Methodenartikel

Kwantificering van fluoride in serum, bot en tanden in een muismodel met behulp van hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie en metingen met ionselectieve elektroden

81 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

28 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de bereiding van diffusieschalen gefaciliteerd door hexamethyldisiloxaan (HMDS), gevolgd door metingen met ion-selectieve elektroden om de massa aan fluoride-ionen in het serum, bot en gebit van muizen te kwantificeren. De methode biedt een gevoelige, op kalibratie gebaseerde benadering voor het evalueren van fluoride-accumulatie in biologische monsters.

Samenvatting

Het kwantificeren van fluoridegehalten in biologische weefsels is essentieel voor het begrijpen van fluorideblootstelling, metabolisme en toxiciteit. Dit protocol beschrijft een gevoelige en reproduceerbare methode voor het meten van de fluoride-ionmassa in serum, botten en tanden met behulp van door hexamethyldisiloxaan (HMDS) gefaciliteerde diffusie, gevolgd door analyse met een ion-selectieve elektrode (ISE). Biologische monsters, waaronder serum, dijbeenderen en mandibulaire snijtanden, worden verzameld van muizen die zijn blootgesteld aan gecontroleerde fluoridebehandelingen. Bot- en tandmonsters worden geasst, gemalen en gehydrateerd, terwijl serum direct wordt verwerkt. Elk monster wordt overgebracht naar een diffusieschaal met ultrapuur water en afgesloten met een met petrolatum bekleed deksel voorzien van natriumhydroxidedruppels die dienen als fluoridetraps. Injectie van HMDS-verzadigd zwavelzuur initieert de afgifte en diffusie van fluoride, waardoor de vrijgekomen fluoride-ionen kwantitatief in de traps worden opgevangen. Na een nachtelijke diffusie worden de druppels uit de fluoridetraps samengevoegd tot één enkel monster, aangezuurd tot het vereiste pH-bereik en aangepast naar een gedefinieerd volume voor ISE-meting. Kalibratie-diffusieschalen, geprepareerd met bekende fluoridemassa's, genereren een standaardcurve voor kwantificering, en kwaliteitscontrolemonsters verifiëren de stabiliteit van de elektrode. Representatieve resultaten van adolescente en volwassen muizen die zijn blootgesteld aan 0 of 125 ppm fluoride tonen het vermogen van de methode aan om leeftijds- en dosisafhankelijke verschillen in fluoridegehaltes in serum, botten en tanden te detecteren. Dit protocol biedt een robuuste, op kalibratie gebaseerde benadering voor het kwantificeren van fluoride in diverse biologische matrices en is uitermate geschikt voor studies naar fluorideblootstelling, weefseldepositie en toxicologische uitkomsten in muismodellen. Een belangrijk voordeel van deze methode is het vermogen om fluoride nauwkeurig te kwantificeren in extreem kleine monsters, waaronder de 3–5 mg as verkregen uit individuele muissnijtanden, omdat het diffusieproces al het vrijgekomen fluoride concentreert in een meetbaar monstervolume van minder dan 100 µL.

Inleiding

Fluoride is een natuurlijk voorkomend anion, en een optimaal fluoridegehalte is effectief bij het voorkomen van cariës1,2,3,4,5. In de Verenigde Staten (U.S.) is fluoridering van het gemeentelijk water op 0.7 ppm geïmplementeerd als volksgezondheidsstrategie om de incidentie van cariës te verminderen en de mondgezondheid te bevorderen6. Echter kan langdurige inname van overmatig fluoride meerdere weefsels nadelig beïnvloeden. Blootstelling aan hoge concentraties fluoride verstoort de glazuurvorming7,8,9, verandert de botvorming10 en tast de skeletintegriteit aan11.

Op cellulair niveau induceert blootstelling aan fluoride verschillende metabole verstoringen, waaronder oxidatieve stress12, stress van het endoplasmatisch reticulum13, epigenetische modificaties die de genexpressie veranderen14 en apoptose in ameloblasten15,16,17,18. Wereldwijd vormen verhoogde fluorideconcentraties in grondwater (>1.5 ppm) een aanzienlijk gezondheidsrisico. Een recente predictieve modelstudie schatte dat ongeveer 180 miljoen mensen wereldwijd potentieel worden beïnvloed door overmatige blootstelling aan fluoride, waarbij de hoogste last voorkomt in Azië en Afrika1. Naast drinkwater vindt blootstelling aan fluoride ook plaats via voedingsmiddelen (bijv. zeevruchten; ~1.9 ppm), dranken (bijv. thee; 0.5–6 ppm19) en tandverzorgingsproducten zoals tandpasta20 (1.000–1.500 ppm).

Inzicht in fluoride-blootstelling, metabolisme en weefseldepositie is daarom essentieel voor het evalueren van zowel de therapeutische voordelen als de potentiële toxicologische gevolgen. Nauwkeurige kwantificering van fluoride in biologische monsters — waaronder urine, serum, bot en tanden — is een cruciaal onderdeel van dit werk. Meting is echter analytisch uitdagend vanwege het chemische gedrag van fluoride en de sterke affiniteit ervan voor calciumrijke matrices. Ongeveer 99% van het fluoride in het lichaam bevindt zich in gemineraliseerde weefsels zoals bot en tanden21. Om deze uitdagingen aan te pakken, zijn diverse analytische technieken ontwikkeld, waaronder ionselectieve elektrode (ISE) potentiometrie, ionchromatografie, colorimetrische assays, titrimetrische procedures en nucleaire of activatiegebaseerde methoden22. Hiervan is de door hexamethyldisiloxaan (HMDS) gefaciliteerde diffusietechniek, gecombineerd met fluoride-selectieve elektrodemeting, een van de meest betrouwbare en veelgebruikte benaderingen voor biologische matrices gebleken vanwege de gevoeligheid, reproduceerbaarheid en compatibiliteit met diverse monstertypes23,24,25,26,27,28,29.

Ondanks de beschikbaarheid van meerdere analytische methoden heeft elke benadering beperkingen die het gebruik in experimenteel of klinisch onderzoek kunnen belemmeren. Ionchromatografie biedt een hoge gevoeligheid en selectiviteit, maar vereist gespecialiseerde instrumentatie en uitgebreide monstervoorbereiding30,31. Colorimetrische assays, zoals de SPADNS-methode (natrium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalen-3,6‑disulfonaat), zijn eenvoudig en goedkoop, maar zijn gevoelig voor interferentie door troebelheid en endogene chromoforen, wat hun betrouwbaarheid in complexe biologische monsters beperkt22,32,33. Titrimetrische methoden zijn kosteneffectief en ongecompliceerd, maar missen de gevoeligheid die nodig is voor de detectie van fluoride op spuurniveau in de meeste biologische monsters34. Nucleaire of activatiegebaseerde technieken bieden een uitzonderlijke gevoeligheid, maar vereisen toegang tot reactoren of accelerator-gebaseerde neutronenbronnen, waardoor ze onpraktisch zijn voor routinematig laboratoriumgebruik35. In contrast hiermee biedt HMDS-gefaciliteerde diffusie gevolgd door ISE-meting een praktische balans tussen gevoeligheid, kosten en toegankelijkheid, terwijl een volledige vrijgave van fluoride uit zowel zachte als gemineraliseerde weefsels wordt gegarandeerd. Dit is bijzonder voordelig voor studies met kleine dieren, waarbij de weefselbeschikbaarheid beperkt is en gemineraliseerde structuren, zoals snijtanden van muizen, slechts 3–5 mg as per tand opleveren.

