Een protocol voor hemisfeer-scheiding voor morfologische observatie en gecombineerde RNA-proteïne-extractie in muizenhersengebieden

Samenvatting

Dit protocol beschrijft het bisecteren van muizenhersenen. Eén hemisfeer wordt gebruikt voor morfologische kleuring en de andere voor RNA- en eiwitextractie. Deze strategie vermindert het verbruik van dieren, volgt de 3R-principes en minimaliseert de interindividuele variatie tussen dieren.

Samenvatting

In het dagelijkse neurowetenschappelijke onderzoek vereisen morfologische kleuringen en moleculaire analyses van nucleïnezuren/eiwitten doorgaans afzonderlijke proefdieren, wat het dierenverbruik verhoogt en strijdig is met het 3R-principe voor dierenwelzijn. Dit protocol introduceert een workflow voor weefselallocatie van muizenbrein die gepaarde morfologische en moleculaire analyses uit één enkel dier mogelijk maakt. Na transcardiale perfusie met 0,9% zoutoplossing wordt het brein bisecteerd in twee hemisferen. Eén hemisfeer wordt gefixeerd in 4% paraformaldehyde voor immunohistochemie en immunofluorescentie; coupes die bewaard worden in een sucrose-ethyleenglycol-polyvinylpyrrolidon (PVP) oplossing behouden tot zeven jaar een betrouwbare kleuringskwaliteit. De contralaterale hemisfeer wordt cryogepreserveerd bij -80 °C voor gecombineerde RNA- en eiwitextractie, met opbrengsten die voldoende zijn voor downstream qPCR en Western Blot. Getest op entorhinale cortex-punches van 9–10 mg, levert deze methode lagere RNA- en eiwitopbrengsten op dan afzonderlijke extractie van RNA of eiwit, maar de herwonnen biomoleculen blijven adequaat voor moleculaire detectie. Deze workflow verlaagt het dierenverbruik en elimineert interindividuele verschillen tussen gepaarde morfologische en moleculaire analyses. Het biedt een haalbare methode voor weefselpreparatie voor multidimensionale profilering van specifieke subregio's van het muizenbrein.

Inleiding

Het neurowetenschappelijk onderzoek is de afgelopen decennia drastisch uitgebreid, waarbij belangrijke mechanismen zijn ontdekt die de fysiologie van de menselijke hersenen, het ontstaan van neurologische ziekten en de ontwikkeling van therapieën bepalen. Diermodellen blijven onmisbaar voor neurowetenschappelijk onderzoek, omdat ze controleerbare en reproduceerbare platformen bieden om neurale ontwikkeling, fysiologische functies en pathologische processen te bestuderen. Experimentele manipulatie en histologische observatie bij muizen stellen onderzoekers in staat om neuronale signalering, de vorming van neurale circuits en neurale-behaviorale associaties te karakteriseren. Parallel aan de technische vooruitgang is de ethiek van dierproeven een centraal aandachtspunt geworden. De 3V-principes (Vervanging, Vermindering en Verfijning) zijn inmiddels wereldwijd geaccepteerde normen voor alle dierstudies^1,2, die van onderzoekers vereisen dat het gebruik van dieren wordt geminimaliseerd terwijl betrouwbare experimentele resultaten behouden blijven.

Innovatieve instrumenten, zoals conditionele knockout-systemen, maken nauwkeurige genetische manipulatie mogelijk binnen specifieke subregio's van het muizenbrein³. Deze vorderingen hebben geleid tot intensief onderzoek naar hersencompartimenten op microschaal, zoals de hippocampale CA1, CA3 en DG, die leren, geheugen en stemming reguleren⁴. Het ontrafelen van de complexe functies van deze kleine hersenregio's vereist gecoördineerde morfologische, transcriptionele en eiwitniveau-metingen. Helaas vormt het geringe weefselvolume een grote technische hindernis voor parallelle multi-indexdetectie.

Morfologische kleuring, RNA-kwantificatie en proteïne-immunodetectie zijn drie routinematige kernmetingen in de neurowetenschappen. Traditionele onderzoeksontwerpen vereisen drie afzonderlijke cohorten muizen om deze drie soorten tests uit te voeren. Deze praktijk verhoogt het verbruik van dieren aanzienlijk en introduceert aanzienlijke biologische variatie tussen dieren, wat de vergelijkbaarheid tussen histologische en moleculaire datasets verzwakt. Een uniforme workflow waarmee overeenkomstige morfologische en moleculaire signalen uit één enkel dier worden verkregen, zou deze twee kritieke beperkingen grotendeels wegnemen en beter voldoen aan het Reduction-principe van de 3V's.

Hier rapporteren wij een reproduceerbaar protocol voor hemisferische scheiding van muizenbreinweefsel. Na systemische saline perfusie wordt het gehele brein verdeeld in twee hemisferen: één hemisfeer wordt gefixeerd voor morfologisch onderzoek, en de contralaterale hemisfeer wordt cryopreserveerd voor simultane co-extractie van RNA en proteïnen. Weefsels die zijn gefixeerd en bewaard in een beschermende buffer van sucrose-ethyleenglycol-polyvinylpyrrolidon (PVP) behouden stabiele, hoogwaardige kleuringssignalen voor immunohistochemie en immunofluorescentie tot wel zeven jaar. We hebben deze methode gevalideerd met behulp van kleine punches van 9–10 mg uit de entorhinale cortex, weefsel dat lichter is dan gewoonlijk onderzochte regio's zoals de hippocampus en de prefrontale cortex. De succesvolle detectie van dit minieme weefselmonster geeft aan dat kleinere hersensubregio's, zoals de hypothalamus en amygdala, ook compatibel zijn met deze workflow. Hoewel het protocol lagere RNA- en proteïneconcentraties oplevert dan gespecialiseerde extractiekits met een enkel doel, bezitten de geïsoleerde biomoleculen een adequate kwaliteit om standaard downstream qPCR- en Western blot-analyses te ondersteunen. Deze workflow vermindert het aantal benodigde dieren en elimineert interindividuele verschillen tussen gepaarde morfologische en moleculaire analyses. Het biedt een haalbare methode voor weefselpreparatie voor multidimensionale profilering van discrete subregio's van het muizenbrein.

