Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Time-lapse-beeldvorming van antilichaam-gestuurde fagocytose van met groen fluorescent eiwit gelabelde triple-negatieve borstkankercellen door macrofagen

219 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71461

⸱

14 augustus 2026

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, National Taiwan University Hospital, 2School of Chinese Medicine, China Medical University, 3Graduate Institute of Biomedical Science, China Medical University, 4Chinese Medicine Research Center, China Medical University, 5Cancer Biology and Precision Therapeutics Center, China Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een time-lapse live-cell imaging methode om antilichaam-afhankelijke fagocytose van met groen fluorescent proteïne gelabelde triple-negatieve borstkankercellen door macrofagen te visualiseren, met gebruik van macrofagen afgeleid van mononucleaire cellen uit perifeer bloed en een geautomatiseerde microscoop.

Samenvatting

Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose is een belangrijk mechanisme waarmee macrofagen antilichaam-opsoniseerde kankercellen insluiten. Dit protocol beschrijft een methode voor time-lapse live-cell imaging om de antilichaam-afhankelijke fagocytose door macrofagen van groen fluorescent eiwit-gelabelde, CD24-expresserende triple-negatieve borstkankercellen te visualiseren. Macrofagen worden afgeleid van mononucleaire cellen uit menselijk perifeer bloed, gedifferentieerd met macrophage colony–stimulating factor en gepolariseerd met interferon gamma en lipopolysacharide om een pro-inflammatoir fenotype te genereren. Kankercellen worden opsoniseerde met een anti-CD24 monoklonaal antilichaam voorafgaand aan co-cultuur met macrofagen bij een gedefinieerde effector-to-target ratio. Fagocytische gebeurtenissen worden gedurende een periode van 16 h geregistreerd met behulp van een geautomatiseerde microscoop uitgerust met omgevingscontrole om fysiologische omstandigheden te handhaven. De beeldvorming wordt uitgevoerd met helderveld- en fluorescentiekanalen, waardoor kankercellen kunnen worden geïdentificeerd en hun internalisatie door macrofagen kan worden gemonitord. Representatieve time-lapse beelden tonen de progressieve insluiting van fluorescente kankercellen in de loop van de tijd. Om een kwantitatieve beoordeling mogelijk te maken, wordt een parallelle endpoint-assay uitgevoerd onder identieke co-cultuurcondities, waarbij niet-geïnternaliseerde kankercellen vóór de beeldvorming worden verwijderd om een nauwkeurige meting van fagocytische gebeurtenissen mogelijk te maken. Deze methode biedt een gestandaardiseerde en reproduceerbare aanpak voor het visualiseren van antilichaam-gestuurde macrofaagfagocytose in vitro. Belangrijk is dat de integratie van time-lapse imaging met endpoint-gebaseerde kwantificering een complementaire evaluatie van de kinetiek en de omvang van de fagocytose mogelijk maakt. Dit protocol ondersteunt de evaluatie van therapeutische antilichamen en macrofaag-gerichte kankerimmunotherapieën in een gecontroleerde in vitro setting.

Inleiding

Borstkanker is de meest gediagnosticeerde maligniteit onder vrouwen wereldwijd, met jaarlijks ongeveer 2,3 miljoen nieuwe gevallen1. De ziekte is klinisch heterogeen en wordt ingedeeld in ten minste vier belangrijke moleculaire subtypen op basis van de status van hormoonreceptoren — de oestrogeenreceptor (ER) en de progesteronreceptor (PR) — en de expressie van het human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) oncogen2. Luminale A-tumoren brengen ER en/of PR tot expressie zonder HER2-overexpressie (ER/PR+ en HER2−); luminale B-tumoren brengen ER/PR en HER2 gelijktijdig tot expressie (ER/PR+ en HER2+); HER2+-tumoren worden gekenmerkt door een hoge HER2-expressie onafhankelijk van de hormoonreceptorstatus; en triple-negatieve borstkanker (TNBC) vertoont geen expressie van deze drie markers (ER−, PR− en HER2−)2,3. Van deze subtypen vormt TNBC de klinisch meest uitdagende vorm en is verantwoordelijk voor ongeveer 15%–20% van alle gevallen van borstkanker. Patiënten met TNBC vertonen het meest agressieve ziekteverloop, met de slechtste prognose en de kortste 5-jaarsoverleving, vanwege de geringe respons op conventionele chemotherapie en het ontbreken van effectieve doelgerichte therapieën3,4. Bovendien vertoont TNBC een significant hoge neiging tot viscerale metastasering, in het bijzonder naar de longen binnen 5 jaar na de diagnose, en patiënten met gevorderde of gemetastaseerde TNBC (mTNBC) hebben een mediane overleving die zelden de 2 jaar overschrijdt5,6. Deze statistieken onderstrepen de kritieke en onvervulde behoefte aan nieuwe therapeutische strategieën voor TNBC.

De tumoromgeving (TME) speelt een cruciale rol bij de progressie van borstkanker en immuunontwijking. Tumor-geassocieerde macrofagen behoren tot de meest voorkomende immuuncellen binnen de TME en zijn recentelijk erkend als kritische mediatoren van de aangeboren anti-tumorimmuniteit7,8,9. Hoewel TAM's historisch gezien werden onderverdeeld in pro-inflammatoire “M1”- en pro-tumorale “M2”-toestanden, slaagt dit binaire model er niet in om de werkelijke omvang van de heterogeniteit van macrofagen vast te leggen. In plaats daarvan beslaan TAM's een dynamisch functioneel spectrum en evolueren ze als reactie op de diverse biochemische signalen binnen de TME. Binnen dit complexe landschap ondermijnen kankercellen actief de macrofaagactiviteit via diverse strategieën voor immuunontwijking, met name de overexpressie van “niet opeten”-signalen. De CD47/SIRPα-as was het eerste geïdentificeerde aangeboren immuuncheckpoint in deze context6,10, en recentelijk is CD24 naar voren gekomen als een nieuw en krachtig antifagocytisch signaal11,12. CD24 is een klein en sterk geglycosyleerd mucine-type glycoproteïne dat via een glycosylfosfatidylinositol-koppeling aan het celmembraan is verankerd13. Het komt onder fysiologische omstandigheden voor in verschillende immuuncellijnen, maar wordt vaak overgeëxpresseerd in solide tumoren, waaronder borst-, eierstok-, pancreas- en colorectale kanker14. Op tumorcellen bindt CD24 aan de inhiberende receptor sialinezuurbindend immunoglobuline-achtig lectine 10 (Siglec-10) die op macrofagen tot expressie komt. Deze interactie triggert de fosforylering van de immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif-domeinen in de cytoplasmatische staart van Siglec-10, waardoor de SHP-1- en SHP-2-fosfatasen worden geactiveerd die de stroomafwaartse fagocytische signalering onderdrukken11. Het blokkeren van de CD24/Siglec-10-interactie met monoklonale antilichamen heeft aangetoond dat de fagocytose van CD24-expresserende menselijke tumoren door macrofagen robuust wordt versterkt. Onze recente studie toonde ook aan dat knockout van CD24a in borstkankercellen hun vatbaarheid voor macrofaagfagocytose verhoogt in een muismodel voor triple-negatieve borstkanker9.

Antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP) is een cruciaal mechanisme waarmee antilichamen macrofagen aansturen om tumorcellen te fagocyteren15,16. Na binding aan op tumorcellen tot expressie gebrachte antigenen, bindt de Fc-regio van het antilichaam aan Fcγ-receptoren (FcγRs) op macrofagen, wat intracellulaire signaleringscascades activeert die leiden tot reorganisatie van het cytoskelet, vorming van de fagocytosecup en insluiting van de doelcel17.

In deze studie hebben we een time-lapse live-cell imagingprotocol ontwikkeld en gevalideerd voor het meten van antilichaam-gestuurde fagocytose van borstkankercellen door macrofagen. De methode maakt gebruik van macrofagen afgeleid van perifere bloedmononucleaire cellen (PBMC) van gezonde menselijke donoren, gedifferentieerd met macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) en vervolgens gestimuleerd met lipopolysaccharide (LPS) en interferon gamma (IFN-γ). Flowcytometrie-analyse bevestigde de upregulatie van CD80 binnen de CD11b⁺ populatie na stimulatie (Figuur 1), wat het klassiek geactiveerde fenotype ondersteunt. Deze activatiestatus verleent een robuuste antilichaam-gemedieerde fagocytische capaciteit, waardoor deze zeer geschikt is voor het evalueren van antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose (ADCP). GFP-getagde CD24-positieve borstkankercellen dienen als doelcellen en worden vóór co-cultuur geopsoniseerd met een therapeutisch anti-CD24 monoklonaal antilichaam. Fagocytische gebeurtenissen worden gedurende een periode van 16 h geregistreerd met een geautomatiseerde microscoop onder gecontroleerde omgevingsomstandigheden. Om kwantitatieve beoordeling parallel aan dynamische visualisatie mogelijk te maken, wordt een aparte endpoint-assay uitgevoerd onder identieke co-cultuurcondities, wat een nauwkeurige meting van fagocytose mogelijk maakt na verwijdering van niet-geïnternaliseerde doelcellen. Dit protocol biedt een gestandaardiseerd, reproduceerbaar en visueel informatief platform voor het evalueren van ADCP gemedieerd door een anti-CD24 antilichaam. Cruciaal is dat de integratie van time-lapse imaging met een complementaire op endpoints gebaseerde kwantificeringsstrategie gelijktijdige evaluatie van de fagocytische kinetiek en omvang mogelijk maakt. De methode kan worden aangepast voor het onderzoeken van andere immunotherapeutische targets gericht op macrofagen. Dit protocol is het meest geschikt voor het evalueren van ADCP gemedieerd door therapeutische monoklonale antilichamen tegen oppervlakteantigenen op kankercellen. Het is zeer geschikt voor vergelijkende screening van kandidaat-antilichamen, dosis-respons karakterisering en mechanistische studies naar Fc–FcγR interacties, inclusief de effecten van blokkade van "don't-eat-me"-signalen (bijv. CD47–SIRPα). Omdat de assay gebruikmaakt van primaire menselijke macrofagen, is deze ook geschikt voor translationele studies waarbij beoordeling van donor-tot-donor variabiliteit vereist is voorafgaand aan klinische ontwikkeling.

figure-introduction-1
Figuur 1. Generatie en flowcytometrie-validatie van IFN-γ/LPS-gestimuleerde macrofagen afgeleid van mononucleaire cellen uit perifeer bloed. Bovenste paneel: Mononucleaire cellen uit perifeer bloed (PBMCs) worden geïsoleerd van gezonde donoren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie met Ficoll-oplossing bij 400 × g gedurende 30 min bij 20°C, waarbij alle reagentia vooraf zijn geëquilibreerd op 20°C ± 2°C. Geïsoleerde PBMCs worden 7 dagen lang gekweekt in ImmunoCult-SF medium aangevuld met 100 ng/mL macrophage colony-stimulating factor (M-CSF) om macrofaagdifferentiatie te stimuleren (Dag 0–7), met aanvulling van het medium op Dag 5. Op Dag 8 worden de gedifferentieerde macrofagen 48 u gedurende gestimuleerd met 100 ng/mL IFN-γ en 1 µg/mL LPS (Dag 8–10). De cellen worden vervolgens onderworpen aan flowcytometrie-analyse. Onderste paneel: Flowcytometrie-analyse van macrofagen. Cellen werden gekleurd met een oppervlaktepaneel bestaande uit CD11b-FITC, CD80-PE en CD206-PerCP-Cy5.5, gevolgd door de toevoeging van DAPI vóór acquisitie voor de uitsluiting van dode cellen. Gating-strategie: Cellen werden eerst gegated op levende cellen (DAPI⁻), gevolgd door CD11b⁺-identificatie op een CD11b-FITC versus FSC-A plot om de macrofaagidentiteit te bevestigen. Levende CD11b⁺-events werden vervolgens geanalyseerd op een CD80 versus CD206 dot plot om de CD80⁺CD206⁻ populatie geïnduceerd door IFN-γ/LPS-stimulatie te bevestigen. Rechts: Representatieve dot plot van CD11b-FITC versus FSC-A die aantoont dat 99,8% van de gegatede cellen CD11b⁺ was, wat de macrofaagidentiteit bevestigt. Links: De meerderheid van de CD11b⁺-cellen viel binnen de CD80⁺CD206⁻ gate (Q1: 95,2%), wat wijst op het verwachte pro-inflammatoire fenotype onder de toegepaste stimulatiecondities. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Gebruikers moeten rekening houden met verschillende beperkingen bij het toepassen van deze techniek. Ten eerste kan donorvariabiliteit in uit PBMC afgeleide macrofagen leiden tot aanzienlijke variantie in de fagocytische output; wij raden aan om meerdere donoren (n ≥ 3) te gebruiken en individuele donorgegevens naast de gepoelde resultaten te rapporteren. Ten tweede bootst het 2D co-cultuurformaat de tumormicro-omgeving niet na, waardoor bevindingen moeten worden gevalideerd in 3D- of in vivo-modellen voordat klinische conclusies kunnen worden getrokken. Ten derde legt het beeldvormingsvenster van 16 uur vroege fagocytische gebeurtenissen vast, maar weerspiegelt het geen langetermijnprocessen zoals antigeenpresentatie of secundaire immuunactivatie. De gecombineerde inzet van real-time beeldvorming en eindpuntkwantificering biedt dus een complementair kader dat zowel de interpreteerbaarheid als de reproduceerbaarheid van ADCP-metingen verbetert.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol omvat het gebruik van primaire macrofagen afgeleid van bloedmonsters van gezonde donoren. De verzameling en verwerking van de monsters werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Institutional Review Board (IRB) van de China Medical University.

