Methodenartikel

Kwantificering van fluoride in serum, bot en tanden in een muismodel met behulp van hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie en metingen met ionselectieve elektroden

20 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71488

⸱

28 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oral Science and Translational Research, College of Dental Medicine, Nova Southeastern University, 2Department of Biological Sciences, Bauru School of Dentistry, University of São Paulo, 3Department of Restorative Dentistry and Endodontology, Osaka University Graduate School of Dentistry, 4Unit of Dentistry, Osaka University Hospital, 5Department of Biomedical Sciences, Adams School of Dentistry, The University of North Carolina at Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de bereiding van diffusieschalen gefaciliteerd door hexamethyldisiloxaan (HMDS), gevolgd door metingen met ion-selectieve elektroden om de massa aan fluoride-ionen in het serum, bot en gebit van muizen te kwantificeren. De methode biedt een gevoelige, op kalibratie gebaseerde benadering voor het evalueren van fluoride-accumulatie in biologische monsters.

Samenvatting

Het kwantificeren van fluoridegehalten in biologische weefsels is essentieel voor het begrijpen van fluorideblootstelling, metabolisme en toxiciteit. Dit protocol beschrijft een gevoelige en reproduceerbare methode voor het meten van de fluoride-ionmassa in serum, botten en tanden met behulp van door hexamethyldisiloxaan (HMDS) gefaciliteerde diffusie, gevolgd door analyse met een ion-selectieve elektrode (ISE). Biologische monsters, waaronder serum, dijbeenderen en mandibulaire snijtanden, worden verzameld van muizen die zijn blootgesteld aan gecontroleerde fluoridebehandelingen. Bot- en tandmonsters worden geasst, gemalen en gehydrateerd, terwijl serum direct wordt verwerkt. Elk monster wordt overgebracht naar een diffusieschaal met ultrapuur water en afgesloten met een met petrolatum bekleed deksel voorzien van natriumhydroxidedruppels die dienen als fluoridetraps. Injectie van HMDS-verzadigd zwavelzuur initieert de afgifte en diffusie van fluoride, waardoor de vrijgekomen fluoride-ionen kwantitatief in de traps worden opgevangen. Na een nachtelijke diffusie worden de druppels uit de fluoridetraps samengevoegd tot één enkel monster, aangezuurd tot het vereiste pH-bereik en aangepast naar een gedefinieerd volume voor ISE-meting. Kalibratie-diffusieschalen, geprepareerd met bekende fluoridemassa's, genereren een standaardcurve voor kwantificering, en kwaliteitscontrolemonsters verifiëren de stabiliteit van de elektrode. Representatieve resultaten van adolescente en volwassen muizen die zijn blootgesteld aan 0 of 125 ppm fluoride tonen het vermogen van de methode aan om leeftijds- en dosisafhankelijke verschillen in fluoridegehaltes in serum, botten en tanden te detecteren. Dit protocol biedt een robuuste, op kalibratie gebaseerde benadering voor het kwantificeren van fluoride in diverse biologische matrices en is uitermate geschikt voor studies naar fluorideblootstelling, weefseldepositie en toxicologische uitkomsten in muismodellen. Een belangrijk voordeel van deze methode is het vermogen om fluoride nauwkeurig te kwantificeren in extreem kleine monsters, waaronder de 3–5 mg as verkregen uit individuele muissnijtanden, omdat het diffusieproces al het vrijgekomen fluoride concentreert in een meetbaar monstervolume van minder dan 100 µL.

Inleiding

Fluoride is een natuurlijk voorkomend anion, en een optimaal fluoridegehalte is effectief bij het voorkomen van cariës1,2,3,4,5. In de Verenigde Staten (U.S.) is fluoridering van het gemeentelijk water op 0.7 ppm geïmplementeerd als volksgezondheidsstrategie om de incidentie van cariës te verminderen en de mondgezondheid te bevorderen6. Echter kan langdurige inname van overmatig fluoride meerdere weefsels nadelig beïnvloeden. Blootstelling aan hoge concentraties fluoride verstoort de glazuurvorming7,8,9, verandert de botvorming10 en tast de skeletintegriteit aan11.

Op cellulair niveau induceert blootstelling aan fluoride verschillende metabole verstoringen, waaronder oxidatieve stress12, stress van het endoplasmatisch reticulum13, epigenetische modificaties die de genexpressie veranderen14 en apoptose in ameloblasten15,16,17,18. Wereldwijd vormen verhoogde fluorideconcentraties in grondwater (>1.5 ppm) een aanzienlijk gezondheidsrisico. Een recente predictieve modelstudie schatte dat ongeveer 180 miljoen mensen wereldwijd potentieel worden beïnvloed door overmatige blootstelling aan fluoride, waarbij de hoogste last voorkomt in Azië en Afrika1. Naast drinkwater vindt blootstelling aan fluoride ook plaats via voedingsmiddelen (bijv. zeevruchten; ~1.9 ppm), dranken (bijv. thee; 0.5–6 ppm19) en tandverzorgingsproducten zoals tandpasta20 (1.000–1.500 ppm).

Inzicht in fluoride-blootstelling, metabolisme en weefseldepositie is daarom essentieel voor het evalueren van zowel de therapeutische voordelen als de potentiële toxicologische gevolgen. Nauwkeurige kwantificering van fluoride in biologische monsters — waaronder urine, serum, bot en tanden — is een cruciaal onderdeel van dit werk. Meting is echter analytisch uitdagend vanwege het chemische gedrag van fluoride en de sterke affiniteit ervan voor calciumrijke matrices. Ongeveer 99% van het fluoride in het lichaam bevindt zich in gemineraliseerde weefsels zoals bot en tanden21. Om deze uitdagingen aan te pakken, zijn diverse analytische technieken ontwikkeld, waaronder ionselectieve elektrode (ISE) potentiometrie, ionchromatografie, colorimetrische assays, titrimetrische procedures en nucleaire of activatiegebaseerde methoden22. Hiervan is de door hexamethyldisiloxaan (HMDS) gefaciliteerde diffusietechniek, gecombineerd met fluoride-selectieve elektrodemeting, een van de meest betrouwbare en veelgebruikte benaderingen voor biologische matrices gebleken vanwege de gevoeligheid, reproduceerbaarheid en compatibiliteit met diverse monstertypes23,24,25,26,27,28,29.

Ondanks de beschikbaarheid van meerdere analytische methoden heeft elke benadering beperkingen die het gebruik in experimenteel of klinisch onderzoek kunnen belemmeren. Ionchromatografie biedt een hoge gevoeligheid en selectiviteit, maar vereist gespecialiseerde instrumentatie en uitgebreide monstervoorbereiding30,31. Colorimetrische assays, zoals de SPADNS-methode (natrium 2‑(parasulfophenylazo)‑1,8-dihydroxynaphthalen-3,6‑disulfonaat), zijn eenvoudig en goedkoop, maar zijn gevoelig voor interferentie door troebelheid en endogene chromoforen, wat hun betrouwbaarheid in complexe biologische monsters beperkt22,32,33. Titrimetrische methoden zijn kosteneffectief en ongecompliceerd, maar missen de gevoeligheid die nodig is voor de detectie van fluoride op spuurniveau in de meeste biologische monsters34. Nucleaire of activatiegebaseerde technieken bieden een uitzonderlijke gevoeligheid, maar vereisen toegang tot reactoren of accelerator-gebaseerde neutronenbronnen, waardoor ze onpraktisch zijn voor routinematig laboratoriumgebruik35. In contrast hiermee biedt HMDS-gefaciliteerde diffusie gevolgd door ISE-meting een praktische balans tussen gevoeligheid, kosten en toegankelijkheid, terwijl een volledige vrijgave van fluoride uit zowel zachte als gemineraliseerde weefsels wordt gegarandeerd. Dit is bijzonder voordelig voor studies met kleine dieren, waarbij de weefselbeschikbaarheid beperkt is en gemineraliseerde structuren, zoals snijtanden van muizen, slechts 3–5 mg as per tand opleveren.

Het vermogen van de diffusie-ISE-methode om al het vrijgekomen fluoride te concentreren in een klein, gedefinieerd volume maakt nauwkeurige kwantificering mogelijk, zelfs in extreem kleine monsters. Dit maakt de methode zeer geschikt voor toxicokinetische studies, dosis-responsexperimenten en onderzoeken naar de fluoride-metabolisme in verschillende ontwikkelingsstadia. Kleine knaagdieren, in het bijzonder C57BL/6J-muizen, zijn veelvuldig gebruikt als diermodellen voor het bestuderen van de effecten van fluoride7,9,12,29,36 .

