Methodenartikel

Multiplexe fluorescerende mRNA in situ hybridisatie van zich ontwikkelende craniofaciale weefsels in FFPE-muismonsters

DOI:

10.3791/71475

⸱

8 mei 2026

 ,  , 
1Center for Engineering in Medicine and Surgery, Department of Surgery, Massachusetts General Hospital, 2Department of Surgery, Harvard Medical School, 3Shriners Hospital for Children, 4Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Conventionele in situ hybridisatie heeft moeite om mRNA in craniofaciale weefsels te visualiseren vanwege complexe architectuur, hoge achtergrond, beperkte specificiteit van de probe en gevoeligheid. Dit protocol beschrijft een multiplex fluorescerende RNA in situ hybridisatiemethode voor gevoelige, specifieke detectie van meerdere mRNA-doelen in FFPE-muisembryonale craniofaciale weefsels, waarbij eerdere beperkingen worden overwonnen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Craniofaciale ontwikkeling is afhankelijk van de gecoördineerde activiteit van diverse, gespecialiseerde celpopulaties die interacteren binnen ingewikkelde weefselarchitecturen om de normale weefselstructuur en -functie te vormen en te behouden. Het begrijpen hoe deze cellen met elkaar en met hun lokale microomgeving communiceren is essentieel om de moleculaire mechanismen te definiëren die hun vorming en homeostase reguleren. Verstoring van deze processen kan leiden tot aangeboren craniofaciale aandoeningen, waaronder tandagenese, gespleten gehemelte en gespleten lip, hetzij alleen of als onderdeel van syndromische aandoeningen. Hoewel kwantitatieve technieken zoals RT-PCR een hoge gevoeligheid en dynamisch bereik bieden, vereisen ze RNA-extractie uit gehomogeniseerd weefsel, wat resulteert in verlies van ruimtelijke en cellulaire context, een bijzonder cruciale beperking voor heterogene craniofaciale weefsels, waar de cellulaire oorsprong van transcripten niet kan worden vastgesteld. Multiplexe fluorescerende RNA-hybridisatie in situ overwint deze beperking door gevoelige en specifieke detectie van meerdere mRNA-transcripten mogelijk te maken, terwijl de weefselarchitectuur behouden blijft. Deze geavanceerde aanpak maakt precieze lokalisatie van genexpressie op cellulair niveau mogelijk, wat waardevolle inzichten biedt in de ruimtelijke regulatie van ontwikkelingsprocessen en ziektemechanismen in de craniofaciale biologie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR) is de gouden standaard voor genexpressie-analyse vanwege de hoge gevoeligheid en brede dynamische bereik; het vereist echter RNA dat uit gehomogeniseerde weefsels wordt gehaald, wat resulteert in verlies van ruimtelijke en cellulaire context1. Deze beperking is vooral problematisch voor heterogene weefsels zoals craniofaciale weefsels tijdens embryonale ontwikkeling, waar de cellulaire bron van gedetecteerde transcripten niet kan worden opgehelderd. RNA in situ hybridisatie (ISH), een techniek die in 1968 werd ontwikkeld door Joseph Gall en Mary Lou Pardue, overwint deze beperking door de lokalisatie van mRNA-expressie binnen intacte weefselarchitectuur2 mogelijk te maken. Desalniettemin is conventioneel RNA ISH technisch veeleisend en sterk afhankelijk van optimale weefselfixatie en monstervoorbereiding om RNA-integriteitte behouden 3. Deze uitdagingen worden verergerd bij sterk verkalkte weefsels, die ontkalkingsprocedures vereisen die vaak agressieve chemicaliën of langdurige verwerking vereisen, wat leidt tot RNA-afbraak. Daarom vereist RNA ISH in craniofaciale weefsels, die complexe mengsels van celtypen omvatten, zorgvuldige optimalisatie en technische expertise, is het tijdrovend en brengt het een aanzienlijk risico op suboptimale kleuring met zich mee. De uitdaging om mRNA-expressie te visualiseren is nog duidelijker in tandweefsels, die een zeer complexe structuur en samenstelling hebben. Tanden bestaan uit gemineraliseerde componenten zoals glazuur, dentine, cement en omringend bot, naast zachtere weefsels zoals de pulpa en het parodontale ligament. Deze weefsels worden bevolkt door een diverse reeks celtypen die een cruciale rol spelen in de tandontwikkeling4. Deze kenmerken vereisen zorgvuldige standaardisatie om betrouwbare signaaldetectie te garanderen. Als gevolg hiervan is het beschreven protocol bijzonder geschikt voor het onderzoeken van genexpressie tijdens ontwikkelings- en postnatale stadia van tandvorming.

