Een multicolor 3D-STORM hoogresolutie visualisatieprotocol voor collageenmineralisatie in zelfgeassembleerde recombinante type I collageenfibrillen

Summary

Hier presenteren we een protocol om intrafibrillaire versus extrafibrillaire mineralisatie in recombinante collageenfibrillen te onderscheiden met behulp van multicolor 3D-STORM, waarbij geoptimaliseerde labeling, beeldvorming en kwantitatieve colocalisatieanalyse worden geïntegreerd.

Abstract

Dit protocol beschrijft een meerkleurige driedimensionale stochastische optische reconstructie microscopiemethode (3D-STORM) voor nanoschaalvisualisatie van collageenmineralisatie in een recombinant type I collageen zelfgeassembleerd fibrillenmodel. De methode maakt gelijktijdige beeldvorming mogelijk van de fasen van collageen, niet-collageeneiwitten (bijv. chondroïtinesulfaat) en calciumfosfaatmineralen. De monstervoorbereiding omvat amino-silanisatie en zelfassemblage van collageen, gevolgd door mineralisatie met behulp van een calciumfosfaatmedium dat in een vroeg stadium (30 min) amorf calciumfosfaat (ACP) vormt en na 6 uur rijpt tot hydroxyapatiet (HAP). Daarna wordt multiplexe immunofluorescentielabeling uitgevoerd, en monsters worden eerst beoordeeld met confocale microscopie voordat 3D-STORM beeldverwerving plaatsvindt met behulp van een zuurstofabsorberende beeldbuffer. Gegevensverwerking en analyse worden uitgevoerd met behulp van publiek beschikbare software. In vergelijking met conventionele elektronen- of confocale microscopie combineert dit protocol moleculaire specificiteit met nanoschaalresolutie (typische laterale precisie 20–30 nm, axiale 50–60 nm), waardoor driedimensionale visualisatie van intrafibrillaire versus extrafibrillaire mineralisatiepatronen mogelijk is. Representatieve resultaten tonen duidelijke visualisatie van collageennetwerken, geassocieerde niet-collageeneiwitten en minerale fasen binnen driedimensionale ruimte. Kwantitatieve metrics, waaronder Pearsons correlatiecoëfficiënt (0,89 ± 0,04) en Manders' overlapcoëfficiënt (0,91 ± 0,03), worden in de sectie Resultaten gegeven. Dit protocol biedt een krachtig hulpmiddel voor onderzoekers in biomateriaalwetenschap, biomineralisatie en botweefselengineering die nanoschaalinzicht nodig hebben in mineralisatiedynamica.

Introduction

Collageenmineralisatie is een fundamenteel biologisch proces dat cruciaal is voor de vorming van harde weefsels zoals botten en tanden¹. De ingewikkelde structuur van collageenvezels, gecombineerd met fijn afgestemde regulatie van mineraalafzetting, geeft deze weefsels opmerkelijke mechanische sterkte en structurele integriteit². Collageen dient niet alleen als een passieve steiger, maar ook als een actieve deelnemer, die precieze minerale afzetting orkestreert via complexe moleculaire en fysieke interacties³. Het ophelderen van deze mechanismen is cruciaal voor het begrijpen van pathologische aandoeningen zoals osteoporose en cariës, en voor het ontwikkelen van biomimetische materialen voor regeneratieve therapieën⁴.

De diameter van collageenvezels in harde weefsels varieert van ongeveer 50 tot 100 nm, waarbij hydroxyapatiet (HAP) deeltjes nog kleiner zijn (meestal 2–5 nm dik en 20–30 nm lang) en in fibrillaire gaps⁵ worden geplaatst. Hoewel gapzones kunnen fungeren als nucleatieplaatsen, vormen mineralen zich in inheemse weefsels aanvankelijk in interfibrillaire ruimtes en breiden zich vervolgens uit tot intrafibrillaire compartimenten. Traditionele karakteriseringsmethoden omvatten histologische kleuring, confocale laserscanningmicroscopie ^6,7 en elektronenmicroscopie ^8,9. Histologische kleuring biedt een macroscopische beoordeling, maar kan mineralisatietoestanden op nanoschaal niet evalueren. Confocale microscopie maakt observatie van specifieke componenten mogelijk, maar is diffractiebeperkt (~200 nm lateraal) en kan intrafibrillaire versus extrafibrillaire mineralisatie¹⁰ niet onderscheiden. Elektronenmicroscopie biedt een hoge resolutie, maar mist moleculaire specificiteit. Hoewel immunogoudlabeling moleculaire specificiteit kan bieden voor elektronenmicroscopie, vereist het gespecialiseerde verwerking en is het minder geschikt voor gemultiplexeerde, driedimensionale visualisatie van meerdere componenten dan STORM, en omvat het lange experimentele cycli en hoge kosten¹¹.

Stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM) overwint de diffractiegrens door individuele fluoroforen met hoge precisie te lokaliseren, wat een laterale resolutie^{van ~}20 nm bereikt. In vergelijking met andere superresolutietechnieken zoals de STED)13-microscopie en gestructureerde verlichtingsmicroscopie (SIM)¹⁴, biedt STORM een hogere lokalisatieprecisie (~20 nm lateraal en ~50 nm axial) en is compatibel met een breder scala aan organische fluoroforen. In het bijzonder vereist STED gespecialiseerde kleurstoffen en hoge laservermogens die biologische monsters kunnen beschadigen, terwijl SIM slechts een resolutie van ~100 nm biedt, onvoldoende om fibrilleschaal (50–100 nm) kenmerken op te lossen. STORM biedt een praktische balans tussen resolutie, multiplexingcapaciteit en samplecompatibiliteit. Gepubliceerde richtlijnen hebben gestandaardiseerde testmonsters beschreven om optimalisatie van STORM-beeldparameters en resolutiebeoordeling¹⁵ te vergemakkelijken. In combinatie met driedimensionale beeldvormingsmogelijkheden maakt 3D-STORM nanoschaalvisualisatie van meerdere componenten gelijktijdig^{mogelijk 16}. Recente ontwikkelingen hebben STORM uitgebreid naar multicolor- en multiplexbeeldvorming, waardoor visualisatie van meerdere doelen binnen dezelfde steekproef^{mogelijk is.}

Dit protocol gebruikt een biomimetisch in vitro model gebaseerd op zelfgeassembleerde recombinante type I collageenfibrillen en is expliciet ontworpen voor in vitro recombinante type I collageen zelfgeassembleerde fibrillenmodellen om intrafibrillaire en extrafibrillaire mineralisatie op nanoschaal te onderscheiden. Het is niet geschikt voor live-cell imaging, omdat STORM vaste monsters en zuurstofopvangbuffers vereist. Het is ook niet geschikt voor inheemse sterk gemineraliseerde weefsels (bijvoorbeeld rijp bot) zonder voorafgaande decalcisatie of antigeenopvang. Als alleen de algehele minerale dichtheid of de morfologie van grote gebieden moet worden beoordeeld, is conventionele confocale of elektronenmicroscopie efficiënter.

