3D-celkweekgebaseerd hybride bioanalytisch platform voor optische beeldvorming met behulp van zijdefibroine-sponzen

Samenvatting

Het artikel beschrijft een eenvoudige, toegankelijke en reproduceerbare methodologie voor de productie en teelt van zijden steigers en kweek van 4T1-iRFP720 borstkankercellen onder stroomgecontroleerde omstandigheden ter ondersteuning van dynamische kweek. Cellulaire groei en migratie werden geëvalueerd als proof of concept met een in vivo optisch beeldvormingsinstrument als belangrijkste niet-invasieve meting.

Samenvatting

We presenteren een innovatief bioanalytisch hybride platform dat is ontworpen voor de preklinische evaluatie van cellulaire kenmerken. Het systeem combineert een driedimensionale (3D) celcultuur die is gekweekt op een kunstmatige extracellulaire matrix met een chromatografie-geïnspireerde arrayconfiguratie. Sponzen, gemaakt van het structurele eiwit zijdefibroïne, dienen zowel als een biomimetische extracellulaire matrix als als stationaire fase. Zijdefibroine-sponzen werden intern geproduceerd met een meerstapsproces waarbij inherente sericine-eiwitten uit ruwe zijdevezels werden verwijderd, gevolgd door oplossing en dialyse om de fibroïneoplossing te zuiveren, oplossen in organisch oplosmiddel en vervolgens zoutbedgieten om zijde-gebaseerde sponzen te produceren met gecontroleerde porositeit/poriegroottes van 500–800 μm. Genetisch gemodificeerde borstkankercellijnen 4T1-iRFP720 en 4T1-wt (non-fluorescent control) werden gekweekt in zijden steigers met behulp van een continue mediastroom via een pomp, en hun cellulaire groei en kenmerken werden niet-invasief geanalyseerd met optische beeldvormingstechnieken (in vivo optisch beeldvormingsinstrument). Door belangrijke voordelen van chromatografische systemen (automatisering, reproduceerbaarheid) te combineren met de biologische relevantie van geavanceerde 3D-celculturen, maakt het platform in vitro modellering van weefselachtige architectuur en morfologie mogelijk, terwijl het de monitoring van dynamisch cellulair gedrag vergemakkelijkt. Tegelijkertijd maakt de toepassing van medische beeldvormingstechnologie realtime en langdurige monitoring van cellulaire migratie en groei mogelijk, naast andere factoren. Deze benadering biedt aanzienlijke mogelijkheden om cellulair gedrag op macroscopische schaal in een laminair-achtig stromingssysteem te onderzoeken. Door de fysiologische relevantie van in vitro modellen te verbeteren, kan deze methode helpen de translationele kloof naar in vivo-studies te overbruggen en is consistent met het reduce, replace, refine (3R)-kader voor dierproeven.

Inleiding

In levende weefsels vinden celmigratie en -groei plaats binnen een driedimensionale, heterogene extracellulaire matrix (ECM), geleid door biofysische en biochemische signalen, zoals interstitiële vloeistofstroom en cel-celinteracties. Deze factoren reguleren celpolariteit, mechanotransductie en gecoördineerde beweging, en ondersteunen belangrijke biologische processen zoals weefselherstel en kankerinvasie 1,2,3,4.

Ondanks hun belang evalueren de meeste in vitro migratieassays, zoals scratch- en Transwell-assays, de beweging van enkelcellige cellen op vlakke, statische substraten. Hoewel eenvoudig en kosteneffectief, reproduceren deze 2D-benaderingen slecht de structurele en dynamische kenmerken van de in vivo microomgeving ^5,6. Deze beperking wordt vooral cruciaal in de context van kankermetastase, waarbij tumorcellen gezamenlijk migreren via mechanisch en chemisch diverse weefselmatrices ^3,7,8. Hoewel 2D-scratch-assays populair blijven omdat ze eenvoudig uit te voeren zijn, weerspiegelen ze niet de complexiteit van de ECM of de effecten van vloeistofstroom⁶. Transwell-gebaseerde benaderingen bieden kwantitatieve uitlezingen, maar alleen op vaste eindpunten, waardoor continue observatie van migratie ^6,9 wordt verhinderd.

Recente studies hebben aangetoond dat interstitiële stroming het metastaserende potentieel versterkt, terwijl ECM-stijfheid en samenstelling de epitheliale-mesenchymale overgang en collectieve migratie bevorderen ^4,10. Meer geavanceerde 3D-systemen, zoals sferoïden en organoïden, benaderen de native ECM-omgevingen benaderen; hun gebruik wordt echter vaak beperkt door variabiliteit, beperkte experimentele toegankelijkheid en moeilijkheden in gestandaardiseerde analyse^11,12. Microfluidische platforms bieden superieure controle over mechanische en fluidische omstandigheden, maar hun afhankelijkheid van gespecialiseerde fabricagemethoden en apparatuur beperkt hun brede gebruik¹³. Daarom blijft het recreëren van deze geïntegreerde cues in vitro op een gecontroleerde, toegankelijke, niet-invasieve en kosteneffectieve manier een grote uitdaging ^5,14.

