mogelijk3.

Verschillende factoren zijn essentieel voor succes. Kritieke stappen in dit protocol zijn onder andere het behouden van RNA-integriteit door strikte RNase-vrije behandeling, het selecteren van optimale geleidings-RNA's en het zorgvuldig optimaliseren van elektroporatiecondities voor elk celtype. RNA-integriteit en nauwkeurige RNase-controle hebben grote invloed op de uitkomsten, en de selectie van RNA blijft een belangrijke factor voor effectiviteit en bijproductprofielen. Elektroporatie-instellingen vereisen empirische optimalisatie op celtype en sommige programma's die hoge bewerking opleveren, kunnen ook toxiciteit veroorzaken. Als er een lage bewerkingsefficiëntie wordt waargenomen, moet optimalisatie van elektroporatieparameters, RNA-kwaliteit of het ontwerp van het geleidelijke RNA worden overwogen. Als er overmatige toxiciteit optreedt, kan het verminderen van de elektroporatiesterkte of RNA-input de levensvatbaarheid van de cel verbeteren. Aanvullende optimalisatiestrategieën omvatten het testen van alternatieve elektroporatiebuffers en programma's die zijn afgestemd op het doelceltype of het modificeren van editor- of leid-RNA-concentraties. Deze workflow biedt een praktisch platform om editors te benchmarken en aangepaste cellen te produceren voordat downstream single-cell klonen, fenotypering, in vivo studies of translationele ontwikkeling plaatsvinden. Deze workflow is breed toepasbaar voor het evalueren van genoombewerkingsstrategieën in primaire cellen, waardoor systematische vergelijking van bewerkingsmodaliteiten tussen genomische contexten en celtypen mogelijk is. Het ondersteunt ziektemodellering door de introductie of correctie van klinisch relevante varianten, evenals functionele onderzoeken van coderende en niet-coderende regulatorische elementen. Daarnaast biedt het een platform om therapeutische bewerkingsmethoden te optimaliseren, waaronder het beoordelen van on-target efficiëntie, off-target activiteit en montageduurzaamheid. De workflow kan ook worden gebruikt om gids-RNA's en bewerkingssystemen te screenen en te prioriteren, toedieningsstrategieën te evalueren en patiëntspecifieke varianten te testen binnen een precisiegeneeskunde-framework. Gezamenlijk dient het als een veelzijdige brug tussen basisgenoombiologie, translationeel onderzoek en preklinische ontwikkeling. Een beperking van deze methode is dat de efficiëntie en levensvatbaarheid van de cel aanzienlijk kunnen variëren tussen celtypen, wat empirische optimalisatie vereist. Daarnaast kunnen bewerkingsuitkomsten afhangen van het ontwerp en de zuiverheid van het gids-RNA, en de toegankelijkheid van de doellocus, wat de reproduceerbaarheid tussen verschillende experimentele systemen kan beperken. Ondanks deze beperkingen kan zorgvuldige optimalisatie van experimentele parameters en het ontwerp van gidsen variabiliteit beperken, waardoor een betrouwbare en reproduceerbare toepassing van deze aanpak mogelijk wordt over diverse cellulaire systemen.

Openbaarmakingen

N.W. en E.V.B. hebben octrooiaanvragen ingediend op genoombewerkingstechnologieën via Johns Hopkins University. G.A.N. heeft octrooiaanvragen ingediend met betrekking tot genoombewerkingstechnologieën via het Broad Institute en Johns Hopkins University.

Bijdrage van de auteur:
M.V., J.N.W., E.V.B, D.M.E., J.D. en G.A.N. stelden elk afzonderlijke delen van de tekst op. M.V. stelde de definitieve tekst samen en redigeerde deze, gevolgd door bewerkingen van alle auteurs.