Het algemene doel van dit protocol is het bieden van een gestandaardiseerde, stapsgewijze workflow voor het gebruik van multicolor 3D-STORM om de nanoschaalverdeling van mineralen en niet-collageeneiwitten binnen individuele collageenfibrillen te visualiseren, met specifieke nadruk op het onderscheiden van intrafibrillaire versus extrafibrillaire mineralisatie. Dit protocol integreert geoptimaliseerde immunolabeling met een op maat gemaakte beeldvormingsbuffer om gelijktijdige tracking mogelijk te maken van meerdere organische componenten (collageen, niet-collageeneiwitten) en anorganische fasen (ACP, HAP) in drie dimensies¹⁹. Een belangrijke innovatie is de kwantitatieve beoordeling van intrafibrillaire versus extrafibrillaire mineralisatiepatronen. Kwantificatie wordt bereikt door twee onafhankelijke criteria: (1) het berekenen van de colocalisatiecoëfficiënt van Pearson tussen de minerale (een calciumindicatorkleurstof (bijv. calcein)) en collageen (een verrood fluorescerende kleurstof) kanalen met behulp van de colokalisatiemodule in beeldanalysesoftware (coëfficiënt >0,8 duidt op sterke associatie); (2) Analyse van de persistentie van het mineraalsignaal over Z-sneden van individuele fibrillen: als mineraalsignaal aanwezig is in centrale sneden (Z = 0 tot ±120 nm vanaf het verticale centrum van de fibrille) bij intensiteit ≥50% van het maximum, wordt het geclassificeerd als intrafibrillair. In tegenstelling tot conventionele elektronen- of confocale microscopie combineert dit protocol moleculaire specificiteit met nanoschaalresolutie, waardoor een driedimensionale ruimtelijke verdeling van intrafibrillaire mineralisatie mogelijk wordt.

Dit protocol is ontworpen voor onderzoekers in biomateriaalwetenschap, biomineralisatie en botweefseltechniek en vereisen nanoschaalinzicht in mineralisatiedynamica. De gestandaardiseerde procedure kan ook worden aangepast om andere gemineraliseerde collageensystemen te bestuderen, zoals gedemineraliseerde dentineschijfjes of collageengebaseerde hydrogels, door de eerste monstervoorbereidingsstappen dienovereenkomstig aan te passen.

Protocol

Alle experimenten met biologische monsters werden uitgevoerd volgens de richtlijnen en voorschriften van de Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine en goedgekeurd door het Institutioneel Bioveiligheidscomité (Goedkeuringscertificaat nr. BSL20235710079). Het hier beschreven experimentele protocol maakt gebruik van commercieel verkregen reagentia en in vitro biomimetische systemen. Het betreft geen menselijke deelnemers, dierlijke proefpersonen of menselijke weefselmonsters, en vereist daarom geen ethische goedkeuring van een institutionele beoordelingscommissie.

VOORZICHTIG: Alle procedures waarbij gevaarlijke chemicaliën betrokken zijn, moeten worden uitgevoerd in een dampkap met passende persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, handschoenen, veiligheidsbril). Verwijder chemisch afval volgens institutionele regelgeving. Voor NaN₃ verzamel afval in een speciale container met het label "azide afval" en meng het niet met zuren (risico op explosief gas). Voor glutaraldehyde moet je inactiveren met 10% overtollig natriumbisulfiet voordat je wordt afgevoerd. Voor β-mercaptoethanol, oxideer met bleekmiddel (1:10 v/v) gedurende 1 uur voordat je het afvoert.

OPMERKING: Immunofluorescentielabeling MOET VÓÓR mineralisatie worden uitgevoerd om epitoopmaskering door mineraalafzettingen te voorkomen. Voor toepassingen die postmineralisatie-labeling vereisen, kan antigeenwinning nodig zijn.

1. Bereiding van mineralisatiemedium

1. Bereiding van mineralisatiemedium voor gereconstitueerde collageenfibrillen
   1. Bereid calciumvoorraadoplossing voor door 100 μL 5 mg/mL polyaspartinzuur (p-Asp, Mw 9-11 kDa) druppelwijs toe te voegen aan 5 mL 3,44 mM CaCl₂-oplossing in een 15 mL conische buis.
   2. Vortex meng in de buis gedurende 30 seconden tot het homogeen is.
   3. Voeg p-Asp langzaam toe en meng grondig om amorf calciumfosfaat (ACP) te stabiliseren.
   4. Voeg 5 mL fosfaatoplossing (19 mM Na₂HPO₄ + 300 mM NaCl) toe aan de calciumvoorraadoplossing.
   5. Vortex mix voor 1 minuut.
      OPMERKING: Eindconcentraties na menging: 1,67 mM CaCl₂, 9,5 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl en 50 μg/mL p-Asp.
   6. Bereid het mineralisatiemedium direct voor gebruik voor. Niet opslaan; gebruik onmiddellijk de onstabiele ACP-voorloper om consistente resultaten te bereiken.
      OPMERKING: Opslag leidt tot voortijdige kristallisatie.
2. Bereiding van mineralisatiemedium voor collageengels/gedemineraliseerde dentine
   1. Bereid calciumhoudende oplossing door 8,77 g NaCl, 0,01 g NaN₃, 6,06 g Tris en 1,11 g CaCl₂ op te lossen in 800 mL gedeïoniseerd water.
   2. Breng het volume tot 1 liter met gedeïoniseerd water.
   3. Voeg 350 μg/mL polyacrylzuur (PAA, Mw ~1800) toe aan de calciumhoudende oplossing.
   4. Vortex voor 1 minuut.
      OPMERKING: Gebruik PAA in plaats van p-Asp voor betere stabilisatie bij hogere calciumconcentraties.
   5. Bereid fosfaatoplossing voor door 0,85 g Na₂HPO₄ op te lossen in 1 L gedeïoniseerd water om 6 mM Na₂HPO₄ te verkrijgen.
   6. Filtersteriliseer de fosfaatoplossing met een membraan van 0,22 μm.
   7. Combineer gelijke volumes (bijv. 500 mL elk) calcium- en fosfaatoplossingen met magnetisch roeren bij 300 toeren per minuut.
   8. Stel de pH in naar 7,4 met 1 M HCl of NaOH terwijl je met een pH-meter meet.
      OPMERKING: Houd de pH op 7,4 ± 0,1. Sta geen pH-afwijkingen >0,2 toe, die voortijdige kristallisatie veroorzaken.