Om deze uitdagingen aan te pakken en de kloof te overbruggen tussen conventionele 2D-assays en complexe in vivo modellen, hebben we een eenvoudig, flow-ondersteund 3D-cellulair platform ontwikkeld op basis van een zijde-fibroïne-sponssteiger. Het systeem gebruikt een zijden spons met afstembare mechanische eigenschappen als een ECM-achtige steiger. Zijde werd geselecteerd vanwege zijn poreuze structuur, die een zachte perfusie mogelijk maakt en fysiologisch relevante interstitiële stroming^ondersteunt. De biocompatibiliteit en het gevestigde gebruik in de biomedische en weefseltechnologie maken het een geschikt materiaal voor deze toepassing. Een recente publicatie toonde verder het milieuduurzaamheid en recyclingpotentieel van het steiger^{aan 16}. In een andere studie toonden we verder hun aanpassingsvermogen aan over verschillende beeldvormingsmodaliteiten, zoals positronemissietomografie¹⁷. Dit eerdere werk diende als basis voor de huidige methodologiebeschrijving, waarin we voortbouwen op hetzelfde platformconcept in een vereenvoudigde in vivo optische beeldvormingsconfiguratie. Samen tonen deze studies het potentieel van het systeem aan voor multimodale, op beeldvorming gebaseerde beoordeling van gemodificeerde weefselconstructies en ondersteunen ze het gebruik ervan als veelzijdig experimenteel platform voor het integreren van in vitro kweek en in vivo relevante uitlezingen over verschillende kankercelmodellen.

Als proof-of-concept kweekten we iRFP720-gelabelde 4T1 drievoudig negatieve borstkankercellen binnen het steiger onder twee laag-shear stress flow-omstandigheden gedurende vijf dagen. Niet-invasieve in vivo optische beeldvorming onthulde duidelijke flow-directed groeipatronen en significante veranderingen in de celpopulatiedynamiek vergeleken met statische controles. Door de nadruk te leggen op technische eenvoud en reproduceerbaarheid, biedt dit model een praktische brug tussen 2D-assays en in vivo-studies , waardoor onderzoekers op macroscopische schaal en niet-invasief flow-gemedieerde cellulaire kenmerken kunnen onderzoeken in een fysiologisch relevante maar toegankelijke vorm. In tegenstelling tot eerdere methodologieën die vaak vertrouwen op destructieve eindpuntanalyses of geen gestandaardiseerde zaaicriteria hebben, introduceert dit protocol een systematisch kader voor het optimaliseren van de steigerproductie en vervolgens celzaaiing en beeldvorming. Deze aanpak verbetert de experimentele robuustheid en biedt een meer uitgebreid, longitudinaal beeld van collectieve celdynamiek binnen 3D-matrices, wat een aanzienlijke verfijning is ten opzichte van bestaande methoden voor het monitoren van groei en migratie.

Protocol

Het eerste deel beschrijft de voorbereiding van zijdefibroïne-steigers op basis van eerder gepubliceerd werk¹⁶. De volgende secties beschrijven optimalisatie van celzaaidichtheid, integratie van stroming en optische beeldvorming voor het monitoren van celbeweging en -groei. Deze studie maakte uitsluitend gebruik van gevestigde muiskankercellijnen (4T1-wt en 4T1-iRFP720) en betrof geen menselijke deelnemers, patiëntmonsters, primaire weefsels of levende dieren. In overeenstemming met institutionele en nationale richtlijnen was ethische goedkeuring niet vereist. Een schematisch overzicht van de workflow is te zien in Figuur 1.

