Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Time-lapse-beeldvorming van antilichaam-gestuurde fagocytose van met groen fluorescent eiwit gelabelde triple-negatieve borstkankercellen door macrofagen

165 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

14 augustus 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een time-lapse live-cell imaging methode om antilichaam-afhankelijke fagocytose van met groen fluorescent proteïne gelabelde triple-negatieve borstkankercellen door macrofagen te visualiseren, met gebruik van macrofagen afgeleid van mononucleaire cellen uit perifeer bloed en een geautomatiseerde microscoop.

Samenvatting

Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose is een belangrijk mechanisme waarmee macrofagen antilichaam-opsoniseerde kankercellen insluiten. Dit protocol beschrijft een methode voor time-lapse live-cell imaging om de antilichaam-afhankelijke fagocytose door macrofagen van groen fluorescent eiwit-gelabelde, CD24-expresserende triple-negatieve borstkankercellen te visualiseren. Macrofagen worden afgeleid van mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed, gedifferentieerd met macrophage colony–stimulating factor en gepolariseerd met interferon gamma en lipopolysacharide om een pro-inflammatoir fenotype te genereren. Kankercellen worden opsoniseerde met een anti-CD24 monoklonaal antilichaam voorafgaand aan co-cultuur met macrofagen bij een gedefinieerde effector-to-target ratio. Fagocytische gebeurtenissen worden gedurende een periode van 16 h geregistreerd met behulp van een geautomatiseerde microscoop uitgerust met omgevingscontrole om fysiologische omstandigheden te handhaven. De beeldvorming wordt uitgevoerd met helderveld- en fluorescentiekanalen, waardoor kankercellen kunnen worden geïdentificeerd en hun internalisatie door macrofagen kan worden gemonitord. Representatieve time-lapse beelden tonen de progressieve insluiting van fluorescente kankercellen in de loop van de tijd. Om een kwantitatieve beoordeling mogelijk te maken, wordt een parallelle endpoint-assay uitgevoerd onder identieke co-cultuurcondities, waarbij niet-geïnternaliseerde kankercellen vóór de beeldvorming worden verwijderd om een nauwkeurige meting van fagocytische gebeurtenissen mogelijk te maken. Deze methode biedt een gestandaardiseerde en reproduceerbare aanpak voor het visualiseren van antilichaam-gestuurde macrofaagfagocytose in vitro. Belangrijk is dat de integratie van time-lapse imaging met endpoint-gebaseerde kwantificering een complementaire evaluatie van de kinetiek en de omvang van de fagocytose mogelijk maakt. Dit protocol ondersteunt de evaluatie van therapeutische antilichamen en macrofaag-gerichte kankerimmunotherapieën in een gecontroleerde in vitro setting.

Inleiding

Borstkanker is de meest gediagnosticeerde maligniteit bij vrouwen wereldwijd, met jaarlijks ongeveer 2,3 miljoen nieuwe gevallen1. De ziekte is klinisch heterogeen en wordt ingedeeld in ten minste vier belangrijke moleculaire subtypen op basis van de status van hormoonreceptoren — de oestrogeenreceptor (ER) en de progesteronreceptor (PR) — en de expressie van het humane epidermale groeifactorreceptor 2 (HER2) oncogen2. Luminale A-tumoren vertonen expressie van ER en/of PR zonder HER2-overexpressie (ER/PR+ en HER2−); luminale B-tumoren co-expresseren ER/PR en HER2 (ER/PR+ en HER2+); HER2+-tumoren worden gekenmerkt door een hoge HER2-expressie onafhankelijk van de hormoonreceptortatus; en triple-negatieve borstkanker (TNBC) vertoont geen expressie van al deze drie markers (ER−, PR− en HER2−)2,3. Van deze subtypen is TNBC de klinisch meest uitdagende vorm en is deze verantwoordelijk voor ongeveer 15%–20% van alle gevallen van borstkanker. Patiënten met TNBC vertonen het meest agressieve ziekteverloop, met de slechtste prognose en de kortste 5-jarige algehele overleving, als gevolg van een geringe respons op conventionele chemotherapie en het ontbreken van effectieve doelgerichte therapieën3,4. Daarnaast vertoont TNBC een significant hoge neiging tot viscerale metastase, in het bijzonder naar de longen binnen 5 jaar na de diagnose, en patiënten met gevorderde of gemetastaseerde TNBC (mTNBC) hebben een mediane overleving die zelden de 2 jaar overschrijdt5,6. Deze statistieken onderstrepen de kritieke en onvervulde behoefte aan nieuwe therapeutische strategieën voor TNBC.

De tumormicro-omgeving (TME) speelt een cruciale rol bij de progressie van borstkanker en immuunontwijking. Tumor-geassocieerde macrofagen behoren tot de meest abundante immuencellen binnen de TME en zijn recentelijk erkend als kritische mediatoren van aangeboren antitumorale immuniteit7,8,9. Hoewel TAMs historisch gezien werden onderverdeeld in pro-inflammatoire “M1”- en pro-tumorale “M2”-toestanden, slaagt dit binaire model er niet in om de werkelijke omvang van de macrofaagheterogeniteit vast te leggen. In plaats daarvan beslaan TAMs een dynamisch functioneel spectrum dat evolueert als reactie op de diverse biochemische signalen binnen de TME. Binnen dit complexe landschap ondermijnen kankercellen actief de macrofaagactiviteit via diverse strategieën voor immuunontwijking, in het bijzonder de overexpressie van “don’t eat me”-signalen. De CD47/SIRPα-as was het eerste geïdentificeerde aangeboren immuun-checkpoint in deze context6,10, en recentelijk is CD24 naar voren gekomen als een nieuw en potent antifagocytisch signaal11,12. CD24 is een klein en sterk geglycosyleerd mucine-type glycoproteïne dat via een glycosylfosfatidylinositol-binding aan het celmembraan is verankerd13. Het wordt onder fysiologische omstandigheden tot expressie gebracht in diverse immuuncellijnen, maar is frequent overexpress in solide tumoren, waaronder borst-, eierstok-, pancreas- en colorectale kanker14. Op tumorcellen bindt CD24 aan de inhiberende receptor sialinezuur-bindend immunoglobuline-achtig lectine 10 (Siglec-10) die tot expressie komt op macrofagen. Deze interactie triggert fosforylering van de immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif-domeinen in de cytoplasmatische staart van Siglec-10, waardoor de SHP-1 en SHP-2 fosfatasen worden geactiveerd die de daaropvolgende fagocytische signalering onderdrukken11. Blokkade van de CD24/Siglec-10-interactie met een monoklonaal antilichaam heeft aangetoond dat de fagocytose van CD24-expresserende humane tumoren door macrofagen robuust wordt versterkt. Onze recente studie toonde ook aan dat knockout van CD24a in borstkankercellen hun vatbaarheid voor macrofaagfagocytose verhoogt in een muismodel voor triple-negatieve borstkanker9.

Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) is een cruciaal mechanisme waarmee antilichamen macrofagen aansturen om tumorcellen te fagocyteren15,16. Na binding aan tumor-geëxprimeerde antigenen engageert de Fc-regio van het antilichaam Fcγ-receptoren (FcγRs) op macrofagen, wat intracellulaire signaalcascades in gang zet die culmineren in cytoskeletale reorganisatie, de vorming van een fagocytotische cup en de opname van de doelcel17.

In deze studie hebben we een time-lapse live-cell imaging protocol ontwikkeld en gevalideerd voor het meten van antilichaam-gestuurde fagocytose van borstkankercellen door macrofagen. De methode maakt gebruik van macrofagen afgeleid van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) van gezonde menselijke donoren, gedifferentieerd met macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) en vervolgens gestimuleerd met lipopolysaccharide (LPS) en interferon gamma (IFN-γ). Flowcytometrie-analyse bevestigde de upregulatie van CD80 binnen de CD11b⁺ populatie na stimulatie (Figuur 1), wat het klassiek geactiveerde fenotype ondersteunt. Deze activatiestatus verleent een robuust antilichaam-gemedieerd fagocytisch vermogen, waardoor het zeer geschikt is voor het evalueren van antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP). GFP-getagde CD24-positieve borstkankercellen dienen als doelcellen en worden geopsoniseerd met een therapeutisch anti-CD24 monoklonaal antilichaam voorafgaand aan de co-cultuur. Fagocytische gebeurtenissen worden over een periode van 16 h vastgelegd met een geautomatiseerde microscoop onder gecontroleerde omgevingscondities. Om een kwantitatieve beoordeling parallel aan de dynamische visualisatie mogelijk te maken, wordt een aparte endpoint-assay uitgevoerd onder identieke co-cultuurcondities, wat een nauwkeurige meting van de fagocytose mogelijk maakt na verwijdering van niet-geïnternaliseerde doelcellen. Dit protocol biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar en visueel informatief platform voor het evalueren van ADCP gemedieerd door een anti-CD24 antilichaam. Belangrijk is dat de integratie van time-lapse imaging met een complementaire endpoint-gebaseerde kwantificatiestrategie gelijktijdige evaluatie van de fagocytische kinetiek en magnitude mogelijk maakt. De methode kan worden aangepast voor het onderzoeken van andere immunotherapeutische targets gericht op macrofagen. Dit protocol is het meest geschikt voor het evalueren van ADCP gemedieerd door therapeutische monoklonale antilichamen tegen oppervlakteantigenen op kankercellen. Het is zeer geschikt voor comparatieve screening van kandidaat-antilichamen, dosis-respons karakterisering en mechanistische studies van Fc–FcγR interactie, inclusief de effecten van blokkade van "don't-eat-me" signalen (bijv. CD47–SIRPα). Omdat de assay gebruikmaakt van primaire menselijke macrofagen, is deze ook geschikt voor translationele studies waarbij beoordeling van donor-tot-donor variabiliteit vereist is voorafgaand aan klinische ontwikkeling.

Diagram van de isolatie van mononucleaire cellen uit perifeer bloed met flowcytometrie voor macrofaaganalyse.
Figuur 1. Generatie en flowcytometrische validatie van IFN-γ/LPS-gestimuleerde macrofagen afgeleid van mononucleaire cellen uit perifeer bloed.Bovenpaneel: Mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMCs) worden geïsoleerd van gezonde donoren door middel van dichtheidsgradiëntcentrifugatie met Ficoll-oplossing bij 400 × g gedurende 30 min bij 20°C, waarbij alle reagentia vooraf zijn geëquilibreerd op 20°C ± 2°C. Geïsoleerde PBMCs worden 7 dagen lang gekweekt in ImmunoCult-SF medium aangevuld met 100 ng/mL macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) om macrofaagdifferentiatie te induceren (Dag 0–7), met aanvulling van het medium op Dag 5. Op Dag 8 worden de gedifferentieerde macrofagen 48 u gestimuleerd met 100 ng/mL IFN-γ en 1 µg/mL LPS (Dag 8–10). De cellen worden vervolgens onderworpen aan flowcytometrische analyse. Onderpaneel: Flowcytometrische analyse van macrofagen. Cellen werden gekleurd met een oppervlaktepanel bestaande uit CD11b-FITC, CD80-PE en CD206-PerCP-Cy5.5, gevolgd door de toevoeging van DAPI vóór acquisitie voor de exclusie van dode cellen. Gatingstrategie: Cellen werden eerst gegated op levende cellen (DAPI⁻), gevolgd door CD11b⁺-identificatie op een CD11b-FITC versus FSC-A plot om de macrofaagidentiteit te bevestigen. Levende CD11b⁺-events werden vervolgens geanalyseerd op een CD80 versus CD206 dot plot om de CD80⁺CD206⁻ populatie te bevestigen die door IFN-γ/LPS-stimulatie is geïnduceerd. Rechts: Representatieve dot plot van CD11b-FITC versus FSC-A die laat zien dat 99,8% van de gegatede cellen CD11b⁺ waren, wat de macrofaagidentiteit bevestigt. Links: De meerderheid van de CD11b⁺-cellen viel binnen de CD80⁺CD206⁻ gate (Q1: 95,2%), wat wijst op het verwachte pro-inflammatoire fenotype onder de toegepaste stimulatiecondities. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gebruikers moeten rekening houden met enkele beperkingen bij het toepassen van deze techniek. Ten eerste kan donorvariabiliteit in macrofagen afgeleid van PBMC aanzienlijke variantie in de fagocytische output veroorzaken; wij raden aan om meerdere donoren (n ≥ 3) te gebruiken, waarbij de individuele donorgegevens naast de gepoolde resultaten worden gerapporteerd. Ten tweede bootst het 2D co-cultureformaat de tumoromgeving niet na, en bevindingen moeten worden gevalideerd in 3D- of in vivo-modellen voordat klinische conclusies kunnen worden getrokken. Ten derde legt het beeldvormingsvenster van 16 uur vroege fagocytische gebeurtenissen vast, maar weerspiegelt het geen langetermijnprocessen zoals antigeenpresentatie of secundaire immuunactivatie. Bijgevolg biedt het gecombineerde gebruik van real-time beeldvorming en eindpuntkwantificering een complementair kader dat zowel de interpreteerbaarheid als de reproduceerbaarheid van ADCP-metingen verbetert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol omvat het gebruik van primaire macrofagen afgeleid van bloedmonsters van gezonde donoren. De verzameling en verwerking van de monsters werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Review Board (IRB) van de China Medical University.