2. Bereiding van recombinante collageenvezels

1. Amino-silanisatie van glazen bodemschotels
   OPMERKING: Deze behandeling gebruikt (3-aminopropyl) triethoxysilaan (APTES) om positief geladen aminogroepen (-NH₂) op het glasoppervlak te introduceren, wat elektrostatische adsorptie en stabilisatie van negatief geladen collageenmonomeren bevordert.
   1. Voeg 200 μL APTES-oplossing (5% v/v in absolute ethanol) toe aan elke kweekschaal op de glasbodem (35 mm, #1,5H dikte, 0,17 mm ± 0,005 mm).
   2. Zorg voor volledige dekking van het schaaloppervlak met de APTES-oplossing.
   3. Broed 2 uur in het donker bij kamertemperatuur (20–25 °C).
   4. Spoel de afwas drie keer af met absolute ethanol (2 ml per was).
   5. Ultrasonicate in gedeïoniseerd water gedurende 10 minuten op 40 kHz. Verwijder de resterende APTES volledig om niet-specifieke bindingen te voorkomen.
   6. Silaniseerde servies kunnen tot 1 week droog worden bewaard op 4 °C.
   7. (Optioneel) Bak voor betere stabiliteit: Plaats gewassen en gedroogde borden in de oven op 100–120 °C gedurende 30–60 minuten.
   8. Laat het afkoelen tot kamertemperatuur voordat je verder gaat.
      OPMERKING: Als je plastic schotels gebruikt, verlaag dan de temperatuur tot onder de 80 °C om vervorming te voorkomen. Pas de silanisatieprocedure aan van Bitter en Muir²⁰.
2. Collageenzelfassemblage en kruisverbinding
   1. Pipetteer 100 μL collageen-I oplossing (50 μg/mL in 0,1 M azijnzuur) op elk silaniseerd gerecht.
   2. Incubeer bij 37 °C gedurende 10 uur in een luchtvochtigheidskamer (> 90% relatieve luchtvochtigheid). Houd een stabiele luchtvochtigheid om verdamping van de oplossing te voorkomen.
   3. Verifieer de vorming van fibrillen met fasecontrast of confocale microscopie; Een succesvolle voorbereiding toont een fijn, webachtig fibrillennetwerk.
   4. Om de juiste fibrillenvorming op ultrastructureel niveau te verifiëren, bereid je een apart monster voor op een polyvinyl formele/koolstofgecoate TEM-rooster volgens dezelfde zelfassemblagecondities (collageen-I 50 μg/mL, 37 °C, 10 uur, luchtvochtigheid > 90%).
   5. Kleur met 1% fosfhotungstisch zuur (pH 7,0) gedurende 10 minuten.
   6. Was met gedeïoniseerd water.
   7. Onderzoek onder een transmissie-elektronenmicroscoop. Succesvolle fibrillogenese wordt aangegeven door het karakteristieke 67 nm D-periodieke bandpatroon (zie Figuur 3).
   8. Aspiraat voorzichtig de resterende collageenoplossing uit de glazen bodemschaal.
   9. Voeg 2 ml chondroïtinesulfaat (CS) oplossing toe (50 mg/mL in PBS, pH 5,5) aan elk gerecht.
   10. Incubeer bij 4 °C gedurende 12 uur om elektrostatische adsorptie van CS op collageenfibrillen mogelijk te maken.
   11. Bereid EDC/NHS crosslinkingoplossing²¹: los 0,2 M EDC op (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) en 0,05 M NHS (N-hydroxysuccinimide) in MES-buffer (0,1 M MES, pH 5,5).
       OPMERKING: MES-buffer kan worden voorbereid door MES-vrije zuur op te lossen in gedeïoniseerd water en de pH aan te passen naar 5,5 met NaOH.
   12. Verwijder de CS-oplossing en voeg 2 ml van de EDC/NHS crosslinking-oplossing toe.
   13. Incubeer 2 uur bij kamertemperatuur om CS covalent te immobiliseren op collageen.
   14. Was de afwas drie keer met PBS (5 ml elk, 5 minuten per stuk) om niet-gereageerde reagentia te verwijderen.
   15. Bewaar bewerkte collageenvezels in PBS bij 4 °C tot 24 uur voor mineralisatie.

3. Immunofluorescentielabeling (uitgevoerd VÓÓR mineralisatie)

1. Monstervoorbereiding
   1. Spoel collageenfibrillen drie keer af met 500 mM NaCl-oplossing (10 mL per was, 5 minuten per was).
   2. Was drie keer met gedeïoniseerd water (10 mL per was, 5 minuten per was).
   3. Voer wasbeurten uit op een horizontaal shakerplatform dat draait op 50 rpm om een grondige wasbeurt te garanderen en schuifkrachten te minimaliseren die samengestelde fibrillen kunnen losmaken.
2. Blokkering en primaire antilichaamincubatie
   1. Incubeer met blokkeringsbuffer (5% runderserumalbumine in PBS) bij 37 °C gedurende 1 uur in een bevochtigde kamer.
   2. Bereid een antilichaamcocktail voor in de blokkerende buffer: konijn anti-collageen-I (1:100 verdunning) en muis anti-chondroïtine sulfaat (1:100 verdunning).
   3. Voeg 200 μL antilichaamcocktail toe per monster.
   4. Bedek monsters met laboratoriumfolie.
   5. Broed 's nachts (12–16 uur) op 4 °C.
   6. Bescherm tegen licht met aluminiumfolie. Na primaire antistofincubatie kunnen monsters worden opgeslagen in PBS bij 4 °C tot 24 uur.
3. Secundaire antilichaamkleuring
   1. Verwijder ongebonden primaire antilichamen door de afwas drie keer te wassen met een wasbuffer (0,1% Tween-20 in PBS), 10 minuten per was.
   2. Bereid het fluorescerende secundaire antistofmengsel voor in een blokkerende buffer (200 μL per 35 mm schaal) die bevat: geitenanti-konijn IgG geconjugeerd tot een verrood fluorescerende kleurstof (1:100) en geitenanti-muis IgM geconjugeerd tot een rode fluorescerende kleurstof (1:100).
      OPMERKING: Vanaf deze stap bescherm je monsters tegen licht om fotobleeken van de fluoroforen te voorkomen.
   3. Incubeer monsters bij kamertemperatuur (20–25 °C) gedurende 1 uur in het donker.
   4. Was de afwas drie keer met een wasbuffer (elk 10 minuten) om ongebonden secundaire antilichamen te verwijderen.
      OPMERKING: Bewaar gelabelde monsters in PBS op 4 °C (lichtbeschermd) tot 48 uur voor beeldvorming. Voeg controles zonder primaire antistoffen toe om autofluorescentie te controleren.

4. Mineralisatie van collageenvezels (uitgevoerd NA labeling)

1. Mineralisatieproces
   1. Voeg per gerecht 2 ml vers bereid mineralisatiemedium toe.
   2. Incubeer bij 37 °C gedurende 30 minuten (kortstondig) voor vroege minerale (ACP) vorming.
   3. Alternatief kun je 6 uur (langdurig) incuberen bij 37 °C voor volwassen minerale (HAP) kristallisatie.
      OPMERKING: Houd de exacte temperatuur aan op 37 °C ± 0,5 °C met behulp van een gekalibreerde broedmachine.
   4. Aspirateer het mineralisatiemedium voorzichtig.
   5. Spoel drie keer met gedeïoniseerd water (5 mL per was, 1 minuut interval).
2. Calciumfosfaatlabeling
   1. Voeg 4 μM van een calciumindicatorkleurstof (bijv. calcein) toe aan PBS (200 μL per schaal).
   2. Breng 30 minuten in het donker op kamertemperatuur (20–25 °C).
      OPMERKING: De calciumindicatorkleurstof (bijv. calcein) bindt aan calciumionen en maakt geen onderscheid tussen amorfe en kristallijne fasen; De fasetoewijzing is gebaseerd op mineralisatietijd (30 min = ACP, 6 uur = HAP). Het moet beschermd worden tegen licht met amberkleurige buizen of foliefolie.
   3. Spoel vijf keer: drie keer met gedeïoniseerd water en twee keer met 70% ethanol (elk 1 minuut), afwisselend tussen de twee.
3. Monstervoorbereiding voor beeldvorming
   1. Dompel monsters in beeldvormingsbuffer: 10% glycerol (w/v) in PBS. Voeg optioneel een antifade-reagens toe volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Breng een voldoende volume (20–50 μL) beeldvormingsbuffer toe om het monster te bedekken.
   3. Leg een dekmantel over het monster.
   4. Bewaar monsters tot 72 uur bij 4 °C in het donker.