1. Bereiding van de zijdefibroïnespons

1. Cocoon schoonmaken en ontlijmen.
   1. Snijd de cocons van de zijderups Bombyx mori L. open met een veiligheidsscalpel.
   2. Verwijder de larven en haal de binnenste coconlaag (compacte laag direct rondom de larvale holte) eruit met een standaard snedenaald.
   3. Vul een beker met 1,6 L dubbel gedestilleerd water (ddH₂O).
   4. Voeg een magnetische roerbalk toe en breng het water aan de kook tijdens het roeren; Bedek de beker met aluminiumfolie om de verwarming te versnellen en waterverlies te verminderen.
   5. Voeg 3,4 g Na_2CO3 toe wanneer de watertemperatuur ongeveer 70 °C bereikt.
   6. Wanneer het mengsel begint te koken, doe je 4 g voorbereide cocons in de oplossing en roer je met een glazen staaf.
   7. Kook de cocons 30 minuten en roer elke 10 minuten met een glazen staaf om een goede belichting te garanderen.
   8. Verwijder de zijde uit de oplossing en spoel deze meerdere keren af met kraanwater om de resterende sericine te verwijderen.
   9. Knijp overtollig water eruit en verspreid de zijden vezels op een voorbereid schaaltje aluminiumfolie.
   10. Droog de zijdevezels in een voorverwarmde oven op 50 °C tot ze volledig droog zijn (ongeveer 18 uur).
2. Ontbinding en dialyse
   1. Gebruik absolute ethanol en watervrij CaCl₂ voor de volgende stappen. De oplosmatrix bestaat uit 1 deel CaCl₂, 2 delen ethanol en 8 delen ddH₂O. De verhouding van droog ontgelen zijde tot de oplosmatrix is 1:10 [w/w].
   2. Weeg de gedroogde zijde en bereken dienovereenkomstig de juiste hoeveelheden van de componenten voor de oplosmatrix.
   3. Vul de betreffende hoeveelheid CaCl₂ in een rondbodemfles met een roerbalk.
   4. Meet de benodigde hoeveelheid ethanol en ddH₂O en meng ze.
   5. Voeg het ethanol-ddH₂O-mengsel toe aan de CaCl₂ tijdens het roeren.
   6. Zet een refluxapparaat op en verwarm het mengsel tot 100 °C in een oliebad, zodat de CaCl₂ kan oplossen en het mengsel aan de kook komt.
   7. Als het mengsel begint te koken, voeg je de gedroogde zijde toe en verwarm je het 45 minuten onder terugvloei.
   8. Bereid 15 cm lange cellulosedialysebuizen van 3,5 kDa voor door ze meerdere keren met water af te spoelen om te hydrateren, en sluit dan één uiteinde vast om een glazen staaf met een afdichtingsclip.
   9. Na het koken breng je de hete zijdeoplossing over in de buis en sluit je het tegenovergestelde uiteinde af met een clip, waarbij je een opening van 2–3 cm tussen de vloeistof en de afdichtclip laat, zonder luchtomhulsels.
   10. Plaats de gevulde dialysebuis in een 2 L beker gevuld met ddH₂O en voer dialyse uit op kamertemperatuur gedurende 72 uur, waarbij het water twee keer per dag wordt vervangen om een effectieve zuivering te garanderen.
   11. Centrifugeer de oplossing op 4500 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
   12. Giet het supernatant voorzichtig in centrifugebuizen zonder de pellet te verstoren, en bewaar de buizen bij -20 °C.
       OPMERKING: Vul de centrifugebuizen tot maximaal de helft van hun capaciteit en vries ze horizontaal in.
3. Lyofilie
   1. Verwarm de vacuümpomp 20 minuten voor en gebruik de lyofilizer volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Plaats de bevroren centrifugebuizen, direct uit de vriezer, in een rondbodemkolf.
   3. Bevestig de fles aan de lyophilizer en lyofilieer 24 uur.
   4. Bewaar de gelyofilieerde zijdefibroïne tot verder gebruik op een droge plek bij kamertemperatuur.
4. Oplosmiddelgieten en deeltjesuitloging
   1. Voeg de benodigde hoeveelheid gevriesde zijde toe aan 1,1,1,3,3,3-hexafluorisopropanol (HFIP) in een urinemonstercontainer onder een dampkap om een 16% [w/v] oplossing met een eindvolume van 30 mL te verkrijgen, en sluit de container met een deksel.
      VOORZICHTIG: HFIP is corrosief en schadelijk als het wordt ingeademd, ingenomen of via de huid wordt opgenomen; Behandel het oplosmiddel in een dampkap terwijl je de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) draagt, en vermijd contact met huid, ogen en dampen. In geval van een lekkage verzamel je de vloeistof met absorberende materialen en maak je de getroffen gebieden schoon. Vervuilde materialen overbrengen naar aangewezen containers voor gevaarlijk afval.
   2. Sluit de container stevig af en zet hem op de orbitale shaker op 70 rpm gedurende 18 uur zodat de zijde kan oplossen.
   3. Zeef NaCl met verschillende meshes en zet de fractie van 500–800 μm apart.
   4. Vul een petrischaal (9 cm diameter, 8,5 cm bodemdiameter) met 100 g gezeefd zout (500–800 μm fractie), wat resulteert in een hoogte van 1,2 cm. Zorg dat het oppervlak gelijkmatig waterpas is.
   5. Giet voorzichtig 25,5 mL van de voorbereide zijdeoplossing over het zoutbed (porogen voor de vorming van sponsporieën).
   6. Bedek de Petrischaal met het deksel en plaats deze 10 minuten op een orbitale shaker bij 70 toeren per minuut voor een uniforme infiltratie van de zijdeoplossing in het zoutbed.
   7. Incubeer de petrischaal op 37 °C gedurende 1 uur met het deksel dicht; daarna wordt de Petrischaal onthuld op 37 °C gebroed, nog eens 18 uur.
   8. Om de vorming van bèta-vellen te induceren, dompel je het zijde composiet 20 minuten onder in een beker met methanol, haal het er dan uit en droog het in een oven op 50 °C (ongeveer 1 uur).
      VOORZICHTIG: Methanol is zeer giftig; Hanteer het in een dampkap terwijl je de juiste PBM draagt, vermijd huidcontact en blootstelling aan damp. In geval van een lekkage verzamel je de vloeistof met absorberende materialen en maak je de getroffen gebieden schoon. Breng besmette materialen over naar aangewezen giftige afvalcontainers.
   9. Verwijder het porogene NaCl door het zijden composiet minstens 3 uur onder te dompelen in een beker met warm kraanwater, met elke 20–30 minuten een waterwissel totdat het materiaal een zachte en sponsachtige textuur krijgt zonder harde resten.
   10. Bewaar de zijden spons in 70% ethanol voor desinfectie en kortdurende conservering bij 4 °C.
       OPMERKING: HFIP-houdende oplossingen werden verzameld als gehalogeneerd oplosmiddelafval, terwijl methanolafval afzonderlijk werd afgevoerd als niet-gehalogeneerd organisch oplosmiddelafval volgens de institutionele richtlijnen voor chemische veiligheid. Voor decontaminatie na gebruik werden containers en werkoppervlakken die aan HFIP of methanol waren blootgesteld, afgespoeld met een compatibel oplosmiddel en gereinigd met een detergentoplossing. Eerste spoelingen en besmette verbruiksmaterialen werden verzameld als chemisch gevaarlijk afval.