Het vermogen van de diffusie-ISE-methode om al het vrijgekomen fluoride te concentreren in een klein, gedefinieerd volume maakt nauwkeurige kwantificering mogelijk, zelfs in extreem kleine monsters. Dit maakt de methode zeer geschikt voor toxicokinetische studies, dosis-responsexperimenten en onderzoeken naar de fluoride-metabolisme in verschillende ontwikkelingsstadia. Kleine knaagdieren, in het bijzonder C57BL/6J-muizen, zijn veelvuldig gebruikt als diermodellen voor het bestuderen van de effecten van fluoride7,9,12,29,36 .

In dit protocol passen de auteurs de HMDS-gefaciliteerde diffusietechniek toe, gevolgd door meting met een fluoride-selectieve elektrode, om fluoride te kwantificeren in serum, bot en tanden verzameld van muizen die zijn blootgesteld aan een hoge fluoridedosis (125 ppm) vergeleken met onbehandelde controles. De auteurs vergelijken verder de fluorideaccumulatie in adolescente (6 weken bij aanvang van de behandeling) en volwassen (18 weken bij aanvang van de behandeling) muizen om leeftijdsafhankelijke verschillen in fluoridemetabolisme en weefseldepositie te evalueren. De mandibulaire snijtanden werden gekozen als representatief tandweefsel omdat knaagersnijtanden continu doorbreken en rond de leeftijd van 7 weken een steady-state balans bereiken tussen doorbraak en occlusale slijtage. Dit continue groeipatroon biedt een consistente en toegankelijke gradiënt van glazuurontwikkeling, waardoor muisnijtanden een veelgebruikt en goed gevalideerd model zijn voor het onderzoek naar glazuurvorming en dentale fluorose.

Protocol

Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en regelgeving voor het gebruik van gewervelde dieren, goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan de Nova Southeastern University (Protocol nr. 2023.02.MSuz1), die is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Al het werk met dieren was in overeenstemming met de handleiding voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren en de richtlijnen van de American Veterinary Medical Association (AVMA) voor de euthanasie van dieren. Alle in deze studie gebruikte materialen staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Dieren en de bereiding en toediening van natriumfluoride in een muismodel

  1. Dieren: Verdeel mannelijke C57BL/6J-muizen over twee leeftijdscategorieën: adolescenten, 6 weken oud bij aanvang van de behandeling, en volwassenen, 18 weken oud bij aanvang van de behandeling.
    1. Voorzie elke groep van ofwel fluoridevrij gedeïoniseerd water (0 ppm F⁻) of drinkwater aangevuld met natriumfluoride (125 ppm F⁻) gedurende een blootstellingsperiode van 6 weken.
    2. Neem vijf dieren op per leeftijd en behandelingsconditie (N = 5/groep).
    3. Oogst aan het einde van de blootstellingsperiode serum, femurs en mandibulaire incisieven, en bereid alle verzamelde monsters voor op verdere analyse.
      OPMERKING: Monster: Verwerkt materiaal zoals asbehandeld bot, asbehandelde tand en serum.
  2. Huisvesting en dieet van de dieren: Huisvest de muizen onder standaard laboratoriumomstandigheden met ad libitum toegang tot voedsel en water.
    1. Voorzie de dieren van een fluoridevrij dieet beginnend één week vóór de collectie van tanden, bot en serum om de achtergrondwaarden van fluoride te minimaliseren.
  3. Natriumfluoride-drinkwater
    1. Om fluoride-supplement drinkwater te bereiden, wordt natriumfluoride (NaF) opgelost in gedeïoniseerd water om de gewenste fluorideconcentratie te bereiken (bijv. 125 ppm F⁻).
    2. Filtreer de oplossing via een 0,2 µm vacuümfilter in een geautoclaveerde fles. Bereid elke 2 dagen een verse oplossing.
      WAARSCHUWING: NaF is toxisch bij inname en kan huid- en oogirritatie veroorzaken. Hanteer dit in een zuurkast terwijl u een laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril draagt.
  4. Voor het fluoridevrije controlewater wordt gedeïoniseerd water via een 0,2 µm vacuümfilter in een geautoclaveerde fles gefiltreerd. Bereid elke 2 dagen vers water.
  5. Voorzie de dieren ad libitum van fluoride-supplement of fluoridevrij drinkwater gedurende de gewenste duur van de fluoridebehandeling. Controleer dagelijks de waterstanden en vervang de flessen elke 2 dagen.
  6. Euthanaseer de dieren aan het einde van de blootstellingsperiode door middel van koolstofdioxide (CO₂)-inhalatie gevolgd door decapitatie. De euthanasieprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de AVMA-richtlijnen voor de euthanasie van dieren en werden goedgekeurd als onderdeel van het institutionele IACUC-protocol.
    WAARSCHUWING: CO2 is een verstikkingsmiddel. Voer de procedures uit in een goed geventileerde ruimte en zorg dat de kamer correct functioneert. Vermijd directe blootstelling door inhalatie.