5. Observatie onder een laserconfocale microscoop

1. Overplaatsing van monsters van 4 °C opslag naar kamertemperatuur (20–25 °C).
2. Laat 10 minuten evenwicht toestaan om condensatie te voorkomen.
3. Behoud lichtbescherming met amberkleurige containers of foliefolie.
4. Controleer of de beeldvormingsbuffer het hele monster bedekt.
5. Configureer de confocale microscoop met de volgende instellingen:
   1. Voor collageenbeeldvorming (ver-rood fluorescerende kleurstof): 647 nm laser, emissiefilter 650-710 nm.
   2. Voor calciumfosfaatbeeldvorming (calciumindicatorkleurstof (bijv. calcein)): 488 nm laser, emissiefilter 500-550 nm.
   3. Doelstelling: 100× olie-onderdompeling (NA 1,4).
   4. Gaatjesdiameter: 1 Airy-eenheid (AU).
   5. Pixel-dwelltijd: 1-2 μs.
      OPMERKING: Voer laseruitlijning en pinhole-kalibratie uit vóór beeldvorming.
6. Voer sequentiële scanning uit: eerste scan met 647 nm excitatie (collageen).
7. Voer een tweede scan uit met 488 nm excitatie (mineraal).
   OPMERKING: Verzamel kanalen achter elkaar om doorbloeding te voorkomen.
8. Voor 3D-reconstructie stel je de Z-stack stapgrootte in op 0,5 μm of kleiner om voldoende bemonstering te garanderen.
9. Savebestanden met metadata behouden.
10. Voor colocalisatieanalyse gebruik je beeldanalysesoftware die in staat is Pearsons correlatiecoëfficiënt te berekenen (bijvoorbeeld publiek beschikbare software met geschikte plugins).