2. Voorbereiding en evenwicht van zijden steigers

1. Snijd zijden fibroïnesponzen met een biopsiepons van 6 mm diameter om cilindrische steigers van 6 mm diameter en 12 mm hoogte te verkrijgen.
   OPMERKING: Voorbereide zijden fibroïne sponssteigers kunnen worden bewaard in 70% ethanol bij 4 °C tot 4 maanden; Voor langdurige opslag wordt periodieke vervanging door verse ethanol aanbevolen. Evenwichtige steigers kunnen tot 1 maand worden opgeslagen in celkweekmedium bij 4 °C.
2. Doe de monsters in de centrifugebuizen met 70% ethanol voor desinfectie.
3. Voer de volgende stappen uit in een gecertificeerde biologische veiligheidskast om besmetting te voorkomen.
4. Aspiraat ethanol met een pipet terwijl je de spons met een pincet indrukt.
5. Plaats de sponzen in een petrischaal met 10–20 ml aangevuld Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium om ze volledig onder te dompelen.
6. Wissel de media drie keer uit met een kleine schudding tussen elke uitwisseling.
7. Na de derde wasbeurt voeg je nieuw medium toe, sluit je het deksel stevig en wikkel je het in paraffinefolie.
8. Bewaar de sponzen minstens een week in de koelkast op 4 °C voordat ze ze gebruiken voor celkweek. In deze periode wissel je de media 4–5 keer uit.
   OPMERKING: Zorg voor volledige verwijdering van ethanol, aangezien restethanol cytotoxisch is en de celhechting en levensvatbaarheid belemmert.

3. Achtergrondmeting en optimalisatie van beeldvorming

1. Transporteren lege optisch transparante filtratiebuizen en optisch transparante filtratiebuizen met ongezaaide zijden steigers naar de in vivo optische beeldvorming.
   OPMERKING: De beeldvorming werd uitgevoerd met een in vivo optische beeldvorming in 2D-epifluorescentiemodus.
2. Voer beeldvorming uit in verschillende filterparen (excitatie: 675 nm, 745 nm; emissie: 720 nm, 800 nm), belichtingstijden (4–60 s), f-stops (1–8), gezichtsveld (13,5–22,5 cm) en variërende lampniveaus (laag en hoog).
3. Evalueer autofluorescentie door beide platforms onder identieke omstandigheden in beeld te brengen voordat celgezaaide steigers worden gebruikt.
4. Vervang de mannelijke Luer-lock inlaat door een afgesneden vrouwelijke Luer-lock connector voor beeldvormingsopstellingen om hoogintensiteit autofluorescentie artefact uit de mannelijke Luer-lock connector te elimineren. Als de materialen voor alle experimenten hetzelfde zijn, is deze stap slechts één keer nodig.
    

4. Bereiding van celsuspensies en zaaien op zijdefibroïne-steigers

OPMERKING: Voer alle volgende stappen uit in een biologische veiligheidskast onder steriele omstandigheden, aangezien deze procedures het hanteren van levende cellen en celhoudende monsters omvatten.

1. Monitor regelmatig 4T1 wildtype (4T1-wt) en 4T1-iRFP720 muis drievoudig negatieve borstkankercellen op besmetting en stabiliteit van de expressie van iRFP720.
2. Houd 4T1-wt en 4T1-iRFP720 muis drievoudig negatieve borstkankercellen in RPMI-1640 medium, aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 1% L-glutamine en 1% penicilline/streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5%_CO-2.
3. Cellen passeren bij ongeveer 80% confluentie met 0,25% trypsine-EDTA, volgens standaard aseptische celkweekprocedures.
4. Gebruik identieke passagenummers en kweekcondities voor 4T1-wt en 4T1-iRFP720 cellen voor alle vergelijkende experimenten.
5. Bereid een celzaaidichtheid voor van 5 × 10⁴ tot 5 × 10⁷ cellen/mL (overeenkomend met een bereik van 1 × 10⁴ tot 1 × 10⁷ cellen per 200 μL). Bereid de volgende concentraties voor voor beeldvormingsanalyse om de signaalintensiteit over verschillende celdichtheden te beoordelen en de optimale concentratie te bepalen: 5 × 10⁴, 3,38 × 10⁵, 6,25 × 10⁵, 1,25 × 10⁶, 2,5 × 10⁶, 3,75 × 10⁶, 5 × 10⁶, 1,25 × 10⁷, 2,5 × 10⁷ en 5 × 10⁷ cellen/mL.
6. Bereid overeenkomstige suspenties van 4T1-wt-cellen voor in hetzelfde concentratiebereik als de 4T1-iRFP720-cellen om als niet-fluorescerende controles te dienen.
7. Plaats individuele steigers (bereid in Sectie 2) in steriele, onbehandelde Petrischalen.
   OPMERKING: Gebruik onbehandelde Petrischalen om celhechting aan het plastic oppervlak te minimaliseren en om de celhechting aan het zijden steiger te bevorderen.
8. Verwijder overtollig medium rond elke steiger en van de steiger met een pipet, waarbij je erop let dat de structuur niet wordt vervormd.
9. Pipette 200 μL van de juiste celsuspensie direct op het bovenoppervlak van elke steiger, zodat het volledige volume in de steiger wordt opgenomen.
10. Breng steigers 4 uur uit bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5%_CO2 zonder de schalen te verstoren om celhechting mogelijk te maken.
11. Na 4 uur breng je elke celgezaaide steiger voorzichtig over in een put van een 24-put plaat met 1 mL voorverwarmd volledig medium.
12. Breng steigers 's nachts (16–24 uur) uit bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5%_CO-2.