1. Preparatie van uit PBMC afgeleide macrofagen

OPMERKING: Voer alle procedures met menselijk bloed uit onder goedkeuring van de institutionele ethische commissie (bijv. CMUH IRB). Verkrijg geïnformeerde toestemming van gezonde donoren voorafgaand aan de bloedafname.

WAARSCHUWING: Behandel alle menselijke bloedproducten onder Biosafety Level 2-omstandigheden met gebruik van universele voorzorgsmaatregelen.

  1. Bloedafname
    1. Neem volbloed af van een gezonde donor in 10 mL vacutainers gecoat met ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA).
  2. Bloedverdunning
    1. Verdun het volbloed in een verhouding van 1:1 met ijskoud fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; Ca2⁺-/Mg2⁺-vrij) (bijv. 10 mL bloed + 10 mL PBS).
    2. Meng door drie tot vijf keer voorzichtig om te keren.
      OPMERKING: Bewaar PBS op ijs vóór gebruik. Een lage temperatuur helpt de levensvatbaarheid van de cellen tijdens de verwerking te behouden.
  3. Laagvorming van de dichtheidsgradiënt
    1. Breng het verdunde bloed voorzichtig in lagen aan over Ficoll–Paque PLUS in een conische buis in een volumeverhouding van 2:1 (v/v) (bijv. 8 mL bloed over 4 mL Ficoll in een 15 mL buis, of 30 mL over 15 mL in een 50 mL buis).
    2. Equilibreer zowel het verdunde bloed als de Ficoll–Paque PLUS tot 20°C ± 2°C vóór het aanbrengen in lagen.
    3. Haal Ficoll–Paque PLUS ten minste 30 min vóór gebruik uit de opslag bij 4°C, of warm kort op in een waterbad van 20°C ± 2°C.
    4. Gebruik geen koude reagentia, aangezien de Ficoll-dichtheid is gekalibreerd voor 20°C ± 2°C, en afwijkingen de scheidingsefficiëntie en de PBMC-opbrengst zullen beïnvloeden.
      OPMERKING: Houd de buis onder een hoek van 45° en pipetteer het bloed langzaam langs de wand om een scherpe interface te behouden. Verstoor de Ficoll-laag niet.
  4. Centrifugatie
    1. Centrifugeer 30 min bij 400 × g bij 20°C met de rem uitgeschakeld (Afbeelding 1).
      OPMERKING: Remmen zal de dichtheidsgradiënt verstoren en de PBMC-opbrengst verminderen.
  5. PBMC-collectie
    1. Aspireer voorzichtig met een serologische pipette alleen de buffy coat-laag (de witachtige interface tussen de plasmalaag en de Ficoll-laag), zonder de bovenliggende plasmalaag of de onderliggende Ficoll-laag te verstoren.
    2. Overbreng de verzamelde laag naar een nieuwe conische buis van 50 mL.
  6. Wassen van PBMC's
    1. Voeg PBS toe om het totale volume aan te vullen tot 25 mL in een conische buis van 50 mL.
    2. Gebruik een 50 mL buis om een correcte centrifugatie en balans te garanderen.
    3. Centrifugeer 10 min bij 300 × g.
  7. RBC-lyse
    1. Verwijder het supernatant.
    2. Resuspendeer de pellet in 5 mL rode bloedcel (RBC) lysebuffer door voorzichtig op en neer te pipetteren met een serologische pipette totdat de pellet volledig is gedispergeerd en er geen zichtbare klontjes meer overblijven.
    3. Incubeer 5 min bij kamertemperatuur.
      WAARSCHUWING: Volledige dispersie is vereist om een uniforme lyse te garanderen; vermijd echter krachtig pipetteren of vortexen, omdat dit de PBMC's kan beschadigen. Overschrijd de incubatietijd van 5 min met de RBC-lysebuffer niet, aangezien langdurige blootstelling de levensvatbaarheid van de PBMC's kan beïnvloeden.
  8. Pelletteren van PBMC's
    1. Centrifugeer 5 min bij 500 × g om de PBMC's te pelletteren en de geliseerde RBC-debris te verwijderen.
  9. Finale resuspensie
    1. Verwijder het supernatant.
    2. Resuspendeer de pellet in 5 mL ImmunoCult-SF macrofaagmedium.
      OPMERKING: Onder standaardcondities levert 10 mL volbloed doorgaans 1,5–2,0 × 107 PBMC's op.

2. Macrofaagdifferentiatie (Dag 0–7)

OPMERKING: Gebruik Petri-schalen die niet zijn behandeld voor weefselkweek (TC) om gedifferentieerde macrofagen, afgeleid van monocyten door adhesie, te selecteren. Niet-adherente lymfocyten worden tijdens de daaropvolgende kweek weggewassen.