Er bestaan multiple fluorescentie in situ hybridisatie (FISH)-gebaseerde technieken voor ruimtelijke RNA-detectie, waaronder probe-gebaseerde amplified RNA FISH 5,6,7,8,9, hybridisatiekettingreactie FISH 6, enkelmolecuul RNA FISH 10, signaalversterking door uitwisselingsreactie FISH 5, en sterk gemultiplexeerde FISH-platforms zoals MERFISH11 en seqFISH12,13. Onder deze wordt multiplex fluorescerende RNA ISH 7,8,9 veel gebruikt vanwege de hoge gevoeligheid bij het detecteren van een enkel RNA-molecuul, als gevolg van het dubbele Z-probe ontwerp, waarbij twee aangrenzende probes moeten hybridiseren met de doelsequentie om signaalversterking te initiëren. Dit dubbele herkenningsontwerp verbetert de specificiteit aanzienlijk en vermindert het signaal van het off-target signaal. De methode ondersteunt multiplexdetectie van 2–4 doelen (uitbreidbaar tot 12 of meer doelen met vergelijkbare technieken), behoudt weefselmorfologie en is compatibel met formaline-gefixeerd paraffine-ingebed (FFPE)7,8,9, versbevroren en geselecteerd verkalkt weefsel, waardoor het geschikt is voor complexe monsters zoals die bij craniofaciale en tandheelkundige ontwikkeling. De methode is gestandaardiseerd, reproduceerbaar, ondersteund door goed gevestigde probebibliotheken en breed gevalideerd, wat zorgt voor toegankelijke en betrouwbare resultaten in diverse laboratoria.

Multiplex fluorescent RNA ISH maakt gebruik van meerdere probes die zich richten op verschillende gebieden van hetzelfde transcript, gecombineerd met verbeterde signaalversterking, waardoor zeer gevoelige en specifieke detectie mogelijk is, zelfs bij mRNA's met lage abundantie of gedeeltelijk afgebroken14,15. Hoewel multiplex fluorescerende RNA ISH met succes is toegepast op ontkalkte botmonsters16, en het gebruik ervan in complexe craniofaciale weefsels eerder is gerapporteerd 7,8,9; Er is echter nog geen gedetailleerd stapsgewijs protocol dat de toepassing in deze context beschrijft.

Craniofaciale structuren bestaan uit ingewikkelde weefselarchitecturen met diverse celtypen, waaronder osteoblasten, osteoklasten, osteocyten, ameloblasten, odontoblasten, fibroblasten, stamcellen, immuuncellen, vaaten en sensorische neuronen, waarvan de ruimtelijk gecoördineerde interacties essentieel zijn voor weefselvorming, functie, regeneratie en immunologische bescherming4. Het bestuderen van gelokaliseerde genexpressies in deze weefsels is daarom cruciaal, en multiplex fluorescerende RNA ISH vormt een toonaangevende benadering voor dergelijke analyses.

In deze studie beschreven we hoe multiplex fluorescerende RNA ISH op basis van RNAscope-probes en technologie toegepast kon worden om complexe craniofaciale weefsels te bestuderen (Figuur 1). Daarnaast hebben we een geoptimaliseerde FFPE-sectieworkflow opgezet die de integriteit van RNA behoudt en hoogwaardige, ruimtelijk opgeloste genexpressie-analyse mogelijk maakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de National Institutes of Health, National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (IACUC), onder Animal Study Protocol #24-031.

1. Getimede paring en het verzamelen van embryoweefsel

  1. Zet getimede paringen op.
    1. Koppel een gezonde, vruchtbare mannelijke en vrouwelijke Mus musculus in de late namiddag. Controleer de volgende ochtend op de aanwezigheid van een vaginale plug. Wijs de dag aan waarop een plug wordt waargenomen als embryonale dag (E) 0,5.
  2. Euthanaser de zwangere vrouw.
    1. In de gewenste ontwikkelingsfase wordt de zwangere vrouwelijke muis geëuthanaseerd via CO₂-inademing gevolgd door een cervicale ontwrichting, in overeenstemming met de richtlijnen voor de institutionele dierenzorg.
    2. Leg de muis op zijn rug op een steriel absorberend oppervlak. Desinfecteer het buikgebied met 70% ethanol langs de bedoelde incisieplaats.
  3. Blootstelling en isoleer de baarmoederhoorns.
    1. Maak een incisie in de buik in het midden met een steriele chirurgische schaar, en open vervolgens de peritoneale wand met microchirurgische schaar om de baarmoederhoorns bloot te leggen.
    2. Gebruik een stompe tang om de baarmoederketen voorzichtig naar buiten te brengen. Laat het baarmoederweefsel langs het myometrium los en snijd de eileider en de mediane baarmoederhoornaanhechting door om de embryo's te isoleren.
  4. Hele embryo's overbrengen.
    1. Breng onmiddellijk de baarmoederketen met embryo's over in een 10 cm petrischaal met ijskoude, steriele 1× PBS (pH 7,4).
  5. Ontleed individuele embryo's.
    1. Scheid elk embryo zorgvuldig van het omliggende baarmoeder-, amnion- en chorionmembranen.
    2. Breng de gereinigde embryo's over in een verse schaal van 10 cm met ijskoude, steriele PBS.
  6. Ontleed de embryonale koppen van muizen.
    1. Met een steriel chirurgisch mes ontleed je de koppen en spoel je de gedissectiede koppen één keer af in ijskoude PBS voordat je verder wordt verwerkt.
      OPMERKING: Verzamel en ontleed de neonatale muizen in de gewenste ontwikkelingsfase volgens het dierprotocol.