In dit protocol passen de auteurs de HMDS-gefaciliteerde diffusietechniek toe, gevolgd door meting met een fluoride-selectieve elektrode, om fluoride te kwantificeren in serum, bot en tanden verzameld van muizen die zijn blootgesteld aan een hoge fluoridedosis (125 ppm) vergeleken met onbehandelde controles. De auteurs vergelijken verder de fluorideaccumulatie in adolescente (6 weken bij aanvang van de behandeling) en volwassen (18 weken bij aanvang van de behandeling) muizen om leeftijdsafhankelijke verschillen in fluoridemetabolisme en weefseldepositie te evalueren. De mandibulaire snijtanden werden gekozen als representatief tandweefsel omdat knaagersnijtanden continu doorbreken en rond de leeftijd van 7 weken een steady-state balans bereiken tussen doorbraak en occlusale slijtage. Dit continue groeipatroon biedt een consistente en toegankelijke gradiënt van glazuurontwikkeling, waardoor muisnijtanden een veelgebruikt en goed gevalideerd model zijn voor het onderzoek naar glazuurvorming en dentale fluorose.

Protocol

Alle procedures die in dit protocol worden beschreven, zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en regelgeving voor het gebruik van gewervelde dieren, goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van Nova Southeastern University (protocol nr. 2023.02.MSuz1), welke is geaccrediteerd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Alle werkzaamheden met dieren waren in overeenstemming met de richtlijn voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren en de richtlijnen van de American Veterinary Medical Association (AVMA) voor de euthanasie van dieren. Alle materialen die in deze studie zijn gebruikt, staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Dieren en preparatie en toediening van natriumfluoride in een muismodel

  1. Dieren: Verdeel mannelijke C57BL/6J-muizen over twee leeftijdscategorieën: adolescenten, 6 weken bij aanvang van de behandeling, en volwassenen, 18 weken bij aanvang van de behandeling.
    1. Voorzie elke groep van ofwel fluoridevrij gedeïoniseerd water (0 ppm F⁻) of drinkwater aangevuld met natriumfluoride (125 ppm F⁻) gedurende een blootstellingsperiode van 6 weken.
    2. Hanteer vijf dieren per leeftijdscategorie en behandelconditie (N = 5/groep).
    3. Oogst aan het einde van de blootstellingsperiode serum, femurs en mandibulaire snijtanden, en bereid alle verzamelde monsters voor op verdere analyse.
      ​OPMERKING: Monster: Verwerkt materiaal zoals asgedroogd bot, asgedroogde tand en serum.
  2. Huisvesting en dieet van de dieren: Huisvest de muizen onder standaard laboratoriumcondities met ad libitum toegang tot voedsel en water.
    1. Bied een fluoridevrij dieet aan vanaf één week vóór de verzameling van tanden, bot en serum om achtergrondfluorideniveaus te minimaliseren.
  3. Natriumfluoride drinkwater
    1. Om fluoride-aangevuld drinkwater te bereiden, wordt natriumfluoride (NaF) opgelost in gedeïoniseerd water om de gewenste fluorideconcentratie te bereiken (bijv. 125 ppm F⁻).
    2. Filtreer de oplossing door een vacuümfilter van 0,2 µm in een geautoclaveerde fles. Bereid elke 2 dagen een verse oplossing.
      WAARSCHUWING: NaF is toxisch bij inname en kan huid- en oogirritatie veroorzaken. Hanteer dit in een zuurkast terwijl u een laboratoriumjas, nitrielhandschoenen en een veiligheidsbril draagt.
  4. Voor fluoridevrij controlewater wordt gedeïoniseerd water door een vacuümfilter van 0,2 µm in een geautoclaveerde fles gefiltreerd. Bereid elke 2 dagen vers water.
  5. Bied fluoride-aangevuld of fluoridevrij drinkwater ad libitum aan gedurende de gewenste duur van de fluoridebehandeling. Controleer dagelijks de waterstanden en vervang de flessen elke 2 dagen.
  6. Euthanaseer de dieren aan het einde van de blootstellingsperiode via koolstofdioxide-inhalatie (CO₂) gevolgd door decapitaties. De euthanasieprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals en werden goedgekeurd als onderdeel van het institutionele IACUC-protocol.
    WAARSCHUWING: CO2 is een verstikkingsmiddel. Voer procedures uit in een goed geventileerde ruimte en zorg dat de kamer correct functioneert. Vermijd directe blootstelling door inhalatie.

2. Specimenpreparatie voor fluoride-meting

  1. Bloedafname
    1. Euthanasie van muizen met CO₂ inhalatie en verzamel onmiddellijk bloed via een terminale hartpunctie met een tuberculinespuit van 1 mL. Breng het bloed over in microcentrifugebuisjes van 1,5 mL. Voer alle gebruikte naalden en spuiten af in een door de instelling goedgekeurde container voor scherp afval.
      WAARSCHUWING: Spuitnaalden zijn scherp en kunnen steekverwondingen veroorzaken; hanteer ze met zorg.
    2. Bewaar het bloed gedurende 30 min bij kamertemperatuur en centrifugeer het vervolgens 10 min bij 2.000 × g.
    3. Overdracht het supernatant (serum) naar een microcentrifugebuisje en bewaar dit bij −80 °C.
      WAARSCHUWING: Ultra-low vriezers vormen een risico op bevriezing. Draag geïsoleerde handschoenen bij het hanteren van buisjes en vermijd langdurig huidcontact met koude oppervlakken.
  2. Botten
    1. Extractie van de femora: Dissecteer na euthanasie de achterpoten bij de heupgewrichten.
    2. Verwijder zorgvuldig alle weke delen van de femora. Was de weefsels drie keer met gedeïoniseerd water. Bewaar de botten bij -80 °C tot verdere verwerking. Gooi verwijderd zacht weefsel en alle gecontamineerde materialen weg via de institutionele stroom voor biologisch afval.
      OPMERKING: Weefsels kunnen voor langdurige bewaring in 70% ethanol gedurende 12–16 uur gefixeerd worden in 4% paraformaldehyde met 2% sucrose. Deze fixatieprocedure beïnvloedt de nauwkeurigheid van de daaropvolgende fluoridekwantificering niet.
    3. Spoel de botten grondig af met gedeïoniseerd water. Dep overtollig vocht weg met een pluisvrije papieren handdoek.
    4. Overbreng de botten naar 1,5 mL microcentrifugebuisjes met open deksels om verdamping mogelijk te maken en plaats deze in een droogoven bij 60 °C. °C gedurende 12–16 u.
      WAARSCHUWING: De droogoven kan brandwonden veroorzaken. Gebruik hittebestendige handschoenen bij het hanteren van monsters.
    5. Verassen van botten: Breng de gedroogde botten over in aluminiumoxidekroesjes. Plaats de kroesjes in een moffeloven en verhit deze tot 600 °C bij 150 °C/u, en houd dit vervolgens 6 u aan. Laat de oven afkoelen tot onder de 200 °C voordat de smeltkroezen worden verwijderd. Voer eventuele resterende botfragmenten of gecontamineerde verbruiksartikelen af via de institutionele stroom voor biologisch afval.
      WAARSCHUWING: De moffeloven en de smeltkroezen bereiken extreme temperaturen, wat een ernstig risico op brandwonden inhoudt. Laat de oven altijd afkoelen voordat u de smeltkroezen hanteert. Draag bij het verwijderen van de smeltkroezen een laboratoriumjas, een veiligheidsbril en hittebestendige handschoenen, en gebruik een lange pincet om direct contact met hete oppervlakken te vermijden.
      CRUCIALE STAP: Onvolledige verassing zal naderhand de analyses beïnvloeden. Controleer of het botmateriaal een volledig geoxideerde toestand heeft bereikt voordat u verdergaat; elk residu van koolstof zal de daaropvolgende metingen verstoren.
      ​OPMERKING: Correct veras bot moet er uniform lichtgrijs tot wit uitzien. Donkerdere deeltjes — in het bijzonder zwarte of houtskoolachtige residuen — duiden op onvolledige verbranding. Indien er verkleuring aanwezig is, dient de asstijd te worden verlengd om volledige verwijdering van organisch materiaal mogelijk te maken.
    6. Opslag van asbehandelde botten: Breng de botten direct na het assen over naar 1,5 mL microcentrifugebuisjes. Sluit de buisjes af met Parafilm en bewaar ze in een vacuümdesiccator tot gebruik.
  3. Tanden
    1. Extractie van de mandibulaire incisiven: Maak een horizontale incisie ter hoogte van het temporomandibulaire gewricht om de mandibula van de maxilla te scheiden.
    2. Voer midsagittale sneden uit om zowel de maxilla als de mandibula in linker- en rechterhelften te verdelen.
    3. Was de weefsels drie keer in gedeïoniseerd water en extraheer zorgvuldig de mandibulaire snijtanden. Bewaar de geëxtraheerde snijtanden bij -80 °C. °C tot verder gebruik. Gooi geëxtraheerde zachte weefsels en alle besmette verbruiksartikelen weg via de institutionele biologische afvalstroom.
      WAARSCHUWING: Gebruik scherpe dissectie-instrumenten voorzichtig bij het maken van sneden bij het temporomandibulair gewricht en in het midsagittale vlak om persoonlijk letsel te voorkomen. Draag geschikte PBM, waaronder handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril.
      OPMERKING: Weefsels kunnen voor langdurige bewaring in 70% ethanol gedurende 12–16 uur worden gefixeerd in 4% paraformaldehyde met 2% sucrose. Deze fixatieprocedure heeft geen invloed op de nauwkeurigheid van de daaropvolgende fluoridekwantificatie.
    4. Tandvoorbereiding voor assing: Spoel de tanden grondig met gedeïoniseerd water en plaats ze in 1% waterstofperoxide (H₂O₂) gedurende 12–16 uur. Voer gebruikte waterstofperoxide-oplossingen af als gevaarlijk chemisch afval.
    5. Spoel opnieuw met gedeïoniseerd water, dep kort droog met een pluisvrije tissue en breng over naar 1,5 mL microcentrifugebuisjes met open doppen. Plaats de buisjes in een droogoven bij 60 °C gedurende 12–16 u.
      WAARSCHUWING: Waterstofperoxide is een oxidator en kan huid- en oogirritatie veroorzaken. Hanteer dit in een zuurkast terwijl u een laboratoriumjas, nitrielhandschoenen en een veiligheidsbril draagt. Vermijd contact met brandbare materialen.
    6. Verassen van tanden: Breng gedroogde tanden over in aluminiumoxidekroezels en veras deze in een moffeloven bij een stabiele temperatuur van 600. °C gedurende 20 u, met een opwarmingssnelheid van 150 °C/u.
    7. Verwijder de smeltkroezen pas nadat de oven is afgekoeld tot onder de 200 °C °C.
      WAARSCHUWING: De muffeloven en de smeltkroezen bereiken extreme temperaturen, wat een ernstig risico op brandwonden vormt. Laat de oven afkoelen tot onder de 200 °C voordat u de smeltkroezen hanteert. Draag bij het verwijderen van de smeltkroezen een laboratoriumjas, een veiligheidsbril en hittebestendige handschoenen, en gebruik een lange pincet om direct contact met hete oppervlakken te vermijden.
      CRUCIALE STAP: Zorg voor volledige oxidatie; residuïstiek van koolstof zal interfereert met opvolgende analyses.
      OPMERKING: Verast tandmateriaal moet er egaal lichtgrijs tot wit uitzien. Veras opnieuw als er zwarte residuen achterblijven.
    8. Bewaring van asgeblazen tandmonsters: Breng de tanden direct na het assen over naar microcentrifugebuisjes van 2 ml met een ronde bodem.
    9. Sluit de buisjes af met Parafilm en bewaar ze in een vacuümdesiccator tot gebruik.