Protocol

Ethische verklaring

Alle dierproeven die in deze studie zijn uitgevoerd, zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Dalian Medical University (goedkeuringsnummer AEE18026 voor rattenexperimenten en nr. AEE24261 voor muisexperimenten), Volksrepubliek China. Alle experimentele protocollen zijn uitgevoerd in overeenstemming met de ethische richtlijnen voor laboratoriumdieren en waren volledig compliant met de 3R-principes (Reduction, Replacement en Refinement) voor dierproeven. Gedurende het gehele experimentele proces zijn strikte maatregelen genomen om het lijden en de stress van de dieren effectief te verminderen. Tegelijkertijd werd het aantal proefdieren beperkt tot het minimum aantal dat nodig was om de betrouwbaarheid en validiteit van de statistische analyseresultaten te waarborgen. Zie de Tabel met Materialen voor een volledige lijst van reagentia, verbruiksartikelen en apparatuur die in dit protocol zijn gebruikt.

1. Voorbereiding van proefdieren en transcardiale perfusiechirurgie

1. Anesthesie en preoperatieve voorbereiding
   1. Gebruik voor dit protocol volwassen mannelijke Sprague-Dawley ratten of C57BL/6 muizen van SPF-grade (specific-pathogen-free). Huis de dieren in een temperatuurgecontroleerde omgeving (22 ± 2 °C) met een licht/donker-cyclus van 12 u. Geef de dieren ad libitum toegang tot steriel voer en water.
   2. Dien sodiumpentobarbital toe aan de dieren via intraperitoneale injectie in een dosis van 80 mg/kg voor ratten of 50 mg/kg voor muizen om anesthesie op te wekken (zie Figuur 1).
2. Transcardiale perfusieprocedure
   1. Fixeer de geanestheseerde dieren in rugligging op een operatieplank.
   2. Snijd de buikwand open langs de middenlijn vanaf het xiphoïdeusproces tot de symfysis pubica met een rechte schaar. Snijd de laterale thoraxwand bilateraal open om het hart volledig bloot te leggen.
   3. Perfuseer het dier met ijskoud 0,9% fysiologisch zout bij een constante stroomsnelheid: 100–150 mL gedurende 10–15 min voor ratten en 20–30 mL gedurende 5–8 min voor muizen.
3. Oogsten van de hersenen en scheiding van de hemisferen
   1. Decapiteer de dieren met een grote chirurgische schaar na voltooiing van de perfusie. Snijd de hoofdhuid langs de middenlijn open om de schedel bloot te leggen.
   2. Gebruik een steriele spatel om de hersenen voorzichtig uit de schedelholte te tillen. Breng de gehele hersenen snel over naar een steriele Petrischaal op ijs.
   3. Gebruik een steriel, RNase-vrij scheermesje om de hersenen symmetrisch in linker- en rechterhemisferen te verdelen langs de sagittale naad.
   4. Breng de linkerhemisfeer onmiddellijk over naar een centrifugebuis van 15 mL met 10 mL ijskoude 4% paraformaldehyde-oplossing voor fixatie. Breng de rechterhemisfeer over naar een gelabelde, RNase-vrije cryopreservatiebuis, vries deze snel in vloeibare stikstof in en bewaar deze bij -80 °C tot de RNA- en eiwitextractie.

2. Fixatie, coupesnijden en langetermijnopslag van hersenweefsel

1. Fixatie en dehydratie
   1. Dompel de linker hemisfeer volledig onder in een 4% paraformaldehyde-oplossing en fixeer het weefsel gedurende 24 h bij 4 °C. Breng de hersenhemisfeer na voltooiing van de fixatie over naar een centrifugebuis van 15 mL met een 30% sucrose-oplossing en dehydrateer het weefsel bij 4 °C.
   2. Vervang de 30% sucrose-oplossing elke 24 h totdat het hersenweefsel naar de bodem van de buis zinkt.
2. Bereiding van cryosecties
   1. Verwijder de gedehydrateerde hersenhemisfeer uit de sucrose-oplossing en dep overtollige vloeistof voorzichtig weg met steriel filterpapier.
   2. Monteer de hersenhemisfeer op de objecttafel van de cryostaat met optimal cutting temperature (OCT) embedding medium.
   3. Neem seriële coronale hersendoorsneden met een dikte van 30 µm met behulp van een cryostaat. Verzamel opeenvolgende secties in een 24-wells plaat met steriele 0.01 M PBS.
3. Langetermijnbewaring van hersensecties
   1. Bereid de cryoprotectieve bewaaroplossing voor hersenplakjes vooraf: Voeg 2 g PVP400, 60 g sucrose en 60 mL ethyleenglycol toe aan 100 mL 0.01 M PBS. Roer de oplossing bij kamertemperatuur totdat alle componenten volledig zijn opgelost en bewaar deze bij 4 °C tot gebruik.

3. RNA-extractie met TRIzol

1. Weefselhomogenisatie en fasescheiding
   1. Homogeniseer het entorhinale corticale weefsel in 1 mL TRIzol-reagens met behulp van een ultrafijne homogenisator en incubeer het homogenaat 15 min op ijs. Centrifugeer 5 min bij 8.000 × g bij 4 °C.
   2. Voeg 200 µL chloroform toe en vortex 10 s. Centrifugeer 15 min bij 5.600 × g bij 4 °C. Draag vervolgens de bovenste waterige fase over naar een RNase-vrije buis. Voeg 500 µL isopropanol toe en incubeer overnight bij -20 °C om het RNA te precipiteren. Centrifugeer opnieuw.
2. RNA-precipitatie, wassen en kwaliteitsbeoordeling
   1. Verwijder het supernatant en was het RNA-pellet met 1 mL 75% ethanol. Centrifugeer 5 min bij 5.600 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant, laat het pellet 10 min aan de lucht drogen en loss het RNA 10 min op in 20 µL DEPC-behandeld water.
   2. Meet de RNA-concentratie en zuiverheid (A₂₆₀/A₂₈₀) met behulp van een spectrofotometer. Bewaar het RNA bij -80 °C tot aan verdere analyse.