6. Beeldvorming door driedimensionale stochastische optische reconstructiemicroscopie (3D-STORM)

1. Voorbereiding van STORM imaging buffer²²
   OPMERKING: Glucoseoxidase en catalase worden toegevoegd aan de beeldvormingsbuffer om zuurstof op te vangen, waardoor fotobleaching wordt verminderd en het knipperen van fluoroforen wordt verlengd, wat essentieel is voor de lokalisatie van één molecuul in STORM.
   1. Maak een glucoseoxidase (GOx) bouillonoplossing van 8 mg/mL in een 50 mM natriumacetaatbuffer (pH 5,1).
   2. Bereid een katalase-bouillonoplossing voor bij 160 μg/mL in 1× PBS.
      OPMERKING: Aliquot de enzymvoorraad, vries ze in met vloeibare stikstof of een droogijs-/ethanolbad, en bewaar ze bij -20 °C of -80 °C. Vermijd herhaalde vries-dooicycli.
   3. Bereid een verse STORM-beeldbuffer voor op ijs, beschermd tegen licht.
   4. Combineer de volgende componenten in de vermelde volgorde tot een eindvolume van 1 mL: steriele nucleasevrije H₂O (tot 1 mL), 1 M NaCl (10 μL, 10 mM eind), 1 M Tris-HCl pH 8,0 (50 μL, 50 mM final), vers bereid 1 M cysteamine (MEA) aangepast op pH ~7,0 (50 μL, 50 mM eind), 50% (w/v) glucose (200 μL, 10% w/v eind), GOx-voorraad (200 μL, 1,6 mg/mL eind), katalase-kolf (200 μL, 32 μg/mL eind).
   5. Meng voorzichtig door te pipetteren of omkeren. Niet vortexen.
      OPMERKING: De buffer moet vers worden voorbereid en op ijs worden bewaard, beschermd tegen licht. Gebruik binnen 30 minuten na voorbereiding. Voor gedetailleerde optimalisatie van STORM-beeldvormingscondities, raadpleeg vastgestelde protocollen met testmonsters¹⁵.
   6. Voeg 200 μL vers voorbereide STORM-beeldbuffer toe om het monster volledig te bedekken.
2. 3D-STORM systeemconfiguratie
   1. Zorg ervoor dat het beeldpad wordt geleid naar een elektronenvermenigvuldigende CCD (EMCCD) camera.
   2. Schakel de cilindrische lensmodule in voor 3D-beeldvorming.
   3. Stel de software in op 3D STORM-acquisitiemodus.
   4. Configureer optische padfilters voor de gebruikte kleurstoffen.
   5. Zet de 647 nm laser aan en zet het vermogen op een laag niveau (1-5 mW).
   6. Met een 100× olie-onderdompelingsobjectief (NA ≥1.4) lokaliseert u het regio van interesse in widefield- of TIRF live preview-modus.
   7. Verkrijg een conventioneel breedveldfluorescentiebeeld voor latere vergelijking.
   8. Schakel over naar TIRF-verlichtingsmodus.
   9. Kalibreer de TIRF-hoek om een dun belichtingsveld (~100-200 nm) te bereiken om achtergrondfluorescentie te minimaliseren.
   10. Pas de belichtingstijd van de camera aan (10-30 ms) op basis van de initiële signaalintensiteit.
   11. Pas de beeldvormingslaserkracht aan op basis van de initiële signaalintensiteit.
   12. Doe een korte testverwerving.
   13. Controleer of de parameters correct zijn ingesteld zonder snel fotobleaching te veroorzaken.
       OPMERKING: Zorg voor een nauwkeurige uitlijning van de cilindrische lensas met het monstervlak. De meeste moderne systemen hebben geautomatiseerde kalibratie. Voor handmatige kalibratie gebruik je 100 nm fluorescerende kralen om symmetrische, ronde puntspreidingsfuncties (PSF's) te verifiëren.
   14. Begin met 10–30 ms belichting bij een laservermogen van 647 nm van 1–2 kW/cm^².
   15. Controleer dat de knipperdichtheid 0,1–1 molecuul/μm² is.
   16. Als de dichtheid te laag of te hoog is, pas dan het laservermogen of de belichtingstijd dienovereenkomstig aan.
   17. Herhaal de verificatie en aanpassing totdat de ideale dichtheid is bereikt.
3. 3D-STORM gegevensverzameling
   1. Zet de acquisitiesoftware op de modus "Continue Activatie".
   2. Stel de beeldvormingslaser (647 nm) in op hoog vermogen (100-500 mW vezelingang) om de meeste fluoroforen naar de donkere toestand te laten overgaan.
   3. Stel de activatielaser (405 nm) in op laag vermogen (0,1–5 mW).
   4. Optimaliseer 405 nm vermogen empirisch om 100–200 gelokaliseerde moleculen per frame in een gebied van 256×256 pixels te behouden.
   5. Stel het totale aantal frames in op 10.000–20.000.
   6. Gebruik 1 frame activatielicht (405 nm) gevolgd door 5 frames beeldend licht (647 nm) per cyclus.
   7. Begin met de acquisitie.
   8. Bedien EMCCD met maximale gevoeligheid (toegepaste EM-versterking)
   9. Gebruik 10–30 ms belichting per frame.
   10. Monitor tijdens de acquisitie de dichtheid van actieve moleculen.
   11. Pas het laservermogen van 405 nm aan om een gestage stroom van enkelmolecuul-gebeurtenissen te behouden.
       OPMERKING: Ruwe filmgegevens kunnen op een standaard harde schijf worden opgeslagen voor langdurige archivering vóór reconstructie.
4. Data-analyse van collageenmineralisatie (met behulp van beeldanalysesoftware met STORM-module)
   1. Selecteer in de analysesoftware de juiste cameradriver (STORM-module).
   2. Klik op [Analyse GUI] in het STORM-paneel. Het analysevenster opent.
   3. Klik op [Bestand Openen]. Selecteer het ruwe microscopiebeeldbestand dat geanalyseerd moet worden. Klik open.
   4. Bepaal de minimale fluorescentiewaarde (minimale hoogte) voor geldige signalen.
   5. Zoek de donkerste plek die nog herkenbaar is als een signaal van één molecuul.
   6. Beweeg de muis naar het midden.
   7. Lees de piekhoogte-waarde.
   8. Noteer deze waarde.
   9. Klik op [Identificatieinstellingen]. Stel in de dialoogdialoog de volgende parameters in: Minimum Height (voer de waarde in stap 6.4.8 in), Maximum Height (20000), CCD Baseline (100), en voor 3D-STORM data controleer "3D" (voor 2D niet aanvinken).
   10. Klik >> om meer parameters uit te breiden. Ingesteld: minimale breedte (nm) op 200, maximale breedte (nm) op 700 (400 voor 2D), initiële pasbreedte (nm) op 300, maximale axiale verhouding op 2,5 (1,3 voor 2D), en maximale verplaatsing (pix) op 1.
   11. Klik op OK om het dialoogvenster te sluiten.
   12. Voer een testanalyse uit om de parameters te valideren. Vink Drift Correctie uit.
   13. Stel periodes in op 1.
   14. Klik op [Test].
   15. Na analyse klik je op OK in het pop-upmenu.
   16. Controleer of de signaalplekken correct zijn geïdentificeerd. Achtergrondgeluid mag niet verkeerd worden geselecteerd. Echte plekken mogen niet gemist worden.
   17. Als het niet bevredigend is, herhaal dan stappen 6.4.9–6.4.16 om de parameters aan te passen tot het correct is.
   18. Na de testanalyse voert u de volledige analyse uit. Controleer de driftcorrectie.
       OPMERKING: De analysesoftware voert driftcorrectie uit met behulp van een redundant cross-correlatie (RCC) algoritme dat de correlatie tussen tijdsegmenten van moleculaire lokalisaties maximaliseert. Er zijn geen fiduciale kralen verplicht²³.
   19. Stel je menstruatie = 1.
   20. Klik op [Start] (of klik opnieuw op [Test], daarna [Start]).
   21. Wacht tot de analyse is afgerond. Klik op OK in het pop-upmenu.
   22. Na analyse worden twee resultaatbestanden (.bin en .txt) gegenereerd in dezelfde map als het .nd2-bestand.
   23. Voor colokalisatieanalyse (647 nm en 488 nm kanalen) wordt beide kanalen gelijktijdig weergegeven in de kanaallijst van het analysevenster.
   24. Kies een geschikte regio van interesse (ROI).
   25. Gebruik de colocalisatiemodule om de correlatiecoëfficiënt van Pearson te berekenen. Indien niet automatisch geleverd, exporteer dan handmatig point cloud-gegevens naar een colocalisatie-plugin in openbaar beschikbare beeldanalysesoftware. Noteer de waarde.
   26. Voer Z-slice-analyse uit om intrafibrillaire mineralisatie te bevestigen. Selecteer in het hoofdmenu Bekijk > Z-stepping > Slice.
   27. Haal individuele vlakken uit met intervallen van 60 zeemijlen.
   28. Let op het mineraalsignaal (groen, 488 nm kanaal). Controleer of het signaal blijft bestaan in de centrale slices (Z = 0 nm ±120 nm). Persistentie bevestigt intrafibrillaire mineralisatie.
   29. Optioneel: voer dichtheidsfiltering uit om overtelling door dicht opeengepakte emitters te verminderen. Open de STORM gereconstrueerde afbeelding in openbaar beschikbare beeldanalysesoftware met behulp van een plugin voor localisatieanalyse^{van één molecuul 24}.
   30. Om overtelling van dicht verpakte emitters te verminderen, pas dichtheidsfiltering toe (bijvoorbeeld mediaanfilter of lokale dichtheidsdrempel) op basis van de signaaldichtheid.
   31. Als driftcorrectie niet was ingeschakeld in stap 6.4.18 of aanvullende correctie nodig is, voer dan driftcorrectie uit. Correct op basis van de PSF van fiduciale markers. Alternatief kun je cross-correlatie-algoritmen gebruiken (bijvoorbeeld driftcorrectie geïmplementeerd in dezelfde plugin).
   32. Voer spectrale unmixing uit om kanaaloverspraak te elimineren. Klik in het STORM-analysevenster op het crosstalk-verwijderingstool (meestal rechtsonder).
   33. Stel de straal in op 25,0 nm (aanbevolen). Selecteer het bronkanaal. Selecteer de verwijderingsmethode: statistisch advies wordt aanbevolen.
   34. Om cross-activatie veroorzaakt door de excitatielaser te verwijderen, selecteer je Subtract naast NSA > Cross Activation. Klik op OK. Een nieuw kanaal, Nonspecific Activation-Xt, wordt automatisch gegenereerd.
   35. Valideer autofluorescentieniveaus en achtergrondsignalen met behulp van ongekleurde controlemonsters. Zorg ervoor dat alle seinen specifiek zijn gelabeld.
   36. Voer 3D-visualisatie uit. Selecteer een interessegebied (ROI) in het analysevenster.
   37. Klik op de [3D]- knop (of [Toon 3D]). Genereer een 3D-projectie of volumerendering.
   38. Rechtsklik om de renderparameters aan te passen. Exporteer video's in gangbare formaten (bijvoorbeeld .avi of .mp4).
   39. Om een mineraalsignaal als intrafibrillair te classificeren, voer je een Z-slice-analyse uit zoals in 6.4.26–6.4.28. Exportintensiteitsprofielen.
   40. Definieer het fibrillencentrum als het Z-vlak waar het collageensignaal maximaal is.
   41. Een mineraalsignaal wordt als intrafibrilair beschouwd als de intensiteit bij Z = 0 (centrum) en bij Z = ±60 nm ≥50% is van de maximale mineraalintensiteit in die fibrille. Als het signaal onder de 30% daalt bij Z = 0, classificeer dan als extrafibrillair.
   42. Noteer de classificatie voor minstens 50 fibrillen per conditie om het percentage intrafibrillaire mineralisatie te berekenen.
       OPMERKING: Alternatieve publiek beschikbare plugins zijn ook beschikbaar voor dichtheidsfiltering, driftcorrectie en spectral unmixing.

Results

Succesvolle implementatie van dit protocol levert een hoogresolutie driedimensionale visualisatie van gemineraliseerde collageenfibrillen op met behulp van multicolor 3D-STORM. De volgende resultaten illustreren typische uitkomsten, kwaliteitscontroles en kwantitatieve beoordelingen.

Figuur 1 toont een meerkleurige 3D-STORM-reconstructie van een collageennetwerk gemineraliseerd met amorf calciumfosfaat (ACP). Collageen (gelabeld met een verrood fluorescerende kleurstof) verschijnt als een goed gedefinieerd fibrillair netwerk. Chondroïtinsulfaat (GAG, gelabeld met een rode kleurstof) is nauw geassocieerd met de collageenfibrillen, en colocalisatiegebieden verschijnen cyaan in het samengevoegde beeld. Belangrijk is dat ACP-deeltjes (groen, gelabeld met een calciumindicatorkleurstof) binnen de grenzen van collageenfibrillen worden waargenomen, waarbij intrafibrillaire mineralisatie in het vroege stadium (30 min) wordt getoond. Deze figuur benadrukt het vermogen van het protocol om gelijktijdig drie verschillende componenten (collageen, GAG, mineraal) op nanoschaal te onderscheiden, een prestatie die niet haalbaar is met conventionele confocale microscopie (zie Figuur 5 voor de vergelijking van de beeldresolutie). De nanoschaal colokalisatie van ACP binnen fibrillen bevestigt dat de amorfe precursor het fibrillaire interieur kan infiltreren vóór de kristallijne transformatie.