5. Assemblage van kalibratieplatforms met frits

OPMERKING: Voer alle assemblagestappen uit in een biologische veiligheidskast met steriele handschoenen, steriele pincetten en steriele gereedschappen.

1. Verwijder zijden steigers met celzaden van de 24-wellplaten met een steriele pincet, waarbij elke steiger voorzichtig wordt ondersteund om compressie te voorkomen.
2. Plaats een celgezaadde steiger in het onderste deel van een optisch transparante vaste-fase extractiebuis met behulp van een steriele kolomstootstang.
3. Plaats één steriele polyethyleenfrit direct boven de steiger met behulp van de duwstaaf.
   OPMERKING: Gebruik polyethyleenfrits alleen tijdens signaaloptimalisatie, omdat hun poriegrootte kleiner is dan de celdiameter en celmigratie of ander cel-celcontact voorkomt. Dit maakt ook een duidelijke signaalafscheiding mogelijk, waardoor de exacte celconcentratie die bij elk signaal hoort, kan worden geïdentificeerd.
4. Herhaal de stapelvolgorde, één steiger gevolgd door één frit, totdat vijf celgezaaide steigers en vijf frits zijn ingebracht.
5. Sluit de onderkant van de filtratiebuis met een steriele vrouwelijke Luer-lock connector.
6. Sluit de bovenkant van de extractiebuis met een steriele mannelijke Luer-lock connector.

6. Signaaloptimalisatie door in vivo optisch beeldvormingsinstrument met kalibratieplatforms met frits (slechts één keer voor systeemvalidatie)

1. Transporteer celgezaadde platforms voor kalibratie naar de in vivo optische beeldruimte in een lichtdichte donkere doos om fluorescerende cellen te beschermen tegen fotobleek.
2. Bereid de in vivo optische beeldvorming voor volgens de institutionele veiligheid en operationele procedures.
3. Plaats samengestelde cel-gezaaide platforms op de beeldvormingsstage.
4. Verkrijg 2D-epifluorescentiebeelden met excitatie bij 675 nm en emissie bij 720 nm en optimaliseer beeldparameters, waaronder belichtingstijd, binningfactor en f-getal, om maximale signaalintensiteit binnen het lineaire detectiebereik te bereiken (zie Aanvullende Figuur 1 en Aanvullende Figuur 2).
5. Neem ten minste één optisch transparante extractiebuis toe met steigers bezaaid met 4T1-wt-cellen bij gelijke celdichtheden als niet-fluorescerende referentiecontrole.
6. Verzamel beelden voor alle monsters met identieke verwervingsinstellingen om kwantitatieve vergelijking van fluorescentieintensiteit mogelijk te maken (zie Aanvullende Figuur 3 en Aanvullende Figuur 4).
7. Kwantificeer fluorescentiesignalen met behulp van in vivo optische beeldvormingsanalysesoftware en bepaal de optimale celzaaddichtheid (d.w.z. 5 × 10 à⁶ cellen per steiger) die het maximale signaal zonder verzadiging levert (zie aanvullende figuur 5).
   OPMERKING: De definitieve instellingen voor het in vivo optische beeldvormingssysteem zijn geselecteerd op basis van optimalisatie-experimenten om signaalacquisitie binnen het lineaire dynamisch bereik van het systeem te waarborgen, scaffold-capaciteitsaturatie te vermijden en een stabiele signaal-achtergrondverhouding te behouden over experimentele en controleomstandigheden. Op basis van geoptimaliseerde instellingen zaad je alle experimentele bioreactoren met 5 × 10^{à 6} cellen/steiger. Voer beeldvorming uit in 2D-epifluorescentiemodus met de volgende instellingen: excitatie: 675 nm (bandbreedte 30 nm); Emissie: 720 nm (bandbreedte 20 nm), belichtingstijd: 10 s, binningfactor: 8, f-getal: 8.