4. Totale eiwitextractie met Minute-kit

1. Weefsellysis en homogenisatie
   1. Koel de spincolumn en de opvangbuis vooraf op ijs. Homogeniseer het weefsel in 100 µL cell lysis buffer met behulp van een ultrafijne homogenisator. Spoel de homogenisator met nog eens 100 µL cell lysis buffer en voeg de lysaten samen.
2. Eiwit Herstel en kwantificatie
   1. Overbreng het homogenisaat naar de spincolumn en incubeer dit gedurende 2 min bij kamertemperatuur.
   2. Centrifugeer gedurende 2 min bij 11,000–14,300 × g.
   3. Plaats de opvangbuis direct na centrifugatie op ijs en gooi de spincolumn weg. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van een BCA-assay.

5. Simultane RNA- en eiwitextractie uit de entorhinale cortex (9–10 mg)

1. Voorbereiding van het experiment en de reagentia
   1. Gebruik de DNA/RNA/protein kit voor alle extractiestappen. Gebruik uitsluitend gecertificeerde RNase-vrije en DNase-vrije verbruiksartikelen (zie Figuur 2).
   2. Bereid de lysisbuffer vlak voor gebruik: voeg een protease-inhibitorcocktail toe aan de bij de kit meegeleverde lysisbuffer in een verdunning van 1:100.
2. Weefsellysis en fasescheiding
   1. Haal de bevroren rechter hersenhemisfeer uit de opslag bij -80 °C en plaats deze op ijs. Gebruik een steriele, RNase-vrije punch om 9–10 mg weefsel uit de doelbrainregio te verzamelen.
   2. Homogeniseer het weefsel volledig op ijs met een elektrische weefselhomogenisator totdat er geen zichtbare weefselfragmenten meer aanwezig zijn. Incubeer het homogenaat 10 min op ijs om volledige lysis te garanderen.
   3. Voeg 200 µL van het bij de kit meegeleverde scheidingsreagens toe aan het homogenaat. Vortex de buis krachtig gedurende 30 s en incubeer deze 3 min bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buis 15 min bij 8.000 × g bij 4 °C om een volledige fasescheiding te bereiken.
3. RNA-purificatie en elutie
   1. Verzamel voorzichtig de bovenste waterige fase met een RNase-vrije pipetpunt. Draag de verzamelde waterige fase over naar een nieuwe RNase-vrije buis van 1,5 mL. Voeg een gelijk volume 100% ethanol toe aan de verzamelde waterige fase en meng dit.
   2. Draag 700 µL van het mengsel over naar de bij de kit meegeleverde RNA-purificatiekolom. Centrifugeer de kolom 1 min bij 5.600 × g bij kamertemperatuur.
   3. Voeg 500 µL van de bij de kit meegeleverde RNA wasbuffer 1 toe aan de kolom. Centrifugeer de kolom 1 min bij 5.600 × g bij kamertemperatuur.
   4. Voeg 500 µL van de bij de kit meegeleverde RNA wasbuffer 2 toe aan de kolom en centrifugeer opnieuw. Centrifugeer de lege kolom 2 min bij 8.000 × g bij kamertemperatuur om restanten ethanol volledig uit het kolommembraan te verwijderen.
   5. Plaats de kolom in een nieuwe RNase-vrije microcentrifugebuis van 1,5 mL. Voeg 30–50 µL RNase-vrij water (voorverwarmd tot 60 °C) direct toe in het midden van het kolommembraan. Incubeer de kolom 2 min bij kamertemperatuur. Centrifugeer de kolom 1 min bij 8.000 × g bij kamertemperatuur om het RNA te elueren.
4. Proteïneprecipitatie en oplossen
   1. Voeg 750 µL isopropanol toe aan de overgebleven organische fase en interfase in de oorspronkelijke buis, nadat de waterige fase voor RNA-extractie is verwijderd. Incubeer het mengsel 30 min bij -20 °C om proteïnen te precipiteren.
   2. Centrifugeer de buis 10 min bij 8.000 × g bij 4 °C. Verwijder het supernatant en laat de proteïnepellet intact op de bodem van de buis.
   3. Voeg 1 mL 95% ethanol toe aan de proteïnepellet. Vortex de buis kort om de pellet te wassen. Centrifugeer de buis 5 min bij 8.000 × g bij 4 °C en verwijder het supernatant. Herhaal deze wasstap nog twee keer.
   4. Laat de proteïnepellet 5–10 min aan de lucht drogen bij kamertemperatuur totdat de pellet doorschijnend wordt en er geen resterende ethanol meer zichtbaar is.
   5. Voeg 50–100 µL 5–10% SDS-oplossing toe aan de gedroogde pellet. Vortex de buis krachtig gedurende 1 min en incubeer deze 10 min op ijs om de proteïne volledig op te lossen. Centrifugeer de buis 5 min bij 8.000 × g bij 4 °C. Verzamel het supernatant als het uiteindelijke proteïne-extract.