3. Voorbereiding van HMDS-gefaciliteerde diffusieschalen

  1. Reagentia en materiaal
    1. 6 N zwavelzuur: Maak ten minste twee dagen voor het voorbereiden van de diffusieschalen een voorraadoplossing van 6 N zwavelzuur.
      OPMERKING: Diffusieschaal: Een afgesloten vat dat is ontworpen om een gecontroleerde, gesloten omgeving te creëren waarin vrijgekomen componenten van een bewerkt biologisch materiaal kunnen worden opgevangen door een chemische val die aan het deksel is bevestigd. Het afgesloten ontwerp voorkomt uitwisseling met de buitenlucht en zorgt ervoor dat vrijgekomen analyten naar de val worden geleid voor daaropvolgende meting.
    2. Plaats een 1 Giet de vloeistof in een plastic bekerglas met een magnetische roerstaf op een magneetroerder en voeg 416 toe mL ultrapuur water.
    3. Met behulp van een 50 84 mL serologische pipette, voeg langzaam toe mL van 36 N H₂SO₄ aan het water terwijl er continu wordt geroerd. De oplossing zal warm worden; laat deze afkoelen tot kamertemperatuur. Voer ongebruikte of verbruikte zwavelzuuroplossingen af als gevaarlijk chemisch afval via de institutionele chemische afvalstroom.
      WAARSCHUWING: Zwavelzuur is sterk corrosief. Werk in een zuurkast en draag zuurbestendige handschoenen, een laboratoriumjas en een veiligheidsbril. Spoel bij contact onmiddellijk met overvloedig water.
    4. met HMDS verzadigd 6 N zwavelzuur: Overbreng de 6 N zwavelzuur aan een 2 Scheidtrechter L en voeg 15 toe mL hexamethyldisiloxaan (HMDS).
    5. Zorg ervoor dat de stop en de stopkraan stevig gesloten zijn, houd de scheitrechter zijwaarts en schud krachtig totdat er kleine HMDS-druppeltjes zichtbaar zijn.
    6. Open de stop om het ontwikkelgas te laten ontsnappen en herhaal dit proces nog twee keer.
    7. Laat de stop meerdere uren halfopenstaan. Bewaar de scheidtrechter met de 6 HMDS-verzadigd zwavelzuur in een statief in de chemische zuurkast. Voer HMDS-houdend zwavelzuur en besmette materialen af als gevaarlijk chemisch afval.
      WAARSCHUWING: HMDS is ontvlambaar en giftig bij inademing. Hanteer in een zuurkast terwijl u een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril draagt. Houd weg van ontstekingsbronnen.
    8. 0,05 N natriumhydroxide: Los 1 g NaOH-pellets in 25 mL ultrapuur water om een 1 N-stamoplossing.
    9. Mengsel 2 mL van de 1 N NaOH-voorraadoplossing met 38 mL ultrapuur water om een 0,05 N NaOH-oplossing.
    10. Portioneer de 0,05 N NaOH in 1,5 mL microcentrifugebuisjes voor eenmalig gebruik, sluit de doppen af met Parafilm en bewaar de buisjes in een vacuümdesiccator om CO2 te minimaliseren₂ absorptie. Voer ongebruikte of verbruikte natriumhydroxide-oplossingen af als gevaarlijk chemisch afval.
      WAARSCHUWING: Natriumhydroxide is zeer corrosief en kan ernstige brandwonden veroorzaken. Draag een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril. Behandel oplossingen zorgvuldig om spatten te voorkomen.
    11. 0,2 N azijnzuur: voeg 575 µL geconcentreerd azijnzuur aan ultrapuur water toevoegen en aanvullen tot een eindvolume van 50 mL om 0,2 voor te bereiden N azijnzuur. Voer azijnzuuroplossingen af als gevaarlijk chemisch afval.
      WAARSCHUWING: Azijnzuur is corrosief en kan de huid, ogen en luchtwegen irriteren. Hanteer dit in een chemische zuurkast terwijl u een laboratoriumjas, handschoenen en een veiligheidsbril draagt.
    12. Petrolatum: Smelt ongeveer 100 g petrolatum bij 60 °C in een oven. Aspireer de vloeibare petrolatum in 10 mL-spuiten en laat deze afkoelen en stollen. Met petrolatum gevulde spuiten kunnen gedurende enkele weken bij kamertemperatuur worden bewaard.
    13. Petrischaal: Gebruik 60 × 15 mm onbehandelde petrischalen voor het bereiden van diffusieschalen.
    14. Smelt met een verhitte 18-G spuitnaald een klein gaatje in het deksel van een petrischaal.
    15. Bedek de binnenrand van het deksel met een doorlopende petrolatumafdichting met behulp van een 10 mL-spuit voorzien van een stompe 14-gaage naald G-naald. Gooi alle gebruikte naalden weg in een door de instelling goedgekeurde container voor scherpe afvalstoffen.
      WAARSCHUWING: Spuitnaalden zijn scherp en kunnen steekverwondingen veroorzaken. Hanteer ze voorzichtig en gooi ze af in goedgekeurde naaldencontainers. Draag hittebestendige handschoenen en oogbescherming bij het verhitten van naalden om brandwonden te voorkomen.
    16. NaF-stoomoplossingen voor kalibratie van diffusieschalen. Los 4,19 g NaF in 1 Voeg ultrapuur water toe om een 100 mM stokoplossing. Bereid 10 mM, 100 µM, en 10 µM stockoplossingen door middel van opeenvolgende 1:10 verdunningen van de 100 mM-oplossing.
      OPMERKING: Eén mol NaF levert 19 g F⁻; daarom, 1 µL van 10 µM NaF bevat 0,19 ng F⁻ en 1 µL van 10 mM NaF bevat 190 ng F⁻.
      ​OPMERKING: Kalibratieschalen voor diffusie: Diffusieschalen die specifiek worden gebruikt voor kalibratie met een bekende massa fluoride-ionen (F-).¯).
  2. Voorbereidingen van diffusieschalen voor specifieke monsters
    1. Serumdiffusieschaal: Pipetteer 3 ml ultrapuur water in de bodem van de Petrischaal en voeg toe 75 µL serum. Gooi alle met serum besmette materialen weg via de institutionele stroom voor biologisch afval. Ga verder met stap 3.4.
    2. Botdiffusieschaal
      1. Pulverisatie van botas: Gebruik een microspatel om de asresten van de botten in de 1,5 mL microcentrifugebuisjes te malen tot een fijn poeder. Ga onmiddellijk verder met de verwerking van de gepulveriseerde botas. Voer verbruiksartikelen die besmet zijn met botas af via de institutionele chemische afvalstroom.
      2. Wegen en hydrateren van botas
        1. Plaats de lege bodem van de petrischaal op de weegpan van een analytische balans met een afleesbaarheid van ten minste 0,1. mg.
        2. Overbreng de gemalen beenas uit de 2 mL microcentrifugebuisje in een klein porseleinen schaaltje om statische lading te minimaliseren en poederverspreiding te voorkomen.
        3. Voeg met een microspatel ongeveer 5 mg botenas aan de schaal toevoegen en het poeder onmiddellijk bedekken met 3 mL ultrapuur water voordat het schaaltje van de analytische balans wordt verwijderd, om verspreiding van as te voorkomen.
        4. Noteer het exacte gewicht van elk bemonster van botas. Ga verder met stap 3.4.
    3. Tandsdiffusieschaal
      1. Frezen van asgecalcineerde tanden
        1. Overbreng de asresten van de incisivussen naar 2 mL microcentrifugebuisjes met ronde bodem en voeg een 5 voeg aan elke buis een roestvrijstalen kraal van mm diameter toe. Sluit de buizen en dicht de doppen af met Parafilm.
        2. Pulveriseer de asresten van de snijtanden in een bead-beater bij 2.500 rpm voor 10 Ga onmiddellijk verder met de verwerking van de gemalen tanden.
      2. Wegen en hydratatie van asgebehandelde tanden
        1. Giet de volledige inhoud van de buis, inclusief de roestvrijstalen kraal, in de bodem van de diffusieschaal die op de weegschaal van een analytische balans is geplaatst. Voer besmette verbruiksartikelen die tandas bevatten af via de institutionele chemische afvalstroom.
        2. Verwijder de roestvrijstalen kraal uit de schaal en noteer het exacte gewicht van de tandas (doorgaans 3–4 mg per mandibulaire snijtand).
        3. Voeg onmiddellijk 3 toe mL ultrapuur water om de tandas te bedekken voordat het schaaltje van de balans wordt verwijderd, om verspreiding van de as door statische ontlading te voorkomen. Ga verder met stap 3.4.
  3. Kalibratie en kwaliteitscontrole van diffusieschalen
    1. Bereid, parallel aan de diffusieschalen voor de monsters, twee sets kalibratiediffusieschalen voor voor een kalibratie met 5–6 punten en één identieke set kwaliteitscontroleschalen, inclusief een blanco.
      OPMERKING: Diffusieschalen voor kwaliteitscontrole: Deze worden op identieke wijze geprepareerd als de kalibratiediffusieschalen, maar worden periodiek gebruikt om de stabiliteit van de elektrode te verifiëren en consistente meetprestaties te waarborgen.
    2. Pipette 3 mL ultrapuur water in elk van de 11 of 13 Petrischalen en voeg NaF-stock toe om de verwachte F te overspannen¯ massa-bereik in de specimenmonsters. Ga verder met stap 3.4. om de assemblage van de diffusieschaal te voltooien37.
  4. Voltooiing van de assemblage van de diffusieschaal
    1. Om een fluoride-vanger depositie op te bouwen, 50 µl voeg drie druppels 0,05 N NaOH toe aan het binnenoppervlak van het deksel van de petrischaal, ruim verwijderd van de rand van het deksel.
      OPMERKING: Fluorideval (F¯ Val): Een onderdeel van diffusieschalen dat F opvangt¯, specifiek natriumhydroxide (NaOH).
    2. Keer het deksel om zonder de NaOH-druppels te verstoren en sluit het stevig af op de bodem van de schaal met de petrolatum.
    3. Om een 3 N HMDS-verzadigde zwavelzuuroplossing te bereiden, mengt u gelijke volumes van 6 N HMDS-verzadigd zwavelzuur en ultrapuur water. Bereid dit direct voor gebruik vers, aangezien het niet bewaard kan worden.
    4. Injecteer met een 10 ml spuit, voorzien van een 20 G naald, 3 mL van het bereide 3 N HMDS-verzadigde zwavelzuur via het gat in het deksel in het water onderin de diffusieschaal. Let erop dat er geen zuur op het binnenoppervlak van het deksel spat bij het inbrengen of terugtrekken van de injectienaald.
    5. HMDS-gefaciliteerde fluoride-diffusie: Seal het injectiegat onmiddellijk met een druppel vaseline die de opening volledig afdekt en plaats de diffusieschalen op een variabele rocker die op een lage snelheid is ingesteld. Incubeer dit gedurende de nacht bij kamertemperatuur (Figuur 1).