  1. Dag 0: Celuitplating
    1. Voer een celtelling uit en plateer 1 × 107 PBMCs in een niet-TC-behandelde Petrischaal van 10 cm.
    2. Breng het totale volume aan tot 10 mL met ImmunoCult-SF macrofaagmedium aangevuld met 100 ng/mL M-CSF (bereid door de M-CSF-stock direct voor gebruik aan het complete medium toe te voegen en door voorzichtig omkeren te mengen).
      OPMERKING: Het protocol kan proportioneel worden geschaald om variaties in de opbrengst van donor-PBMCs op te vangen, waarbij een uitplatingsdichtheid vanaf 1 × 106 cellen/mL als basis dient.
  2. Incubatie en monitoring
    1. Incubeer bij 37°C met 5% CO₂ in een bevochtigde incubator.
    2. Houd de vorming van zwevende monocytenclusters en de verschijning van adherente cellen dagelijks in de gaten.
      OPMERKING: De monocyten zullen geleidelijk in omvang toenemen en clusters vormen naarmate de differentiatie vordert. Sommige monocyten zullen zich aan de plaat gaan hechten. Er is in deze stap geen interventie vereist.
  3. Dag 5: Supplementatie van het medium
    1. Voeg voorzichtig 5 mL vers ImmunoCult-SF macrofaagmedium aangevuld met 100 ng/mL M-CSF toe aan de schaal, waarbij u er zorg voor draagt dat de adherente macrofagen niet worden verstoord.
    2. Zet de kweek nog 2 dagen voort (tot dag 7).
      WAARSCHUWING: Voeg het verse medium voorzichtig langs de rand van de schaal toe om te voorkomen dat de adherente macrofagen worden verstoord, aangezien mechanische verstoring de differentiatie-efficiëntie en celopbrengst kan beïnvloeden.
      OPMERKING: Vermijd het vervangen van het medium om autocriene/paracriene factoren te behouden die de macrofaagdifferentiatie ondersteunen.
  4. Dag 7: Morfologische beoordeling
    1. Beoordeel de differentiatie-efficiëntie van de macrofagen onder een omgekeerde microscoop.
    2. Adherente cellen vertonen de karakteristieke macrofaagmorfologie: groot, afgeplat en onregelmatig van vorm, met zichtbare pseudopodia.
    3. Op dag 7 moeten goed gedifferentieerde macrofagen zichtbaar zijn.
      WAARSCHUWING: De morfologische beoordeling op dag 7 dient als een kritische voorwaarde voor de daaropvolgende validatie via flowcytometrie. Goed gedifferentieerde macrofagen moeten duidelijk zichtbaar zijn onder de microscoop, en een hoger aandeel adherente cellen met macrofaagmorfologie weerspiegelt een grotere differentiatie-efficiëntie (een confluentie van ongeveer 70% van adherente macrofagen met karakteristieke morfologie wordt beschouwd als indicatief voor een succesvolle differentiatie). Kweken die een geringe adhesie vertonen, voornamelijk ronde cellen bevatten of anderszins een slechte morfologische differentiatie laten zien, zullen waarschijnlijk geen betrouwbare resultaten bij flowcytometrie opleveren en mogen niet worden doorgevoerd naar stimulatie en kleuring.

3. Macrofagenpolarisatie (Dag 8–10)

  1. Verzamelen en klaren van geconditioneerd medium
    1. Aspireer op dag 8 voorzichtig de 15 mL medium uit de kweekschaal zonder de adherente macrofagen te verstoren en breng dit over naar een steriele conische buis van 50 mL.
    2. Centrifugeer het verzamelde medium bij 400 × g gedurende 5 min om celresten te pelletteren.
    3. Bewaar het geklaarde supernatant voor de volgende stap.
  2. Stimulatie met interferon gamma (IFN-γ) en lipopolysaccharide (LPS)
    1. Breng het geklaarde supernatant van 15 mL over naar een nieuwe steriele buis en vul dit aan met 100 ng/mL IFN-γ en 1 µg/mL LPS.
    2. Meng grondig door voorzichtig met de pipet op en neer te bewegen (5–10 keer) om een uniforme cytokineverdeling te garanderen zonder luchtbellen te introduceren.
    3. Breng de volledige 15 mL van het cytokine-gesupplementeerde medium terug in de oorspronkelijke kweekschaal door voorzichtig langs de binnenwand te pipetteren om te voorkomen dat de adherente macrofagen worden verstoord.
    4. Incubeer bij 37°C met 5% CO₂ gedurende 48 h (dag 8 tot dag 10).
      OPMERKING: Gebruik geconditioneerd (oud) medium om autocriene/paracriene factoren te behouden. Deze combinatie van IFN-γ en LPS wordt gebruikt om macrofagen te polariseren naar een pro-inflammatoir fenotype. Onder de stimulatiecondities met IFN-γ (100 ng/mL) en LPS (1 µg/mL) die in dit protocol worden gebruikt, vertonen macrofagen karakteristieke morfologische veranderingen, waaronder verlengde lamellipodia die consistent zijn met een geactiveerde pro-inflammatoire staat, evenals CD11b- en CD80-expressie.
      WAARSCHUWING: Behandel LPS volgens de juiste laboratoriumveiligheidsprocedures, aangezien het een bioactief endotoxine is dat bij blootstelling ontstekingsreacties kan veroorzaken.

4. Bevestiging van inflammatoire fenotype-markers van IFN-γ- en LPS-gestimuleerde macrofagen via flowcytometrie

  1. Oogsten van cellen
    1. Oogst op dag 10 een subset van gepolariseerde macrofagen voor fenotypering.
    2. Voeg 10 mM EDTA in PBS toe en incubeer 10–15 min bij 37°C.
    3. Los de cellen voorzichtig los door middel van pipetteren.
      OPMERKING: Verleng de EDTA-incubatie met nog eens 30 min bij 37°C als de cellen adherent blijven, en herhaal vervolgens het voorzichtig pipetteren. Vermijd krachtig pipetteren of mechanisch schrapen om de levensvatbaarheid van de cellen en de integriteit van de oppervlaktemarkers te behouden.
  2. Voorbereiding van antilichaamkleuring
    1. Kleur de cellen met fluorochroom-geconjugeerde antilichamen tegen CD11b (pan-macrofaag lineage marker), CD80 (inflammatoire marker) en CD206 (anti-inflammatoire marker gebruikt als negatieve exclusiemarker voor de identificatie van het inflammatoire fenotype).
  3. Kleuringsprocedure
    1. Overbreng 5 × 105 losgekomen macrofagen naar een flowcytometrie-buis met 100 µL koud PBS.
    2. Voeg CD11b-FITC, CD80-PE en CD206-PerCP-Cy5.5 antilichamen toe tot een eindconcentratie van elk 1 µg/mL.
    3. Meng de celsuspensie door voorzichtig te pipetteren.
    4. Incubeer de monsters 1 u op ijs, beschermd tegen licht.
    5. Centrifugeer de monsters 1 min bij 300 × g bij 4°C.
    6. Aspireer het supernatant zorgvuldig.
    7. Voeg 0,5 mL koud PBS toe om de celpellet te wassen.
    8. Centrifugeer de monsters 1 min bij 300 × g bij 4°C.
    9. Verwijder het supernatant.
    10. Resuspendeer de celpellet in 200 µL koud PBS.
    11. Voeg DAPI toe tot een eindconcentratie van 1 µg/mL.
      OPMERKING: Voeg geschikte isotype-controles en een levensvatbaarheidskleurstof toe (bijv. DAPI of Viobility 405/452 Fixable Dye).
  4. Flowcytometrie-analyse
    1. Analyseer de gekleurde monsters met een flowcytometer.
    2. Bevestig de expressie van CD11b en CD80 in de macrofaagpopulatie.
    3. Ga pas over tot de fagocytose-assay nadat de marker-expressie consistent met een inflammatoir fenotype is bevestigd.
  5. Acquisitie en instelling van flowcytometrie
    1. Instelling van het instrument
      1. Configureer de flowcytometer met de volgende kanalen: Pacific Blue/V450 (DAPI), FITC (CD11b), PE (CD80) en PerCP-Cy5.5 (CD206).
      2. Stel de acquisitieparameter in om 10.000 events per monster te verzamelen binnen de gedefinieerde parent gate.
    2. Kalibratie van drempelwaarde en gain
      1. Open vier dot plots met FSC op de x-as en één fluorofoor-kanaal op de y-as.
      2. Bereid cellen voor die zijn gekleurd met de overeenkomstige isotype-controle-antilichamen die passen bij elke fluorofoor.
      3. Acquireer de isotype-controlemonsters.
      4. Pas de gain voor elk kanaal aan om de isotype-controlepopulatie onder 101 op de logaritmische schaal te positioneren.
      5. Gebruik deze drempelwaarde om de achtergrondsignaalniveaus te definiëren.
        OPMERKING: Gebruik een logaritmisch schaalbereik van 101 tot 101·5 om een betrouwbare scheiding tussen achtergrond en specifiek signaal vast te stellen.
    3. Compensatie
      1. Voeg één druppel compensatie-beads toe aan een 1,5 mL microcentrifugebuis.
      2. Voeg het overeenkomstige fluorochroom-geconjugeerde antilichaam toe tot een eindconcentratie van 1 µg/mL.
      3. Incubeer 30 min op ijs, beschermd tegen licht.
      4. Centrifugeer 1 min bij 400 × g.
      5. Verwijder het supernatant.
      6. Resuspendeer de beads in 200 µL koud PBS.
      7. Acquireer single-color controles.
      8. Pas spectrale compensatie toe om fluorofoor-spillover te corrigeren.
    4. Gating-strategie
      1. Selectie van levende cellen
        1. Toon Pacific Blue/V450 (DAPI) op de y-as en FSC op de x-as.
        2. Gate op DAPI-negatieve events (onder 101) om levende cellen te selecteren.
      2. Identificatie van macrofagen
        1. Stel de populatie levende cellen in als de parent gate.
        2. Toon FITC (CD11b) op de y-as en FSC op de x-as.
        3. Gate op CD11b⁺ events (boven 101).
      3. Identificatie van het inflammatoire fenotype
        1. Stel de CD11b⁺ populatie in als de parent gate.
        2. Toon PE (CD80) op de y-as en PerCP-Cy5.5 (CD206) op de x-as.
        3. Pas quadrant gating toe bij 101.5 op beide assen.
        4. Identificeer CD80⁺CD206⁻ cellen in het linksbovenkwadrant (Q1).
  6. Acceptatiecriteria
    1. Bevestig dat ≥90% van de cellen binnen de CD11b⁺ parent gate CD80⁺CD206⁻ zijn.
    2. Ga pas over tot de fagocytose-assay wanneer deze drempelwaarde is bereikt.
    3. Herhaal de PBMC-isolatie, M-CSF-differentiatie en IFN-γ/LPS-stimulatie als monsters niet aan dit criterium voldoen.