7. Experimentele platformassemblage (zonder frits)

1. Na signaaloptimalisatie zaaien experimentele steigers met de bepaalde optimale celdichtheid (d.w.z. 5 × 10⁶ cellen/200 μL, zie sectie 4).
2. Assembleer een experimenteel platform met in totaal vijf zijden sponzen: één celgezaadde steiger en vier lege steigers zonder polyethyleenfritten om celcommunicatie mogelijk te maken.
3. Sluit de bovenkant van de filtratiebuis af met een steriele mannelijke Luer-lock connector.
4. Configureer het kweeksysteem voor statische of dynamische cultuuromstandigheden
   1. Statische kweek: Sluit de onderste poort af met een steriele vrouwelijke Luer-lock connector. Het systeem wordt vervolgens in een centrifugebuis geplaatst met een losjes geplaatst deksel.
      OPMERKING: Omdat de mannelijke Luer-lock een opening heeft, maakt deze configuratie gasuitwisseling mogelijk terwijl het risico op besmetting wordt geminimaliseerd. In deze opstelling wordt media handmatig één keer per dag in de hood uitgewisseld.
   2. Dynamische kweek: Verbind de onderste poort met de steriele buis en verbind de inlaatleiding met de mannelijke Luer-lock bij de bovenste poort om perfusiecultuur mogelijk te maken. Voer continu media toe en verwijder het medium met behulp van een peristaltisch pompsysteem (Aanvullende Figuur 6).

8. Dynamische cultuur op het platform

1. Begin met het desinfecteren van de pomp en de bijbehorende slang door 10 minuten met 70% ethanol op maximale doorstroming door te spoelen.
2. Spoel de pomp en slang minstens 10 minuten met een steriel volledig medium om de restanten van ethanol te verwijderen. Vervang door vers medium en blijf perfusie nog 10 minuten gebruiken om volledige systeembalans te garanderen vóór gebruik.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat alle componenten volledig gevuld zijn met medium en vrij van luchtbellen voordat de celzaaiing begint.
3. Verbind de mannelijke Luer-lock inlaat (bovenkant) van de gemonteerde reactor met de uitlaatleiding van de pomp met behulp van steriele slangen en Luer-lock connectoren.
4. Sluit de pompinlaat aan op een steriel reservoir met een volledig medium.
5. Verbind de reactoruitgang (onderkant) met het mediumreservoir om een recirculatieperfusielus tot stand te brengen. Deze configuratie maakt continue doorstroming van medium door de steiger mogelijk, terwijl een gesloten lus wordt behouden.
   OPMERKING: In dit protocol wordt perfusie uitgevoerd met een recirculerende configuratie, waarbij het medium continu wordt gecycleerd tussen het reservoir en de reactor. Deze aanpak minimaliseert het middelgrote verbruik terwijl de continue stroom behouden blijft.
6. Stel de gewenste debiet op de pomp in om de nominale wandafschuifspanning te begeleiden (bijv. 1 dyn/cm² en 4 dyn/cm²), met behulp van de interne kanaalstraal ( = 3 mm) op basis van de aanname van Poiseuille-stroming¹⁹:
   
   waarbij τ de wandafschuifspanning is (dyn/cm²), en Q de volumetrische debiet (cm³/s), de vloeistofviscositeit van het RPMI-1640 medium (0,958 × 10-3 N·s/m ² bij 37 °C)²⁰. Hoewel het daadwerkelijke systeem een poreuze zijden steiger bevat en daardoor afwijkt van deze geïdealiseerde geometrie, werden de berekende waarden gebruikt als gestandaardiseerde operationele benchmarks om reproduceerbare vergelijkingen tussen stromingscondities mogelijk te maken. De overeenkomstige debieten waren 0,133 mL/min en 0,531 mL/min en werden gebruikt als perfusiecondities voor kweek.
7. Start de perfusie en monitor het systeem op lekkages, bubbelvorming en stabiele stroming.
8. Start de perfusie met migratieremmer of een testmiddel (bijv. Cucurbitacine E (CuE) bij 0,05 μmol/L in volledig medium) of zonder (controle) en houd de hele opstelling op 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5%_CO2 tot vijf dagen. Sluit daarom de pompinlaat aan op een steriel reservoir met een volledig medium inclusief de bijbehorende teststof, en start de pomp met vergelijkbare instellingen als voorheen.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat ethanol volledig uit de pomp en slang wordt verwijderd door de vastgestelde mediumspoelstappen uit te voeren. Verwijder het eerste deel van het medium na het spoelen voordat je het aansluit op celzaadreactoren en zorg ervoor dat het systeem volledig gevuld is met vers medium en vrij van luchtbellen.