2. Fixatie en verwerking van weefsel

  1. Herstel het weefsel.
    1. Dompel het dissecte weefsel onmiddellijk onder in 10% neutrale gedempte formaline en doop het 's nachts op kamertemperatuur op een shaker.
      OPMERKING: Een juiste conservering van RNA is cruciaal voor het succes van in situ hybridisatie-analyses. Talrijke studies hebben aangetoond dat de standaardmethode—het fixeren van weefselmonsters in 10% neutrale gebufferde formaline voor duurs van 6 tot 48 uur, afhankelijk van de specifieke grootte en leeftijd van het weefsel—betrouwbare resultaten oplevert voor RNA-behoud 16,17,18,19. Voor eerdere embryonale stadia (E12.5 en lager) is de penetratie van het fixatiemiddel snel en moet de fixatietijd dienovereenkomstig worden verkort om overfixatie te voorkomen. Vanaf embryonale dag 17.5 (E17.5) en ook in postnatale monsters kan de penetratie van het fixatiem minder efficiënt zijn vanwege de aanwezigheid van huid op het hoofd, die als fysieke barrière fungeert. Daarom moet de huid van de hele kop worden verwijderd om efficiënt de fixatieoplossing te kunnen penetreren. Decalcificatie kan worden uitgevoerd in 0,5 M EDTA (pH 8,0) met 0,5% methanolvrije formaldehyde bij 4 °C7. De duur van decalcificatie kan worden gemonitord met een snelle microCT-scan en kan worden aangepast afhankelijk van de mate van mineralisatie en het specifieke weefseltype; voor E18.5-embryo's is 24–48 uur meestal voldoende.
  2. Spoel en verwerk het weefsel.
    1. Verwijder het fixatiemiddel en spoel de monsters af met PBS. Plaats het weefsel op 70% ethanol en bewaar het bij 4 °C tot verdere verwerking (1–4 weken)20. Voer weefseldehydratie, clearing en paraffine-infiltratie uit met een geautomatiseerde weefselprocessor volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Het typische weefselverwerkingsprotocol is het volgende: 70% ethanol gedurende 30 minuten, gevolgd door 95% ethanol voor 30 minuten (2 keer), en 100% ethanol voor 30 minuten (3 keer) voor dehydratatie; Verwijdering in xyleen gedurende 1 uur (3 keer), en vervolgens infiltratie met paraffinewas bij 60 °C gedurende 1 uur (3 keer) voordat het in paraffineweefselblokken wordt ingebed.
  3. Inbed het weefsel.
    1. Plaats de koppen in paraffine en oriënteer de monsters in het coronale of sagittale vlak, afhankelijk van de experimentele vereisten.
    2. Breng de ingebedde blokken over op een paraffineblok koudplaat zodat de was ongeveer 30 minuten kan uitharden, waarbij de timing indien nodig wordt aangepast op basis van de blokgrootte.
  4. Bewaar de FFPE-blokken.
    1. Laat de paraffine volledig stollen. Haal blokken uit mallen, doe ze in gelabelde luchtdichte containers of ziplockzakken en bewaar ze op 4 °C tot ze klaar zijn om te snijden.
      OPMERKING: FFPE-blokken met goed bewaard RNA kunnen meerdere jaren worden opgeslagen vóór het doorsnijden zonder de weefselintegriteit te compromitteren.