2. Monstervoorbereiding voor fluoride-meting

  1. Bloedafname
    1. Euthanaseer de muizen door CO₂-inhalatie en neem onmiddellijk bloed af via een terminale hartpunctie met een 1 mL tuberculinespuit. Breng het bloed over in 1,5 mL microcentrifugebuisjes. Voer alle gebruikte naalden en spuiten af in een goedgekeurde institutionele container voor scherp afval.
      WAARSCHUWING: Spuitnaalden zijn scherp en kunnen punctiewonden veroorzaken; hanteer ze met zorg.
    2. Bewaar het bloed 30 min bij kamertemperatuur en centrifugeer het vervolgens 10 min bij 2.000 × g.
    3. Breng het supernatant (serum) over naar een microcentrifugebuisje en bewaar dit bij −80 °C.
      WAARSCHUWING: Ultra-lage vriezers vormen een risico op bevriezingsletsel. Draag geïsoleerde handschoenen bij het hanteren van buisjes en vermijd langdurig huidcontact met koude oppervlakken.
  2. Botten
    1. Extractie van femora: Dissecteer na euthanasie de achterpoten bij de heupgewrichten.
    2. Verwijder voorzichtig alle weke delen van de femora. Was de weefsels drie keer met gedeïoniseerd water. Bewaar de botten bij -80 °C tot verdere verwerking. Voer verwijderde weke delen en alle gecontamineerde materialen af via de institutionele stroom voor biologisch afval.
      OPMERKING: Weefsels kunnen voor langdurige bewaring in 70% ethanol gedurende 12–16 u worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde met 2% sucrose. Deze fixatieprocedure heeft geen invloed op de nauwkeurigheid van de daaropvolgende fluoridekwantificering.
    3. Spoel de botten grondig met gedeïoniseerd water. Dep overtollig vocht weg met een pluisvrije papieren handdoek.
    4. Breng de botten over in 1,5 mL microcentrifugebuisjes met open deksels om verdamping mogelijk te maken en plaats deze in een droogoven bij 60 °C gedurende 12–16 u.
      WAARSCHUWING: De droogoven kan brandwonden veroorzaken. Gebruik hittebestendige handschoenen bij het hanteren van de monsters.
    5. Asen van botten: Breng de gedroogde botten over in aluminiumoxidekroezen. Plaats de kroezen in een moffeloven en verhit ze tot 600 °C met een opwarmingssnelheid van 150 °C/u, en houd deze temperatuur vervolgens 6 u vast. Laat de oven afkoelen tot onder de 200 °C voordat de kroezen worden verwijderd. Voer alle resterende botfragmenten of gecontamineerde verbruiksartikelen af via de institutionele stroom voor biologisch afval.
      WAARSCHUWING: De moffeloven en de kroezen bereiken extreme temperaturen, wat een ernstig risico op brandwonden vormt. Laat de oven altijd afkoelen voordat u de kroezen hanteert. Draag bij het verwijderen van de kroezen een laboratoriumjas, een veiligheidsbril en hittebestendige handschoenen, en gebruik een lange pincet om direct contact met hete oppervlakken te vermijden.
      CRUCIALE STAP: Onvolledig asen zal downstream analyses compromitteren. Controleer of het botmateriaal een volledig geoxideerde staat heeft bereikt voordat u verdergaat; elk residu van koolstof zal de daaropvolgende metingen storen.
      OPMERKING: Correct verasde botten moeten er uniform lichtgrijs tot wit uitzien. Donkerdere deeltjes — met name zwarte of houtskoolachtige residuen — duiden op onvolledige verbranding. Indien verkleuring optreedt, verleng dan de asduur om volledige verwijdering van organisch materiaal mogelijk te maken.
    6. Bewaring van verasde botten: Breng de botten direct na het asen over in 1,5 mL microcentrifugebuisjes. Sluit de buisjes af met Parafilm en bewaar ze in een vacuümdesiccator tot gebruik.
  3. Tanden
    1. Extractie van mandibulaire incisieven: Maak een horizontale snede op het niveau van het temporomandibulaire gewricht om de onderkaak (mandibula) van de bovenkaak (maxilla) te scheiden.
    2. Voer mid-sagittale sneden uit om zowel de maxilla als de mandibula in linker- en rechterhelften te verdelen.
    3. Was de weefsels drie keer met gedeïoniseerd water en extraheer voorzichtig de mandibulaire incisieven. Bewaar de geëxtraheerde incisieven bij -80 °C tot verder gebruik. Voer geëxtraheerde weke delen en alle gecontamineerde verbruiksartikelen af via de institutionele stroom voor biologisch afval.
      WAARSCHUWING: Gebruik scherpe dissectie-instrumenten voorzichtig bij het maken van sneden in het temporomandibulaire gewricht en het mid-sagittale vlak om persoonlijk letsel te voorkomen. Draag geschikte PBM, inclusief handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril.
      OPMERKING: Weefsels kunnen voor langdurige bewaring in 70% ethanol gedurende 12–16 u worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde met 2% sucrose. Deze fixatieprocedure heeft geen invloed op de nauwkeurigheid van de daaropvolgende fluoridekwantificering.
    4. Voorbereiding van tanden voor het asen: Spoel de tanden grondig met gedeïoniseerd water en plaats ze gedurende 12–16 u in 1% waterstofperoxide (H₂O₂). Voer gebruikte waterstofperoxide-oplossingen af als gevaarlijk chemisch afval.
    5. Spoel opnieuw met gedeïoniseerd water, dep kort droog met een pluisvrij doekje en breng over naar 1,5 mL microcentrifugebuisjes met open deksels. Plaats de buisjes in een droogoven bij 60 °C gedurende 12–16 u.
      WAARSCHUWING: Waterstofperoxide is een oxidator en kan huid- en oogirritatie veroorzaken. Hanteer dit in een zuurkast terwijl u een laboratoriumjas, nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril draagt. Vermijd contact met brandbare materialen.
    6. Asen van tanden: Breng de gedroogde tanden over in aluminiumoxidekroezen en as deze in een moffeloven bij een verblijftemperatuur van 600 °C gedurende 20 u, met een opwarmingssnelheid van 150 °C/u.
    7. Verwijder de kroezen pas nadat de oven is afgekoeld tot onder de 200 °C.
      WAARSCHUWING: De moffeloven en de kroezen bereiken extreme temperaturen, wat een ernstig risico op brandwonden vormt. Laat de oven afkoelen tot onder de 200 °C voordat u de kroezen hanteert. Draag bij het verwijderen van de kroezen een laboratoriumjas, een veiligheidsbril en hittebestendige handschoenen, en gebruik een lange pincet om direct contact met hete oppervlakken te vermijden.
      CRUCIALE STAP: Zorg voor volledige oxidatie; residuen van koolstof zullen de daaropvolgende analyses storen.
      OPMERKING: Verast tandmateriaal moet er uniform lichtgrijs tot wit uitzien. As opnieuw indien er zwarte residuen achterblijven.
    8. Bewaring van verasde tandmonsters: Breng de tanden direct na het asen over in 2 mL microcentrifugebuisjes met ronde bodem.
    9. Sluit de buisjes af met Parafilm en bewaar ze in een vacuümdesiccator tot gebruik.