Dankbetuigingen

Wij danken Beatriz Olalla Sastre voor nuttige discussies over dit protocol. Dit werk werd ondersteund door de Big Beat Challenge-prijs van de British Heart Foundation aan CureHeart (prijsreferentie nr. BBC/F/21/220106), de Cystic Fibrosis Foundation (toekenning NEWBY23XX0) en de US National Institutes of Health (R00HL163805 en DP2OD038783 aan G.A.N.). J.N.W. erkent steun van NIH Grant nr. T32 GM148383.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1M Tris-HCl, pH 8.0Thermo Fisher Scientific15568025
Agarose Thermo Fisher Scientific R0491 Agarose UltraPure 16500500 ThermoFisher 500g
AMPure XP SPRI Beads Beckman Coulter B23317 A63880, AMPure XP Beads for DNA Cleanup, 5 mL, Beckman Coulter
ATP (100 mM) New England Biolabs N0450 
CEPT Cocktail Bio-Techne / Tocris 7200 
CleanCap AG Reagent TriLink Biotechnologies N-7113 CleanCap AG 3′ OMe CleanScript IVT Kit, 125 x 20 µL rxns, 
CTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Custom DNA Primers Integrated DNA Technologies Custom 
DNA Loading Dye New England Biolabs B7024 
DPBS (Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline) Thermo Fisher Scientific 14190-144 D8537-100ML
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Thermo Fisher Scientific 11965-092 DMEM High Glucose [4,500 mg/L] with [4.0 mM] L-Glutamine and [110 mg/L] Sodium Pyruvate, 500 mL
Gel Extraction Kit Qiagen 28704 
GTP (100 mM) New England Biolabs N0450 
Illumina Indexing Primers Illumina FC-131-2001 10uM stocks
Illumina MiSeq Sequencer Illumina SY-410-1003 
Lithium Chloride RNA Precipitation Solution Thermo Fisher Scientific AM9480 
Lonza 4D Nucleofector System Lonza AAF-1002X 
ssRNA Ladder NEBNEBN0362S5ul/ reactie
MiSeq Reagent Kit v3 (300 cycles) Illumina MS-102-3002 
N1-Methyl-Pseudouridine-5′-Triphosphate TriLink Biotechnologies N-1081 
NEBNext Ultra II Q5 Master Mix New England Biolabs M0544 
Nuclease-Free Water Thermo Fisher Scientific AM9937 
NucleoCounter NC Slide A8 ChemoMetec 941-0008 
NucleoCounter NC-3000 ChemoMetec NC-3000 10ul van celoplossing en 0.4167 μL van DAPI-oplossing 
Solution 15, Hoechst 33342, 1 mL 910-3015 ChemometecChemometec910-3013 500 μg/ml ~ 0.9 mM ~ 0.05%
Nucleocuvette Strips Lonza V4XP-3032 
P3 Primary Cell Nucleofector Solution Lonza V4XP-3032 1 x 0.675 mL P3 Primary Cell Nucleofector® Solution
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher Scientific F530L 
Proteinase K Thermo Fisher Scientific EO0491 Hoeveelheid: 1mL, >600 U/mL (~20 mg/mL)
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase New England Biolabs M0491 2.000 eenheden/ml 100 eenheden 
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104 
Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q33230 
Qubit RNA Broad Range Assay Kit Thermo Fisher Scientific Q10211 
Qubit™ Assay TubesThermo Fisher ScientificQ32856
RNA Gel Loading Dye (2x)Thermo Fisher ScientificR06415ul/ reactie
RNA Purification Kit Zymo Research R1017 
RNase Away Thermo Fisher Scientific 1236B62 
SDS, 10% oplossingThermo Fisher Scientific 15553027
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermo Fisher ScientificS11494
SYBR Safe DNA Gel Stain Thermo Fisher Scientific S33102 
Synthetic sgRNA / pegRNA Synthego / IDT Custom 2ug 
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit, 250 reactiesNew England Biolabs E2040L
TrypLE Express Enzyme Thermo Fisher Scientific 12604013 100 mL
TE buffer (Tris-EDTA)Thermo Fisher Scientific AM9849TE, pH 8.0, RNase-vrij Thermo
Trypsin-EDTA (0.25%) Thermo Fisher Scientific 25200056 1X 
Fetal Bovine Serum (FBS), Premium, 500 mLThermo Fisher ScientificA5670701
mTSER PLUS STEM cell Technologies# 100-0276
Penicillin/Streptomycin Mixture 10.000 ug/mL, 100 mL, 4-packQuality Biological120-095

Referenties

  1. Gao H, Gao S, Kan G, Valentovich LN, An Y. Research progress of base editing and prime editing tools based on the CRISPR/Cas system. Mol Ther Nucleic Acids. 2025;36.
  2. Chen PJ, Hussmann JA, Yan J, et al. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes. Cell. 2021;184(22):5635–5652. doi:10.1016/j.cell.2021.09.018.
  3. Newby GA, Yen JS, Woodard KJ, et al. Base editing of haematopoietic stem cells rescues sickle cell disease in mice. Nature. 2022;595(7866):295-302. doi:10.1038/s41586-021-03609-w.
  4. Sousa AA, Hemez C, Lei L, et al. Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells. Nat Biomed Eng. 2024;9(1):7. doi:10.1038/s41551-024-01233-3.
  5. Mayuranathan T, Newby GA, Feng R, et al. Potent and uniform fetal hemoglobin induction via base editing. Nat Genet. 2023;55(7):1210-1217.
  6. He W, Zhang X, Zou Y, et al. Effective synthesis of high-integrity mRNA using in vitro transcription. Molecules. 2024;29(11).
  7. Popova PG, Lagace MA, Tang G, Blakney AK. Effect of in vitro transcription conditions on yield of high-quality messenger and self-amplifying RNA. Eur J Pharm Biopharm. 2024;198.
  8. Zhang F, Wang Y, Wang X, et al. RT-IVT method allows multiplex real-time quantification of in vitro transcriptional mRNA production. Commun Biol. 2023;6(1).
  9. Montague TG, Cruz JM, Gagnon JA, Church GM, Valen E. CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing. Nucleic Acids Res. 2014;42(W1)-W407.
  10. Concordet JP, Haeussler M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Res. 2018;46(W1)-W245.
  11. Mohr SE, Hu Y, Ewen-Campen B, Housden BE, Viswanatha R, Perrimon N. CRISPR guide RNA design for research applications. FEBS J. 2016;283(17):3232-3245.
  12. Huang TP, Newby GA, Liu DR. Precision genome editing using cytosine and adenine base editors in mammalian cells. Nat Protoc. 2021;16(2):1089-1106. doi:10.1038/s41596-020-00450-9.
  13. Doman JL, Sousa AA, Randolph PB, Chen PJ, Liu DR. Designing and executing prime editing experiments in mammalian cells. Nat Protoc. 2023;18(6):1780-1818. doi:10.1038/s41596-022-00724-4.
  14. Chicaybam L, Barcelos C, Peixoto B, et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Front Bioeng Biotechnol. 2017;4:99.
  15. Clement K, Rees H, Canver MC, et al. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis. Nat Biotechnol. 2019;37(3):224-230.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

BiologieEditie 233Editie 233Lege WaardeEditiemRNAnucleofectieIVTiPSCsfibroblastenbase editorprime editor
Genoombewerking in primaire zoogdiercellen via elektroporatie van editor-RNA
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.