Figuur 2 geeft kwantitatief bewijs voor intrafibrillaire penetratie van rijpe hydroxyapatiet (HAP) na 6 uur mineralisatie. Figuur 2A toont 2D STORM-beelden die uitgebreide colokalisatie van collageen (rood) en HAP (groen) tonen, waarbij samengevoegde kanalen geel lijken. Figuur 2B is een 3D-volumereconstructie die geïntegreerde architectuur illustreert. Figuur 2C toont Z-as slice-analyse met intervallen van 60 nm van de top (Z = −120 nm) tot het centrum (Z = 0) en tot diepere secties (Z = +120 nm). Het HAP-signaal blijft bestaan in de centrale sneden (Z = 0 tot ±120 nm) met een intensiteit ≥50% van het maximum, wat voldoet aan de classificatiecriteria voor intrafibrillaire mineralisatie gedefinieerd in protocolstappen 6.4.39–6.4.41. Kwantitatieve colocalisatieanalyse van drie onafhankelijke experimenten (n = 3 replicaten, elk met 5 interessegebieden) leverde een Pearson-correlatiecoëfficiënt van 0,89 ± 0,04 en een Manders-overlapcoëfficiënt van 0,91 ± 0,03 (gemiddelde ± SD). Deze waarden wijzen op een sterke en specifieke associatie tussen collageen en HAP binnen de fibrillen, wat bevestigt dat de volwassen kristallijne fase ook intrafibrillair voorkomt.

Figuur 3 valideert de structurele integriteit van de zelfgeassembleerde collageensteiger met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Collageenfibrillen gekleurd met 1% fosfhotungstisch zuur (pH 7,0) vertonen het karakteristieke 67 nm D-periodieke kruisbandpatroon, wat kenmerkend is voor inheemse fibrillogenese. Deze kwaliteitscontrolestap is essentieel voordat men begint met mineralisatie-experimenten, omdat het bevestigt dat het steigerwerk structureel intact is en in staat is om intrafibrillaire mineraalafzetting te ondersteunen. Zonder dit bandingpatroon kan het collageen worden gedenatureerd of verkeerd samengesteld, wat leidt tot artefactische mineralisatiepatronen.

Figuur 4 illustreert een representatief negatief resultaat dat wordt verkregen wanneer mineralisatiecondities niet goed worden gecontroleerd (bijvoorbeeld de afwezigheid van polyasparatinzuur of pH > 7,6). Onder deze suboptimale omstandigheden worden HAP-afzettingen (groen) uitsluitend waargenomen op het glassubstraat buiten de collageenfibrillen (rood), zonder intrafibrillaire invasie. Dit resultaat dient als een belangrijke controle: het toont aan dat de intrafibrillaire mineralisatie die in Figuren 1 en 2 wordt waargenomen niet het gevolg is van niet-specifieke neerslag of onvolledige was, maar eerder nauwkeurige controle van de chemische omgeving vereist (pH 7,4 ± 0,1, aanwezigheid van polyasparatinzuur en onmiddellijk gebruik van een nieuw mineralisatiemedium). Onderzoekers zouden zulke negatieve controles moeten opnemen om hun eigen systeem te valideren.

Figuur 5 toont representatieve confocale microscopiebeelden die zijn verkregen vóór de STORM-verwerving voor voorlopige monsterscreening. Het collageenkanaal (Figuur 5A) toont een duidelijk fibrillair netwerk, en het HAP-kanaal (Figuur 5B) toont een mineraal dat met de fibrillen is geassocieerd. De samengevoegde afbeelding (Figuur 5C) bevestigt colocalisatie op het diffractie-beperkte niveau (~200 nm). Deze beelden dienen twee doelen: (1) ze verifiëren de kwaliteit van het monster (adequate etikettering, minimale aggregatie en specifieke minerale associatie) voordat ze overgaan tot tijdrovende STORM-beelden; en (2) ze sturen de keuze van regio's van belang voor 3D-STORM-acquisitie. Belangrijk is dat de confocale beelden niet de resolutie hebben om intrafibrillaire versus extrafibrillaire mineralisatie te onderscheiden. Let op dat het mineraalsignaal continu lijkt langs de fibrillen zonder te onthullen of het binnen of buiten is. Deze beperking onderstreept de noodzaak van de hier beschreven superresolutie-benadering.

Figuur 6 toont twee controle-experimenten. Figuur 6A (geen primaire antistofcontrole) toont geen specifiek signaal wanneer alleen het secundaire antilichaam wordt aangebracht, wat bevestigt dat de waargenomen signalen in gelabelde monsters niet het gevolg zijn van niet-specifieke secundaire antistofbinding. Figuur 6B (ongekleurde controle) toont geen fluorescentiesignaal (volledig zwart), waarmee significante autofluorescentie van het monster of substraat wordt uitgesloten. Deze controles zijn essentieel voor het valideren van de specificiteit van de immunofluorescentielabeling. Elk detecteerbaar signaal in deze bedieningen zou aangeven dat blokkerings- of wasstappen aangepast moeten worden.

Onder onze geoptimaliseerde beeldomstandigheden bereikte het 3D-STORM-systeem een typische lokalisatieprecisie van 20–30 nm lateraal en 50–60 nm axial, in overeenstemming met de oorspronkelijke 3D-STORM-literatuur²⁵. Driftcorrectie werd uitgevoerd tijdens de nabewerking met behulp van het ingebouwde redundante kruiscorrelatie (RCC) algoritme, waardoor exogene fiduciale markers²³ niet meer nodig zijn. Voor fasetoewijzing werd ACP toegewezen op 30 minuten mineralisatie en HAP op 6 uur, gebaseerd op de vastgestelde rijpingskinetika. Het vermogen om deze twee fasen temporeel te onderscheiden, gecombineerd met nanoschaallokalisatie, stelt onderzoekers in staat de dynamiek van intrafibrillaire mineraaltransformatie te bestuderen.

Samenvattend tonen de representatieve resultaten aan dat dit protocol nanoschaal onderscheid maakt tussen intrafibrillaire en extrafibrillaire mineralisatie in een recombinant collageenmodel, met kwantitatieve colocalisatie-metrics en passende negatieve controles. De methode is bijzonder waardevol voor onderzoekers die biomineralisatiemechanismen, biomimetische materialen en botweefselengineering bestuderen.