3. Bereiding van schaaltjes voor HMDS-gefaciliteerde diffusie

  1. Reagentia en materiaal
    1. 6 N zwavelzuur: Maak ten minste twee dagen voor het voorbereiden van de diffusieschaaltjes een voorraadoplossing van 6 N zwavelzuur.
      OPMERKING: Diffusieschaal: Een afgesloten vat dat is ontworpen om een gecontroleerde gesloten omgeving te creëren waarin vrijgekomen componenten uit een bewerkt biologisch materiaal kunnen worden opgevangen door een chemische val die aan het deksel is bevestigd. Het afgesloten ontwerp voorkomt uitwisseling met de buitenlucht en zorgt ervoor dat vrijgekomen analyten naar de val worden geleid voor daaropvolgende meting.
    2. Plaats een plastic bekerglas van 1 L met een magnetische roerstaaf op een magnetische roerder en voeg 416 mL ultrapuur water toe.
    3. Voeg met een serologische pipette van 50 mL langzaam 84 mL 36 N H₂SO₄ toe aan het water onder voortdurend roeren. De oplossing zal warm worden; laat deze afkoelen tot kamertemperatuur.. Voer alle ongebruikte of verbruikte zwavelzuuroplossingen af als gevaarlijk chemisch afval via de institutionele chemische afvalstroom.
      WAARSCHUWING: Zwavelzuur is sterk corrosief. Werk in een zuurkast en draag zuurbestendige handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril. Spoel bij contact onmiddellijk met overvloedige hoeveelheden water.
    4. HMDS-verzadigd 6 N zwavelzuur: Overbreng het 6 N zwavelzuur naar een scheitrechter van 2 L en voeg 15 mL hexamethyldisiloxaan (HMDS) toe.
    5. Zorg ervoor dat de stop en de stopkraan stevig gesloten zijn, houd de scheitrechter zijwaarts en schud krachtig totdat er kleine HMDS-druppeltjes zichtbaar zijn.
    6. Open de stop om het ontwikkelgas te laten ontsnappen en herhaal dit proces nog twee keer.
    7. Laat de stop enkele uren halfopen staan. Bewaar de scheidtrechter met het 6 N HMDS-verzadigde zwavelzuur in een statief in de zuurkast. Voer het HMDS-houdende zwavelzuur en besmette materialen af als gevaarlijk chemisch afval.
      WAARSCHUWING: HMDS is brandbaar en giftig bij inademing. Hanteer dit in een zuurkast terwijl u een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril draagt. Houd het middelst verwijderd van ontstekingsbronnen.
    8. 0,05 N natriumhydroxide: Los 1 g NaOH-pellets op in 25 mL ultrapuur water om een 1 N stamoplossing te bereiden.
    9. Meng 2 mL van de 1 N NaOH-stamoplossing met 38 mL ultrapuur water om een 0,05 N NaOH-oplossing te verkrijgen.
    10. Verdeel de 0,05 N NaOH in 1,5 mL microcentrifugebuisjes voor eenmalig gebruik, sluit de doppen af met Parafilm en bewaar de buisjes in een vacuümexsiccator om de absorptie van CO₂ te minimaliseren. Voer ongebruikte of verbruikte natriumhydroxide-oplossingen af als gevaarlijk chemisch afval.
      WAARSCHUWING: Natriumhydroxide is sterk corrosief en kan ernstige brandwonden veroorzaken. Draag een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril. Ga voorzichtig om met oplossingen om spatten te voorkomen.
    11. 0,2 N azijnzuur: Voeg toe 575 µL voeg glaciaal azijnzuur toe aan ultrapuur water en vul aan tot een eindvolume van 50 mL om 0,2 N azijnzuur te bereiden. Voer azijnzuuroplossingen af als gevaarlijk chemisch afval.
      WAARSCHUWING: Azijnzuur is corrosief en kan de huid, ogen en luchtwegen irriteren. Hanteer dit in een chemische zuurkast met een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril.
    12. Petrolatum: Smelt ongeveer 100 g petrolatum bij 60 °C in een oven. Zuig de vloeibare petrolatum op in spuiten van 10 mL en laat deze afkoelen en stollen. Spuiten gevuld met petrolatum kunnen gedurende enkele weken bij kamertemperatuur worden bewaard.
    13. Petrischaal: Gebruik onbehandelde Petrischalen van 60 × 15 mm voor het bereiden van diffusieschalen.
    14. Smelt met een verhitte 18-G injectienaald een klein gaatje in het deksel van een petrischaal.
    15. Breng met een 10 mL spuit, voorzien van een stompe 14 G naald, een continue afsluiting van petrolatum aan op de binnenrand van het deksel. Voer alle gebruikte naalden af in een door de instelling goedgekeurde container voor scherp afval.
      WAARSCHUWING: Spuitnaalden zijn scherp en kunnen steekverwondingen veroorzaken. Behandel ze met zorg en voer ze af in goedgekeurde naaldencontainers. Draag bij het verhitten van naalden hittebestendige handschoenen en een oogbescherming om brandwonden te voorkomen.
    16. NaF-stamboosters voor kalibratie van diffusieschalen. Los 4,19 g NaF op in 1 L ultrapuur water om een stambooster van 100 mM te bereiden. Bereid 10 mM, 100 µM, en 10 µM stamsoplossingen door opeenvolgende 1:10 verdunningen van de 100 mM oplossing.
      OPMERKING: Eén mol NaF levert 19 g F⁻; daarom, 1 µL van 10 µM NaF bevat 0,19 ng F⁻ en 1 µL van 10 mM NaF bevat 190 ng F⁻.
      OPMERKING: Kalibratieschalen voor diffusie: Diffusieschalen die specifiek worden gebruikt voor kalibratie met een bekende massa fluoride-ionen (F¯).
  2. Voorbereidingen van diffusieschalen specifiek voor het monster
    1. Serumdiffusieschaal: Pipetteer 3 mL ultrapuur water in de bodem van de Petrischaal en voeg toe 75 µL serum. Voer alle met serum besmette materialen af via de institutionele stroom voor biologisch afval. Ga verder met stap 3.4.
    2. Botdiffusieschaal
      1. Pulverisatie van botas: Gebruik een microspatel om de asresten van de botten in de 1,5 mL microcentrifugebuisjes te vermalen tot een fijn poeder. Ga onmiddellijk verder met de verwerking van de gepulveriseerde botas. Voer verbruiksartikelen die besmet zijn met botas af via de institutionele chemische afvalstroom.
      2. Wegen en hydrateren van botas
        1. Plaats de lege bodem van de petrischaal op het weegplateau van een analytische balans met een afleesbaarheid van ten minste 0,1 mg.
        2. Breng de gemalen botenas over van de microcentrifugebuis van 2 mL naar een klein porseleinen schaaltje om statische lading te minimaliseren en verstrooiing van het poeder te voorkomen.
        3. Voeg met een microscopiale spatel ongeveer 5 mg botas toe aan de schaal en dek het poeder onmiddellijk af met 3 mL ultrapuur water voordat de schaal van de analytische balans wordt verwijderd om verspreiding van de as te voorkomen.
        4. Noteer het exacte gewicht van elk botasmonster. Ga verder met stap 3.4.
    3. Tanddiffusieschaal
      1. Frezen van asgeblazen tanden
        1. Overbreng de asgedroogde snijtanden naar microcentrifugebuisjes met een ronde bodem van 2 mL en voeg aan elk buisje een roestvrijstalen kraal met een diameter van 5 mm toe. Sluit de buisjes en zet de doppen vast met Parafilm.
        2. Pulveriseer de asgedroogde snijtanden in een bead beater bij 2.500 rpm gedurende 10 s. Ga onmiddellijk verder met de verwerking van de gemalen tanden.
      2. Wegen en hydratatie van geashte tanden
        1. Giet de gehele inhoud van de buis, inclusief de roestvrijstalen kraal, in de bodem van de diffusieschaal die op de weegschaal van een analytische balans is geplaatst. Voer besmette verbruiksartikelen die tandas bevatten af via de institutionele chemische afvalstroom.
        2. Verwijder de roestvrijstalen kraal uit het schaaltje en noteer het exacte gewicht van de tandas (doorgaans 3–4 mg per mandibulaire snijtand).
        3. Voeg onmiddellijk 3 mL ultrapuur water toe om de tandoas te bedekken voordat u het schaaltje van de balans verwijdert, om verstrooiing van de as door statische ontlading te voorkomen. Ga verder met stap 3.4.
  3. Kalibratie en kwaliteitscontrole van diffusieschaaltjes
    1. Bereid parallel aan de diffusieschalen voor de monsters twee sets kalibratiediffusieschalen voor een kalibratie met 5–6 punten en één identieke set kwaliteitscontrolediffusieschalen, inclusief een blanco.
      OPMERKING: Diffusieschalen voor kwaliteitscontrole: Deze worden op identieke wijze bereid als de kalibratiediffusieschalen, maar worden periodiek gebruikt om de stabiliteit van de elektrode te verifiëren en consistente meetprestaties te waarborgen.
    2. Pipetteer 3 mL ultrapuur water in elk van de 11 of 13 Petrischalen en voeg NaF-stockoplossing toe om het verwachte F¯-massa bereik in de specimenmonsters te bestrijken. Ga verder met stap 3.4. om de assemblage van de diffusieschalen te voltooien.37.
  4. Voltooiing van de assemblage van de diffusieschaal
    1. Om een fluoride-absorptieval te maken, 50 µl voeg drie druppels 0,05 N NaOH toe aan het binnenoppervlak van het deksel van de Petrischaal, op voldoende afstand van de rand van het deksel.
      OPMERKING: Fluoridevanger (F¯-vanger): Een onderdeel van diffusieschalen dat F¯ opvangt, specifiek natriumhydroxide (NaOH).
    2. Keer het deksel om zonder de NaOH-druppels te verstoren en sluit het stevig af op de bodem van de schaal met de vaseline.
    3. Om een 3 N HMDS-verzadigde zwavelzuuroplossing te bereiden, mengt u gelijke volumes van 6 N HMDS-verzadigd zwavelzuur en ultrapuur water. Bereid dit direct voor gebruik vers, aangezien het niet bewaard kan worden.
    4. Injecteer 3 mL van het bereide 3 N HMDS-verzadigde zwavelzuur via het gat in het deksel in het water onderin de diffusieschaal met een 10 ml spuit voorzien van een 20 G naald. Zorg ervoor dat er geen zuur op het binnenoppervlak van het deksel spat bij het inbrengen of terugtrekken van de spuitnaald.
    5. HMDS-gefaciliteerde fluoride-diffusie: Seal het injectiegat onmiddellijk met een druppel petrolatum die de opening volledig afdekt en plaats de diffusieschalen op een variabele rocker die is ingesteld op een lage snelheid. Incubeer dit gedurende de nacht bij kamertemperatuur (Figuur 1).