9. Fluorescentiebeeldvorming van het experimentele platform

1. Stop de pomp, koppel alle slangen los terwijl je de steriele omstandigheden handhaaft.
2. Sluit de onderkant van de SPE-buis af met een vrouwelijke Luer-lock connector, plaats het hele systeem in een steriele 50 mL centrifugebuis en sluit de buis stevig.
3. Breng het systeem over naar een bioveiligheidskast om alle volgende stappen voort te zetten. Binnen de motorkap vervang je de mannelijke Luer-lock connector door een afgekapte vrouwelijke Luer-lock connector om het systeem volledig te sluiten.
4. Plaats het afgesloten systeem terug in een steriele 50 mL centrifugebuis en sluit de buis stevig voor transport.
   OPMERKING: Afhankelijk van de laboratoriumomstandigheden hoeft de stroming niet te worden gestopt voor beeldvorming wanneer het systeem strak is. Dit was echter niet mogelijk onder de gegeven experimentele omstandigheden.
5. Transporteren afgesloten reactoren naar de kamer van het in vivo optische beeldvormingssysteem in een lichtdichte donkere doos om fluorescerende cellen te beschermen tegen fotobleek.
6. Plaats de reactoren op het in vivo optisch beeldvormingssysteem in de juiste houder.
7. Verneem 2D-epifluorescentiebeelden met behulp van de eerder geoptimaliseerde parameters (bijv. excitatie 675 nm, emissie 720 nm, belichtingstijd 10 s, binning 8, f-getal 8).
8. Voeg 4T1-wt zaad, ongezaaide steigers en lege reactorcontroles toe voor elke beeldvormingssessie.
9. Kwantificeer fluorescentiesignalen met behulp van in vivo optische beeldvormingsanalyse.
10. Plot de kwantitatieve resultaten voor de controle- en behandelingsgroepen en genereer vergelijkende grafieken om het effect van de testverbinding op het gemeten resultaat te visualiseren.

10. Beeldanalyse van experimenteel platform

1. Verzamel fluorescentiebeelden op dag 0, dag 3 en dag 5 en analyseer met beeldanalysesoftware.
2. Voer voor elke afbeelding ruimtelijke kalibratie uit voorafgaand aan de analyse. Meet de bekende fysieke lengte van het experimentele platform in pixels met behulp van de lijntool en voer de overeenkomstige echte afstand (85 mm) in via Analyze > Set Scale om de pixel-naar-lengte-conversie te definiëren.
3. Na de kalibratie kwantificeert u het fluorescerende gebied door handmatig het interessegebied (ROI) te omlijnen met behulp van de vrijhandselectietool.
4. Om gebruikersbias te minimaliseren, bepaal ROI's met consistente visuele criteria op basis van de intensiteit van het fluorescentiesignaal ten opzichte van de achtergrond. Voer alle analyses uit onder identieke omstandigheden en, waar mogelijk, laat een enkele getrainde operator de analyse uitvoeren.
5. Identificeer het fluorescentiesignaal als heldere gebieden die duidelijk te onderscheiden zijn van de donkere achtergrond in de in vivo optische beeldvormingsanalyse-softwarebeelden, en gebruik deze signalen om consistente handmatige segmentatie te sturen.
6. Meet de geselecteerde gebieden met Analyze > Measure en registreer de gebiedswaarden voor elk tijdstip. Herhaal deze procedure voor alle beelden in alle experimentele groepen.
7. Normaliseer oppervlaktemetingen naar de overeenkomstige dag 0-waarde voor elk monster met behulp van spreadsheetsoftware om rekening te houden met verschillen in initiële grootte, en druk de resultaten uit als vouwverandering ten opzichte van de basislijn (dag 0 = 1).

11. Statistische analyse

1. Voer alle experimenten minstens in drievoud uit.
2. Herhaal alle experimenten minstens drie keer (n = 3), bepaal de gemiddelde waarden evenals de standaarddeviaties (SD).
3. Bepaal statistische significantie met behulp van tweerichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's meervoudige vergelijkingstest met α = 0,05.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een gebruiksvriendelijk, goedkope platform voor macroscopische observatie van celgroei en -beweging in een fysiologisch relevante 3D-omgeving. De methode gebruikt zijdefibroïnesponzen als ECM-imitator en verwerkt gecontroleerde interstitiële stroming om dynamische weefselcondities te modelleren. Een schematisch overzicht van stapsgewijze procedures, van de fabricage van zijdespons en steigers tot celzaaien en experimentele platformassemblage, is weergegeven in