Aanvullende Tabel 1 vat de veelvoorkomende problemen samen die tijdens de mineralisatie- en STORM-beeldvormingsprocedures worden ondervonden, samen met hun mogelijke oorzaken en aanbevolen oplossingen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Figuur 1: Multicolor 3D-STORM reconstructie van gemineraliseerde collageenfibrillen. Collageen (rood, ver-rood fluorescerende kleurstof) en chondroïtinesulfaat (GAG, blauwe, rode fluorescerende kleurstof) worden gelijktijdig afgebeeld. Colokalisatie van collageen en GAG verschijnt als magenta in het samengevoegde kanaal, en gebieden waar alle drie overlappen lijken wit. Amorf calciumfosfaat (ACP, groen, calciumindicatorkleurstof) wordt ook getoond. ACP wordt waargenomen binnen de grenzen van collageenfibrillen, wat wijst op intrafibrillaire lokalisatie. Schaalbalk: 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: 3D-STORM-beeldvorming van intrafibrillaire hydroxyapatiet (HAP) mineralisatie. (A) 2D STORM-beelden van collageen (rood, verrood fluorescerende kleurstof), HAP (groen, calciumindicatorkleurstof) en samengevoegd kanaal. (B) 3D-volumereconstructie. (C) Z-as slice-analyse met intervallen van 60 nm (Z = −120, −60, 0, +60, +120 nm). Het persistent HAP-signaal in de centrale slices (Z = 0 tot ±120 nm) voldoet aan de classificatiecriteria voor intrafibrillaire mineralisatie (intensiteit ≥50% van maximum). Kwantitatieve colocalisatie berekend op basis van deze figuur: Pearson's r = 0,89 ± 0,04, Mander's overlap = 0,91 ± 0,03. Schaalbalken: 0,1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) validatie van zelfgeassembleerde collageenfibrillen. Collageenfibrillen werden gekleurd met 1% fosfhotungstisch zuur (pH 7,0). Het diagnostische 67 nm D-periodiek crossbandingpatroon bevestigt succesvolle fibrillogenese en structurele integriteit. Schaalbalk: 200 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Representatief negatief resultaat: extrafibrillaire mineralisatie. Collageen (rood, ver-rood fluorescerende kleurstof) en HAP (groen, calcium-indicatorkleurstof). HAP zet zich uitsluitend af op het glassubstraat buiten de collageenfibrillen, zonder intrafibrillaire invasie. Deze suboptimale uitkomst wordt als negatieve controle opgenomen om het bereik van mogelijke resultaten te illustreren. Schaalbalk: 0,1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve confocale beelden gebruikt voor voorlopige screening. (A) Het collageenkanaal (rood, ver-rood fluorescerende kleurstof) toont een duidelijk fibrillair netwerk. (B) HAP (groen, calcium indicator dye) kanaal toont minerale associatie. (C) De samengevoegde afbeelding toont colocalisatie van collageen en HAP. Schaalbalk = 2 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Controle-experimenten. (A) Geen primaire antilichamencontrole: alleen secundaire antistoffen toegepast; Geen specifiek signaal. (B) Ongekleurde controle: geen fluorofoor of antilichaam aangebracht; Geen fluorescentiesignaal (volledig zwart). Schaalbalk = 1 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Handleiding voor probleemoplossing. Veelvoorkomende problemen die worden ondervonden tijdens mineralisatie en 3D-STORM acquisitie/analyse, samen met hun mogelijke oorzaken en aanbevolen oplossingen. Zie tekst voor gedetailleerde stapnummers. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Dit protocol biedt een uitgebreide workflow voor nanoschaalvisualisatie van collageenmineralisatie met behulp van multicolor 3D-STORM. Verschillende cruciale stappen vereisen bijzondere aandacht om succesvolle resultaten te garanderen.

Ten eerste is de voorbereiding van monsters essentieel voor hoogwaardige STORM-beeldvorming. De amino-silanisatie van glazen bodemschalen moet grondig zijn om een stabiele hechting van collageenfibrillen te waarborgen tijdens het volgende wassen en labelen. Resterende APTES kunnen niet-specifieke binding en hoge achtergrond veroorzaken, terwijl onvolledige silanisatie kan leiden tot fibrillenloslating. De aanbevolen ultrasonicatiestap (10 minuten bij 40 kHz) verwijdert effectief ongebonden silaan terwijl de oppervlaktefunctionaliteit behouden blijft. Voor het kruisbinden van collageenvezels wordt EDC/NHS^{aanbevolen voor} hoge specificiteit. Alternatief kan 0,1% glutaraldehyde worden gebruikt (30 minuten incuberen op kamertemperatuur, daarna grondig wassen), maar dat is minder specifiek. Cruciaal is dat we aanraden om de juiste fibrillenvorming met TEM te verifiëren voordat we beginnen met mineralisatie. Zoals getoond in Figuur 3 bevestigt de aanwezigheid van het karakteristieke 67 nm D-periodieke bandpatroon dat het zelfassemblageproces structureel intacte, inheemse collageenfibrillen²⁶ heeft geproduceerd. Deze kwaliteitscontrolestap voorkomt verkeerde interpretatie van resultaten die voortkomen uit slecht gevormde of gedenatureerde collageensteigers.

Ten tweede moet het mineralisatiemedium worden voorbereid met nauwkeurige pH-controle (7,4 ± 0,1) en onmiddellijk worden gebruikt. De amorfe calciumfosfaat (ACP) precursor is zeer gevoelig voor pH en ionensterkte; Kleine afwijkingen kunnen voortijdige kristallisatie veroorzaken. Daarom moet het mineralisatiemedium direct na de voorbereiding worden gebruikt. Voor studies die vergelijkingen vereisen over meerdere tijdstippen, bereid voor elk experiment een nieuw medium voor in plaats van opgeslagen oplossingen te gebruiken. Wanneer mineralisatiecondities niet goed worden gecontroleerd (bijvoorbeeld onvoldoende polyasparinzuur of een verkeerde pH), overheerst extrafibrillaire mineralisatie, zoals weergegeven in Figuur 4. In deze negatieve controle zet HAP zich uitsluitend af op het glassubstraat buiten de collageenfibrillen, zonder intrafibrillaire invasie. De opname van dergelijke negatieve resultaten is essentieel om te valideren dat het intrafibrillaire signaal dat in Figuur 1 en Figuur 2 wordt waargenomen inderdaad te wijten is aan gecontroleerde intrafibrillaire mineralisatie en niet aan niet-specifieke neerslag of onvolledige was. Bovendien hebben eerdere studies benadrukt dat het onderscheiden van intrafibrillaire en extrafibrillaire mineralisatie zorgvuldige controle vereist van de lokale chemische omgeving en de aanwezigheid van stabiliserende additieven zoals polyasparaginezuur²⁷.

Ten derde vereist immunofluorescentielabeling zorgvuldige optimalisatie. De antistofconcentratie (1:100) die wordt geleverd, werkt goed voor het beschreven collageen- en chondroïtinesulfaatsysteem, maar kan titratie vereisen voor verschillende antilichamen of monstertypes. Neem altijd controles zonder primaire antistoffen op om autofluorescentie en niet-specifieke binding te beoordelen. Vanaf de stap secundair antilichaam is strikte lichtbescherming essentieel om fluorofoorfotobleaching te voorkomen.

Ten vierde moet de STORM-beeldbuffer vers worden voorbereid en binnen 30 minuten worden gebruikt. Het zuurstofopvangsysteem (glucoseoxidase/catalase) verliest na verloop van tijd activiteit, en cysteamine is zowel lichtgevoelig als zuurstofgevoelig. Het vooraf aliquoteren van enzymvoorraden en het opslaan ervan bij -80 °C zorgt voor consistente prestaties over alle experimenten heen. De knipperdichtheid moet in realtime worden gemonitord en aangepast door het 405 nm laservermogen te moduleren; te weinig moleculen verlengen de opnametijd, terwijl te veel leiden tot overlappende PSF's en verminderde lokalisatieprecisie. Voor gedetailleerde optimalisatie van STORM-beeldvormingsparameters verwijzen we lezers naar gevestigde testvoorbeeldprotocollen¹⁵.