3. Verwerking van FFPE-weefsel voor multiplex fluorescerend RNA ISH

  1. Bereid een werkruimte voor zonder RNase.
    1. Desinfecteer alle werkoppervlakken en instrumenten met 70% ethanol. Behandel oppervlakken, gereedschap en handschoenen met een RNase-ontsmettingsoplossing om RNA-afbraak te minimaliseren.
    2. Stel de microtome in en plaats een nieuw mes. Stel de vrijingshoek in op 10°. Behandel pincetten en borstels met een RNase-ontsmettende oplossing voordat je ze gebruikt.
      OPMERKING: Gebruik altijd een nieuw mes voor het snijden om precieze weefselsneedes te verkrijgen. De bladhoek heeft een aanzienlijke invloed op de kwaliteit van de doorsnede, de integriteit van het weefsel, de uniformiteit van de dikte en het behoud van morfologische kenmerken.
  2. Maak het waterbad klaar.
    1. Vul een drijfwaterbad met ultrazuiver laboratoriumwater.
    2. Pas de temperatuur aan tussen 40–43 °C naar behoefte, afhankelijk van het embryonale stadium en de weefselkenmerken.
  3. Knip en monteer het FFPE-blok.
    1. Verwijder overtollig paraffine rond het ingesloten weefsel. Koel het FFPE-blok af op ijs en monteer het op het microtome cold stage.
  4. Beperk tot het interessegebied.
    1. Lijn het paraffineblokvlak uit met het microtoomblad en trim bij 12 μm stappen totdat het interessegebied (bijvoorbeeld het aangrenzende kies- of snijtand) in coronale secties verschijnt.
    2. Herplaats het blok en het lemmet indien nodig voor symmetrische, correct georiënteerde coronale of sagittale secties van de hele kop.
  5. Snijd het weefsel in een sneep.
    1. Zodra het interessegebied is bereikt, snijd je 5–7 μm doorsneden. Laat de delen van het waterbad drijven voor zachte ontspanning en platdruk voordat je ze op de glijbaan overzet.
  6. Monteer en droog de secties.
    1. Bevestig de secties op positief geladen glazen slides. Bekijk de preparaten onder een lichtmicroscoop om de juiste oriëntatie en weefselintegriteit te bevestigen.
    2. Droog de glaasglaasjes op een glaasverwarmer bij 40 °C 's nachts voordat je de multiplex fluorescent RNA ISH-assay uitvoert.

4. Dag 1: Deparaffinisatie en rehydratatie

  1. Bak de dia's.
    1. Bak de dia's met FFPE-secties 1 uur op 60 °C.
      OPMERKING: Als de glaasje niet direct wordt gebruikt, bewaar hem dan 1–4 weken zonder gebakken kamertemperatuur (RT) met droogmiddelen. Langdurige opslag kan leiden tot RNA-afbraak.
  2. Balanceer de slides.
    1. Laat het FFPE-weefselglaasje 10 minuten in evenwicht komen bij kamertemperatuur (RT).
  3. Deparaffiniseer en rehydrateer de secties.
    1. Dompel de glaasjes onder in xyleen of een xyleenvervanger met zachte beweging gedurende 5–10 minuten bij RT. Herhaal deze stap één keer om het paraffine volledig te verwijderen.
      OPMERKING: Werk met xyleen moet worden uitgevoerd in een chemische afzuigkap. Als een laag-toxiciteit xyleenvervanger wordt gebruikt, kan deze buiten de chemische dampkap worden gebruikt.
    2. Zet de glaasjes over in 100% ethanol en incubeer ze 2 minuten bij RT. Herhaal één keer om de resterende xyleen te verwijderen. Rehydrateer de secties in 70% ethanol gedurende 2 minuten.
    3. Spoel de secties 3 keer af met PBS. Voeg dan een druppel PBS toe die voldoende is om de secties volledig te bedekken en ga direct door naar de volgende stap.

5. Multiplexe fluorescerende RNA ISH op FFPE-weefselsecties

OPMERKING: Deze studie volgde de instructies van de fabrikant voor het uitvoeren van de multiplex fluorescent RNA ISH op FFPE-weefseldoorsneden met RNAscope-technologie21.