6. Immunohistochemische (IHC) kleuring

1. Voorbehandeling van coupes en inactivatie van endogene enzymen
   1. Haal de hersencoupes uit de cryoprotectieve opslag bij -20 °C. Gebruik een glazen naald om de coupes over te brengen naar een 24-well plaat met 0,01 M PBS (pH 7,4).
   2. Was de coupes drie keer met 0,01 M PBS, 5 min per wasbeurt, bij kamertemperatuur op een schudplaat.
   3. Incubeer de coupes gedurende 10 min bij kamertemperatuur met een peroxidase-blokkeerder van 3% waterstofperoxide om de endogene peroxidase-activiteit te inactiveren. Herhaal de wasstappen na het blokkeren.
2. Permeabilisatie en aspecifieke blokkering
   1. Incubeer de coupes gedurende 30 min bij kamertemperatuur op een schudplaat in 0,5% Triton X-100 voor permeabilisatie van het celmembraan. Herhaal de wasstappen.
   2. Incubeer de coupes 30 min bij kamertemperatuur in 4% runder-serumalbumine (BSA), gevolgd door incubatie met een aspecifieke kleuringsremmer voor nog eens 30 min bij kamertemperatuur.
3. Incubatie van primaire en secundaire antilichamen
   1. Verdun de primaire antilichamen in een 1% BSA-oplossing volgens de volgende geoptimaliseerde verdunningen: doublecortin (DCX, 1:4000), neuronal nuclear antigen (NeuN, 1:3000), ionized calcium-binding adapter molecule 1 (Iba-1, 1:2000) en glial fibrillary acidic protein (GFAP, 1:2000).
   2. Voeg 200 µL van de verdunde primaire antilichaamoplossing toe aan elke well, waarbij volledige onderdompeling van de coupes wordt gegarandeerd.
   3. Voeg 200 µL biotin-gelabeld secundair antilichaam toe aan elke well. Incubeer de coupes 30 min bij kamertemperatuur.
   4. Was de coupes drie keer met 0,01 M PBS, 5 min per wasbeurt. Voeg 300 µL streptavidine-peroxidase-conjugaat toe aan elke well. Incubeer de coupes 30 min bij kamertemperatuur. Herhaal de wasstappen na incubatie.
4. Chromogene ontwikkeling met 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) en dekglasplaatsing
   1. Voeg 200 µL DAB-werkoplossing toe aan elke well. Volg de chromogene reactie via een lichtmicroscoop.
   2. Monteer de coupes met een glazen naald op met gelatine gecoate glazen objectglazen. Laat de objectglazen volledig aan de lucht drogen bij kamertemperatuur.
   3. Dehydrateer de objectglazen via een oplopende ethanolserie (50%, 70%, 90%, 95%, 100%, 100% ethanol, telkens 5 min), gevolgd door twee keer klaren in xyleen, telkens 5 min.

7. Immunofluorescentiekleuring (IF)

1. Voorbehandeling en permeabilisatie van coupes
   1. Haal de hersencoupes uit de cryoprotectieve opslag bij -20 °C. Breng de coupes over naar een 24-wells plaat met 0.01 M PBS (pH 7.4).
   2. Was de coupes drie keer met 0.01 M PBS, 5 min per wasbeurt, bij kamertemperatuur op een schudplaat.
   3. Incubeer de coupes gedurende 30 min in 0.5% Triton X-100 bij kamertemperatuur op een schudplaat.
   4. Was de coupes na permeabilisatie drie keer met 0.01 M PBS, 10 min per wasbeurt.
2. Blokkeren en incubatie van het primaire antilichaam
   1. Incubeer de coupes gedurende 1 h bij kamertemperatuur in een bevochtigingskamer in een blokkeringsoplossing die 4% BSA en een aspecifieke kleuringsremmer bevat.
   2. Zuig de blokkeringsoplossing af. Verdun primaire antilichamen in een 1% BSA-oplossing tegen geoptimaliseerde concentraties en voeg 300 µL van de verdunde primaire antilichaamoplossing toe aan elke well. Incubeer de coupes overnacht bij 4 °C in een bevochtigingskamer die lichtdicht is.
3. Incubatie van het secundaire antilichaam
   1. Laat de coupes de volgende dag gedurende 1 h in het donker opwarmen tot kamertemperatuur. Verwijder de primaire antilichaamoplossing en was de coupes drie keer met 0.01 M PBS, 10 min per wasbeurt, op een schudplaat in het donker.
   2. Verdun fluorofoor-geconjugeerde secundaire antilichamen in een 1% BSA-oplossing volgens de door de fabrikant aanbevolen verdunning. Voeg 300 µL van de secundaire antilichaamoplossing toe aan elke well. Incubeer de coupes gedurende 1–2 h bij kamertemperatuur in het donker.
   3. Was de coupes vijf keer met 0.01 M PBS, 5 min per wasbeurt, in het donker.

8. Kwantitatieve real-time PCR (qPCR) analyse

1. Verwijdering van gDNA uit RNA en reverse transcriptie
   1. Voer de reverse transcriptie uit om cDNA te synthetiseren met behulp van een reverse transcriptie-kit, met 1 µg totaal RNA per reactiesysteem van 20 µL. Gebruik het door de fabrikant aanbevolen thermische cyclusprogramma: 25 °C gedurende 5 min, 50 °C gedurende 15 min, 85 °C gedurende 5 min, gevolgd door bewaring bij 4 °C.
   2. Verdun het gesynthetiseerde cDNA 1:5 met RNase-vrij water. Bewaar het cDNA bij -20 °C tot aan de qPCR-amplificatie.
2. Voorbereiding van het qPCR-systeem en amplificatie
   1. Bereid het qPCR-reactiesysteem op ijs voor in een speciale RNase-vrije PCR-kast. Het reactiesysteem van 20 µL bevat: 10 µL qPCR Master Mix, 0,4 µL forward primer (10 µM), 0,4 µL reverse primer (10 µM), 2 µL verdund cDNA-template en 7,2 µL RNase-vrij water.
   2. Voer de qPCR-amplificatie uit met behulp van het volgende programma: 95 °C gedurende 30 s voor de initiële denaturatie; 40 cycli van 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s; gevolgd door een dissociatiecurve-analyse van 60 °C naar 95 °C, met stappen van 0,5 °C per 5 s.