1. Preparatie van uit PBMC afgeleide macrofagen

OPMERKING: Voer alle procedures met menselijk bloed uit onder goedkeuring van de institutionele IRB (bijv. CMUH IRB). Verkrijg geïnformeerde toestemming van gezonde donoren voorafgaand aan de bloedafname.

WAARSCHUWING: Behandel alle menselijke bloedproducten onder biosafety-niveau 2 (BSL-2) condities met gebruik van universele voorzorgsmaatregelen.

  1. Bloedafname
    1. Neem volbloed af van een gezonde donor in 10 mL ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA)-gecoate vacutainerbuizen.
  2. Bloedverdunning
    1. Verdun het volbloed in een verhouding van 1:1 met ijskoud fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; Ca2⁺-vrij/Mg2⁺-vrij) (bijv. 10 mL bloed + 10 mL PBS).
    2. Meng door drie tot vijf keer om te keren.
      OPMERKING: Bewaar de PBS op ijs vóór gebruik. Een lage temperatuur helpt de celviabiliteit tijdens de verwerking te behouden.
  3. Laagjes aanbrengen voor dichtheidsgradiënt
    1. Breng het verdunde bloed voorzichtig in laagjes aan over Ficoll–Paque PLUS in een conische buis in een volumeverhouding van 2:1 (v/v) (bijv. 8 mL bloed over 4 mL Ficoll in een 15 mL buis, of 30 mL over 15 mL in een 50 mL buis).
    2. Evenequlibreer zowel het verdunde bloed als de Ficoll–Paque PLUS tot 20°C ± 2°C vóór het aanbrengen van de lagen.
    3. Haal de Ficoll–Paque PLUS ten minste 30 min voor gebruik uit de opslag bij 4°C, of warm kort op in een waterbad van 20°C ± 2°C.
    4. Gebruik geen koude reagentia, aangezien de dichtheid van Ficoll is gekalibreerd voor 20°C ± 2°C, en afwijkingen de scheidingsefficiëntie en de PBMC-opbrengst zullen beïnvloeden.
      OPMERKING: Houd de buis in een hoek van 45° en pipetteer het bloed langzaam langs de wand om een scherpe interface te behouden. Verstoor de Ficoll-laag niet.
  4. Centrifugatie
    1. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 30 min bij 20°C met de rem uitgeschakeld (Figuur 1).
      OPMERKING: Remmen zal de dichtheidsgradiënt verstoren en de PBMC-opbrengst verminderen.
  5. PBMC-verzameling
    1. Aspireer voorzichtig met een serologische pipette alleen de buffy coat-laag (de witachtige interface tussen de plasmalaag en de Ficoll-laag), zonder de bovenliggende plasmalaag of de onderliggende Ficoll-laag te verstoren.
    2. Overbreng de verzamelde laag naar een nieuwe conische buis van 50 mL.
  6. PBMC-wassing
    1. Voeg PBS toe om het totale volume aan te vullen tot 25 mL in een conische buis van 50 mL.
    2. Gebruik een 50 mL buis om een juiste centrifugatie en balans te waarborgen.
    3. Centrifugeer bij 300 × g gedurende 10 min.
  7. RBC-lyse
    1. Verwijder het supernatant.
    2. Resuspendeer de pellet in 5 mL rode bloedcel (RBC) lysebuffer door voorzichtig met een serologische pipette op en neer te pipetteren totdat de pellet volledig is gedispergeerd en er geen zichtbare klonten meer aanwezig zijn.
    3. Incubeer gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
      WAARSCHUWING: Volledige dispersie is vereist om een uniforme lyse te garanderen; vermijd echter krachtig pipetteren of vortexen, aangezien dit de PBMCs kan beschadigen. Overschrijd de incubatietijd van 5 min met de RBC-lysebuffer niet, omdat langdurige blootstelling de viabiliteit van de PBMCs kan beïnvloeden.
  8. PBMC-pelletvorming
    1. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min om de PBMCs te pelletteren en de gelyseerde RBC-debris te verwijderen.
  9. Finale resuspensie
    1. Verwijder het supernatant.
    2. Resuspendeer de pellet in 5 mL ImmunoCult-SF macrofaagmedium.
      OPMERKING: Onder standaardcondities levert 10 mL volbloed doorgaans 1,5–2,0 × 107 PBMCs op.

2. Macrofagen-differentiatie (Dag 0–7)

OPMERKING: Gebruik Petri-schalen die niet zijn behandeld voor weefselkweek (TC-behandeld) om gedifferentieerde macrofagen, afgeleid van monocyten door adhesie, te selecteren. Niet-adherente lymfocyten worden tijdens de daaropvolgende kweek weggewassen.