5. Assay voor antilichaam-afhankelijke fagocytose

OPMERKING: Verifieer de stabiele GFP-expressie in kankercellen vóór de opzet van de assay. Bevestig de CD24-expressie op doelcellen voorafgaand aan de assay. Gebruik kankercellen met een CD24-positiviteit van 50%–100% voor optimale prestaties. De in dit protocol gebruikte MDA-MB-468-cellen vertonen een CD24-positiviteit van 100%.

  1. Zaaien van macrofagen
    1. Zaai IFN-γ- en LPS-gestimuleerde macrofagen, zoals gevalideerd in Stap 4, bij 2 × 105 cellen per putje in een 24-wells weefselkweekplaat.
    2. Incubeer de plaat bij 37°C onder statische omstandigheden met 5% CO₂ gedurende 12–16 u om celadhesie mogelijk te maken (Figuur 2A).
      OPMERKING: Zorg voor een stevige adhesie van de macrofagen voordat u verdergaat. Slecht geadhereerde macrofagen kunnen tijdens de beeldvorming loslaten, wat de resultaten kan beïnvloeden.
  2. Preparatie van kankercellen
    1. Kweek CD24-positieve GFP-gelabelde borstkankercellen (MDA-MB-468) tot een confluentie van 70%–80%.
    2. Aspireer het kweekmedium.
    3. Was de cellaag eenmaal met PBS.
  3. Loskoppeling van kankercellen
    1. Voeg 10 mM EDTA in PBS toe aan de kweekschaal.
    2. Incubeer de cellen bij 37°C gedurende 5–10 min.
    3. Los de cellen voorzichtig met een pipet los om een volledige celvrijgave te bereiken.
      OPMERKING: Vermijd het gebruik van trypsine voor het losmaken van cellen. Enzymatische digestie kan CD24 van het celoppervlak splitsen, waardoor de antilichaambinding in gevaar komt.
  4. Verzamelen en tellen van kankercellen
    1. Verzamel de losgekoppelde cellen in een centrifugebuis.
    2. Centrifugeer de cellen bij 300 × g gedurende 5 min.
    3. Verwijder het supernatant.
    4. Resuspendeer de celpellet in compleet RPMI medium
    5. Tel de levensvatbare cellen.
  5. Antilichaam-opsonisatie van kankercellen
    1. Resuspendeer de kankercellen bij een dichtheid van 2 × 105 cellen/ml in 0,5 ml compleet RPMI medium
    2. Voeg anti-CD24 monoklonaal antilichaam toe tot een eindconcentratie van 1 µg/mL.
    3. Meng de cel-suspensie door voorzichtig te pipetteren om een uniforme distributie van de antilichamen te waarborgen.
    4. Incubeer de cellen bij 37°C gedurende 30 min onder statische omstandigheden.
      OPMERKING: Voeg een isotype-gematchte IgG-controle toe in dezelfde concentratie als negatieve controle voor antilichaam-afhankelijke fagocytose.
  6. Voorbereiding voor co-cultuur
    1. Was de cellen niet na opsonisatie.
    2. Ga direct over tot co-cultuur om de antilichaamcoating op het celoppervlak te behouden.
  7. Opstelling van de cocultuur
    1. Voeg 1 toe × 105 met antilichamen geopsoniseerde GFP-gelabelde borstkankercellen aan elke put met macrofagen.
    2. Houd een effector-targetratio van 2:1 aan.
      OPMERKING: Pas de effector-targetratio aan op basis van het experimentele ontwerp. Gebruik hogere ratio's van macrofagen ten opzichte van kankercellen dan de beschreven ratio van 2:1 (bijv. 3:1 of 5:1) om de frequentie van cel-celcontacten te verhogen en de detectie van fagocytische gebeurtenissen te verbeteren.