9. Western blot

1. Eiwitkwantificering en monstervoorbereiding
   1. Verdun de eiwitextracten tot gelijke concentraties met behulp van een 5–10% SDS-oplossing, op basis van de resultaten van de BCA-assay.
2. SDS-PAGE elektroforese en eiwitoverdracht
   1. Bereid een 10% SDS-PAGE scheidingsgel en een 5% stapelgel voor volgens standaard moleculair biologische protocollen.
   2. Laad 20 µg totaal eiwit per put in de gel. Voor experimenten met gradiëntbelading worden 15 µg, 30 µg en 45 µg eiwit per put geladen.
   3. Voer elektroforese uit bij 80 V gedurende 30 min totdat de eiwitmarker de scheidingsgel binnengaat, verhoog vervolgens het voltage naar 120 V gedurende 60–90 min totdat de bromofenolblauw-kleurstof de onderkant van de gel bereikt.
   4. Stel de transfer-sandwich samen in de volgende volgorde (van kathode naar anode): spons, filterpapier, gel, PVDF-membraan, filterpapier en spons. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de gel en het membraan achterblijven.
   5. Voer natte transfer uit bij een constante stroom van 300 mA gedurende 90 min in een ijsbad.
3. Blokkeren van het membraan en incubatie van antilichamen
   1. Spoel het PVDF-membraan na voltooiing van de transfer kort af met TBST-buffer. Incubeer het membraan in 5% BSA gedurende 2 u bij kamertemperatuur op een schudplaat om aspecifieke bindingsplaatsen te blokkeren.
   2. Verdun primaire antilichamen in een 5% BSA-oplossing tegen geoptimaliseerde concentraties. Incubeer het membraan met de primaire antilichaamoplossing gedurende de nacht bij 4 °C op een schudplaat.
   3. Was het membraan de volgende dag drie keer met TBST-buffer, 10 min per wasbeurt, op een schudplaat.
   4. Verdun het met mierikwortelperoxidase (HRP) geconjugeerde secundaire antilichaam in een 5% vetvrije melkoplossing volgens de door de fabrikant aanbevolen verdunning. Incubeer het membraan met de secundaire antilichaamoplossing gedurende 2 u bij kamertemperatuur op een schudplaat.
   5. Was het membraan drie keer met TBST-buffer, 10 min per wasbeurt, na incubatie met het secundaire antilichaam. Incubeer het membraan gedurende 1–2 min in het donker met de ECL-substraatoplossing.

Resultaten

Beoordeling van de RNA-concentratie, agarosegelelektroforese en qPCR

Zoals getoond werden totaal RNA en eiwit samen geëxtraheerd uit biopten van de entorinale cortex (9–10 mg) met de DNA/RNA/protein kit. Parallelle monsters die verwerkt waren met TRIzol (RNA) of de protein extraction kit dienden als controles. Het protocol leverde 235 ± 12 ng µL⁻¹ RNA op, 36 % minder dan met TRIzol (p < 0.05) (Figuur 3A). Desondanks toonden agarosegels scherpe 28S en 18S rRNA-banden en 5S-signalen, wat duidt op intact RNA (Figuur 3B). qPCR voor CD86, IL-1β, TNF-α en IL-6 produceerde enkele, symmetrische dissociatiecurven (Figuur 3C) en er werden lagere Ct-waarden waargenomen in de groep (Figuur 3D); verdere studies, inclusief analyses van de RNA-integriteit, zijn echter vereist om te bepalen of deze verschillen een verbeterde RNA-kwaliteit of extractie-efficiëntie weerspiegelen. Hoewel de RNA-opbrengst lager was dan die verkregen met TRIzol-extractie, gaven de duidelijke 28S en 18S rRNA-banden en specifieke qPCR-amplificatiecurven aan dat het geëxtraheerde RNA van voldoende kwaliteit was voor downstream qPCR-analyses.

Evaluatie van de eiwitconcentratie, SDS-PAGE en Western blot-analyse

In overeenstemming met de RNA-gegevens leverde het dubbele extractieprotocol lagere totale proteïneconcentraties op dan de proteïnekit (p < 0.05). Desondanks toonden Western blots aanzienlijk sterkere immunoreactieve banden voor elk onderzocht doelwit (Figuur 4A). In overeenstemming met de resultaten van de RNA-kwantificering herstelt het RNA-proteïne co-extractieprotocol minder totaal proteïne dan de specifieke enkeldoel proteïnekit, wat kan worden waargenomen via CBB whole-protein kleuring (Figuur 4B–C). Het housekeeping-proteïne β-Tubulin vertoonde duidelijke en stabiele banden bij beide extractiemethoden, met een vergelijkbare signaalintensiteit. Het laag-abundante ULK-proteïne werd ook succesvol gedetecteerd in co-geëxtraheerde monsters. Opvallend is dat de bandsignalen van PSD-95, p-ERK en p-NFκB p65 aanzienlijk sterker waren in de co-extractiegroep vergeleken met de enkelvoudige proteïne-extractiekit. Seriële proteïnelading van 15 µg tot 45 µg genereerde dosisafhankelijke bandgradiënten voor alle gedetecteerde doelwitten in beide groepen. Collectief gezien is, hoewel de totale proteïneopbrengst van de dubbele extractieworkflow lager is, de proteïnekwaliteit voldoende voor standaard Western blot-analyse, en zijn de algemene detectieprestaties niet inferieur aan conventionele enkelvoudige proteïne-extractiekits.

Immunohistochemie en immunofluorescentie

Immunohistochemie op hersensecties die 0,5–7 jaar bewaard waren, toonde een robuuste markering van DCX⁺ pasgeboren neuronen, AVP⁺ secretoire cellen en MAP2/NeuN⁺ neuronen met intacte morfologie en vezels (Figuur 5A). Immunofluorescentie van secties van 5–7 jaar oud liet duidelijke GFAP⁺ astrocyten, Iba-1⁺ microglia en FosB⁺ geactiveerde neuronen zien (Figuur 5B). Representatieve secties die 0,5–zeven jaar bewaard waren, behielden onder de geteste omstandigheden detecteerbare immunohistochemische en immunofluorescente signalen. De conserveervloeistof behoudt dus de weefselintegriteit en antigeniciteit, wat betrouwbare langetermijnbewaring mogelijk maakt.