  1. Dag 1: Voorbehandeling en probe-hybridisatie
    1. Teken een hydrofobe barrière.
      1. Met een barrièrepen tekent u een hydrofobe barrière rond elk weefselsegment. Laat de glaasjes ongeveer 10 minuten aan de lucht drogen bij kamertemperatuur (RT).
      2. Zorg ervoor dat weefselsecties altijd bedekt blijven met PBS om uitdrogen te voorkomen.
        OPMERKING: Gebruik een pluisvrije doek (lensdoek) om de glaasglaasje rond het tissue te drogen terwijl het weefsel gehydrateerd blijft. Zorg ervoor dat de barrière-inkt niet in contact komt met het weefselgedeelte.
    2. Voer voorbehandeling uit.
      1. Breng het op maat gemaakte voorbehandelingsreagens aan om elk deel volledig te bedekken. Incubeer de glaasjes 30 minuten bij 40 °C in een bevochtigde kamer die in een hybridisatieoven is geplaatst.
        OPMERKING: Voor alle reagentia die in druppelflessen worden geleverd, voeg voldoende druppels toe om het gedeelte binnen de barrière volledig te bedekken. Zorg ervoor dat alle reagentia vóór gebruik naar RT worden gebracht.
    3. Spoel de secties af.
      1. Spoel de secties meerdere keren af met PBS en incubeer dan 2 minuten in verse PBS bij RT.
        OPMERKING: Gebruik een 5 mL transferpipet om elke diaa afzonderlijk te wassen met PBS. Zorg dat de secties tijdens de 2 minuten lange wasbeurt volledig bedekt blijven met PBS.
    4. Afkoelen van endogene peroxidaseactiviteit.
      1. Breng 3% waterstofperoxide aan op elk gedeelte en incubeer 10 minuten bij RT om endogene peroxidaseactiviteit te blokkeren.
    5. Herhaal de was.
      1. Was de dia's 2 minuten in PBS bij RT. Herhaal het twee keer.
    6. Maak de sondes klaar.
      1. Verwarm de sondes 10 minuten op 40 °C. Laat de probes afkoelen tot RT voordat je ze gebruikt.
    7. Maak het probemengsel klaar.
      1. De C1-probe wordt geleverd als een werkende oplossing van 1×; Gebruik dit direct.
      2. Ter vergelijking: C2-, C3- en C4-probes worden geleverd als 50×concentraten; verdun deze probes met de C1-probeoplossing. Als de C1-probe niet wordt gebruikt, verdun dan C2-, C3- en/of C4-probes met de probe-verdunningsmiddel die door de fabrikant wordt geleverd.
    8. Hybridiseer de sondes.
      1. Breng 30–40 μL probemengsel aan op elke weefselsectie, zodat volledige dekking wordt gegarandeerd. Incubeer de glaasjes 2 uur bij 40 °C in een bevochtigde kamer in de hybridisatieoven.
        OPMERKING: Bij het leren van de RNAscoop-techniek wordt aanbevolen om zowel negatieve als positieve controleprobes te gebruiken tijdens testruns. Deze aanpak helpt de assay te valideren en de kwaliteit van de procedure te bevestigen. Een mogelijke beperking waar je rekening mee moet houden, is dat sommige door de fabrikant geleverde positieve controleprobes mogelijk niet in het weefsel van interesse worden uitgedrukt. Om dit aan te pakken, kunnen celtype-specifieke probes worden gebruikt. Col1a1 is bijvoorbeeld een betrouwbare positieve controle voor bindweefsel. Kleuring op Col1a1 (of een ander gen met bekende hoge expressie) kan worden uitgevoerd als eerste stap om RNA-behoud en weefselmorfologie in de monsters te beoordelen. Zodra de vaardigheid van de techniek is bereikt, worden negatieve controles meestal uitgevoerd door dia's zonder probes te verwerken, maar ze met alle andere oplossingen te behandelen. Deze methode levert cruciale informatie over het achtergrondsignaal in alle detectiekanalen. De standaard Multiplex V2-kit maakt gelijktijdige kleuring en beeldvorming van maximaal vier verschillende probes mogelijk. Wanneer de genexpressieniveaus zijn vastgesteld via eerdere transcriptomics-studies, is het raadzaam om genen met lage expressie toe te wijzen aan de Cy5- en Cy7-kanalen. Genen die sterk tot expressie komen, moeten in de GFP- en RFP-kanalen worden geplaatst voor optimale detectie. In gevallen waarin geen van de probes genen met hoge expressie aanspreekt, moet het GFP-kanaal ongebruikt blijven. Hierdoor kan het GFP-kanaal dienen als referentie voor achtergrondsubtractie van het RFP-kanaal, waardoor de nauwkeurigheid van signaaldetectie voor doelen met lage expressie verbetert.
    9. Spoel af met een wasbuffer.
      OPMERKING: De commercieel verkrijgbare 20× Wash Buffer werd voor gebruik verdund tot 1× met RNase-vrij water.
      1. Was de slides 2 minuten bij RT in de 1× Wash Buffer die bij de kit wordt geleverd. Herhaal het twee keer.
    10. Incubeer in een 5x zoutoplossing-natriumcitraat (SSC) buffer.
      OPMERKING: Commercieel verkrijgbare 20× SSC Buffer (3 M NaCl, 0,3 M natriumcitraat, pH 7,0) werd verdund tot 5× met RNase-vrij water vóór gebruik.
      1. Na het wassen incubeer je de secties een nacht in een 5× SSC-buffer bij RT.
  2. Dag 2: Signaalversterking, fluorescentie-labeling en montage
    1. Was de dia's.
      1. Was de slides in 1× Wash Buffer voor 2 minuten op kamertemperatuur (RT). Herhaal het twee keer.
    2. Voer de versterkingsstappen uit.
      1. Breng Amplification 1-reagens aan op elke sectie en incubeer 30 minuten bij 40 °C in een bevochtigde kamer.