Discussie

Het productieproces van zijdespons zoals beschreven in dit protocol is gestandaardiseerd, wat zorgt voor reproduceerbare steigerfabricage, zoals gerapporteerd in een eerdere studie¹⁶. De productie van sponzen onder volledig gestandaardiseerde omstandigheden, zoals zoutbedhoogte/-hoeveelheid, volume van zijdeoplossing en methanolincubatie, is cruciaal om uniforme, vergelijkbare sponzen te verkrijgen. De geproduceerde sponzen moeten voldoen aan de kwaliteitscontrole...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,1,1,3,3,3-Hexafluoroisopropanol (HFIP)	Sigma-Aldrich	8.04515	Let op: Gevaarlijk. Gebruikt voor het oplossen van gevriesdroogde zijde
24-Well plate	Cellstar, Greiner Bio-One	662102	Opslag van op cellen gezaaide scaffolds tijdens incubatie
4T1-iRFP720 muis triple-negatieve borstkankercellen	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	N/A	Celcultuurexperimenten; 4T1-iRFP720 is in eigen huis afgeleid van de ouderlijke 4T1 (ATCC: CRL-2539)
4T1-wt muis triple-negatieve borstkankercellen	Macromolecular Cancer Therapeutics Laboratory (MMCT), University of Vienna	ATCC: CRL-2539	Celcultuurexperimenten
Bruker Alpha Compact FTIR met Platinum-ATR Sampling Module	Bruker	A220/D-01	FT-IR-analyse
Calciumchloride, watervrij, ≥93% reagentiakwaliteit	Sigma-Aldrich	902179	Voor de bereiding van oplosmatrix
Celcultuurkolf, T25	Cellstar, Greiner Bio-One	690175	Consumables; voor celkweek
Celcultuurkolf, T75	Cellstar, Greiner Bio-One	658175	Consumables; voor celkweek
Centrifuge 5804 R	Eppendorf	5805000010	Gebruikt voor monsterscheiding door centrifugatie
Combi-stop (vrouwelijke Luer-lock-connector)	Braun Melsungen AG	4495101	Gebruikt voor de platformassemblage
Cucurbitacin E	Sigma-Aldrich	SML0577	Celmigratie-remmer
Dermale biopsie puncher, ø 6 mm	Dahlhausen	1190001006	Gebruikt om cilindrische sponsscaffolds te verkrijgen
Dialysebuizen (3,5 kDa, cellulose)	Spectra/Por van Spectrum Labs	SPEC132724	Voor dialyse van zijde-fibroïne-oplossing
Dulbecco's fosfaatbuffer oplossing (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Voor celonderhoud
Ethanol, absoluut	Merck	1.07017	Voor de bereiding van oplosmatrix
Excel	Microsoft	v2604	Dataorganisatie, basisberekeningen en plotten
Foetaal runder serum (FCS) hitte-geïnactiveerd	Biowest	S181H-500	Supplement voor celkweekmedia
Fiji (voorheen ImageJ)	Open source (https://imagej.net/software/fiji/)	N/A	Beeldverwerking en -analyse
GraphPad Prism	GraphPad Software	v8.2.1	Statistische analyse en grafiekgeneratie
HPLC-pomp Hitachi L-7120 LaChrom	Merck	K-5244	Voor dynamische kweekcondities in de geassembleerde platform
IVIS 200 Spectrum CT-systeem	PerkinElmer	128201	Optisch beeldvormingssysteem met CT-mogelijkheid
IVIS Living Image Software	PerkinElmer	v4.5.2	Software voor acquisitie, visualisatie en kwantitatieve analyse van IVIS-beeldgegevens
JEOL JSM-6510 Rasterelektronenmicroscoop	JEOL GmbH	JSM-6510	SEM-beelden
L-glutamine, 200 mM oplossing, geschikt voor celkweek (L-Glu)	Sigma-Aldrich	G7513	Supplement voor celkweekmedia
Lyofilisaat Alpha 2-4 LD Plus	Martin Christ	101542	Voor zijde-fibroïne lyofilisaat
Mannelijke Luer-lock-connector	Supelco (Sigma-Aldrich)	57020-U	Adapter voor monsterreservoirs
Methanol, ≥99,9 %, HPLC Gradient Grade	Carl Roth	7342.1	Let op: Toxisch. Inductie van beta-sheet-vorming in zijdecomposieten
Optisch transparante Solid Phase Extraction (SPE) buizen zonder frits	Sigma Aldrich	57240-U	Gebruikt voor de platformassemblage
OPUS Spectroscopy software	Bruker	v7.5	FT-IR-analyse
Orbitale en lineaire schudder MI0103002	Four E'S Scientific	MI0103002	Uniforme verdeling/mengen
Parafilm PM996	Sigma-Aldrich	P7793	Voor het afdichten/inpakken van platen en containers voor opslag (bijv. koeling)
Penicilline-Streptomycine, vloeibaar, geschikt voor celkweek (P/S)	Sigma-Aldrich	P0781	Supplement voor celkweekmedia
Petrischaal, 9 cm	VWR	391-0598	Voor zoutbed-sponskast; voor zaaien op zijdescaffolds
Polyethyleen frits voor 1 mL SPE buizen	Supelco (Sigma Aldrich)	57244	Gebruikt voor de platformassemblage
RPMI-1640 Medium, geschikt voor celkweek	Sigma-Aldrich	R0883	Aangevuld medium wordt gebruikt voor zijdespons-equilibratie, celkweekonderhoud en gerelateerde experimenten
Serologische pipet, 10 mL	Sarstedt	86.1254.025	Consumables; voor celonderhoud
Serologische pipet, 25 mL	Sarstedt	86.1685.020	Consumables; voor celonderhoud
Serologische pipet, 5 mL	Sarstedt	86.1253.025	Consumables; voor celonderhoud
Zijdekokons van Bombyx mori L.	Sericulture and Agriculture Experimental Station, Vratsa, Bulgarije	N/A	Grondstof voor de productie van zijde-fibroïne-spons
Natriumcarbonaat, watervrij, ≥99,5% ACS	VWR	11552.A3	Gebruikt voor chemische ontsering, d.w.z. verwijdering van sericine
Natriumchloride, ≥98%, technisch	VWR	27788.366	Voor zoutbed-sponskast
SPE Column Push Rod	Carl ROTH	36P9.1	Ge