Ten vijfde vereist gegevensverwerking gestandaardiseerde parameters voor betekenisvolle vergelijkingen tussen steekproeven. De minimale drempel voor fotonentelling (typisch 500-1000 fotonen) sluit localisaties met weinig vertrouwen uit. Als de steekproefsignalen zwak zijn, kan het mogelijk worden teruggebracht tot 300 fotonen, maar het wordt niet aanbevolen om onder de 200 fotonen te gaan. Driftcorrectie met fiduciale markers of kruiscorrelatie-algoritmen is essentieel om resolutie te behouden, vooral voor 3D-reconstructies²⁸. Spectrale unmixing helpt crosstalk tussen kanalen te elimineren, wat cruciaal is voor nauwkeurige colokalisatie-analyse. Het oplossen van veelvoorkomende problemen wordt beschreven in Aanvullende Tabel 1.

Het protocol heeft verschillende beperkingen. Het is geoptimaliseerd voor biomimetische in vitro modellen; Toepassing op inheemse, sterk gemineraliseerde weefsels (bijvoorbeeld volwassen bot) kan extra stappen vereisen, zoals ontkalking of agressievere antigeenextractie, wat de ultrastructuur kan beïnvloeden. Afhankelijkheid van specifieke antilichamen kan problemen met labelingsdichtheid of sterische belemmering veroorzaken, vooral in dicht opeengepakte structuren. De techniek is apparatuurintensief en vereist toegang tot een geavanceerde STORM-microscoop met geschikte laserlijnen en een EMCCD-camera. Daarnaast kan de totale benodigde tijd (~53 uur van monstervoorbereiding tot data-analyse) de doorvoersnelheid voor sommige toepassingen beperken.

Ondanks deze beperkingen biedt dit protocol aanzienlijke voordelen ten opzichte van alternatieve methoden. In vergelijking met elektronenmicroscopie biedt het moleculaire specificiteit door immunofluorescentielabeling, waardoor gelijktijdige visualisatie van meerdere organische en anorganische componenten mogelijk is. In vergelijking met confocale microscopie bereikt het ~10 keer een hogere ruimtelijke resolutie, waardoor het onderscheid kan worden gemaakt tussen intrafibrillaire en extrafibrillaire mineralisatiepatronen. De 3D-mogelijkheid levert volumetrische informatie die essentieel is voor het begrijpen van de minerale distributie binnen de collageenmatrix.

De methode heeft brede toepassing in biomineralisatieonderzoek. Potentiële toepassingen zijn onder meer het bestuderen van de rol van niet-collageeneiwitten bij minerale nucleatie, het evalueren van biomimetische materialen voor botregeneratie, het onderzoeken van pathologische mineralisatie bij ziekten zoals osteoporose en tandcariës, en het beoordelen van de effecten van therapeutische interventies op de verspreiding van mineralen. Met passende aanpassingen kan het protocol worden aangepast om andere organisch-anorganische interfaces in weefsels of biomaterialen te bestuderen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Polyaspartic acid (p-Asp)	Sigma-Aldrich	P9903	Stabilizer for amorphous calcium phosphate
Calcium chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Calcium source
Sodium phosphate dibasic (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S0876	Phosphate source
Sodium chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888	Ionic strength adjuster
Polyacrylic acid (PAA)	Sigma-Aldrich	323667	Stabilizer for high-concentration calcium
Tris base	Sigma-Aldrich	T1503	Buffer component
Sodium azide (NaN3)	Sigma-Aldrich	S2002	Antimicrobial agent
(3-Aminopropyl)triethoxysilane (APTES)	Sigma-Aldrich	440140	Glass surface functionalization agent
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	459836	Solvent
Type I collagen solution (50 μg/mL in 0.1 M acetic acid)	Corning	354249	Self-assembly scaffold
Chondroitin sulfate (CS)	Sigma-Aldrich	C9819	Non-collagenous protein mimic
EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)	Sigma-Aldrich	E7750	Crosslinker
NHS (N-hydroxysuccinimide)	Sigma-Aldrich	130672	Crosslinker activator
MES free acid	Sigma-Aldrich	M5287	Buffer for crosslinking
Phosphate-buffered saline (PBS)	Gibco	10010023	Washing and dilution buffer
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A3059	Blocking agent
Rabbit anti-collagen-I antibody	Abcam	ab34710	Primary antibody for collagen
Mouse anti-chondroitin sulfate antibody	Sigma-Aldrich	C8035	Primary antibody for CS
Goat anti-rabbit IgG conjugated to far-red fluorescent dye (Alexa Fluor 647)	Thermo Fisher Scientific	A-21244	Secondary antibody for collagen
Goat anti-mouse IgM conjugated to red fluorescent dye (Alexa Fluor 568)	Thermo Fisher Scientific	A-11031	Secondary antibody for CS
Calcein (calcium indicator dye)	Sigma-Aldrich	C0875	Calcium phosphate label
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379	Detergent for washing buffer
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	Imaging buffer component
Glucose oxidase (GOx)	Sigma-Aldrich	G7141	Oxygen scavenger
Catalase	Sigma-Aldrich	C1345	Oxygen scavenger
Cysteamine (MEA)	Sigma-Aldrich	M6500	Thiol for fluorophore blinking
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G6152	Substrate for glucose oxidase
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S2889	Buffer for GOx stock
Hydrochloric acid (HCl)	Sigma-Aldrich	320331	pH adjustment
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	71690	pH adjustment
Phosphotungstic acid	Sigma-Aldrich	P4006	Negative stain for TEM
Glass-bottom culture dishes (35 mm, #1.5H)	MatTek	P35G-1.5-14-C	Sample substrate; thickness 0.17 mm
Ultrasonic cleaner (40 kHz)	Branson	B200	Cleaning device
Humidity chamber	Thermo Fisher Scientific	11-432-10	For collagen self-assembly
Transmission electron microscope	Hitachi	HT7800	TEM imaging
Formvar/carbon-coated TEM grids (200 mesh)	Sigma-Aldrich	FCF200-Cu	TEM sample support
Horizontal shaker platform	Labnet	S2030-RC	Gentle washing
Confocal laser scanning microscope	Nikon	A1	Preliminary screening
3D-STORM microscope system (with 405/488/647 nm lasers, cylindrical lens, EMCCD)	Nikon	N-STORM	Super-resolution imaging
100× oil immersion objective (NA 1.49)	Nikon	MRD01991	High-resolution imaging
pH meter	Mettler Toledo	FiveGo F2	pH control
STORM acquisition and analysis software	Nikon	NIS-Elements (STORM module)	STORM data acquisition and processing
.nd2 file format (raw microscopy image file)	Nikon	N/A	Raw image file format generated by Nikon microscopes.
Publicly available image analysis software	Open source	N/A	e.g., ImageJ with ThunderSTORM plugin for single-molecule localization analysis (colocalization, drift correction)
Parafilm	Bemis	PM996	Sample covering during incubation
Aluminum foil	Any laboratory supplier	N/A	For light protection (e.g., wrapping samples)
Amber microcentrifuge tubes	Fisher Scientific	05-669-21	For light protection of fluorophores
Coverslips (No. 1.5)	Corning	2855-18	Sample mounting