Diagram van Petri-schaal; F-Trap, petrolatumafdichting, botenas, proces met HDMS-verzadigd zwavelzuur.
Figuur 1: Schema van een botdiffusieschaal voor fluoride-extractie en -opvang. Figuur 1 illustreert het ontwerp van een botdiffusieschaal, gemonteerd in een onbehandelde Petri-schaal van 60 × 15 mm. Het deksel bevat een klein injectiegat dat is afgedicht met een petrolatumkraal. Op het binnenoppervlak van het deksel zijn drie druppels NaOH geplaatst als fluoride-ionen (F⁻) vallen, die tijdens de diffusie aan het deksel hangen. Het deksel is luchtdicht afgesloten van de bodem van de schaal met behulp van petrolatum. De bodem van de Petri-schaal bevat ultrapuur water, hexamethyldisiloxaan (HMDS)–verzadigd zwavelzuur en botenas, die samen de reactieomgeving vormen voor de vrijgave van fluoride en de daaropvolgende opvang. Deze figuur is door de auteurs gemaakt met Biorender en is gelicentieerd onder de CC BY-licentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Fluoridemeting met een ISE

  1. De ISE opstellen
    1. Vul de dubbelkanaals fluoride-selectieve elektrode met de juiste vuloplossing, sluit deze aan op de potentiometer en bevestig de elektrode in een elektrodehouder.
    2. Plaats een onbehandelde Petrischaal op een schaarlift onder het sensoroppervlak van de elektrode, waarbij wordt gewaarborgd dat het sensoroppervlak parallel staat aan de bodem van de Petrischaal, en til de tafel van de schaarlift op zodat de Petrischaal de elektrode bijna raakt (Figuur 2).
  2. Voorbereiding van monsters voor meting
    OPMERKING: Monsters: Alleen de eindproducten die gemeten worden met een ion-selectieve elektrode (ISE), bestaande uit de F¯-trap na diffusie, die vervolgens is gecombineerd met azijnzuur en water, worden in dit protocol als monsters aangeduid. 
    1. Om de pH van het monster op 5 in te stellen, verwijdert u de diffusieschaal van de schudplaat en tilt u na de incubatieperiode voorzichtig het deksel op door de petrolatumafdichting te verbreken. Plaats het deksel omgekeerd op een vlak oppervlak, waarbij wordt gewaarborgd dat de drie F¯-trapdruppels ongestoord blijven.
    2. Voeg met een P20-pipet 15–20 µL 0,2 N azijnzuur toe aan één druppel, en voeg vervolgens alle drie de druppels samen tot één enkele druppel zonder de pipetpunt te vervangen.
      OPMERKING: Monsters met hoge F¯-concentraties hebben de neiging een lagere initiële pH te hebben en vereisen daarom minder 0,2 N azijnzuur om de pH op 5 in te stellen in vergelijking met monsters die minder F¯ bevatten. Omdat het resterende monstervolume na het registreren van het elektrodepotentiaal (stap 5.3) minimaal is, dient het beschikbare resterende monster te worden gebruikt om de pH met indicatorpapier te controleren.
    3. Om het volume van het monster aan te passen, stelt u een P100-pipet in op 75 µL, zuigt u het volledige volume van de F¯-trap op zonder lucht binnen te laten, en stelt u het monster bij tot precies 75 µL met ultra-puur water.
    4. Voer deze stap zorgvuldig uit om een nauwkeurig volume te waarborgen voor de berekeningen van de fluorideconcentratie. Behoud het monster in de pipetpunt en ga onmiddellijk over naar stap 4.3.
  3. Meting van specimen-, kalibratie- en kwaliteitscontrolemonsters
    1. Om het elektrodepotentiaal van het monster te meten, brengt u dit aan tussen het sensoroppervlak van de fluoride-selectieve elektrode en de Petrischaal. Zorg ervoor dat het gehele sensoroppervlak van de elektrode volledig is ondergedompeld in vloeistof, zonder de Petrischaal direct te raken. Laat de potentiometer stabiliseren en registreer het potentiaal (mV) dat door de ISE wordt weergegeven.
    2. Stel de kalibratiestandaardcurve vast door de eerste set kalibratiestandaarden sequentieel te meten, beginnend bij de laagste F¯-concentratie tot aan de hoogste.
      1. Zet het elektrodepotentiaal (mV) uit tegen het logaritme van F¯ (ng) om de kalibratiecurve te construeren (Figuur 3). Pas exponentiële regressie toe om de vergelijking van de standaardcurve en de determinatiecoëfficiënt (R2) te verkrijgen. Accepteer kalibratiecurves alleen wanneer R2 ≥ 0,99 is.
    3. Meet elk specimenmonster en registreer het elektrodepotentiaal (mV).
    4. Om de stabiliteit van de elektrode te bewaken en eventuele drift in de assay te detecteren, meet u gedurende elke analytische run met tussenpozen kwaliteitscontrolemonsters.
      1. Vergelijk de waarden van de kwaliteitscontrolemonsters direct met de overeenkomstige kalibratiemonsters en bevestig een overeenstemming binnen ongeveer 5% om een stabiele elektrodeprestatie in de loop van de tijd te verifiëren.
      2. Meet periodiek een blanco diffusieschaal om de afwezigheid van fluoridecontaminatie tijdens de monsterbehandeling en diffusie te bevestigen.
  4. Gebruik de vergelijking van de standaardcurve om de massa F¯ (ng) in elk specimenmonster te berekenen. Deel deze massa vervolgens door het volume (µL) serum, of de massa (mg) bot- of tandoas die aan de diffusieschaal is toegevoegd.
    1. Voorbeeldberekening van F¯-concentratie in botas (ng/mg)
      1. Massa botas toegevoegd aan diffusieschaal: 5,1 mg ; Elektrodepotentiaal van 75 µL specimenmonster: –31,6 mV
      2. Stap 1: Bereken de fluoridemassa met behulp van de kalibratievergelijking
        1. F⁻ massa (ng) = 3505,4 x e(-0,043x-31,6)
        2. F⁻ massa (ng) = 13.641 ng
      3. Stap 2: Bereken de fluorideconcentratie in botas
        1. F⁻ concentratie =  13.641 ng  /  5,1  mg
        2. F⁻ concentratie =  2.675 ng / mg (ppm)