  1. Dag 0: Celuitplating
    1. Voer een cel telling uit en plateer 1 × 107 PBMCs in een niet-TC-behandelde Petrischaal van 10 cm.
    2. Breng het totale volume aan tot 10 mL met behulp van ImmunoCult-SF macrofaagmedium aangevuld met 100 ng/mL M-CSF (bereid door de M-CSF-stock direct voor gebruik aan het complete medium toe te voegen en te mengen door voorzichtig om te keren).
      OPMERKING: Het protocol kan proportioneel worden geschaald om variaties in de PBMC-opbrengst van donoren op te vangen, waarbij een uitplaatdichtheid vanaf 1 × 106 cellen/mL als basis dient.
  2. Incubatie en monitoring
    1. Incubeer bij 37°C met 5% CO₂ in een bevochtigde incubator.
    2. Controleer dagelijks op de vorming van zwevende monocytclusters en de verschijning van adherente cellen.
      OPMERKING: Monocyten zullen geleidelijk in grootte toenemen en clusters vormen naarmate de differentiatie vordert. Sommige monocyten zullen zich aan de plaat hechten. Er is in deze stap geen interventie vereist.
  3. Dag 5: Supplementatie van het medium
    1. Voeg voorzichtig 5 mL vers ImmunoCult-SF macrofaagmedium aangevuld met 100 ng/mL M-CSF toe aan de schaal, waarbij u er zorg voor draagt dat de adherente macrofagen niet worden verstoord.
    2. Zet de cultuur voort voor nog eens 2 dagen (tot dag 7).
      WAARSCHUWING: Voeg het verse medium voorzichtig langs de zijkant van de schaal toe om te voorkomen dat adherente macrofagen worden verstoord, aangezien mechanische disruptie de differentiatie-efficiëntie en de celopbrengst kan beïnvloeden.
      OPMERKING: Vermijd het vervangen van het medium om autocriene/paracriene factoren te behouden die de macrofaagdifferentiatie ondersteunen.
  4. Dag 7: Morfologische beoordeling
    1. Beoordeel de differentiatie-efficiëntie van de macrofagen onder een omgekeerde microscoop.
    2. Adherente cellen vertonen de karakteristieke macrofaagmorfologie: groot, afgeplat en onregelmatig van vorm, met zichtbare pseudopodia.
    3. Op dag 7 moeten goed gedifferentieerde macrofagen zichtbaar zijn.
      WAARSCHUWING: De morfologische beoordeling op dag 7 dient als een kritische voorwaarde voor de daaropvolgende validatie via flowcytometrie. Goed gedifferentieerde macrofagen moeten duidelijk zichtbaar zijn onder de microscoop, en een hoger aandeel adherente cellen met macrofaagmorfologie weerspiegelt een grotere differentiatie-efficiëntie (een confluentie van ongeveer 70% van adherente macrofagen met karakteristieke morfologie wordt beschouwd als indicatief voor succesvolle differentiatie). Culturen met een geringe adhesie, voornamelijk ronde cellen of anderszins een slechte morfologische differentiatie zullen waarschijnlijk geen betrouwbare flowcytometrie-resultaten opleveren en mogen niet worden doorgezet naar stimulatie en kleuring.

3. Macrofagepolarisatie (Dag 8–10)

  1. Verzamelen en klaren van geconditioneerd medium
    1. Aspireer op dag 8 voorzichtig de 15 mL medium uit de kweekschaal zonder de adherente macrofagen te verstoren en breng dit over naar een steriele conische buis van 50 mL.
    2. Centrifugeer het verzamelde medium bij 400 × g gedurende 5 min om celdebris te pelletteren.
    3. Bewaar het geklaarde supernatant voor de volgende stap.
  2. Stimulatie met interferon gamma (IFN-γ) en lipopolysaccharide (LPS)
    1. Breng de 15 mL geklaard supernatant over naar een nieuwe steriele buis en vul dit aan met 100 ng/mL IFN-γ en 1 µg/mL LPS.
    2. Meng grondig door voorzichtig op en neer te pipetteren (5–10 keer) om een uniforme distributie van cytokinen te waarborgen zonder bellen te introduceren.
    3. Breng de volledige 15 mL cytokine-gesupplementeerd medium terug naar de oorspronkelijke kweekschaal door voorzichtig langs de binnenwand te pipetteren om verstoring van de adherente macrofagen te voorkomen.
    4. Incubeer bij 37°C met 5% CO₂ gedurende 48 h (dag 8 tot dag 10).
      OPMERKING: Gebruik geconditioneerd (oud) medium om autocriene/paracriene factoren te behouden. Deze combinatie van IFN-γ en LPS wordt gebruikt om macrofagen te polariseren naar een pro-inflammatoir fenotype. Onder de stimulatiecondities met IFN-γ (100 ng/mL) en LPS (1 µg/mL) die in dit protocol worden gebruikt, vertonen macrofagen kenmerkende morfologische veranderingen, waaronder verlengde lamellipodia passend bij een geactiveerde pro-inflammatoire status, evenals CD11b- en CD80-expressie.
      WAARSCHUWING: Hanteer LPS volgens de juiste laboratoriumveiligheidsprocedures, aangezien het een bioactieve endotoxine is die bij blootstelling ontstekingsreacties kan veroorzaken.