      2. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
      3. Breng Amplification 2-reagens aan en incubeer 30 minuten bij 40 °C.
      4. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
      5. Breng Amplification 3-reagens aan en incubeer 15 minuten bij 40 °C.
        OPMERKING: Alle drie de versterkingsstappen zijn vereist, ongeacht welke kanalen (probes) worden ontwikkeld.
      6. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
    3. Ontwikkel mieriksradicusperoxidase (HRP) en fluorofoor.
      1. Bereken het benodigde volume fluorofoor (meestal 100–200 μL per glaas) en verdun de opaalfluorofoorstokken.
        OPMERKING: Het aanbevolen verdunningsbereik voor fluoroforen is 1:300–1:1500. In deze experimenten werd Opal Polaris 780 (fluorofoorreagens) verdund met 1:500 in antilichaamverdunner, en alle andere kleurstoffen verdund met 1:1000 in TSA-buffer. Minimaliseer de lichtblootstelling aan de dia's waar mogelijk.
      2. Breng HRP-C1 reagens aan en incubeer 15 minuten bij 40 °C.
      3. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
      4. Breng 30–40 μL opalkleurstof (bijv. Opal 570 of Opal 690) aan op elk gedeelte. Breng 30 minuten uit bij 40 °C.
      5. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
      6. Breng HRP-blokker aan en incubeer 15 minuten bij 40 °C.
      7. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
      8. Breng HRP-C2 of HRP-C3 reagens aan en incubeer bij 40 °C gedurende 15 minuten.
      9. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
      10. Breng 30–40 μL van de tweede opaalkleurstof aan en incubeer 30 minuten bij 40 °C.
      11. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
      12. Breng HRP-blokker aan en incubeer 15 minuten bij 40 °C.
      13. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
      14. Breng HRP-C3 of HRP-C4 reagens aan en incubeer 15 minuten bij 40 °C.
      15. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
    4. Voer tyramidesignaalversterking-digoxigenine (TSA-DIG) en fluorofoorlabeling uit (indien van toepassing).
      1. Breng per sectie 30–40 μL verdund TSA-DIG-reagens aan en incubeer 30 minuten bij RT.
      2. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
      3. Breng blokkeringsreagens aan en incubeer 15 minuten bij 40 °C.
      4. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
      5. Breng 30–40 μL verdunde fluoroforreagens aan en incubeer 30 minuten bij 40 °C.
      6. Spoel twee keer in 1 × Wash Buffer 2 minuten bij RT.
    5. Voer tegenkleuring en montage uit.
      1. Breng 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) aan en incubeer 5 minuten in het donker bij RT.
      2. Spoel DAPI af en monteer de secties direct met antifade montage, breng de coverslip voorzichtig aan en voorkom het opsluiten van luchtbellen. Kies een dekmantelmaat die passend bij de weefselbedekking past.
      3. Droog de preparaten 2 uur in het donker in RT, en houd ze dan op 4 °C voor langdurige opslag.
        OPMERKING: Fluorescentie kan tot een jaar worden bewaard als deze wordt bewaard bij 4 °C in het donker met een juiste antifade-montage.
    6. Voer beeldvorming uit.
      1. Voer beeldvorming uit met een multikanaals fluorescentiemicroscoop met LED-verlichting en filters voor spectrale scheiding (Figuur 2A). Gebruik de excitatie- en emissiegolflengten als volgt: DAPI (353/465 nm), FITC (495/519 nm), Cy3 (548/561 nm), Cy5 (650/673 nm) en Cy7 (747/773 nm). Specifieke filters minimaliseren spectrale overlap en onderscheiden blauwe, groene, oranje, rode en nabij-infrarode signalen.
      2. Verzamel alle beelden met identieke belichtings- en belichtingsinstellingen over de monsters, zodat consistentie wordt gegarandeerd en betrouwbare vergelijkende analyses mogelijk zijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Met behulp van het beschreven protocol (Figuur 1) demonstreren we multiplex fluorescent mRNA ISH transcriptdetectie in een muishoofd dat op een Zeiss-microscoopplatform is afgebeeld (Figuur 2B). Specifieke beeldweergaven kunnen worden geselecteerd met het zijtabblad (gele doos), terwijl meerdere kanalen gelijktijdig kunnen worden weergegeven met het kanaaltabblad (rode doos). Helderheid, gamma en contrast van de live-afbeelding ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In situ hybridisatie is al meer dan vier decennia een fundamenteel hulpmiddel voor het bestuderen van genexpressie en heeft voortdurend verfijning ondergaan. Conventionele ISH-benaderingen worden echter vaak beperkt door lage gevoeligheid, een hoog achtergrondsignaal en lange, arbeidsintensieve procedures. Deze beperkingen hebben hun bredere toepassing beperkt, vooral in complexe craniofaciale weefsels waar precieze ruimtelijke resolutie en detectie van laag-abundantie transcrip...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten om te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wij danken het personeel van de NICHD dierenfaciliteit voor hun hulp bij veeteelt en fokken. Wij danken Dr. Vincent Schram van de Microscopy and Imaging Core (NIH/NICHD) voor de hulp bij fluorescentiebeeldvorming. Het huidige manuscript wordt ondersteund door middelen van NIH/NIDCR RO1DE033520 aan M.B., het Intramural Research Program, het National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) tot E.M., en de National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) Research Grant Identifier ZIA HD009015. De financier had geen rol bij het opzetten van het onderzoek, het verzamelen en analyseren van gegevens, de beslissing om te publiceren of de voorbereiding van het manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1×PBSThermo Fischer10010023Gebruik  om wasbeurten uit te voeren tijdens de workflow