figure-protocol-1
Figuur 2. Time-lapse imaging van antilichaam-afhankelijke cellulaire fagocytose. (A) Schematisch overzicht van het co-cultuursysteem en de time-lapse imaging-opstelling. De beeldparameters omvatten een interval van 10 min over een totale acquisitietijd van 16 h (97 frames), met gebruik van een 10× objectief met fasecontrast- en GFP-kanalen. (B) Representatieve time-lapse beelden van 1 h tot 16 h die fagocytische gebeurtenissen tonen, gekenmerkt door de internalisatie van GFP-positieve kankercellen door macrofagen in de loop van de tijd. Gele gestreepte cirkels markeren representatieve fagocytische gebeurtenissen. In het fasecontrastkanaal verschijnen ingesloten kankercellen als fase-heldere intracellulaire structuren binnen het cytoplasma van de macrofaag (witte pijlen). In het GFP-kanaal bevestigt fluorescentie gelokaliseerd binnen macrofagen de internalisatie. (C) Vergrotingen van representatieve fagocytische gebeurtenissen op 0, 1, 4 en 16 h, die het sequentiële proces van macrofaag-gemedieerde insluiting van GFP-gelabelde kankercellen illustreren. De beeldsequentie is geselecteerd als representatief op basis van duidelijke visualisatie van macrofaag-gemedieerde fagocytische gebeurtenissen. Witte pijlen geven macrofagen aan die interageren met en doelcellen internaliseren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Time-lapse imaging (Geautomatiseerd live-cell imaging systeem)

OPMERKING: Configureer het beeldvormingsprotocol met een Lionheart geautomatiseerd live-cell imaging-systeem en Gen5 geautomatiseerde live-cell imaging-software vóór de assay. Volg een适当 training voordat u het beeldvormingssysteem bedient om een nauwkeurige installatie, optimale prestaties en veilig gebruik te garanderen.

  1. Voorbereiding van het instrument
    1. Schakel het imaging-systeem, de module voor omgevingscontrole en de CO₂-gasvoorziening ten minste 1 u vóór de beeldvorming in.
    2. Open het paneel Environment Control in de software voor geautomatiseerde live-cell imaging.
    3. Stel de temperatuur in op 37°C en de CO₂ op 5%.
    4. Bevestig dat de temperatuur in de kamer stabiliseert binnen ± 0.2°C en de CO₂ op 5.0% ± 0.1% vóór het laden van de plaat.
  2. Opstelling van de plaat
    1. Plaats de 24-wellplaat in de imaging-kamer van het imaging-systeem.
  3. Initiële configuratie
    1. Open de Task Manager van de software voor geautomatiseerde live-cell imaging.
    2. Selecteer [Imager manual mode].
    3. Klik op [Capture now] om de imaging-parameters te initialiseren.
    4. Selecteer een 10× objectief.
    5. Selecteer microplate als filterinstelling.
    6. Selecteer een 24-wellplaat uit de plaatbibliotheek van de software voor geautomatiseerde live-cell imaging.
  4. Focus- en image-opstelling
    1. Selecteer het fasecontrastkanaal.
    2. Selecteer een representatieve well (bijv. A1).
    3. Activeer de autofocus voorafgaand aan de time-lapse acquisitie.
    4. Leg een beeld vast met behulp van het camera-icoon.
    5. Bevestig de celmorfologie en de focuskwaliteit.
    6. Navigeer naar [Process/Analyze].
    7. Selecteer [Create experiment from an image set] om het experiment te configureren.
  5. Parameters voor time-lapse acquisitie
    1. Open het instellingenpaneel [Procedure].
    2. Stel de temperatuur in op 37°C en de CO₂ op 5%.
    3. Stel onder [Start Kinetic] de looptijd in op 16:00:00.
    4. Stel het imaging-interval in op 0:10:00.
    5. Stel het totaal aantal reads in op 97.
    6. Gebruik een imaging-interval van 10–15 min om een balans te vinden tussen temporele resolutie en fototoxiciteit bij het vastleggen van vroege fagocytische gebeurtenissen.
  6. Configuratie van de imaging-kanalen
    1. Stel Kanaal 1 in op fasecontrast.
    2. Stel Kanaal 2 in op GFP (Ex 469/35, Em 525/39).
    3. Selecteer een 10× objectief voor een optimaal gezichtsveld en resolutie.
    4. Stel de verlichting, integratietijd en gain in op [Auto], of pas deze handmatig aan.
    5. Gebruik een typische GFP-belichtingstijd van 100–300 ms om signaalverzadiging te voorkomen.
    6. Pas identieke imaging-instellingen toe op alle wells.
  7. Opstelling van de imaging-posities
    1. Open het menu [Define beacons].
    2. Schakel Z-stack acquisitie uit.
    3. Schakel montage-acquisitie uit.
    4. Voer de beeldvorming uit op een enkel brandvlak.
    5. Definieer de imaging-posities handmatig door representatieve, niet-overlappende gebieden binnen elke well te selecteren met behulp van het microscoop-icoon.
    6. Houd identieke imaging-posities aan over alle tijdspunten.
    7. Selecteer ten minste 4–6 gezichtsvelden per well.
  8. Time-lapse acquisitie
    1. Klik op [Play] om de geautomatiseerde time-lapse imaging te starten.
  9. Data-export en visualisatie
    1. Open het opgeslagen experimentbestand na de acquisitie.
    2. Selecteer de imaging-posities.
    3. Exporteer de time-lapse data in MP4-formaat.
    4. Open de [Process Tool].
    5. Pas indien nodig [Image Deconvolution] toe om de visualisatie te verbeteren en representatieve fagocytose-gebeurtenissen te identificeren.
      OPMERKING: Gebruik time-lapse imaging uitsluitend voor kwalitatieve visualisatie. Niet-opgenomen GFP-positieve kankercellen kunnen overlappen of tijdelijk geassocieerd zijn met macrofagen, wat leidt tot fout-positieve signalen. Voer kwantitatieve analyse uit met een aparte endpoint-assay.