4. Bevestiging van inflammatoire fenotype-markers van IFN-γ- en LPS-gestimuleerde macrofagen via flowcytometrie

  1. Oogsten van cellen
    1. Oogst op dag 10 een subset van gepolariseerde macrofagen voor fenotypering.
    2. Voeg 10 mM EDTA in PBS toe en incubeer 10–15 min bij 37°C.
    3. Detachereer de cellen door voorzichtig te pipetteren.
      OPMERKING: Verleng de EDTA-incubatie met nog eens 30 min bij 37°C als de cellen adherent blijven, en herhaal vervolgens het voorzichtig pipetteren. Vermijd krachtig pipetteren of mechanisch schrapen om de levensvatbaarheid van de cellen en de integriteit van de oppervlaktemarkers te behouden.
  2. Voorbereiding antilichaamkleuring
    1. Kleur de cellen met fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen CD11b (pan-macrofaaglijn-marker), CD80 (inflammatoire marker) en CD206 (anti-inflammatoire marker, gebruikt als negatieve exclusiemarker voor de identificatie van het inflammatoire fenotype).
  3. Kleuringsprocedure
    1. Overbreng 5 × 105 gedetacheerde macrofagen naar een flowcytometrie-buis bevattende 100 µL koude PBS.
    2. Voeg CD11b-FITC, CD80-PE en CD206-PerCP-Cy5.5 antilichamen toe tot een eindconcentratie van elk 1 µg/mL.
    3. Meng de celsuspensie door voorzichtig te pipetteren.
    4. Incubeer de monsters 1 u op ijs, beschermd tegen licht.
    5. Centrifugeer de monsters bij 300 × g gedurende 1 min bij 4°C.
    6. Aspireer het supernatant voorzichtig.
    7. Voeg 0,5 mL koude PBS toe om de celpellet te wassen.
    8. Centrifugeer de monsters bij 300 × g gedurende 1 min bij 4°C.
    9. Verwijder het supernatant.
    10. Resuspendeer de celpellet in 200 µL koude PBS.
    11. Voeg DAPI toe tot een eindconcentratie van 1 µg/mL.
      OPMERKING: Voeg passende isotype-controles en een levensvatbaarheidskleurstof toe (bijv. DAPI of Viobility 405/452 Fixable Dye).
  4. Flowcytometrie-analyse
    1. Analyseer de gekleurde monsters met een flowcytometer.
    2. Bevestig de expressie van CD11b en CD80 in de macrofaagpopulatie.
    3. Ga pas over tot de fagocytose-assay nadat is bevestigd dat de markerexpressie consistent is met een inflammatoir fenotype.
  5. Flowcytometrie acquisitie en instelling
    1. Instrumentinstelling
      1. Configureer de flowcytometer met behulp van de volgende kanalen: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80) en PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. Stel de acquisitieparameter in om 10.000 events per monster te verzamelen binnen de gedefinieerde parent gate.
    2. Drempelwaarde- en gain-kalibratie
      1. Open vier dot-plots met FSC op de x-as en één fluorochroomkanaal op de y-as.
      2. Bereid cellen voor die gekleurd zijn met de bijbehorende isotype-controle-antilichamen die passen bij elk fluorochroom.
      3. Verzamel de isotype-controlemonsters.
      4. Stel de gain voor elk kanaal zo in dat de isotype-controlepopulatie onder 101 op de logaritmische schaal komt te liggen.
      5. Gebruik deze drempelwaarde om de achtergrondsignaalniveaus te definiëren.
        OPMERKING: Gebruik een logaritmische schaalserie van 101 tot 101·5 om een betrouwbare scheiding tussen achtergrond en specifiek signaal vast te stellen.
    3. Compensatie
      1. Voeg één druppel compensatiebeads toe aan een 1,5 mL microcentrifugebuis.
      2. Voeg het overeenkomende fluorochroom-geconjugeerde antilichaam toe tot een eindconcentratie van 1 µg/mL.
      3. Incubeer 30 min op ijs, beschermd tegen licht.
      4. Centrifugeer bij 400 × g gedurende 1 min.
      5. Verwijder het supernatant.
      6. Resuspendeer de beads in 200 µL koude PBS.
      7. Verzamel de single-color controles.
      8. Pas spectrale compensatie toe om fluorochroom-spillover te corrigeren.
    4. Gating-strategie
      1. Selectie van levende cellen
        1. Toon Pacific Blue/V450 (DAPI) op de y-as en FSC op de x-as.
        2. Gate op DAPI-negatieve events (onder 101) om levende cellen te selecteren.
      2. Identificatie van macrofagen
        1. Stel de populatie levende cellen in als de parent gate.
        2. Toon FITC (CD11b) op de y-as en FSC op de x-as.
        3. Gate op CD11b⁺ events (boven 101).
      3. Identificatie van inflammatoir fenotype
        1. Stel de CD11b⁺ populatie in als de parent gate.
        2. Toon PE (CD80) op de y-as en PerCP-Cy5.5 (CD206) op de x-as.
        3. Pas kwadrant-gating toe bij 101.5 op beide assen.
        4. Identificeer CD80⁺CD206⁻ cellen in het linkerbovenkwadrant (Q1).
  6. Acceptatiecriteria
    1. Bevestig dat ≥90% van de cellen binnen de CD11b⁺ parent gate CD80⁺CD206⁻ zijn.
    2. Ga pas over tot de fagocytose-assay wanneer deze drempelwaarde is bereikt.
    3. Herhaal de PBMC-isolatie, M-CSF-differentiatie en IFN-γ/LPS-stimulatie als de monsters niet aan dit criterium voldoen.

5. Assay voor antilichaam-afhankelijke fagocytose

OPMERKING: Verifieer de stabiele GFP-expressie in kankercellen vóór de opzet van de assay. Bevestig de CD24-expressie op doelcellen voorafgaand aan de assay. Gebruik kankercellen met 50%–100% CD24-positiviteit voor optimale prestaties. De in dit protocol gebruikte MDA-MB-468-cellen vertonen 100% CD24-positiviteit.

  1. Uitzaaien van macrofagen
    1. Zaai IFN-γ- en LPS-gestimuleerde macrofagen, zoals gevalideerd in stap 4, uit bij 2 × 105 cellen per putje in een 24-wells weefselkweekplaat.
    2. Incubeer de plaat bij 37°C onder statische omstandigheden met 5% CO₂ gedurende 12–16 u om celadherentie mogelijk te maken (Figuur 2A).
      OPMERKING: Zorg voor een stevige adhesie van de macrofagen voordat u verdergaat. Slecht geadheerde macrofagen kunnen tijdens de beeldvorming loslaten, wat de resultaten kan beïnvloeden.
  2. Bereiding van kankercellen
    1. Kweek CD24-positieve GFP-gelabelde borstkankercellen (MDA-MB-468) tot een confluentie van 70%–80%.
    2. Aspireer het kweekmedium.
    3. Was de cellaag eenmaal met PBS.
  3. Loskoppeling van kankercellen
    1. Voeg 10 mM EDTA in PBS toe aan de kweekschaal.
    2. Incubeer de cellen bij 37°C gedurende 5–10 min.
    3. Detacheer de cellen door voorzichtig te pipetteren om een volledige celvrijgave te bereiken.
      OPMERKING: Vermijd het gebruik van trypsine voor de celdetachering. Enzymatische digestie kan CD24 van het celoppervlak splitsen, waardoor de antilichaambinding in gevaar komt.
  4. Verzamelen en tellen van kankercellen
    1. Verzamel de losgekoppelde cellen in een centrifugebuis.
    2. Centrifugeer de cellen gedurende 5 min bij 300 × g.
    3. Verwijder het supernatant.
    4. Resuspendeer de celpellet in compleet RPMI-medium.
    5. Tel de levensvatbare cellen.
  5. Antilichaam-opsonisatie van kankercellen
    1. Resuspendeer de kankercellen bij een dichtheid van 2 × 105 cellen/mL in 0,5 mL compleet RPMI-medium.
    2. Voeg anti-CD24 monoklonaal antilichaam toe tot een eindconcentratie van 1 µg/mL.
    3. Meng de cel-suspensie door voorzichtig te pipetteren om een uniforme distributie van antilichamen te waarborgen.
    4. Incubeer de cellen bij 37°C gedurende 30 min onder statische condities.
      OPMERKING: Voeg een isotype-gematchte IgG-controle toe in dezelfde concentratie als negatieve controle voor antilichaam-afhankelijke fagocytose.
  6. Voorbereiding voor co-cultuur
    1. Was de cellen niet na opsonisatie.
    2. Ga direct over tot co-cultuur om de antilichaankoating op het celoppervlak te behouden.
  7. Opstelling van co-cultuur
    1. Voeg 1 × 10 toe5 met antilichamen geopsoniseerde GFP-gelabelde borstkankercellen aan elke put met macrofagen.
    2. Houd een effector-target-ratio van 2:1 aan.
      OPMERKING: Pas de effector-doelwitverhouding aan op basis van het experimentele ontwerp. Gebruik hogere macrofaag-kankercelverhoudingen dan de beschreven verhouding van 2:1 (bijv. 3:1 of 5:1) om de frequentie van cel-celcontacten te verhogen en de detectie van fagocytische gebeurtenissen te verbeteren.