Diagram van potentiometrische analyse: ISE met potentiometer meet monster op schaarlift voor iondetectie.
Figuur 2: Schema van de ISE-meetopstelling. Figuur 2 illustreert de configuratie die wordt gebruikt voor fluoride-ionmetingen met een dubbelkanaals ion-selectieve elektrode (ISE). Een Petrischaal is geplaatst op een schaarlift om een nauwkeurige aanpassing van de hoogte ten opzichte van de elektrode mogelijk te maken. De ISE is verbonden met een potentiometer en is zodanig georiënteerd dat het detectieoppervlak parallel staat aan het vlak van de Petrischaal, met een afstand van ongeveer 1–2 mm. Nadat de afstand is ingesteld, wordt een klein volume monster (75 µL) gepipetteerd in de opening tussen het detectieoppervlak en de Petrischaal, waardoor wordt gewaarborgd dat het monster het detectiegebied van de elektrode tijdens de meting volledig bedekt. Deze figuur is door de auteurs gemaakt met Biorender en is gelicentieerd onder de CC BY-licentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Fluoride-ionkalibratiegrafiek; lineaire regressie; elektrodepotentiaal vs. concentratie in mV/nanogrammen.
Figuur 3: Kalibratiecurve en bijbehorende kalibratietabel voor kwantificering van de fluoride-ionmassa in tandspecimenmonsters. Bovenpaneel: Voorbeeld van de kalibratiecurve die is gebruikt om de fluoride-ionmassa in tandspecimenmonsters te bepalen. De x-as toont de elektrodepotentiaal (mV, lineaire schaal) en de y-as toont de overeenkomstige fluoride-ionmassa (ng F⁻, logaritmische schaal). Gemeten kalibratiepunten zijn weergegeven als een doorgetrokken lijn en de gefitte exponentiële regressie is weergegeven als een stippellijn. Een inzetkader toont de vergelijking van de standaardcurve en de determinatiecoëfficiënt (R2 = 0,99). Onderpaneel: Tabel met de numerieke waarden die zijn gebruikt om de kalibratiecurve te genereren. De eerste rij vermeldt de vijf elektrodepotentialen (mV) die zijn geregistreerd voor de kalibratiemonsters. De tweede rij geeft de overeenkomstige fluoride-ionmassa's (ng F⁻) voor elk kalibratiemonster. De derde rij vermeldt de volumes (µL) van 10 mM NaF-stamlopossing die aan de kalibratiediffusieschalen zijn toegevoegd; deze toegevoegde fluoride-ionmassa is gelijk aan de massa die in elk kalibratiemonster is vastgelegd na diffusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Om de toepassing van dit protocol voor het meten van fluoride (F-)concentraties in biologische materialen aan te tonen, werden monsterstalen gemaakt van serum, bot en mandibulaire snijtanden die waren verzameld van muizen die waren blootgesteld aan gecontroleerde fluoridebehandelingen. Mannelijke C57BL/6J-muizen werden toegewezen aan twee leeftijdscategorieën, adolescent (6 weken) en volwassen (18 weken), en kregen gedurende een blootstellingsperiode van 6 weken ofwel fluoridevrij gedeïoniseerd water (0 ppm F⁻) of drinkwater aangevuld met natriumfluoride (125 ppm F⁻). Per leeftijd en behandelconditie waren vijf dieren opgenomen. Aan het einde van de blootstellingsperiode werden serum, femurs en mandibulaire snijtanden geoogst, waarna de monsterstalen werden klaargemaakt en geanalyseerd volgens het protocol. De representatieve fluorideconcentraties gemeten in serum, bot en tanden zijn hieronder samengevat.

Staafdiagram van fluorideconcentraties; serum, dijbeen, snijtand; analyse van adolescenten versus volwassenen.
Figuur 4: Fluorideconcentraties gemeten in serum, dijbeen en mandibulaire snijtanden. Mannelijke C57BL/6J muizen werden ingedeeld in twee leeftijdscategorieën, adolescenten (6 weken, open staaf) en volwassenen (18 weken, gevulde staaf), en kregen gedurende een blootstellingsperiode van 6 weken ofwel fluoridevrij gedeïoniseerd water (0 ppm F⁻) of drinkwater aangevuld met natriumfluoride (125 ppm F⁻). Aan het einde van de blootstellingsperiode werden de fluorideniveaus gemeten in (A) serum, (B) dijbeen en (C) mandibulaire snijtanden van dezelfde behandelingsgroepen. Serumwaarden onder de detectielimiet (<0.02 ppm) zijn ingetekend ter visualisatie, maar uitgesloten van de statistische analyse. Gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelden ± SD. Vergelijkingen tussen de adolescenten- en volwassenengroepen werden uitgevoerd met een Mann–Whitney U-test met Bonferroni–Dunn-correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/groep). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Fluorideconcentraties in serum
In zowel de adolescente als de volwassen groepen die behandeld werden met 0 ppm fluoride, lagen de serumfluorideconcentraties onder de detectielimiet van de ion-selectieve elektrode (<0.02 ppm). In de 125 ppm behandelgroepen steeg het serumfluoride naar 0.3 ± 0.2 ppm in de adolescente groep en naar 0.7 ± 0.2 ppm in de volwassen groep (p = 0.06). De vergelijking tussen de 125 ppm behandelde adolescente en volwassen groep werd uitgevoerd met een Mann–Whitney U-test met Bonferroni–Dunn-correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0.05, **p < 0.01 (N = 5/groep). De 0 ppm behandelgroepen werden uitgesloten van de statistische analyse. (Figuur 4A, Tabel 1).

Fluorideconcentraties in het dijbeen
In de 0‑ppm behandelgroepen waren de fluorideconcentraties in het dijbeen bij adolescenten (292 ± 39 ppm) significant lager vergeleken met volwassen dieren (896 ± 55 ppm) (p < 0,01). Daarentegen waren in de 125‑ppm groepen de fluorideconcentraties bij adolescenten (4.108 ± 482 ppm) significant hoger dan bij volwassen dieren (2.966 ± 612 ppm) (p = 0,04). Vergelijkingen tussen de adolescente en volwassen groepen werden uitgevoerd met een Mann-Whitney U-toets met Bonferroni-Dunn correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/groep). (Figuur 4B, Tabel 1). Figuur 5A toont de fold-change in femoral fluoride tussen de 0‑ppm en 125‑ppm behandelingen voor elke leeftijdsgroep. Adolescenten vertoonden een 14-voudige toename van de fluorideniveaus bij 125 ppm, terwijl volwassen muizen een 3-voudige toename vertoonden.

Fluorideconcentraties in mandibulaire snijtanden
In de 0 ppm-groepen waren de fluorideconcentraties in de mandibulaire snijtanden significant lager bij adolescenten (35 ± 4 ppm) vergeleken met volwassen dieren (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). In de 125 ppm-behandelingsgroepen stegen de fluorideconcentraties in de snijtanden naar 5641 ± 955 ppm bij adolescenten en 4392 ± 1694 ppm bij volwassen dieren. Vergelijkingen tussen de adolescente en volwassen groepen werden uitgevoerd met een Mann-Whitney U-toets met Bonferroni-Dunn-correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/groep). (Figuur 4C, Tabel 1). Hoewel de absolute fluorideconcentraties bij 125 ppm niet significant verschilden tussen de leeftijdsgroepen, was de fold-change van 0 ppm naar 125 ppm significant groter bij adolescente (161-voudige toename) dan bij volwassen muizen (36-voudige toename) (Figuur 5B).

Staafdiagram dat de impact van fluoride op de fold change in femur- en snijtandweefsel laat zien, adolescenten versus volwassenen.
Figuur 5: Adolescenten vertonen een grotere fold-toename in fluorideaccumulatie in bot en snijtanden dan volwassen muizen. Fold-change in fluorideconcentraties bij een fluoridebehandeling van 0 ppm naar 125 ppm bij adolescente (open staaf) en volwassen (gevulde staaf) muizen. (A) Femurbot en (B) mandibulaire snijtand van dezelfde behandelingsgroepen. Gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelden ± SD. Vergelijkingen tussen adolescente en volwassen groepen werden uitgevoerd met een ongepaarde t-test. * p < 0.05, (N = 5/groep). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MonsterSerumDijbeenOnderkaaksnijtand
LeeftijdsgroepAdolescentVolwassenAdolescentVolwassenAdolescentVolgroeid
Behandelgroep0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192De brontekst is niet opgegeven. Voer aub de tekst in die u wilt laten vertalen.72711114909
Gemiddelde< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
SDGeen gegevens beschikbaar0.2Geen gegevens beschikbaar0.239482556123955231694

Tabel 1: Individuele fluoride-metingen in serum, dijbeen en mandibulaire snijtanden. Tabel 1 vermeldt de individuele fluorideconcentraties (ppm F⁻) gemeten in serum, dijbeen en mandibulaire snijttandmonsters van adolescente en volwassen muizen die zijn blootgesteld aan respectievelijk 0 ppm of 125 ppm fluoride. Voor elk weefseltype worden de gegevens gepresenteerd in kolommen die overeenkomen met de vier behandelingsgroepen: adolescent 0 ppm, adolescent 125 ppm, volwassen 0 ppm en volwassen 125 ppm. Elke kolom bevat de vijf individueel geregistreerde waarden (N = 5), gevolgd door het berekende gemiddelde en de standaarddeviatie (SD). In de adolescent 0 ppm serumgroep lagen alle geregistreerde waarden onder de detectielimiet van de ion-selectieve elektrode (<0,02 ppm). De tabel biedt de ruwe numerieke gegevens die ten grondslag liggen aan de samenvattende waarden en statistische vergelijkingen getoond in Figuur 4.