7. Kwantificatie van de fagocytose bij het eindpunt

  1. Verwijdering van niet-geïnternaliseerde cellen
    1. Voer de assay uit onder identieke co-culturecondities.
    2. Beëindig het experiment na 4 h.
    3. Verwijder het cultuurmedium.
    4. Voeg 10 mM EDTA in PBS toe.
    5. Incubeer gedurende 5 min bij 37°C.
    6. Was voorzichtig met PBS om niet-geïnternaliseerde GFP-positieve cellen te verwijderen.
    7. Voeg vers macrofaagmedium toe.
  2. Beeldacquisitie voor kwantificering
    1. Neem beelden op met fasecontrast- en GFP-kanalen.
    2. Leg minstens 4–6 gezichtsvelden per well vast.
    3. Analyseer minimaal drie wells per conditie.
  3. Definitie van fagocytische gebeurtenissen
    1. Identificeer macrofagen die GFP-positieve signalen bevatten die volledig omsloten zijn binnen de cellulaire grens.
  4. Beeldanalyse
    1. Open de beelden in de ImageJ-software.
    2. Gebruik de Cell Counter-plugin.
    3. Tel het totale aantal macrofagen.
    4. Tel de macrofagen die geïnternaliseerde GFP-positieve cellen bevatten.
  5. Berekening van de fagocytose-index
    1. Bereken: figure-protocol-2
    2. Voer de analyse blind uit.
    3. Herhaal dit in ten minste drie onafhankelijke experimenten.
  6. Datapresentatie
    1. Presenteer representatieve time-lapse-beelden chronologisch (Figuur 2B en Figuur 2C).
    2. Presenteer representatieve eindpuntbeelden (Figuur 3A en Figuur 3B).

figure-protocol-3
Figuur 3. Kwantificering van antilichaam-afhankelijke macrofaag-fagocytose via eindpuntsanalyse. (A) Representatieve fasecontrast- en GFP-fluorescentiebeelden van macrofagen die gedurende 4 h zijn gecocultureerd met GFP-gelabelde borstkankercellen, gevolgd door verwijdering van niet-opgenomen cellen middels EDTA-behandeling. Fasecontrast- en GFP-kanalen werden samengevoegd om macrofagen en geïnternaliseerde GFP-positieve doelcellen te identificeren. Macrofagen (teller 0) en GFP-positieve fagocyterende macrofagen (teller 1) werden geteld met de Cell Counter-plugin in ImageJ. In de IgG-controleconditie werden geen fagocytische gebeurtenissen waargenomen, terwijl behandeling met anti-CD24 monoklonaal antilichaam resulteerde in duidelijke intracellulaire GFP-positieve signalen binnen macrofagen, wat duidt op actieve fagocytose. Schaalbalk = 200 µm. (B) Kwantificering van de fagocytose-index, gedefinieerd als het percentage macrofagen dat geïnternaliseerde GFP-positieve cellen bevat ten opzichte van de totale macrofaagpopulatie. Anti-CD24 monoklonaal antilichaam verhoogde de fagocytose-index significant vergeleken met de IgG-controle (0.00 ± 0.00% vs. 18.76 ± 4.01%, gemiddelde ± SD; n = 6 velden per groep; ***p < 0.001, Welch’s unpaired t-test). Gegevens zijn representatief voor ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De succesvolle generatie en polarisatie van macrofagen uit PBMC's werden bevestigd middels morfologische beoordeling en flowcytometrie-analyse (Figuur 1). PBMC's die waren geïsoleerd via dichtheidsgradiëntcentrifugatie werden gekweekt in medium aangevuld met M-CSF, wat tegen dag 7 resulteerde in adherente cellen met een kenmerkende macrofaagmorfologie. Na stimulatie met IFN-γ en LPS vertoonden de cellen een fenotype dat consistent was met activatie onder de toegepaste condities. Flowcytometr...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Verschillende stappen in dit protocol zijn cruciaal voor het verkrijgen van betrouwbare en reproduceerbare resultaten. Ten eerste hebben de kwaliteit en zuiverheid van de PBMC-isolatie een directe invloed op de opbrengst van macrofagen en de efficiëntie van de differentiatie. Voorzichtige gelaagdheid van verdund bloed over de Ficoll-gradiënt en centrifugatie waarbij de rem is uitgeschakeld, zijn essentieel om de interface van de buffy coat te behouden. Onvolledige RBC-lyse of een te lange incubatie met lysebuffer zal de ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Cancer Biology and Precision Therapeutics Center van de China Medical University, vanuit het Featured Areas Research Center Program in het kader van het Higher Education Sprout Project van het Ministerie van Onderwijs (MOE) in Taiwan (CBPTC-PROJ-5-2).

Wij danken het Cancer Biology and Precision Therapeutics Center voor de financiering en de academische ondersteuning.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,5 M ethylendiaminetetraazijnzuur (EDTA) voorraadoplossingSigma-Aldrich (of gelijkwaardig)E7889 (of equivalent)Gebruikt voor het bereiden van een 10 mM EDTA-werkoplossing in PBS voor celdetachering
24-well weefselkweekplaten (TC-behandeld)Corning (of gelijkwaardig)3524Gebruikt voor co-cultuur van macrofagen en kankercellen tijdens de fagocytose-assay
Anti-humaan CD206-antilichaam (flowcytometrie)BioLegend (of gelijkwaardig)321122 (of equivalent)Marker voor alternatief macrofaagfenotype
Anti-humaan CD24 monoklonaal antilichaamThermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)MA1-91384 (of equivalent)Wordt gebruikt om kankercellen te opsoniseren voor antilichaam-afhankelijke fagocytose
Geautomatiseerd live-cell imaging-systeem met omgevingscontrolekamer (bijv. Lionheart FX)Agilent Technologies (of gelijkwaardig)BioTek Lionheart FX geautomatiseerde microscoopMaakt langdurige time-lapse-beeldvorming mogelijk onder gecontroleerde temperatuur en 2 condities
Beeldvormingssoftware voor geautomatiseerde live-cell imaging (bijv. Gen5)Agilent Technologies (of gelijkwaardig)Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling produceren. Voer aub de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands.Gebruikt voor de acquisitie en analyse van time-lapse imaging-data
Centrifuge (swing-bucket rotor)Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)Multifuge X4R Pro met TX-1000 rotor (of equivalent)Gebruikt voor de isolatie van PBMC's en cellenwasstappen
2 incubator (37°C)°C, 5% 2)Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)Forma Direct Heat 2 Incubator (of equivalent)Handhaaft fysiologische omstandigheden voor celkweek
2 gasvoorziening met drukregelaarAgilent Technologies (of gelijkwaardig)Geen gegevens beschikbaarBenodigdheden 2 voor omgevingscontrole van de incubator en het imagingsysteem
Conische buizen (15 ml en 50 ml)Corning (of gelijkwaardig)352070 (of equivalent)Gebruikt voor de isolatie, het wassen en de centrifugatiestappen van PBMC's
met EDTA gecoate bloedafnamebuizen (vacutainers)BD Biosciences (of gelijkwaardig)367863 (of gelijkwaardig)Gebruikt voor de afname van volbloedmonsters van donoren
Ficoll-Paque PLUSCytiva (of gelijkwaardig)17144003 (of equivalent)Dichtheidsgradiërmedium voor de isolatie van PBMC's
Flowcytometer (bijv. FACSCanto II)BD Biosciences (of gelijkwaardig)BD FACSCanto II Gebruikt voor fenotypische analyse van macrofagen
Compensatieparels (flowcytometrie)Biolegend (of gelijkwaardig)424602Gebruikt voor eenkleurige compensatiecontroles
FITC anti-human CD11b-antilichaam (flowcytometrie)BioLegend (of gelijkwaardig)101205 (of gelijkwaardig)Marker gebruikt voor de identificatie van macrofagen
PE anti-human CD80-antilichaam (flowcytometrie)BioLegend (of gelijkwaardig)375410 (of equivalent)Marker geassocieerd met geactiveerd macrofaagfenotype
GFP-expresserende borstkankercellijn (MDA-MB-468)ATCC (of equivalent)HTB-132 (of equivalent)Doelcellen gebruikt in fagocytose-assay; GFP maakt visualisatie mogelijk
ImmunoCult-SF macrofaagmediumSTEMCELL Technologies (of gelijkwaardig)10961 (of equivalent)Serumvrij medium gebruikt voor macrofaagdifferentiatie
Dulbecco’Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)12100046Gebruikt voor de kweek en resuspensie van kankercellen
Isotype-controleantilichaam (IgG)Bio X Cell (of gelijkwaardig)BE0297 (of equivalent)Negatieve controle voor antilichaam-afhankelijke fagocytose-assay
Lipopolysaccharide (LPS)Sigma-Aldrich (of equivalent)L2630 (of gelijkwaardig)Stimulus gebruikt voor de activatie van macrofagen in combinatie met IFN-γ
Recombinant humaan interferon gamma (IFN-γ)STEMCELL Technologies (of gelijkwaardig)78020 (of gelijkwaardig)Cytokine gebruikt voor macrofaagactivatie
Recombinant menselijke macrofaag-koloniestimulerende factor (M-CSF)STEMCELL Technologies (of gelijkwaardig)78057 (of equivalent)Groeifactor gebruikt voor macrofaagdifferentiatie
Pasteurpipetten of serologische pipettenJetbiofil (of equivalent)GSP010010 (of gelijkwaardig)Gebruikt voor vloeistofbehandeling tijdens PBMC-isolatie en celkweek
PBS (Ca2+-vrij)2+-/Mg2+-vrij)Thermo Fisher Scientific (of gelijkwaardig)BP399-500 (of equivalent)Buffer gebruikt voor het wassen van cellen en verdunningsstappen
Petrischalen (100 mm, niet-behandeld)–(behandeld voor weefselkweek)Corning (of gelijkwaardig)430591Gebruikt voor macrofaagdifferentiatie via adherentieselectie
Lysisbuffer voor rode bloedcellen (RBC)BioLegend (of gelijkwaardig)420301 (of equivalent)Wordt gebruikt voor het verwijderen van rode bloedcellen tijdens de isolatie van PBMC's
Viability 405/452 Fixable DyeMiltenyi Biotec (of gelijkwaardig)130-130-404 (of equivalent)Wordt gebruikt om de celviabiliteit te beoordelen tijdens flowcytometrie-analyse
DAPISigma-Aldrich (of gelijkwaardig)D9542 (of equivalent)Gebruikt voor de uitsluiting van dode cellen bij flowcytometrie