figure-protocol-1
Figuur 1: Schema van een botdiffusieschaal voor fluoride-extractie en -opvang. Figuur 1 illustreert het ontwerp van een botdiffusieschaal gemonteerd in een onbehandelde Petri-schaal van 60 × 15 mm. Het deksel bevat een klein injectiegat dat is afgedicht met een petrolatumbolletje. Op het binnenoppervlak van het deksel zijn drie druppels NaOH geplaatst als fluoride-ion (F⁻) vallen, die tijdens de diffusie aan het deksel hangen. Het deksel is luchtdicht aan de bodem van de schaal afgekit met petrolatum. De bodem van de Petri-schaal bevat ultrapuur water, met hexamethyldisiloxaan (HMDS) verzadigd zwavelzuur en botas, die samen de reactieomgeving vormen voor de fluoride-vrijgave en daaropvolgende opvang. Deze figuur is door de auteurs gemaakt met BioRender en de figuur is gelicentieerd onder de CC BY-licentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Fluoridemeting met een ISE

  1. Opstelling van de ISE
    1. Vul de fluoride-selectieve elektrode met dubbel kanaal met de juiste vuloplossing, sluit deze aan op de potentiometer en bevestig de elektrode in een elektrodehouder.
    2. Plaats een onbehandelde Petri-schaal op een schaarhefplatform onder het detectieoppervlak van de elektrode, waarbij u ervoor zorgt dat het detectieoppervlak parallel is aan de bodem van de Petri-schaal, en til de tafel van het schaarhefplatform op zodat de Petri-schaal de elektrode bijna raakt (Figuur 2).
  2. Voorbereiding van monsters voor meting
    OPMERKING: Monsters: Alleen de eindproducten die gemeten worden met een ion-selectieve elektrode (ISE), bestaande uit de F¯-trap na diffusie, die vervolgens is gecombineerd met azijnzuur en water, worden in het protocol als monsters aangeduid. 
    1. Om de pH van het monster op 5 in te stellen, verwijdert u de diffusieschaal van de schudplaat en tilt u na de incubatieperiode voorzichtig het deksel op door de petrolatumafdichting te verbreken. Keer het deksel om op een vlak oppervlak, waarbij u ervoor zorgt dat de drie F¯-trapdruppels ongestoord blijven.
    2. Voeg met een P20-pipet 15–20 µL 0,2 N azijnzuur toe aan één druppel, en voeg vervolgens alle drie de druppels samen tot één enkele druppel zonder de pipetpunt te vervangen.
      OPMERKING: Monsters met hoge F¯-concentraties hebben de neiging een lagere initiële pH te hebben en vereisen daarom minder 0,2 N azijnzuur om de pH op 5 in te stellen in vergelijking met monsters die minder F¯ bevatten. Omdat het resterende monstervolume na het registreren van het elektrodepotentiaal (stap 5.3) minimaal is, gebruikt u het beschikbare resterende monster om de pH met indicatorpapier te verifiëren.
    3. Om het volume van het monster aan te passen, stelt u een P100-pipet in op 75 µL, zuigt u het volledige volume van de F¯-trap op zonder lucht binnen te laten, en stelt u het monster bij tot precies 75 µL met ultrapuur water.
    4. Voer deze stap zorgvuldig uit om een nauwkeurig volume te garanderen voor de berekeningen van de fluorideconcentratie. Houd het monster in de pipetpunt en ga direct door naar stap 4.3.
  3. Meting van specimen, kalibratie- en kwaliteitscontrolemonsters
    1. Om het elektrodepotentiaal van het monster te meten, brengt u dit aan tussen het detectieoppervlak van de fluoride-selectieve elektrode en de Petri-schaal. Zorg ervoor dat het gehele detectieoppervlak van de elektrode volledig is ondergedompeld in vloeistof, zonder de Petri-schaal direct te raken. Laat de potentiometer stabiliseren en registreer het door de ISE weergegeven potentiaal (mV).
    2. Bepaal de kalibratiestandaardcurve door de eerste set kalibratiestandaarden sequentieel te meten, beginnend bij de laagste F¯-concentratie en progressief naar de hoogste.
      1. Zet het elektrodepotentiaal (mV) uit tegen het logaritme van F¯ (ng) om de kalibratiecurve te construeren (Figuur 3). Pas exponentiële regressie toe om de vergelijking van de standaardcurve en de determinatiecoëfficiënt (R2) te verkrijgen. Accepteer kalibratiecurves alleen wanneer R2 ≥ 0,99 is.
    3. Meet elk specimenmonster en registreer het elektrodepotentiaal (mV).
    4. Om de stabiliteit van de elektrode te bewaken en potentiële assay-drift te detecteren, meet u gedurende elke analytische run met tussenpozen kwaliteitscontrolemonsters.
      1. Vergelijk de waarden van de kwaliteitscontrolemonsters direct met de overeenkomstige kalibratiemonsters en bevestig een overeenstemming van ongeveer 5% om een stabiele elektrodeprestatie in de tijd te verifiëren.
      2. Meet periodiek een blanco diffusieschaal om de afwezigheid van fluoridecontaminatie tijdens de monsterbehandeling en diffusie te bevestigen.
  4. Om de massa F¯(ng) in elk specimenmonster te berekenen, gebruikt u de vergelijking van de standaardcurve. Deel deze massa vervolgens door het volume (µL) serum, of de massa (mg) van de bot- of tandas die aan de diffusieschaal is toegevoegd.
    1. Voorbeeldberekening van de F¯-concentratie in botas (ng/mg)
      1. Massa botas toegevoegd aan diffusieschaal: 5,1 mg ; Elektrodepotentiaal van 75 µL specimenmonster: –31,6 mV
      2. Stap 1: Bereken de fluoridemassa met de kalibratievergelijking
        1. F⁻ massa (ng) = 3505,4 x e(-0,043x-31,6)
        2. F⁻ massa (ng) = 13.641 ng
      3. Stap 2: Bereken de fluorideconcentratie in botas
        1. F⁻ concentratie =  13.641 ng  /  5,1  mg
        2. F⁻ concentratie =  2.675 ng / mg (ppm)