Time-lapse diagram van de interactie tussen macrofaag en GFP-gelabelde cel in een imaging-experiment.
Figuur 2. Time-lapse imaging van antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose. (A) Schematisch overzicht van het co-cultuursysteem en de time-lapse imaging-opstelling. De imaging-parameters omvatten een interval van 10 min over een totale acquisitietijd van 16 h (97 frames), met gebruik van een 10× objectief met fasecontrast- en GFP-kanalen. (B) Representatieve time-lapse beelden van 1 h tot 16 h die fagocytische gebeurtenissen tonen, gekenmerkt door de internalisatie van GFP-positieve kankercellen door macrofagen in de loop van de tijd. Gele gestreepte cirkels markeren representatieve fagocytische gebeurtenissen. In het fasecontrastkanaal verschijnen ingesloten kankercellen als fase-heldere intracellulaire structuren binnen het cytoplasma van de macrofaag (witte pijlen). In het GFP-kanaal bevestigt fluorescentie gelokaliseerd binnen macrofagen de internalisatie. (C) Vergrotingen van representatieve fagocytische gebeurtenissen op 0, 1, 4 en 16 h, die het sequentiële proces illustreren van macrofaag-gemedieerde insluiting van GFP-gelabelde kankercellen. De beeldsequentie is geselecteerd als representatief op basis van een duidelijke visualisatie van macrofaag-gemedieerde fagocytische gebeurtenissen. Witte pijlen geven macrofagen aan die interageren met en doelcellen internaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Time-lapse imaging (Geautomatiseerd live-cell imaging systeem)

OPMERKING: Configureer het beeldvormingsprotocol voorafgaand aan de assay met behulp van een Lionheart geautomatiseerd live-cell imaging-systeem en Gen5 geautomatiseerde live-cell imaging-software. Volg de juiste training voordat u het beeldvormingssysteem bedient om een nauwkeurige installatie, optimale prestaties en veilig gebruik te garanderen.

  1. Voorbereiding van het instrument
    1. Schakel het beeldsysteem, de module voor omgevingsbeheersing en de CO₂-gasvoorziening ten minste 1 u voor het beelden in.
    2. Open het Environment Control-paneel in de software voor geautomatiseerde live-cell imaging.
    3. Stel de temperatuur in op 37°C en de CO₂ op 5%.
    4. Bevestig dat de temperatuur in de kamer stabiliseert binnen ± 0,2°C en de CO₂ op 5,0% ± 0,1% voordat de plaat wordt geplaatst.
  2. Opstelling van de plaat
    1. Plaats de 24-wells plaat in de beeldkamer van het beeldsysteem.
  3. Initiële configuratie
    1. Open de Task Manager van de software voor geautomatiseerde live-cell imaging.
    2. Selecteer [Imager manual mode].
    3. Klik op [Capture now] om de beeldingparameters te initialiseren.
    4. Selecteer een 10× objectief.
    5. Selecteer microplate als filterinstelling.
    6. Selecteer een 24-wells plaat uit de plaatbibliotheek van de software voor geautomatiseerde live-cell imaging.
  4. Instelling van focus en beeld
    1. Selecteer het fasecontrastkanaal.
    2. Selecteer een representatieve well (bijv. A1).
    3. Activeer de autofocus voorafgaand aan de time-lapse acquisitie.
    4. Neem een beeld op met behulp van het camera-icoon.
    5. Bevestig de celmorfologie en de focuskwaliteit.
    6. Navigeer naar [Process/Analyze].
    7. Selecteer [Create experiment from an image set] om het experiment te configureren.
  5. Parameters voor time-lapse acquisitie
    1. Open het instellingenpaneel [Procedure].
    2. Stel de temperatuur in op 37°C en de CO₂ op 5%.
    3. Stel onder [Start Kinetic] de looptijd in op 16:00:00.
    4. Stel het beeldinginterval in op 0:10:00.
    5. Stel het totaal aantal metingen in op 97.
    6. Gebruik een beeldinginterval van 10–15 min om een balans te vinden tussen temporele resolutie en fototoxiciteit bij het vastleggen van vroege fagocytose-gebeurtenissen.
  6. Configuratie van de beeldingkanalen
    1. Stel Kanaal 1 in op fasecontrast.
    2. Stel Kanaal 2 in op GFP (Ex 469/35, Em 525/39).
    3. Selecteer een 10× objectief voor een optimaal gezichtsveld en resolutie.
    4. Stel de belichting, integratietijd en gain in op [Auto], of pas deze handmatig aan.
    5. Gebruik een typische GFP-belichtingstijd van 100–300 ms om verzadiging van het signaal te voorkomen.
    6. Pas identieke beeldinginstellingen toe op alle wells.
  7. Instelling van de beeldingposities
    1. Open het menu [Define beacons].
    2. Schakel Z-stack acquisitie uit.
    3. Schakel montage-acquisitie uit.
    4. Voer de beelding uit in een enkel brandvlak.
    5. Definieer de beeldingposities handmatig door met behulp van het microscoop-icoon representatieve, niet-overlappende regio's binnen elke well te selecteren.
    6. Houd identieke beeldingposities aan over alle tijdspunten.
    7. Selecteer ten minste 4–6 gezichtsvelden per well.
  8. Time-lapse acquisitie
    1. Klik op [Play] om de geautomatiseerde time-lapse beelding te starten.
  9. Data-export en visualisatie
    1. Open het opgeslagen experimentbestand na de acquisitie.
    2. Selecteer de beeldingposities.
    3. Exporteer de time-lapse data in MP4-formaat.
    4. Open de [Process Tool].
    5. Pas indien nodig [Image Deconvolution] toe om de visualisatie te verbeteren en representatieve fagocytose-gebeurtenissen te identificeren.
      OPMERKING: Gebruik time-lapse beelding uitsluitend voor kwalitatieve visualisatie. Niet-opgenomen GFP-positieve kankercellen kunnen overlappen of tijdelijk associëren met macrofagen, wat leidt tot fout-positieve signalen. Voer een kwantitatieve analyse uit met een aparte endpoint-assay.