Figuur 1: Geïntegreerde workflow voor hemisfeer-scheiding voor morfologische en moleculaire detectie van de hersenen. Dit schema illustreert de volledige experimentele pijplijn, inclusief transcardiale saline perfusie bij knaagdieren, midlijnbisectie van de geïsoleerde gehele hersenen, fixatie en bereiding van cryosecties van de linkerhemisfeer voor IHC/IF-kleuring, en cryopreservatie van de contralaterale hemisfeer voor daaropvolgende simultane RNA-eiwit co-extractie, qPCR en Western blot-analyse. Alle illustraties van muizen zijn oorspronkelijk gegenereerd door Jimeng AI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Workflow voor gelijktijdige co-extractie van RNA en eiwit uit bevroren hersenweefsel van knaagdieren. Het diagram toont de opeenvolgende stappen, beginnend bij het uitstansen van doelweefsel uit bevroren hemisferen, weefsellysis en driefasescheiding, RNA-zuivering en elutie voor qPCR, alsook eiwitprecipitatie, wassen en oplossen om monsters voor te bereiden op Western blot-detectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Evaluatie van RNA-opbrengst, RNA-integriteit en qPCR-compatibiliteit met behulp van microscale monsters van de entorhinale cortex van ratten. (A) Gekwantificeerde RNA-concentraties verkregen via de co-extractiekit versus de TRIzol-methode (gemiddelde ± SEM). (B) Agarosegelelektroforese die intacte 28S- en 18S-rRNA-banden toont van beide extractiegroepen. (C) Enkele smeltcurven bevestigen specifieke amplificatie van target-inflammatoire genen en GAPDH als referentiegen. (D) Ct-waarden van gedetecteerde inflammatoire genen bij een identieke RNA-input over twee extractiemethoden. *p < 0.05, **p < 0.01 t.o.v. de TRIzol-groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Western blot-analyse van eiwitten verkregen via het RNA/eiwit co-extractieprotocol. (A) Gradiënt van eiwitbelading (15/30/45 µg) die dosisafhankelijke bandsignalen van synaptische en signalerende eiwitten laat zien. (B) Detectie van het hoogmoleculaire eiwit ULK1 met CBB-totaaleiwitkleuring als beladingsreferentie. (C) Vergelijking via Western blot met gelijke belading van doeleiwitten tussen twee extractiewerkstromen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Immunohistochemische en immunofluorescente kleuring van vrijzwevende hersensecties die 0,5–7 jaar bewaard zijn gebleven. (A) Micrografieën van immunohistochemische kleuring in helderveld, vastgelegd bij een vergroting van 200× en 400×. DCX- en AVP-kleuringen zijn uitgevoerd op muisweefselmonsters, terwijl MAP2- en NeuN-kleuringen zijn uitgevoerd op ratweefselmonsters. (B) Representatieve immunofluorescentiebeelden verkregen uit ratweefselmonsters. GFAP labelt astrocyten, IBA-1 labelt microglia en FOSB duidt op neuronale activiteit. Alle immunofluorescentie-kleuringsexperimenten in dit paneel zijn uitgevoerd met ratmonsters om de expressie van neuronale markers en de cellulaire lokalisatie te evalueren, micrografieën bij 200× vergroting.  Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

In muisonderzoek vereisen morfologische analyses en nucleic acid/eiwit-assays vaak afzonderlijke dierlijke monsters vanwege hun verschillende preparatieprocedures. Dit verhoogt het aantal gebruikte dieren en introduceert biologische variatie tussen de dieren, wat de vergelijkbaarheid tussen histologische en moleculaire datasets kan verminderen. Om deze beperkingen aan te pakken, hebben we een workflow ontwikkeld waarmee histologische en moleculaire gegevens uit hetzelfde dier kunnen worden verkregen.

Het centrale ontwerp van deze workflow is de hemisferische allocatie van hersenweefsel na transcardiale perfusie met 0,9% zoutoplossing^5,6. Eén hemisfeer wordt gefixeerd in 4% paraformaldehyde voor immunohistochemie en immunofluorescentie, terwijl de contralaterale hemisfeer wordt bewaard bij −80 °C voor daaropvolgende RNA-proteïne co-extractie, qPCR en Western blotting. De geselecteerde read-outs zijn echter mogelijk niet volledig vergelijkbaar tussen de twee hersenhemisferen. Structurele en functionele lateralisatie is aangetoond in knaagdierhersenen, en dergelijke hemisferische verschillen kunnen variabiliteit introduceren wanneer analyses worden uitgevoerd op tegenovergestelde zijden^7,8. Onderzoekers dienen daarom consequent weefsel uit dezelfde hersenhemisfeer te selecteren, in overeenstemming met hun onderzoeksdoelen.

Een belangrijk voordeel van deze methode is de langetermijnbewaring van gefixeerde, drijvende hersendoorsneden. Na dehydratatie met 30% sucrose worden coronale coupes van 30 µm bewaard in een conserveringsoplossing van sucrose-ethyleenglycol-PVP. Eerdere studies hebben aangetoond dat cryoprotectieve oplossingen van sucrose-ethyleenglycol-PVP helpen bij het behoud van de weefselmorfologie en antigeniciteit tijdens langdurige bewaring^9,10. Er zijn echter weinig studies uitgevoerd waarin bewaringstermijnen van meerdere jaren zijn geëvalueerd. De gegevens van ons laboratorium breiden deze bevindingen uit: representatieve coupes die tot zeven jaar werden bewaard, behielden detecteerbare immunohistochemische en immunofluorescentiesignalen onder de geteste condities. Deze observaties bevestigen de haalbaarheid van het gedurende meerdere jaren bewaren van drijvende hersendoorsneden voor retrospectieve analyses en vervolgexperimenten.

Opmerkelijk is dat deze workflow een ander belangrijk voordeel biedt door middel van duale RNA-proteïne co-extractie uit een enkele bevroren hersenhemisfeer. Hoewel dit co-extractieprotocol resulteert in iets lagere hoeveelheden RNA en proteïne dan conventionele extractiemethoden voor één enkel doelwit, zijn de verkregen biomaterialen nog steeds voldoende voor robuuste qPCR- en Western blot-detectie. Cruciaal is dat co-extractie het mogelijk maakt om de abundantie van transcripten en proteïnen te kwantificeren uit identieke weefselmonsters, waardoor biologische variatie door afzonderlijke monsterverwerking wordt geëlimineerd en een zeer consistente, geïntegreerde moleculaire profilering mogelijk wordt^11,12. Bovendien vereist deze aanpak slechts een kleine weefselmassa van ongeveer 9–10 mg, waardoor het zeer geschikt is voor analyses van discrete, regio-specifieke hersensubpopulaties met een beperkte beschikbaarheid van monsters.