figure-protocol-2
Figuur 2: Schema van de ISE-meetopstelling.Figuur 2 illustreert de configuratie die is gebruikt voor fluoride-ionmetingen met een dubbelkanaals ion-selectieve elektrode (ISE). Een Petrischaal is geplaatst op een schaarlift om een nauwkeurige instelling van de hoogte ten opzichte van de elektrode mogelijk te maken. De ISE is verbonden met een potentioömeter en is zo georiënteerd dat het sensoroppervlak parallel staat aan het vlak van de Petrischaal, waarbij een afstand van ongeveer 1–2 mm wordt aangehouden. Nadat de tussenruimte is ingesteld, wordt een klein volume monster (75 µL) gepipetteerd in de opening tussen het sensoroppervlak en de Petrischaal, zodat het monster het sensorgedeelte van de elektrode tijdens de meting volledig bedekt. Deze figuur is door de auteurs gemaakt met Biorender en is gelicenseerd onder de CC BY-licentie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-3
Figuur 3: IJkkurve en bijbehorende kalibratietabel voor kwantificatie van de fluoride-ionmassa in tandmonsters. Bovenpaneel: Voorbeeld van de ijkkurve die wordt gebruikt om de fluoride-ionmassa in tandmonsters te bepalen. De x-as toont het elektrodepotentiaal (mV, lineaire schaal) en de y-as toont de overeenkomstige fluoride-ionmassa (ng F⁻, logaritmische schaal). Gemeten kalibratiepunten zijn uitgezet als een doorgetrokken lijn, en de gefitte exponentiële regressie wordt weergegeven als een stippellijn. Een inzetvak toont de vergelijking van de standaardcurve en de determinatiecoëfficiënt (R2 = 0,99). Onderpaneel: Tabel met de numerieke waarden die zijn gebruikt om de ijkkurve te genereren. De eerste rij vermeldt de vijf electrodepotentialen (mV) die zijn geregistreerd voor de kalibratiemonsters. De tweede rij geeft de overeenkomstige fluoride-ionmassa's (ng F⁻) voor elk kalibratiemonster. De derde rij vermeldt de volumes (µL) van de 10 mM NaF-stamoplossing die aan de kalibratiediffusieschalen zijn toegevoegd; deze toegevoegde fluoride-ionmassa is gelijk aan de massa die in elk kalibratiemonster is vastgelegd na diffusie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Om de toepassing van dit protocol voor het meten van fluorideconcentraties (F-) in biologische materialen aan te tonen, werden monsterstalen gemaakt van serum, bot en mandibulaire snijtanden, verzameld van muizen die waren blootgesteld aan gecontroleerde fluoridebehandelingen. Mannelijke C57BL/6J-muizen werden toegewezen aan twee leeftijdscategorieën, adolescent (6 weken) en volwassen (18 weken), en kregen gedurende een blootstellingsperiode van 6 weken entweder fluoridevrij gedeïoniseerd water (0 ppm F⁻) of drinkwater aangevuld met natriumfluoride (125 ppm F⁻). Elke leeftijdscategorie en behandelconditie omvatte vijf dieren. Aan het einde van de blootstellingsperiode werden serum, femurs en mandibulaire snijtanden geoogst, waarna de monsterstalen werden voorbereid en geanalyseerd volgens het protocol. Representatieve fluorideconcentraties gemeten in serum, bot en tanden zijn hieronder samengevat.

figure-results-1
Figuur 4Fluorideconcentraties gemeten in serum, femurbenen en mandibulaire snijtanden. Mannelijke C57BL/6J-muizen werden toegewezen aan twee leeftijdscategorieën, adolescent (6 weken, open staaf) en volwassen (18 weken, gevulde staaf), en kregen ofwel fluoridevrij gedeïoniseerd water (0 ppm F⁻) of drinkwater aangevuld met natriumfluoride (125 ppm F⁻) gedurende een blootstellingsperiode van 6 weken. Aan het einde van de blootstellingsperiode werden de fluoridegehaltes gemeten in (A) serum, (B) femurbenen en (C) mandibulaire snijtanden van dezelfde behandelgroepen. Serumwaarden onder de detectielimiet (<0,02 ppm) werden uitgezet voor visualisatie, maar uitgesloten van de statistische analyse. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelden ± SD. Vergelijkingen tussen de adolescente en de volwassen groepen werden uitgevoerd met een Mann-Whitney U-toets met Bonferroni-Dunn-correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0.05, **p < 0,01 (N = 5/groep). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Fluorideconcentraties in serum
In zowel de adolescente als de volwassen groepen behandeld met 0 ppm fluoride, lagen de serumfluorideconcentraties onder de detectielimiet van de ion-selectieve elektrode (<0,02 ppm). In de 125 ppm behandelingsgroepen steeg het serumfluoride naar 0,3 ± 0,2 ppm in de adolescente groep en naar 0,7 ± 0,2 ppm in de volwassen groep (p = 0,06). De vergelijking tussen de adolescente en volwassen 125 ppm behandelingsgroep werd uitgevoerd met behulp van een Mann–Whitney U-toets met Bonferroni–Dunn-correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/groep). De 0 ppm behandelingsgroepen werden uitgesloten van de statistische analyse. (Figuur 4A, Tabel 1).

Fluorideconcentraties in het dijbeen
In de 0‑ppm behandelingsgroepen waren de fluorideconcentraties in het dijbeen significant lager bij adolescenten (292 ± 39 ppm) vergeleken met volwassen dieren (896 ± 55 ppm) (p < 0,01). In contrast waren in de 125‑ppm groepen de fluorideconcentraties bij adolescenten (4.108 ± 482 ppm) significant hoger dan bij volwassen dieren (2.966 ± 612 ppm) (p = 0,04). Vergelijkingen tussen de adolescente en volwassen groepen werden uitgevoerd met een Mann–Whitney U-test met Bonferroni–Dunn correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/groep). (Figuur 4B, Tabel 1). Figuur 5A toont de fold‑change in femuraal fluoride tussen de 0‑ppm en 125‑ppm behandelingen voor elke leeftijdsgroep. Adolescenten vertoonden een 14-voudige toename in fluorideniveaus bij 125 ppm, terwijl volwassen muizen een 3-voudige toename vertoonden.