Discussie

Fluoridemetingen werden uitgevoerd met een fluoride-selectieve ion-selectieve elektrode (ISE) met een lanthaanfluoride (LaF₃) kristalmembraan38,39. Dit membraan vormt zeer stabiele La–F bindingen, wat resulteert in een sterke voorkeur voor fluoride-ionen boven andere halogeniden. Volgens vastgestelde elektrochemische literatuur en fabrikantspecificaties vertoont het LaF₃-membraan zeer lage selectiviteitscoëfficiënten voor chloride, wat aangeeft dat chloride-ionen geen meetbare interferentie veroorzaken onder de in dit protocol gebruikte omstandigheden. Hoewel chloride van nature aanwezig is in tanden en botten, beïnvloedt de activiteit hiervan de elektrodepotentiaal niet, en weerspiegelt het geregistreerde signaal specifiek de fluoride-activiteit. De lagere detectielimiet van 0,02 ppm komt overeen met de door de fabrikant gevalideerde minimale kwantificeerbare concentratie voor de Orion fluoride-selectieve elektrode. Deze limiet weerspiegelt de laagste fluorideconcentratie waarbij de elektrode een stabiele Nernstiaanse respons en een lineaire relatie met de kalibratiecurve behoudt. Omdat de detectielimiet wordt bepaald door de membraankenmerken van de elektrode en is gevalideerd door de fabrikant, was er voor dit protocol geen aanvullende experimentele bepaling nodig; wat betreft het bovenste detectiebereik merkten de auteurs echter op dat fluoridemassa's die ongeveer 38.000 ng overschreden in een 50 µL NaOH-val resulteerden in een niet-lineaire elektroderespons, wat aangeeft dat de kalibratiecurve niet langer betrouwbaar is bij zeer hoge fluoridelast. Deze niet-lineariteit is waarschijnlijk te wijten aan het overschrijden van de optimale ionsterkte en activiteitsrange voor de elektrode onder de gegeven experimentele omstandigheden, in plaats van een inherente bovengrens van de ISE zelf. Voor monsters waarvan wordt verwacht dat ze fluoridemassa's boven deze drempelwaarde bevatten, is het raadzaam om het volume van de NaOH-val te verhogen om metingen binnen het lineaire dynamische bereik van de elektrode te houden.

Deze overweging moet in acht worden genomen bij het toepassen van het protocol op monsters met een ongebruikelijk hoog fluoridegehalte. Omdat de diffusiestap het volledige monstervolume verbruikt, konden er geen dubbele metingen en spike-and-recovery-experimenten worden uitgevoerd op de biologische monsters. Om de analytische nauwkeurigheid en precisie te waarborgen, werden kwaliteitscontrolestandaarden (QC-standaarden) met bekende fluorideconcentraties opgenomen in elke meetserie. Deze QC-standaarden werden op identieke wijze verwerkt en gemeten als de experimentele monsters. Over alle runs heen lagen de gemeten fluorideconcentraties van de QC-standaarden consistent binnen 5% van hun verwachte waarden. Voor elke serie van 10–20 specimenmonsters werden twee onafhankelijke sets van 5–6 kalibratiemonsters parallel aan de specimenmonsters voorbereid, en er werd een kalibratiecurve geregistreerd voorafgaand aan elke meetsessie. Het kalibratiebereik werd voor elke run aangepast om de verwachte fluoridemassa's van de specimenmonsters te benaderen, wat afhankelijk was van het specimen-type, de massa van het materiaal dat aan de diffusieschaal was toegevoegd, en de behandelingsgroep en leeftijd van het dier. Voor serummetingen kwamen de kalibratiestandaarden overeen met fluorideconcentraties van ongeveer 0,06–1,20 ppm in het specimen. Voor metingen aan bot en tand kwamen de kalibratiestandaarden overeen met fluorideconcentraties van ongeveer 19–7.600 ppm in het specimen.

Dit protocol biedt een gevoelige en reproduceerbare methode voor het kwantificeren van de fluoride-ionmassa in serum, bot en tanden met behulp van hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie gevolgd door ISE-analyse. De methode brengt betrouwbaar fluoride in kaart dat is vrijgekomen uit diverse biologische matrices en maakt een kwantitatieve beoordeling mogelijk van fluoride-accumulatie na gecontroleerde blootstelling. Representatieve resultaten van adolescente en volwassen muizen tonen duidelijke leeftijd- en dosisafhankelijke verschillen in fluoride-depositie in verschillende weefsels, wat het nut van deze aanpak onderstreept voor het bestuderen van fluoride-metabolisme en toxicokinetiek in vivo.

Een belangrijk voordeel van dit protocol is het gebruik van diffusieschalen die de fluoride-vrijmakende reactie fysiek scheiden van de fluoride-vangende omgeving. Het met petrolatum afgesloten ontwerp minimaliseert atmosferische uitwisseling en zorgt voor een efficiële opvang van vrijgekomen fluoride-ionen door natriumhydroxidedruppels op het deksel. Met HMDS verzadigd zwavelzuur biedt een sterke en consistente drijvende kracht voor de vrijgave van fluoride uit gemineraliseerde weefsels, waaronder sterk gecalcificeerde structuren zoals botten en tanden. De daaropvolgende ISE-meting, gekalibreerd met diffusie-overeenkomstige standaarden, maakt een nauwkeurige kwantificering mogelijk over een breed dynamisch bereik. Een ander voordeel van deze aanpak is de mogelijkheid om fluoride in extreem kleine biologische monsters te kwantificeren. Gemineraliseerde weefsels van muizen, in het bijzonder de mandibulaire snijtanden, leveren slechts 3–5 mg as per tand op. Conventionele analytische methoden vereisen vaak grotere monstermassa's of een hoger fluoridegehalte om een betrouwbare detectie te bereiken. In tegenstelling hiermee concentreert het op diffusie gebaseerde ontwerp alle fluoride die uit het gehele specimen is vrijgekomen in een klein, gedefinieerd volume, waardoor nauwkeurige kwantificering mogelijk is, zelfs in minuscule monsters met een lage absolute fluoridemassa. Deze eigenschap is bijzonder waardevol voor studies met kleine dieren, beperkte weefselbeschikbaarheid of micro-gedissecteerde gemineraliseerde structuren.

Een primaire beperking van deze methode is de detectielimiet van de ISE die in deze studie is gebruikt (0,02 ppm). Serummonsters van fluoride-vrije controledieren vielen vaak onder deze drempelwaarde, waardoor kwantificering van extreem lage fluorideconcentraties niet mogelijk was. Wanneer sporenconcentraties nabij of onder de detectielimiet worden gemeten, kan een grotere massa of een groter volume van het monster in de diffusieschaal, indien beschikbaar, of het gebruik van alternatieve analytische technieken vereist zijn. Daarnaast vereist de methode een diffusie gedurende de nacht en een zorgvuldige hantering van corrosieve reagentia, wat de doorvoersnelheid in studies met een groot volume kan beperken. Hoewel ISE een gevoelige kwantificering van het totale fluoride biedt, kan het de ruimtelijke verdeling binnen weefsels niet beoordelen. Complementaire benaderingen, zoals scanning elektronenmicroscopie gekoppeld aan energie-dispersieve röntgenspectroscopie (SEM-EDX) of particle-induced gamma-ray emission (PIGE), kunnen worden geïntegreerd om de fluorideverdeling op micro- tot macroschaal te visualiseren en in kaart te brengen. Deze op beeldvorming gebaseerde modaliteiten maken de evaluatie van lokale fluoride-accumulatie in gemineraliseerde of zachte weefsels mogelijk, waardoor ze de ISE-metingen aanvullen en een uitgebreider assessment van het fluoridegehalte in het weefsel bieden.