20×SSCThermo FischerJ60839.K2Gebruik om de 1´ Wash buffer te maken
50 mL conische buizen (Ambion) RNAse vrijThermo FischerAM12502Gebruik om monsters in verschillende oplossingen op te slaan
Geavanceerde orbitale schudderVWR6683-470Gebruik om weefsels in fixatievos te schudden tijdens incubatie
Alcohol, 70%, Fisherbrand, HistoPrepFisher ScientificHC-1000-1GLGebruik om alle werkruimte te reinigen en te desinfecteren
Antibody Diluent Akoya BiosciencesARD1001EAVerdunner voor TSA-DIG
Automatische vacuüm weefselprocessorLeica BiosystemsASP300SGebruik voor het opruimen, dehydratatie, rehydratatie en was infiltratie van monsters
Dekglaas Dikte 1.5, 25 mm x 25 mm Corning2850-25Gebruik voor het monteren van een glijbaan in Visium HD workflow
Aangepaste Pretreatment ReagensACD, Bio-Techne300040Om weefselpermeabilisatie en doelwit toegankelijkheid te optimaliseren
EDTAMillipore Sigma03690Gebruik om gemineraliseerde weefsels te decalcificeren
Ethanol 100%AeroBase Group6505001050000Gebruik om xyline te verwijderen en monsters te rehydrateren tijdens verwerking
HistoCore Waterbad Leica BiosystemsHIS2326Gebruik om de secties bij 40-43 °C te laten zweven om rimpels van FFPE-secties te verwijderen 
HybEZ Bevochtigend papierACD, Bio-Techne310015Gebruik in de HybEZ oven om de luchtvochtigheid te handhaven en te voorkomen dat weefselsecties uitdrogen tijdens hybridisatie
HybEZ Oven, Tray, en RackACD, Bio-Techne310011, 310012, 310014Gebruik om gecontroleerde temperatuur, luchtvochtigheid en de juiste schuifpositionering te bieden tijdens hybridisatie en incubatiestappen 
ImmEdge Hydrofobe Barrière PenVector LaboratoryH-4000Gebruik om hydrofobe grenzen op dia's te tekenen om reagentia te beperken tot het weefselgedeelte tijdens kleuringsprocedures.
Laag profiel wegwerpmessen DB80LXLeica Biosystems14035843496Gebruik om FFPE blokken te snijden 
Neutraal Gebufferd Formaline 10%Azer ScientificNBF-4-GGebruik om de weefsels te fixeren
OPAL 520 REAGENTEN PACKAkoya Biosciences, Inc.FP1487001KTOm doelwit RNA signalen met fluorescerende markering te versterken en te detecteren.
OPAL 570 REAGENTEN PACKAkoya Biosciences, Inc.FP1488001KTOm doelwit RNA signalen met fluorescerende markering te versterken en te detecteren.
OPAL 620 REAGENTEN PACKAkoya Biosciences, Inc.FP1495001KTOm doelwit RNA signalen met fluorescerende markering te versterken en te detecteren.
OPAL 690 REAGENTEN PACKAkoya Biosciences, Inc.FP1497001KTOm doelwit RNA signalen met fluorescerende markering te versterken en te detecteren.
Opal Polaris 780 Reagens PackAkoya Biosciences, Inc.FP1501001KTOm doelwit RNA signalen met fluorescerende markering te versterken en te detecteren.
Prolong DiamondThermo FischerP36970Een antifade montage medium om fluorescerende signalen te behouden en het RNAscope signaal tijdens beeldvorming te beschermen
RNAscope 4-Plex Ancillary kitSPECIFIC UIACD, Bio-Techne323120Aanvullende materialen gebruikt met de RNAscope Multiplex Fluorescent v2 assay
RNAscope DAPIACD, Bio-Techne320858Een fluorescerende nucleaire vlek gebruikt in RNAscope assays om celkernen te visualiseren
RNAscope Multiplex Fluorescent Reagens Kit v2ACD, Bio-Techne323100Om multiplex fluorescente in situ hybridisatie uit te voeren
RNAscope Multiplex TSA BufferACD, Bio-Techne322810Een buffer gebruikt in RNAscope om opale kleurstoffen te verdunnen
RNAscope Was buffer reagentiaACD, Bio-Techne310091Gebruik om de weefselsecties op dia's tijdens de assay te wassen
RNaseZap RNase Decontaminatie OplossingThermo FischerAM9782Gebruik om RNase te reinigen en te verwijderen
Semi-automatische roterende MicrotomeLeica BiosystemsRM2245Gebruik om FFPE blokken te snijden zoals vermeld in de richtlijnen.
Slide BriteElectron Microscopy Science23401-01Voor deparaffinisatie stap voorafgaand aan RNAscope verwerking.
Dia's Warmer met DekselPremiere XH2004Gebruik voor incubatie van dia's bij verschillende temperaturen
Superfrost Plus Dia's Fisher Scientific12-550-15 Gebruik om secties te bevestigen voor Vsium HD
Surgipath ParaplastLeica Biosystems39601006Gebruik om weefsel infiltratie en inbedding van weefsels uit te voeren
Weefsel kweek SCHAAL 100 X 20 MM 500/CSFisher Scientific877222Gebruik voor het verzamelen en dissekeren van monsters in 1´ PBS
XYleenFisher Scientific6.81001E+12Gebruikt als een clearing agent om alcohol te verwijderen en weefsels transparant te maken

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Artika, I. M., et al. Real-time polymerase chain reaction: current techniques, applications, and role in COVID-19 diagnosis. Genes. 13 (12), 2387(2022).
  2. Chu, Y. H., et al. In situ hybridization: introduction to techniques, applications and pitfalls in the performance and interpretation of assays. Semin Diagn Pathol. 36 (5), 336-341 (2019).
  3. Atout, S., et al. Evaluation of the suitability of RNAscope as a technique to measure gene expression in clinical diagnostics: a systematic review. Mol Diagn Ther. 26 (1), 19-37 (2022).
  4. Tseng, K. C., Crump, J. G. Craniofacial developmental biology in the single-cell era. Development. 150 (19), dev202077(2023).
  5. Kishi, J. Y., et al. SABER amplifies FISH: enhanced multiplexed imaging of RNA and DNA in cells and tissues. Nat Methods. 16 (6), 533-544 (2019).
  6. Lovely, A. M., et al. Hybridization chain reaction fluorescence in situ hybridization (HCR-FISH) in Ambystoma mexicanum tissue. Methods Mol Biol. 2562, 109-122 (2023).
  7. Raju, R., et al. Profiles of Wnt pathway gene expression during tooth morphogenesis. Front Physiol. 14, 1316635(2024).
  8. Piña, J. O., et al. Multimodal spatiotemporal transcriptomic resolution of embryonic palate osteogenesis. Nat Commun. 14, 5687(2023).
  9. Piña, J. O., et al. Spatial multi-omics reveals the role of the Wnt modulator Dkk2 in palatogenesis. J Dent Res. 103 (13), 1412-1420 (2024).
  10. Raj, A., et al. Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes. Nat Methods. 5 (10), 877-879 (2008).
  11. Xia, C., et al. Spatial transcriptome profiling by MERFISH reveals subcellular RNA compartmentalization and cell cycle-dependent gene expression. Proc Natl Acad Sci USA. 116, 19490-19499 (2019).
  12. Lubeck, E., et al. Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization. Nat Methods. 11, 360-361 (2014).
  13. Shah, S., et al. In situ transcription profiling of single cells reveals spatial organization of cells in the mouse hippocampus. Neuron. 92, 342-357 (2016).
  14. Gaspar, I., Ephrussi, A. Strength in numbers: quantitative single-molecule RNA detection assays. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 4 (2), 135-150 (2015).
  15. Erben, L., Buonanno, A. Detection and quantification of multiple RNA sequences using emerging ultrasensitive fluorescent in situ hybridization techniques. Curr Protoc Neurosci. 87, e63(2019).
  16. Makareeva, E., et al. RNA-based bone histomorphometry: method and its application. J Bone Miner Res. 39 (2), 177-189 (2024).
  17. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
  18. Monné Rodríguez, J. M., et al. Review of in situ hybridization techniques for drug research and development. Toxicol Pathol. 51 (3), 92-111 (2023).
  19. Colburn, M. E., et al. Effect of formalin-fixation and paraffin-embedded tissue storage times on RNAscope signal amplification. J Vet Diagn Invest. 36 (4), 498-505 (2024).
  20. Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium. Am J Clin Pathol. 137 (3), 429-436 (2012).
  21. RNAscope multiplex fluorescent reagent kit v2 user manual. , ACDbio. Available from: https://manuals.plus/m/0f24eea864dcf70b83735b261589c2e98f9c707b01c1c9c0455f349c8ab2eb0c (2025).
  22. Bankhead, P., et al. QuPath: open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7, 16878(2017).
  23. Hernández, S. C., et al. Single-cell and spatial transcriptomic profiling of cardiac fibroblasts following myocardial infarction. Sci Data. 13, 216(2026).
  24. Dropmann, A., et al. The TGF-β1 target WISP1 is highly expressed in liver cirrhosis and cirrhotic HCC microenvironment. Biochem Biophys Res Commun. 732, 150409(2024).
  25. Stolley, D. L., et al. RNA in situ hybridization with sequential protein immunofluorescence in tandem assay. J Vis Exp. (224), e68615(2025).
  26. Anderson, C. M., et al. Visualizing genetic variants, short targets, and point mutations in the morphological tissue context. J Vis Exp. (138), e58097(2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Multiplex Fluorescent HybridizationIn Situ HybridizationCraniofacial DevelopmentFFPE Mouse SamplesmRNA DetectionGene Expression LocalizationTissue ArchitectureCraniofacial TissuesCongenital Craniofacial DisordersSpatial Gene Expression

Gerelateerde artikelen