Fluorideconcentraties in mandibulaire incisieven
In de 0 ppm-groepen waren de fluorideconcentraties in de mandibulaire incisieven significant lager bij adolescenten (35 ± 4 ppm) vergeleken met volwassen dieren (123 ± 23 ppm) (p = 0,03). In de 125 ppm-behandelingsgroepen stegen de fluorideconcentraties in de incisieven naar 5641 ± 955 ppm bij adolescenten en 4392 ± 1694 ppm bij volwassen dieren. Vergelijkingen tussen de adolescente en volwassen groepen werden uitgevoerd met een Mann-Whitney U-test met Bonferroni-Dunn-correctie voor meervoudige vergelijkingen. *p < 0,05, **p < 0,01 (N = 5/groep). (Figuur 4C, Tabel 1). Hoewel de absolute fluorideconcentraties bij 125 ppm niet significant verschilden tussen de leeftijdsgroepen, was de fold-change van 0 ppm naar 125 ppm significant groter bij adolescente muizen (161-voudige toename) dan bij volwassen muizen (36-voudige toename) (Figuur 5B).

figure-results-2
Figuur 5: Adolescenten vertonen een groterevoudige toename in fluorideaccumulatie in het bot en de snijtand dan volwassen muizen. Voudige verandering in fluorideconcentraties bij een behandeling van 0 ppm tot 125 ppm fluoride bij adolescente (open staaf) en volwassen (gevulde staaf) muizen. (A) Femur bot en (B) mandibulaire snijtand van dezelfde behandelingsgroepen. Gegevens zijn uitgedrukt als gemiddelden ± SD. Vergelijkingen tussen de adolescente en volwassen groepen werden uitgevoerd met een ongepaarde t-test. * p < 0,05, (N = 5/groep). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MonsterSerumFemurOnderkaakznijstand
LeeftijdsgroepAdolescentVolwassenAdolescentVolwassenAdolescentVolwassen
Behandelingsgroep0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm 0 ppm125 ppm0 ppm125 ppm
< 0.020.2< 0.020.8324457693330813748241613229
< 0.020.1< 0.020.8229377892433263954511272654
< 0.020.7< 0.021.0300468387737133155441126997
< 0.020.4< 0.020.5323383280725193551141034169
< 0.020.3< 0.020.528336699372192N/A72711114909
Gemiddelde< 0.020.3< 0.020.7292410889629663556411234392
SDNA0.2NA0.239482556123955231694

Tabel 1: Individuele fluoride-metingen in serum, dijbeen en mandibulaire snijtanden. Tabel 1 vermeldt de individuele fluorideconcentraties (ppm F⁻) gemeten in serum, dijbeen en mandibulaire snijtandmonsters van adolescente en volwassen muizen die zijn blootgesteld aan respectievelijk 0 ppm of 125 ppm fluoride. Voor elk weefseltype worden de gegevens gepresenteerd in kolommen die overeenkomen met de vier behandelingsgroepen: adolescent 0 ppm, adolescent 125 ppm, volwassen 0 ppm en volwassen 125 ppm. Elke kolom bevat de vijf individueel geregistreerde waarden (N = 5), gevolgd door het berekende gemiddelde en de standaarddeviatie (SD). In de adolescent 0 ppm serumgroep lagen alle geregistreerde waarden onder de detectielimiet van de ion-selectieve elektrode (<0,02 ppm). De tabel biedt de ruwe numerieke gegevens die ten grondslag liggen aan de samenvattende waarden en statistische vergelijkingen getoond in Figuur 4.

Discussie

Fluoridemetingen werden uitgevoerd met een fluoride-selectieve ion-selectieve elektrode (ISE) met een lanthaanfluoride (LaF₃) kristalmembraan38,39. Dit membraan vormt zeer stabiele La–F bindingen, wat resulteert in een sterke voorkeur voor fluoride-ionen boven andere halogeniden. Volgens vastgestelde elektrochemische literatuur en fabrikantspecificaties vertoont het LaF₃-membraan zeer lage selectiviteitscoëfficiënten voor chloride, wat aangeeft dat chloride-ionen geen meetbare interferentie veroorzaken onder de in dit protocol gebruikte omstandigheden. Hoewel chloride van nature aanwezig is in tanden en botten, beïnvloedt de activiteit hiervan de elektrodepotentiaal niet, en weerspiegelt het geregistreerde signaal specifiek de fluoride-activiteit. De lagere detectielimiet van 0,02 ppm komt overeen met de door de fabrikant gevalideerde minimale kwantificeerbare concentratie voor de Orion fluoride-selectieve elektrode. Deze limiet weerspiegelt de laagste fluorideconcentratie waarbij de elektrode een stabiele Nernstiaanse respons en een lineaire relatie met de kalibratiecurve behoudt. Omdat de detectielimiet wordt bepaald door de membraankenmerken van de elektrode en is gevalideerd door de fabrikant, was er voor dit protocol geen aanvullende experimentele bepaling nodig; wat betreft het bovenste detectiebereik merkten de auteurs echter op dat fluoridemassa's die ongeveer 38.000 ng overschreden in een 50 µL NaOH-val resulteerden in een niet-lineaire elektroderespons, wat aangeeft dat de kalibratiecurve niet langer betrouwbaar is bij zeer hoge fluoridelast. Deze niet-lineariteit is waarschijnlijk te wijten aan het overschrijden van de optimale ionsterkte en activiteitsrange voor de elektrode onder de gegeven experimentele omstandigheden, in plaats van een inherente bovengrens van de ISE zelf. Voor monsters waarvan wordt verwacht dat ze fluoridemassa's boven deze drempelwaarde bevatten, is het raadzaam om het volume van de NaOH-val te verhogen om metingen binnen het lineaire dynamische bereik van de elektrode te houden.

Deze overweging moet in acht worden genomen bij het toepassen van het protocol op monsters met een ongebruikelijk hoog fluoridegehalte. Omdat de diffusiestap het volledige monstervolume verbruikt, konden er geen dubbele metingen en spike-and-recovery-experimenten worden uitgevoerd op de biologische monsters. Om de analytische nauwkeurigheid en precisie te waarborgen, werden kwaliteitscontrolestandaarden (QC-standaarden) met bekende fluorideconcentraties opgenomen in elke meetserie. Deze QC-standaarden werden op identieke wijze verwerkt en gemeten als de experimentele monsters. Over alle runs heen lagen de gemeten fluorideconcentraties van de QC-standaarden consistent binnen 5% van hun verwachte waarden. Voor elke serie van 10–20 specimenmonsters werden twee onafhankelijke sets van 5–6 kalibratiemonsters parallel aan de specimenmonsters voorbereid, en er werd een kalibratiecurve geregistreerd voorafgaand aan elke meetsessie. Het kalibratiebereik werd voor elke run aangepast om de verwachte fluoridemassa's van de specimenmonsters te benaderen, wat afhankelijk was van het specimen-type, de massa van het materiaal dat aan de diffusieschaal was toegevoegd, en de behandelingsgroep en leeftijd van het dier. Voor serummetingen kwamen de kalibratiestandaarden overeen met fluorideconcentraties van ongeveer 0,06–1,20 ppm in het specimen. Voor metingen aan bot en tand kwamen de kalibratiestandaarden overeen met fluorideconcentraties van ongeveer 19–7.600 ppm in het specimen.

Dit protocol biedt een gevoelige en reproduceerbare methode voor het kwantificeren van de fluoride-ionmassa in serum, bot en tanden met behulp van hexamethyldisiloxaan-gefaciliteerde diffusie gevolgd door ISE-analyse. De methode brengt betrouwbaar fluoride in kaart dat is vrijgekomen uit diverse biologische matrices en maakt een kwantitatieve beoordeling mogelijk van fluoride-accumulatie na gecontroleerde blootstelling. Representatieve resultaten van adolescente en volwassen muizen tonen duidelijke leeftijd- en dosisafhankelijke verschillen in fluoride-depositie in verschillende weefsels, wat het nut van deze aanpak onderstreept voor het bestuderen van fluoride-metabolisme en toxicokinetiek in vivo.

Een belangrijk voordeel van dit protocol is het gebruik van diffusieschalen die de fluoride-vrijmakende reactie fysiek scheiden van de fluoride-vangende omgeving. Het met petrolatum afgesloten ontwerp minimaliseert atmosferische uitwisseling en zorgt voor een efficiële opvang van vrijgekomen fluoride-ionen door natriumhydroxidedruppels op het deksel. Met HMDS verzadigd zwavelzuur biedt een sterke en consistente drijvende kracht voor de vrijgave van fluoride uit gemineraliseerde weefsels, waaronder sterk gecalcificeerde structuren zoals botten en tanden. De daaropvolgende ISE-meting, gekalibreerd met diffusie-overeenkomstige standaarden, maakt een nauwkeurige kwantificering mogelijk over een breed dynamisch bereik. Een ander voordeel van deze aanpak is de mogelijkheid om fluoride in extreem kleine biologische monsters te kwantificeren. Gemineraliseerde weefsels van muizen, in het bijzonder de mandibulaire snijtanden, leveren slechts 3–5 mg as per tand op. Conventionele analytische methoden vereisen vaak grotere monstermassa's of een hoger fluoridegehalte om een betrouwbare detectie te bereiken. In tegenstelling hiermee concentreert het op diffusie gebaseerde ontwerp alle fluoride die uit het gehele specimen is vrijgekomen in een klein, gedefinieerd volume, waardoor nauwkeurige kwantificering mogelijk is, zelfs in minuscule monsters met een lage absolute fluoridemassa. Deze eigenschap is bijzonder waardevol voor studies met kleine dieren, beperkte weefselbeschikbaarheid of micro-gedissecteerde gemineraliseerde structuren.