Verschillende terugkerende technische factoren kunnen de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de fluoride-diffusie en -meting in dit protocol beïnvloeden, en onze observaties benadrukken hoe de voorbereiding van de kalibratie, het afdichten van de diffusieschaal, de pH-controle, de prestaties van de elektrode en de monsterbehandeling gezamenlijk de datakwaliteit bepalen. Mogelijke oorzaken voor een niet-lineaire kalibratiecurve (R2 < 0,99) of metingen van weefselmonsters buiten het verwachte bereik zijn rekenfouten bij het volume NaF-stamoplossing dat aan de diffusieschaal wordt toegevoegd of pipetteerfouten tijdens de bereiding van de kalibratiestandaarden. Aanbevolen actie: Bereid voor elke run ten minste twee onafhankelijke sets kalibratiemonsters voor, zodat er een reserveset beschikbaar is als één kalibratiecurve buiten het verwachte bereik valt. Een onvolledige afdichting van de diffusieschaal kan ook leiden tot fluorideverlies tijdens de diffusie, wat resulteert in kunstmatig lage metingen. Dit gebeurt doorgaans wanneer er onvoldoende vaseline op de rand van het deksel van de diffusieschaal is aangebracht. Aanbevolen actie: Breng een royale hoeveelheid vaseline aan rond de rand van het deksel van de diffusieschaal en druk stevig aan om een volledige afdichting te garanderen. Pipetteerfouten bij het toevoegen van de azijnzuuroplossing aan de NaOH-val kunnen de pH van het monster buiten het optimale bereik van pH 5,0 verschuiven, wat leidt tot een onnauwkeurig fluorideherstel. Aanbevolen actie: Controleer de pH van elk monster met pH-papier en gooi elk monster weg dat buiten pH 5 valt. Kalibratiemonsters kunnen ook buiten de geldige registratielimieten van de fluoride-selectieve elektrode vallen. Concentraties onder 0,02 ppm liggen onder de detectielimiet van de elektrode. Aanbevolen actie: Gebruik geen kalibratiemonsters die minder dan 0,02 ppm fluoride bevatten. Omgekeerd kunnen kalibratiemonsters met excessief hoge fluorideconcentraties de ionsterkte van de oplossing veranderen en niet-lineaire elektroderesponsen produceren. Aanbevolen actie: Bereid aan het begin van het project kalibratieoplossingen voor over een breed fluorideconcentratiebereik om het lineaire werkbereik van de specifieke gebruikte elektrode te bepalen. Als weefselmonsters dit lineaire bereik overschrijden, verlaag dan de weefselmassa of verhoog het volume van de NaOH-val en pas het volume azijnzuur dienovereenkomstig aan om pH 5 te handhaven. Moeite met het verkrijgen van lineaire kalibratiecurves in het bereik 0,02–1 ppm: Een veelvoorkomende oorzaak is veroudering van de elektrode. Oudere fluoride-selectieve elektroden verliezen hun gevoeligheid bij zeer lage fluorideconcentraties. Aanbevolen actie: Vervang de fluoride-selectieve elektrode. Onstabiele potentiometermetingen (signaaldrift of sprongen) treden gewoonlijk op wanneer het meetoppervlak van de elektrode niet volledig is ondergedompeld in de monsteroplossing. Aanbevolen actie: Laat de elektrode zakken zodat het meetoppervlak volledig door het vloeibare monster wordt bedekt.

Over het algemeen biedt dit protocol een robuuste, op kalibratie gebaseerde aanpak voor het kwantificeren van fluoride in diverse biologische matrices en is het uitermate geschikt voor studies naar fluorideblootstelling, weefseldepositie en toxicologische uitkomsten in muismodellen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Het in deze publicatie beschreven onderzoek werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.), en het National Institute of Dental and Craniofacial Research van de National Institutes of Health; R01DE027648 (M.S.) en K02DE029531 (M.S.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Azijnzuur, glaciaalSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
AluminakruiselsAdvalue Technology12 mm buitendiameter × 25 mm H, AL-6212AL-6212
Analytische balansVWRVWR 124B2, d = 0,1 mg—
KralenbeaterReferentiekaderBeadBug 6—
Sproeinaald voor spuitAmazonIndustriële stomp kop naald, 14 G × 0,5 inchX001TT8KX1
KoolstofdioxideAirGas——
Chemische zuurkastMott ManufacturingModel 7421040—
D(+)-sucroseThermo Scientific99,7% voor biochemie177142500
ElektrodevuloplossingThermo ScientificOrion IonPlus vuloplossing900061
EthylalcoholoplossingKoptec140 Proof2401
Vriezer, −80 °CThermo ScientificRevco RDE-serie—
Hittebestendige handschoenenFisher ScientificBel-Art Clavies biohazard-autoclaafhandschoenenH13201
Hexamethyldisiloxaan (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
WaterstofperoxideVWRJ.T. Baker, 30%2204-01
Ion-selectieve elektrodeThermo ScientificOrion Fluoride ISE, dubbelkanaals9609BNWP
Magnetische roerderVWR360-graden roerder—
MicrospatelAmazonWascarvespatel #7A, roestvrij staal—
MicrocentrifugeEppendorf5427R5404000131
MoffelovenThermo ScientificThermolyne kleine moffeloven voor op het aanrecht, 1,3 L, FB1315MFB1315M
OvenBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
Paraformaldehyde-oplossing in PBSThermo Scientific4% paraformaldehyde in PBSJ19943-K2
PetrischaalVWR60 × 15 mm, Onbehandeld25384-092
PetrolatumThermo ScientificPetrolatum, wit, zuiver417090010
pH-indicatorpapierFisher ScientificpH-Fix 4,5–10.092120.3
Porseleinen schaalFisher ScientificFisherbrand smeltkroes, 5 mL, 20 mm hoogte, hoge vormFB-965-B
PotentiometerThermo ScientificOrion Dual Star pH/ISE-meter2115102
Statief met klemVWRRingklem, 15 cm470104-526
KnaagdierdieetBio-ServF1515, AIN-76A, ½ PelletsF1515
ScherenkrikAmazonLaboratorium schaarlift—
ScheidingskolfFisher ScientificEisco, borosilicaatglas, 2 LS89285
NatriumchlorideFisher ScientificGecertificeerd ACS, kristallijnS271-1
NatriumfluorideFisher ScientificGecertificeerd ACS, poederS299-100
NatriumhydroxideFisher ScientificWitte pelletsBP359-500
Roestvrijstalen kraaltjesFisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100 stuksSI-CS05
ZwavelzuurFisher ScientificACS-kwaliteitA300-500
TISAB IIThermo ScientificOrion IonPlus Applicatieoplossing940909
VacuümexsikkaatorFisher ScientificBel-Art Space Saver vacuümdesiccator, 10 inchF42010-0000
VacuümfilterFisher ScientificFlow Bottle-Top Filter, PES, 90 mm, 0.2 µm597-4520
Variabele RockerMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Referenties

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

Herprints en machtigingen

Tags

FluoridekwantificeringHMDS-diffusieserumfluoridebotfluoridetandfluoridebiologische monstersstandaardcurveweefseldepositie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.