7. Kwantificering van de eindpuntfagocytose

  1. Verwijdering van niet-geïnternaliseerde cellen
    1. Voer de assay uit onder identieke co-cultuurcondities.
    2. Beëindig het experiment na 4 h.
    3. Verwijder het kweekmedium.
    4. Voeg 10 mM EDTA in PBS toe.
    5. Incubeer gedurende 5 min bij 37°C.
    6. Was voorzichtig met PBS om niet-geïnternaliseerde GFP-positieve cellen te verwijderen.
    7. Voeg vers macrofaagmedium toe.
  2. Beeldacquisitie voor kwantificering
    1. Verkrijg beelden met behulp van fasecontrast- en GFP-kanalen.
    2. Leg ten minste 4–6 gezichtsvelden per well vast.
    3. Analyseer minimaal drie wells per conditie.
  3. Definitie van fagocytische gebeurtenissen
    1. Identificeer macrofagen met GFP-positieve signalen die volledig omsloten zijn binnen de cellulaire grens.
  4. Beeldanalyse
    1. Open de beelden in de ImageJ-software.
    2. Gebruik de Cell Counter-plugin.
    3. Tel het totaal aantal macrofagen.
    4. Tel de macrofagen die geïnternaliseerde GFP-positieve cellen bevatten.
  5. Berekening van de fagocytose-index
    1. Bereken: Formule voor fagocytose-index; verhouding van opgeslokte GFP-positieve cellen ten opzichte van het totaal aantal macrofagen; vergelijking.
    2. Voer de analyse blind uit.
    3. Herhaal dit in ten minste drie onafhankelijke experimenten.
  6. Datapresentatie
    1. Presenteer representatieve time-lapse beelden chronologisch (Figuur 2B en Figuur 2C).
    2. Presenteer representatieve eindpuntbeelden (Figuur 3A en Figuur 3B).

Fagocytose-analyse: macrofaag-cocultuur, anti-CD24 mAb; microscopiebeelden, vergelijking van datagrafieken.
Figuur 3. Kwantificering van antilichaam-afhankelijke macrofaag-fagocytose via eindpuntanalyse. (A) Representatieve fasecontrast- en GFP-fluorescentiebeelden van macrofagen die gedurende 4 h zijn gecocultureerd met GFP-gelabelde borstkankercellen, gevolgd door verwijdering van niet-opgenomen cellen middels EDTA-behandeling. Fasecontrast- en GFP-kanalen zijn samengevoegd om macrofagen en geïnternaliseerde GFP-positieve doelcellen te identificeren. Macrofagen (teller 0) en GFP-positieve fagocyterende macrofagen (teller 1) zijn geteld met de Cell Counter-plugin in ImageJ. In de IgG-controleconditie werden geen fagocytaire gebeurtenissen waargenomen, terwijl behandeling met het anti-CD24 monoklonale antilichaam resulteerde in duidelijke intracellulaire GFP-positieve signalen binnen de macrofagen, wat wijst op actieve fagocytose. Schaalbalk = 200 µm. (B) Kwantificering van de fagocytose-index, gedefinieerd als het percentage macrofagen dat geïnternaliseerde GFP-positieve cellen bevat ten opzichte van de totale macrofaagpopulatie. Het anti-CD24 monoklonale antilichaam verhoogde de fagocytose-index significant vergeleken met de IgG-controle (0,00 ± 0,00% vs. 18,76 ± 4,01%, gemiddelde ± SD; n = 6 velden per groep; ***p < 0,001, Welch’s ongepaarde t-toets). De gegevens zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De succesvolle generatie en polarisatie van macrofagen uit PBMC's werden bevestigd middels morfologische beoordeling en flowcytometrie-analyse (Figuur 1). PBMC's die waren geïsoleerd via dichtheidsgradiëntcentrifugatie werden gekweekt in medium aangevuld met M-CSF, wat tegen dag 7 resulteerde in adherente cellen met een kenmerkende macrofaagmorfologie. Na stimulatie met IFN-γ en LPS vertoonden de cellen een fenotype dat consistent was met activatie onder de toegepaste condities. Flowcytometr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende stappen in dit protocol zijn cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten. Ten eerste hebben de kwaliteit en zuiverheid van de PBMC-isolatie een directe invloed op de opbrengst van macrofagen en de efficiëntie van de differentiatie. Voorzichtige gelaagdheid van verdund bloed over de Ficoll-gradiënt en centrifugatie waarbij de rem is uitgeschakeld, zijn essentieel om de interface van de buffy coat te behouden. Onvolledige RBC-lyse of een te lange incubatie met lysebuffer zal de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Cancer Biology and Precision Therapeutics Center van de China Medical University, vanuit het Featured Areas Research Center Program in het kader van het Higher Education Sprout Project van het Ministerie van Onderwijs (MOE) in Taiwan (CBPTC-PROJ-5-2).