Referenties

  1. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Perou, C. M., et al. Molecular portraits of human breast tumours. Nature. 406 (6797), 747-752 (2000).
  3. Foulkes, W. D., Smith, I. E., Reis-Filho, J. S. Triple-negative breast cancer. N Engl J Med. 363 (20), 1938-1948 (2010).
  4. Dent, R., et al. Triple-negative breast cancer: Clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 13 (15 Pt 1), 4429-4434 (2007).
  5. Lin, N. U., et al. Sites of distant recurrence and clinical outcomes in patients with metastatic triple-negative breast cancer: High incidence of central nervous system metastases. Cancer. 113 (10), 2638-2645 (2008).
  6. Bianchini, G., De Angelis, C., Licata, L., Gianni, L. Treatment landscape of triple-negative breast cancer - expanded options, evolving needs. Nat Rev Clin Oncol. 19 (2), 91-113 (2022).
  7. Lecoultre, M., Dutoit, V., Walker, P. R. Phagocytic function of tumor-associated macrophages as a key determinant of tumor progression control: A review. J Immunother Cancer. 8 (2), (2020).
  8. Mantovani, A., Allavena, P., Marchesi, F., Garlanda, C. Macrophages as tools and targets in cancer therapy. Nat Rev Drug Discov. 21 (11), 799-820 (2022).
  9. Chan, S. H., Lin, C. Y., Tseng, H. J., Wang, L. H. Cd24a knockout results in an enhanced macrophage- and cd8⁺ t cell-mediated anti-tumor immune responses in tumor microenvironment in a murine triple-negative breast cancer model. J Biomed Sci. 32 (1), 73 (2025).
  10. Majeti, R., et al. CD47 is an adverse prognostic factor and therapeutic antibody target on human acute myeloid leukemia stem cells. Cell. 138 (2), 286-299 (2009).
  11. Barkal, A. A., et al. CD24 signalling through macrophage siglec-10 is a target for cancer immunotherapy. Nature. 572 (7769), 392-396 (2019).
  12. Wang, X., et al. CD24-siglec axis is an innate immune checkpoint against metaflammation and metabolic disorder. Cell Metab. 34 (8), 1088-1103.e6 (2022).
  13. Chan, S. H., et al. Identification of the novel role of CD24 as an oncogenesis regulator and therapeutic target for triple-negative breast cancer. Mol Cancer Ther. 18 (1), 147-161 (2019).
  14. Huang, S., Zhang, X., Wei, Y., Xiao, Y. Checkpoint CD24 function on tumor and immunotherapy. Front Immunol. 15, 1367959 (2024).
  15. Weiskopf, K., Weissman, I. L. Macrophages are critical effectors of antibody therapies for cancer. MAbs. 7 (2), 303-310 (2015).
  16. Cao, X., et al. Promoting antibody-dependent cellular phagocytosis for effective macrophage-based cancer immunotherapy. Sci Adv. 8 (11), eabl9171 (2022).
  17. Aderem, A., Underhill, D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annu Rev Immunol. 17, 593-623 (1999).
  18. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu Rev Pathol. 7, 61-98 (2012).
  19. Denardo, D. G., Ruffell, B. Macrophages as regulators of tumour immunity and immunotherapy. Nat Rev Immunol. 19 (6), 369-382 (2019).
  20. Horsthemke, M., Wilden, J., Bachg, A. C., Hanley, P. J. Time-lapse 3d imaging of phagocytosis by mouse macrophages. J Vis Exp. (140), e57566 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Antilichaam-afhankelijke fagocytosegroen fluorescent eiwitCD24-expresserende cellenlive-cell imagingmonoklonaal antilichaam-opsonisatieeindpuntanalysekankerimmunotherapie
Time-lapse-beeldvorming van antilichaam-gestuurde fagocytose van met groen fluorescent eiwit gelabelde triple-negatieve borstkankercellen door macrofagen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.