Een primaire beperking van deze methode is de detectielimiet van de ISE die in deze studie is gebruikt (0,02 ppm). Serummonsters van fluoride-vrije controledieren vielen vaak onder deze drempelwaarde, waardoor kwantificering van extreem lage fluorideconcentraties niet mogelijk was. Wanneer sporenconcentraties nabij of onder de detectielimiet worden gemeten, kan een grotere massa of een groter volume van het monster in de diffusieschaal, indien beschikbaar, of het gebruik van alternatieve analytische technieken vereist zijn. Daarnaast vereist de methode een diffusie gedurende de nacht en een zorgvuldige hantering van corrosieve reagentia, wat de doorvoersnelheid in studies met een groot volume kan beperken. Hoewel ISE een gevoelige kwantificering van het totale fluoride biedt, kan het de ruimtelijke verdeling binnen weefsels niet beoordelen. Complementaire benaderingen, zoals scanning elektronenmicroscopie gekoppeld aan energie-dispersieve röntgenspectroscopie (SEM-EDX) of particle-induced gamma-ray emission (PIGE), kunnen worden geïntegreerd om de fluorideverdeling op micro- tot macroschaal te visualiseren en in kaart te brengen. Deze op beeldvorming gebaseerde modaliteiten maken de evaluatie van lokale fluoride-accumulatie in gemineraliseerde of zachte weefsels mogelijk, waardoor ze de ISE-metingen aanvullen en een uitgebreider assessment van het fluoridegehalte in het weefsel bieden.

Verschillende terugkerende technische factoren kunnen de nauwkeurigheid en betrouwbaarheid van de fluoride-diffusie en -meting in dit protocol beïnvloeden, en onze observaties benadrukken hoe de voorbereiding van de kalibratie, het afdichten van de diffusieschaal, de pH-controle, de prestaties van de elektrode en de monsterbehandeling gezamenlijk de datakwaliteit bepalen. Mogelijke oorzaken voor een niet-lineaire kalibratiecurve (R2 < 0,99) of metingen van weefselmonsters buiten het verwachte bereik zijn rekenfouten bij het volume NaF-stamoplossing dat aan de diffusieschaal wordt toegevoegd of pipetteerfouten tijdens de bereiding van de kalibratiestandaarden. Aanbevolen actie: Bereid voor elke run ten minste twee onafhankelijke sets kalibratiemonsters voor, zodat er een reserveset beschikbaar is als één kalibratiecurve buiten het verwachte bereik valt. Een onvolledige afdichting van de diffusieschaal kan ook leiden tot fluorideverlies tijdens de diffusie, wat resulteert in kunstmatig lage metingen. Dit gebeurt doorgaans wanneer er onvoldoende vaseline op de rand van het deksel van de diffusieschaal is aangebracht. Aanbevolen actie: Breng een royale hoeveelheid vaseline aan rond de rand van het deksel van de diffusieschaal en druk stevig aan om een volledige afdichting te garanderen. Pipetteerfouten bij het toevoegen van de azijnzuuroplossing aan de NaOH-val kunnen de pH van het monster buiten het optimale bereik van pH 5,0 verschuiven, wat leidt tot een onnauwkeurig fluorideherstel. Aanbevolen actie: Controleer de pH van elk monster met pH-papier en gooi elk monster weg dat buiten pH 5 valt. Kalibratiemonsters kunnen ook buiten de geldige registratielimieten van de fluoride-selectieve elektrode vallen. Concentraties onder 0,02 ppm liggen onder de detectielimiet van de elektrode. Aanbevolen actie: Gebruik geen kalibratiemonsters die minder dan 0,02 ppm fluoride bevatten. Omgekeerd kunnen kalibratiemonsters met excessief hoge fluorideconcentraties de ionsterkte van de oplossing veranderen en niet-lineaire elektroderesponsen produceren. Aanbevolen actie: Bereid aan het begin van het project kalibratieoplossingen voor over een breed fluorideconcentratiebereik om het lineaire werkbereik van de specifieke gebruikte elektrode te bepalen. Als weefselmonsters dit lineaire bereik overschrijden, verlaag dan de weefselmassa of verhoog het volume van de NaOH-val en pas het volume azijnzuur dienovereenkomstig aan om pH 5 te handhaven. Moeite met het verkrijgen van lineaire kalibratiecurves in het bereik 0,02–1 ppm: Een veelvoorkomende oorzaak is veroudering van de elektrode. Oudere fluoride-selectieve elektroden verliezen hun gevoeligheid bij zeer lage fluorideconcentraties. Aanbevolen actie: Vervang de fluoride-selectieve elektrode. Onstabiele potentiometermetingen (signaaldrift of sprongen) treden gewoonlijk op wanneer het meetoppervlak van de elektrode niet volledig is ondergedompeld in de monsteroplossing. Aanbevolen actie: Laat de elektrode zakken zodat het meetoppervlak volledig door het vloeibare monster wordt bedekt.

Over het algemeen biedt dit protocol een robuuste, op kalibratie gebaseerde aanpak voor het kwantificeren van fluoride in diverse biologische matrices en is het uitermate geschikt voor studies naar fluorideblootstelling, weefseldepositie en toxicologische uitkomsten in muismodellen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Het in deze publicatie beschreven onderzoek werd ondersteund door de Japan Society for the Promotion of Science; JSPS Overseas Research Fellowships 202560528 (S.Y.), Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP); 2024/07452-9 (J.S.T.), en het National Institute of Dental and Craniofacial Research van de National Institutes of Health; R01DE027648 (M.S.) en K02DE029531 (M.S.).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Azijnzuur, glaciaalSigma-AldrichSupelco, GR ACSAX0073-6
AluminakruiselsAdvalue Technology12 mm buitendiameter × 25 mm H, AL-6212AL-6212
Analytische balansVWRVWR 124B2, d = 0,1 mg—
KralenbeaterReferentiekaderBeadBug 6—
Sproeinaald voor spuitAmazonIndustriële stomp kop naald, 14 G × 0,5 inchX001TT8KX1
KoolstofdioxideAirGas——
Chemische zuurkastMott ManufacturingModel 7421040—
D(+)-sucroseThermo Scientific99,7% voor biochemie177142500
ElektrodevuloplossingThermo ScientificOrion IonPlus vuloplossing900061
EthylalcoholoplossingKoptec140 Proof2401
Vriezer, −80 °CThermo ScientificRevco RDE-serie—
Hittebestendige handschoenenFisher ScientificBel-Art Clavies biohazard-autoclaafhandschoenenH13201
Hexamethyldisiloxaan (HMDS)Fisher ScientificTCI H0091, >98%H0091
WaterstofperoxideVWRJ.T. Baker, 30%2204-01
Ion-selectieve elektrodeThermo ScientificOrion Fluoride ISE, dubbelkanaals9609BNWP
Magnetische roerderVWR360-graden roerder—
MicrospatelAmazonWascarvespatel #7A, roestvrij staal—
MicrocentrifugeEppendorf5427R5404000131
MoffelovenThermo ScientificThermolyne kleine moffeloven voor op het aanrecht, 1,3 L, FB1315MFB1315M
OvenBoekel ScientificBoekel RapidFISH240200
Paraformaldehyde-oplossing in PBSThermo Scientific4% paraformaldehyde in PBSJ19943-K2
PetrischaalVWR60 × 15 mm, Onbehandeld25384-092
PetrolatumThermo ScientificPetrolatum, wit, zuiver417090010
pH-indicatorpapierFisher ScientificpH-Fix 4,5–10.092120.3
Porseleinen schaalFisher ScientificFisherbrand smeltkroes, 5 mL, 20 mm hoogte, hoge vormFB-965-B
PotentiometerThermo ScientificOrion Dual Star pH/ISE-meter2115102
Statief met klemVWRRingklem, 15 cm470104-526
KnaagdierdieetBio-ServF1515, AIN-76A, ½ PelletsF1515
ScherenkrikAmazonLaboratorium schaarlift—
ScheidingskolfFisher ScientificEisco, borosilicaatglas, 2 LS89285
NatriumchlorideFisher ScientificGecertificeerd ACS, kristallijnS271-1
NatriumfluorideFisher ScientificGecertificeerd ACS, poederS299-100
NatriumhydroxideFisher ScientificWitte pelletsBP359-500
Roestvrijstalen kraaltjesFisher ScientificScientific Industries, 5 mm, 100 stuksSI-CS05
ZwavelzuurFisher ScientificACS-kwaliteitA300-500
TISAB IIThermo ScientificOrion IonPlus Applicatieoplossing940909
VacuümexsikkaatorFisher ScientificBel-Art Space Saver vacuümdesiccator, 10 inchF42010-0000
VacuümfilterFisher ScientificFlow Bottle-Top Filter, PES, 90 mm, 0.2 µm597-4520
Variabele RockerMidSciLabDoctor / Benchmark Scientific—