Ondanks deze aanzienlijke voordelen kent deze methode ook bepaalde beperkingen die vermeld moeten worden. Ten eerste kunnen de relatief lage opbrengsten aan RNA en eiwit de toepasbaarheid beperken voor experimenten waarbij grote hoeveelheden nucleïnezuren of eiwitten vereist zijn, zoals grootschalige eiwitzuivering of RNA-sequencing met hoge diepte. Ten tweede, hoewel langdurige bewaring van coupes effectief is tot zeven jaar, kan er over langere perioden nog steeds geleidelijke degradatie optreden van bepaalde labiele antigenen of nucleïnezuren, wat de kleuringsintensiteit of de gevoeligheid van moleculaire detectie kan beïnvloeden. Ten derde is de methode momenteel geoptimaliseerd voor muizenbreinweefsel en kan deze aanpassing vereisen voor toepassing op andere weefsels of alternatieve diermodellen, aangezien de weefselsamenstelling en structurele kenmerken variëren per soort en orgaan. Ten slotte kan 5–10% SDS interfereren met massaspectrometrie, assays voor enzymactiviteit, studies naar eiwit-eiwitinteracties^13,14 en andere SDS-gevoelige toepassingen. Aanvullende procedures voor het verwijderen van detergenten of bufferuitwisseling kunnen daarom noodzakelijk zijn.

Concluderend maakt deze workflow voor hemisferische allocatie gepaarde morfologische en moleculaire analyses mogelijk vanuit hetzelfde dier, terwijl het diergebruik en de interindividuele variatie worden verminderd. Deze workflow is nuttig bij studies waarbij gepaarde histologische en moleculaire analyses vereist zijn, met name wanneer de beschikbaarheid van weefsel beperkt is. De mogelijkheid tot langdurige bewaring van coupes kan bovendien retrospectieve analyses en gestandaardiseerde monsterarchivering faciliteren, terwijl het gebruik van kleine monsters van hersengebieden regio-specifieke onderzoeken ondersteunt. De belangrijkste beperkingen zijn lagere opbrengsten van RNA en eiwit, potentiële hemisferische asymmetrie, beperking tot muizenhersenweefsel en beperkte compatibiliteit met SDS-gevoelige toepassingen. Toekomstige studies dienen het herstel van biomoleculen te optimaliseren, de workflow te valideren in andere weefsels en soorten, en de langetermijnstabiliteit van aanvullende moleculaire targets te beoordelen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
RNase-vrije microcentrifugebuisjes van 1,5 ml	Axygen	MCT-150-C-S	Verzameling van weefselbiopten en extractiefracties van RNA/eiwit.
15 mL conische centrifugebuisjes	Biofilm	CFT010150	Fixatie, sucrose-dehydratatie en bewaring van de oplossing.
celkweekplaten met 24 wells	NEST	702001	Verzamelen, kleuren en langetermijnopslag van vrijdrijvende hersendoorsneden.
30% sucrose-oplossing	In het laboratorium bereid	Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling produceren. Voer s.v.p. de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands.	Cryoprotectie van gefixeerde hersenhemisferen voorafgaand aan cryosectie.
4% paraformaldehydeluitsing	Biosharp	BL539A	Immersiefixatie van de voor morfologie bestemde hersenhemisfeer.
5× eiwitlaadbuffer	Beyotime Biotechnology	DL101	Voorbereiding van eiwitmonsters voor SDS-PAGE.
Agarose	Solarbio	Cat: A8201	Beoordeling van de RNA-integriteit via agarosegelelektroforese.
Anti-doublecortine-antilichaam	Abcam	ab18723	Primair antilichaam voor immunohistochemie van doublecortin.
Anti-ERK-antilichaam	Beyotime	AB2014	Primair antilichaam voor Western blotting van totaal ERK.
Anti-GFAP-antilichaam	Abcam	ab10062	Primair antilichaam voor immunofluorescentie van gliaal fibrillair zuur eiwit.
Anti-Iba1-antilichaam	Wako	NCNP24	Primair antilichaam voor immunofluorescentie van ionized calcium-binding adaptor molecule 1.
Anti-NeuN-antilichaam	Millipore	A60	Primair antilichaam voor kleuring van neuronaal nucleair antigeen.
Anti-NF-κB p65-antilichaam	HUABIO	ET1603-12	Primair antilichaam voor NF-κWestern blotting van p65.
Anti-fosfo-ERK-antilichaam	Beyotime	ET1610-13	Primair antilichaam voor Western blotting van gefosforyleerd ERK.
Anti-PSD95-antilichaam	HUABIO	ET1602-20	Primair antilichaam voor PSD95 Western blotting.
Anti-ULK1-antilichaam	HUABIO	ET1704-63	Primair antilichaam voor ULK1 Western blotting.
Anti-β-tubuline-antilichaam	ABclonal	AC021	Primaire antilichaam voor ladingscontrole bij Western blotting.
Antifade fluorescent monteermedium	Beyotime	P0126-5	Medium voor het opglasen van met immunofluorescentie gekleurde coupes.
Biotine-streptavidine peroxidase detectiekit	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Secundair detectiesysteem voor DAB-immunohistochemie.
Runderserumalbumine	Qiansheng Biotech Co., Ltd.	QO3000	Blokkeringsbuffer voor immunokleuring en Western blotting.
C57BL/6-muizen	Liaoning Changsheng Biotechology Co., LTD	4 weken oude C57BL/6-muizen	Experimentele dieren voor de verzameling van muizenhersenweefsel, indien van toepassing.
Chemiluminescentie-beeldvormingssysteem	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Detectie van chemiluminescente signalen bij Western blot.
Confocale laser scanning microscoop	Leica Microsystems CMS GmbH	SN: 591974	Beeldacquisitie voor immunofluorescentie-coupes.
Cryoprotectieve conserveersolution	In het laboratorium bereid	Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan ik geen vertaling aanbieden. Raadpleeg a.u.b. de brontekst die u wilt laten vertalen.	Langdurige bewaring van vrijdrijvende hersensecties bij −20 °C.
Cryostaat	Leica	CM1950	Bereiding van 30 μm coronale hersensecties.
DAB chromogene substraatkit	Sigma	SLBP7387V	Chromogene ontwikkeling voor immunohistochemie.
DAPI-kernkleuringsoplossing	Coolaber	SL7100	Nucleaire tegenkleuring voor immunofluorescentie.
Digitale lichtmicroscoop	Ningbo Yongxin Optics Co., Ltd.	Model NE910+FL-900	Monitoring van de DAB-ontwikkeling en beeldvorming van met bright-field gekleurde coupes.
DNase I	Vazyme	R223-01	Verwijdering van residueel genomisch DNA vóór reverse transcriptie.
Donkey anti-konijn IgG, 488-geconjugeerd	Thermo Fisher Scientific	A21206	Fluorescent secundair antilichaam voor immunofluorescentie.
Donkey anti-konijn IgG, 594-geconjugeerd	Abcam	ab150076	Fluorescent secundair antilichaam voor immunofluorescentie.
E.Z.N.A. DNA/RNA/Protein Kit	Omega Bio-Tek	D3892-01
Elektroforesevoeding	Bio-Rad	1645050	Voeding voor agarosegelelektroforese en SDS-PAGE.
Ethyleenglycol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10009828	Component van cryoprotectieve bewaaroplossing.
Gel-beeldvormingssysteem	Clinx Science Instruments Co., Ltd.	ChemiScope 6200 Touch	Beeldvorming van agarosegels voor de evaluatie van RNA-kwaliteit.
Met gelatine gecoate glazen objectglazen	CITOTEST LABWARE MANUFACTURING CO.,LTD	REF: 10127105P P/N: 80312-2101	Het inklissen van DAB-gekleurde, vrijdrijvende hersendoorsneden.
Software voor beeldanalyse	National Institutes of Health	ImageJ/Fiji	Densitometrische analyse van Western blot-banden en beeldbewerking.
Isopropanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	80109218	Eiwitprecipitatie uit de organische/interfasefractie.
Gekoelde microcentrifuge	Yancheng Kaite Laboratory Instrument Co., Ltd.	TGL16M	Centrifugatie tijdens de RNA/proteïnextractie en de wasstappen.
Minute Protein Extraction Kit	Uitvinden	MS-026
Neutraal balsam monteermiddel	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	Catalogus nr. S30509, CAS 96949-21-2	Dekglasplaatsing van gedehydrateerde DAB-gekleurde coupes.
OCT-inbeddingsmedium	Sakura	4583	Inbedmedium voor cryosectie van gefixeerde hersenhemisferen.
Optische qPCR-platen of -buisjes	Axygen	PCR-0208-C	Reactievaten voor qPCR-amplificatie.
Parafilm	amcor	PM996	Het afsluiten van multiwellplaten voor langdurige bewaring van coupes.
Pentobarbitalnatrium	Hualan Bio	57-33-0	Anestheticum vóór transcardiale perfusie.
Petrischalen	Biosharp	BS-90-D	Behandeling van de hersenen op ijs en scheiding van de hersenhelften.
Fenol/guanidinium RNA-extractiereagens	Sparklade	AC0101-B	Comparator-reagens voor controle-experimenten bij RNA-extractie.
Fosfataseremmercocktail	APExBIO	K1015-100	Behoud van fosforylering tijdens proteïne-extractie.
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	Biosharp	BL601A	Wasbuffer, sucrose-oplossingsoplosmiddel en cryoprotectant-oplosmiddel.
Polyvinylideenfluoride-membraan	Millipore	IPVH08100	Membraan voor Western blot-transfer.
Polyvinylpyrrolidon K40	Sigma	9003-39-8	Component van de cryoprotectieve conserveeroplossing.
Proteaseremmercocktail	Beyotime	P1045	Preventie van eiwitdegradatie tijdens weefsellyse.
Proteïne-extractiekit	Uitvinden	MS-026	Comparator-kit voor controle-experimenten bij totale eiwitextractie.
Real-time PCR-systeem	Amolarray	MA6000	Kwantitatieve PCR-amplificatie en smeltcurve-analyse.
Natriumlaurylsulfaat	BioFroxx	3250GR500	Oplossen van het eiwitprecipitaat en monsterpreparatie voor SDS-PAGE.
Steriele scheermesjes	Biosharp	BS-RB-11	Scheiding van de hemisferen en trimmen van het weefsel op ijs.
Streptavidine-peroxidase-conjugaat	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Signaalversterkings-/detectiereagens voor DAB-immunohistochemie.
Sucrose	Hushi	57-50-1	Cryoprotectie-oplossing en cryoprotectant-bewaaroplossing.
SYBR qPCR master mix	Vazyme	Q711-02	Kwantitatieve PCR-amplificatie.
Overdrachtsapparatuur	Bio-Rad	1703930	Natte overdracht van eiwitten van SDS-PAGE-gel naar membraan.
Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween 20	In het laboratorium bereid	K.O.	Wasbuffer voor Western blot-membranen.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilisering van hersensecties voor immunokleuring.
Trizol	Sparklade	AC0101-B
UltraSensitive SP immunohistochemie detectieset (voor muis/konijn primair antilichaam)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Secundair antilichaam/detectiereagens voor DAB-immunohistochemie.
Wistar-rat	Liaoning Changsheng Biotechology Co.,LTD	280-320 g, mannelijk	Experimentele dieren voor het verzamelen van rattenhersenweefsel, indien van toepassing.
Xyleen	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Klaarmaken van DAB-gekleurde coupes vóór het dekglas plaatsen.
Neutraal balsam monteermedium	Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd., Shanghai, China	Catalogusnr. S30509, CAS 96949-21-2	Dekglasplaatsing van gedehydrateerde DAB-gekleurde coupes.
Streptavidine-peroxidase-conjugaat	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Signaalversterkings-/detectiereagens voor DAB-immunohistochemie.
Triton X-100	Sinopharm	9002-93-1	Permeabilisatie van hersendoorsneden voor immunokleuring.
UltraSensitive SP Immunohistochemie Detectiekit (voor muis/konijn primair antilichaam)	Fuzhou Maixin Biotech Co., Ltd.	KIT-9720	Secundair antilichaam/detectiereagens voor DAB-immunohistochemie.
Xyleen	Sinopharm Chemical Reagent Co.Ltd.	10023418	Klaarmaken van DAB-gekleurde coupes vóór het afdekken.