Wij danken het Cancer Biology and Precision Therapeutics Center voor de financiering en de academische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,5 M ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) voorraadoplossingSigma-Aldrich (of gelijkwaardig)E7889 (of equivalent)Gebruikt voor het bereiden van een 10 mM EDTA-werkoplossing in PBS voor celdetachering
24-well weefselkweekplaten (TC-behandeld)Corning (of gelijkwaardig)3524Gebruikt voor co-cultuur van macrofagen en kankercellen tijdens de fagocytose-assay
Anti-humaan CD206-antilichaam (flowcytometrie)BioLegend (of gelijkwaardig)321122 (of equivalent)Marker voor alternatief macrofaagfenotype
Anti-humaan CD24 monoklonaal antilichaamThermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)MA1-91384 (of equivalent)Wordt gebruikt om kankercellen te opsoniseren voor antilichaam-afhankelijke fagocytose
Geautomatiseerd live-cell imaging-systeem met omgevingscontrolekamer (bijv. Lionheart FX)Agilent Technologies (of gelijkwaardig)BioTek Lionheart FX geautomatiseerde microscoopMaakt langdurige time-lapse-beeldvorming mogelijk onder gecontroleerde temperatuur en 2 condities
Beeldvormingssoftware voor geautomatiseerde live-cell imaging (bijv. Gen5)Agilent Technologies (of gelijkwaardig)Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling produceren. Voer aub de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands.Gebruikt voor de acquisitie en analyse van time-lapse imaging-data
Centrifuge (swing-bucket rotor)Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)Multifuge X4R Pro met TX-1000 rotor (of equivalent)Gebruikt voor de isolatie van PBMC's en cellenwasstappen
2 incubator (37°C)°C, 5% 2)Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)Forma Direct Heat 2 Incubator (of equivalent)Handhaaft fysiologische omstandigheden voor celkweek
2 gasvoorziening met drukregelaarAgilent Technologies (of gelijkwaardig)Geen gegevens beschikbaarBenodigdheden 2 voor omgevingscontrole van de incubator en het imagingsysteem
Conische buizen (15 ml en 50 ml)Corning (of gelijkwaardig)352070 (of equivalent)Gebruikt voor de isolatie, het wassen en de centrifugatiestappen van PBMC's
met EDTA gecoate bloedafnamebuizen (vacutainers)BD Biosciences (of gelijkwaardig)367863 (of gelijkwaardig)Gebruikt voor de afname van volbloedmonsters van donoren
Ficoll-Paque PLUSCytiva (of gelijkwaardig)17144003 (of equivalent)Dichtheidsgradiërmedium voor de isolatie van PBMC's
Flowcytometer (bijv. FACSCanto II)BD Biosciences (of gelijkwaardig)BD FACSCanto II Gebruikt voor fenotypische analyse van macrofagen
Compensatieparels (flowcytometrie)Biolegend (of gelijkwaardig)424602Gebruikt voor eenkleurige compensatiecontroles
FITC anti-human CD11b-antilichaam (flowcytometrie)BioLegend (of gelijkwaardig)101205 (of gelijkwaardig)Marker gebruikt voor de identificatie van macrofagen
PE anti-human CD80-antilichaam (flowcytometrie)BioLegend (of gelijkwaardig)375410 (of equivalent)Marker geassocieerd met geactiveerd macrofaagfenotype
GFP-expresserende borstkankercellijn (MDA-MB-468)ATCC (of equivalent)HTB-132 (of equivalent)Doelcellen gebruikt in fagocytose-assay; GFP maakt visualisatie mogelijk
ImmunoCult-SF macrofaagmediumSTEMCELL Technologies (of gelijkwaardig)10961 (of equivalent)Serumvrij medium gebruikt voor macrofaagdifferentiatie
Dulbecco’Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)12100046Gebruikt voor de kweek en resuspensie van kankercellen
Isotype-controleantilichaam (IgG)Bio X Cell (of gelijkwaardig)BE0297 (of equivalent)Negatieve controle voor antilichaam-afhankelijke fagocytose-assay
Lipopolysaccharide (LPS)Sigma-Aldrich (of equivalent)L2630 (of gelijkwaardig)Stimulus gebruikt voor de activatie van macrofagen in combinatie met IFN-γ
Recombinant humaan interferon gamma (IFN-γ)STEMCELL Technologies (of gelijkwaardig)78020 (of gelijkwaardig)Cytokine gebruikt voor macrofaagactivatie
Recombinant menselijke macrofaag-koloniestimulerende factor (M-CSF)STEMCELL Technologies (of gelijkwaardig)78057 (of equivalent)Groeifactor gebruikt voor macrofaagdifferentiatie
Pasteurpipetten of serologische pipettenJetbiofil (of equivalent)GSP010010 (of gelijkwaardig)Gebruikt voor vloeistofbehandeling tijdens PBMC-isolatie en celkweek
PBS (Ca2+-vrij)2+-/Mg2+-vrij)Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)BP399-500 (of equivalent)Buffer gebruikt voor het wassen van cellen en verdunningsstappen
Petrischalen (100 mm, niet-behandeld)–(behandeld voor weefselkweek)Corning (of gelijkwaardig)430591Gebruikt voor macrofaagdifferentiatie via adherentieselectie
Lysisbuffer voor rode bloedcellen (RBC)BioLegend (of gelijkwaardig)420301 (of equivalent)Wordt gebruikt voor het verwijderen van rode bloedcellen tijdens de isolatie van PBMC's
Viability 405/452 Fixable DyeMiltenyi Biotec (of gelijkwaardig)130-130-404 (of equivalent)Wordt gebruikt om de celviabiliteit te beoordelen tijdens flowcytometrie-analyse
DAPISigma-Aldrich (of gelijkwaardig)D9542 (of equivalent)Gebruikt voor de uitsluiting van dode cellen bij flowcytometrie

Referenties

  1. Sung H, et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 2021;71(3):209-249.
  2. Perou CM, et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2000;406(6797):747-752.
  3. Foulkes WD, Smith IE, Reis-Filho JS. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363(20):1938-1948.
  4. Dent R, et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 2007;13(15 Pt 1):4429-4434.
  5. Lin NU, et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 2008;113(10):2638-2645.
  6. Bianchini G, De Angelis C, Licata L, Gianni L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 2022;19(2):91-113.
  7. Lecoultre M, Dutoit V, Walker PR. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 2020;8(2).
  8. Mantovani A, Allavena P, Marchesi F, Garlanda C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 2022;21(11):799-820.
  9. Chan SH, Lin CY, Tseng HJ, Wang LH. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 2025;32(1):73.
  10. Majeti R, et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 2009;138(2):286-299.
  11. Barkal AA, et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 2019;572(7769):392-396.
  12. Wang X, et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 2022;34(8):1088-1103.e1086.
  13. Chan SH, et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 2019;18(1):147-161.
  14. Huang S, Zhang X, Wei Y, Xiao Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 2024;15:1367959.
  15. Weiskopf K, Weissman IL. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 2015;7(2):303-310.
  16. Cao X, et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 2022;8(11):eabl9171.
  17. Aderem A, Underhill DM. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 1999;17:593-623.
  18. Flannagan RS, Jaumouille V, Grinstein S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 2012;7:61-98.
  19. Denardo DG, Ruffell B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 2019;19(6):369-382.
  20. Horsthemke M, Wilden J, Bachg AC, Hanley PJ. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. 2018;(140). doi:10.3791/57566.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Antilichaam afhankelijke fagocytosegroen fluorescent eiwitCD24 expresserende cellenlive cell imagingmonoklonaal antilichaam opsonisatieeindpuntanalysekankerimmunotherapie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.