Referenties

  1. Podgorski J, Berg M. Global analysis and prediction of fluoride in groundwater. Nat Commun. 2022;13(1):4232. doi:10.1038/s41467-022-31940-x
  2. Iheozor-Ejiofor Z, Worthington HV, Walsh T, O'Malley L, Clarkson JE, Macey R, et al. Water fluoridation for the prevention of dental caries. Cochrane Database Syst Rev. 2015;2015(6):Cd010856. doi:10.1002/14651858.CD010856.pub2
  3. Manchanda S, Sardana D, Liu P, Lee GH, Li KY, Lo EC, et al. Topical fluoride to prevent early childhood caries: Systematic review with network meta-analysis. J Dent. 2022;116:103885. doi:10.1016/j.jdent.2021.103885
  4. Chan AKY, Tamrakar M, Jiang CM, Tsang YC, Leung KCM, Chu CH. Clinical evidence for professionally applied fluoride therapy to prevent and arrest dental caries in older adults: A systematic review. J Dent. 2022;125:104273. doi:10.1016/j.jdent.2022.104273
  5. Zamperini CA, Bedran-Russo AK. Immediate and Sustained Root Caries Prevention of Fluoride Varnish Combined with Toothpastes. Caries Res. 2023;57(5-6):592-601. doi:10.1159/000533279
  6. Melough MM, Sathyanarayana S, Zohoori FV, Gustafsson HC, Sullivan EL, Chi DL, et al. Impact of Fluoride on Associations between Free Sugars Intake and Dental Caries in US Children. JDR Clin Trans Res. 2023;8(3):215-23. doi:10.1177/23800844221093038
  7. Suzuki M, Everett ET, Whitford GM, Bartlett JD. 4-phenylbutyrate Mitigates Fluoride-Induced Cytotoxicity in ALC Cells. Front Physiol. 2017;8:302. doi:10.3389/fphys.2017.00302
  8. Suzuki M, Shin M, Simmer JP, Bartlett JD. Fluoride affects enamel protein content via TGF-beta1-mediated KLK4 inhibition. J Dent Res. 2014;93(10):1022-7. doi:10.1177/0022034514545629
  9. Everett ET, McHenry MA, Reynolds N, Eggertsson H, Sullivan J, Kantmann C, et al. Dental fluorosis: variability among different inbred mouse strains. J Dent Res. 2002;81(11):794-8.
  10. Kong H, He Z, Li H, Xing D, Lin J. The association between fluoride and bone mineral density in US children and adolescents: a pilot study. Nutrients. 2024. doi:10.3390/nu16172948
  11. Mazzoli R, Filippini T, Iamandii I, De Pasquale L, Veneri F, Birnbaum LS, et al. The association of fluoride exposure with bone density and fracture risk: a dose-response meta-analysis. Environ Health. 2025;24(1):73.
  12. Suzuki M, Bandoski C, Bartlett JD. Fluoride induces oxidative damage and SIRT1/autophagy through ROS-mediated JNK signaling. Free Radic Biol Med. 2015;89:369-78.
  13. Kubota K, Lee DH, Tsuchiya M, Young CS, Everett ET, Martinez-Mier EA, et al. Fluoride induces endoplasmic reticulum stress in ameloblasts responsible for dental enamel formation. J Biol Chem. 2005;280(24):23194-202. doi:10.1074/jbc.M503288200
  14. Yamashita S, Okamoto M, Mendonca M. Fluoride alters gene expression via histone H3K27 acetylation in ameloblast-like LS8 cells. Int J Mol Sci. 2024. doi:10.3390/ijms25179600
  15. Deng H, Fujiwara N, Cui H, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Histone acetyltransferase promotes fluoride toxicity in LS8 cells. Chemosphere. 2020;247:125825.
  16. Deng H, Ikeda A, Cui H, Bartlett JD, Suzuki M. MDM2-Mediated p21 Proteasomal Degradation Promotes Fluoride Toxicity in Ameloblasts. Cells. 2019;8(5). doi:10.3390/cells8050436
  17. Fujiwara N, Whitford GM, Bartlett JD, Suzuki M. Curcumin suppresses cell growth and attenuates fluoride-mediated Caspase-3 activation in ameloblast-like LS8 cells. Environ Pollut. 2021;273:116495. doi:10.1016/j.envpol.2021.116495
  18. Suzuki M, Ikeda A, Bartlett JD. Sirt1 overexpression suppresses fluoride-induced p53 acetylation to alleviate fluoride toxicity in ameloblasts responsible for enamel formation. Arch Toxicol. 2018;92(3):1283-93. doi:10.1007/s00204-017-2135-2
  19. Regelson S, Dehghan M, Tantbirojn D, Almoazen H. Evaluation of fluoride levels in commercially available tea in the United States. 2020/12/23 ed2021 Jan-Feb. 17-20 p.
  20. Cantoral A, Luna-Villa LC, Mantilla-Rodriguez AA, Mercado A, Lippert F, Liu Y, et al. Fluoride Content in Foods and Beverages From Mexico City Markets and Supermarkets. Food Nutr Bull. 2019;40(4):514-31. doi:10.1177/0379572119858486
  21. Institute of Medicine SCotSEoDRI. Dietary Reference Intakes for Calcium, Phosphorus, Magnesium, Vitamin D, and Fluoride. Washington, DC: National Academy Press; 1997.
  22. Otal E.H. KML, Kimura M. Fluoride Detection and Quantification, an Overview from Traditional to Innovative Material-Based Methods. In: Wambu E.W. LGJ, Kiplagat A., editor. Fluoride. London: IntechOpen; 2022.
  23. Whitford GM. Absorption and Plasma Concentrations of Fluoride, 1996.
  24. Taves DR. Determination of submicromolar concentrations of fluoride in biological samples. Talanta. 1968;15(10):1015-23. doi:10.1016/0039-9140(68)80109-2
  25. Buzalaf MA, Caroselli EE, de Carvalho JG, de Oliveira RC, da Silva Cardoso VE, Whitford GM. Bone surface and whole bone as biomarkers for acute fluoride exposure. J Anal Toxicol. 2005;29(8):810-3.
  26. Zohoori FV, Maguire A, Martinez-Mier EA, Buzalaf MAR, Sanderson R, Eckert GJ. A Comparison of Simple Analytical Methods for Determination of Fluoride in Microlitre-Volume Plasma Samples. Caries Res. 2019;53(3):275-83. doi:10.1159/000492339
  27. Martínez-Mier EA, Cury JA, Heilman JR, Katz BP, Levy SM, Li Y, et al. Development of gold standard ion-selective electrode-based methods for fluoride analysis. Caries Res. 2011;45(1):3-12. doi:10.1159/000321657
  28. Boivin G, Chapuy MC, Baud CA, Meunier PJ. Fluoride content in human iliac bone: results in controls, patients with fluorosis, and osteoporotic patients treated with fluoride. J Bone Miner Res. 1988;3(5):497-502.
  29. Yamashita S, Okamoto M, Fujiwara N, Achong-Bowe R, Brueckner S, Mendonca M, et al. Developmental vulnerability to fluoride toxicity: enamel and clearance differences in adolescent versus mature mice. Arch Toxicol. 2025.
  30. Chiba K, Hisamatsu, S., Takizawa, Y, Katsura, K. Determination of fluoride in biological materials by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1982;245:8.
  31. Ikenishi K, Chiba, K., Hisamatsu, S, Takizawa, Y. Determination of fluoride in biological samples by ion chromatography. Journal of Chromatography. 1988;437:8.
  32. Venkateswarlu P, Reddy, D.S., Reddy, T.S. Spectrophotometric determination of fluoride using the SPADNS method. Analyst 1971;96:5.
  33. Kakabadse G. KN, Davies C.W. The Spectrophotometric Determination of Fluoride with SPDNS-Zirkonium Lake. Analyst. 1971;96:8.
  34. Mendham J, Denney RC, Barnes JD, Thomas MJK. Vogel's Textbook of Quantitative Chemical Analysis. 6th ed. Harlow, England: Prentice Hall; 2000.
  35. Kučera J, Štefánik, M. & Veselka, P. Fluorine determination in biological and environmental samples with INAA using fast neutrons from a p(19 MeV)+Be neutron generator. Journal of Radioanalytical and Nuclear Chemistry 2019;322:7.
  36. Okamoto M, Yamashita S, Memida T, Mendonca M, Brueckner S, Nakamura S, et al. Microhardness Measurements on Tooth and Alveolar Bone in Rodent Oral Disease Models. J Vis Exp. 2024(206). doi:10.3791/66583
  37. Okamoto M, Yamashita S, Mendonca M, Brueckner S, Achong-Bowe R, Thompson J, et al. Ultrastructural evaluation of adverse effects on dentine formation from systemic fluoride application in an experimental mouse model. Int Endod J. 2025;58(1):128-40.
  38. Frant MS, Ross JW, Jr. Electrode for sensing fluoride ion activity in solution. Science. 1966;154(3756):1553-5.
  39. Umezawa Y, Umezawa, K and Sato, H. Selectivity coefficients for ion-selective electrodes: recommended methods for reporting KRB values, 1995.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

BiologyFluorideHexamethyldisiloxane HMDS facilitated diffusionion selective electrodeserumboneteeth
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen