Methodenartikel

CRISPR-Cas9 genoomredigering in Mesorhizobium ciceri via nodC-disruptie voor studies naar symbiose bij kikkererwten

0 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71513

⸱

25 september 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Root Nodule Symbiosis Laboratory, National Institute of Plant Genome Research, 2Microbial Engineering Laboratory, International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de CRISPR-Cas9-gemedieerde disruptie van de nodC locus in Mesorhizobium ciceri met behulp van homology-directed repair en GFP-gebaseerde screening om symbiose-defecte mutanten te genereren voor functionele genomische studies in kikkererwten-geassocieerde rhizobia.

Samenvatting

Mesorhizobium ciceri, een stikstofbindende symbiont van de kikkererwt (Cicer arietinum), blijft genetisch lastig te manipuleren met conventionele methoden voor homologe recombinatie, die arbeidsintensief zijn en vaak ongewenste selectiemarkers achterlaten. In dit protocol beschrijven we een gestroomlijnde strategie voor genoomredigering met behulp van een Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9)-systeem met een breed gastheerbereik, aangepast voor M. ciceri. We demonstreren de effectiviteit van deze methode door te richten op nodC, dat codeert voor de N-acetylglucosaminyltransferase die nodig is voor de synthese van het chitine-skelet in Nod-factoren, de primaire signaleringsmoleculen die betrokken zijn bij symbiotische moleculaire communicatie. Dit protocol beschrijft in detail het systematische ontwerp van single-guide RNA's (sgRNA's) en de constructie van een template voor homology-directed repair (HDR). Het HDR-template is ontworpen om de site-specifieke integratie van een green fluorescent protein (GFP)-reporter te faciliteren, geflankeerd door de nodC-splitsingsplaats. Na overdracht van het Cas9/sgRNA/HDR-construct via biparentale paring werden putative mutanten geïdentificeerd met behulp van een screeningsmethode op basis van fluorescentie. De succesvolle disruptie van de 1.3 kb nodC-locus binnen de nodulatie- (nod)-cassette werd aanvankelijk gescreend door visualisatie van de GFP-expressie in mutante kolonies met fluorescentiemicroscopie. De disruptie werd verder gevalideerd door restrictiedigestie, amplificatie van de geïntegreerde cassette uit genomisch DNA en Sanger-sequencing. De GFP-expressie werd bovendien gekwantificeerd via reverse transcription quantitative polymerase chain reaction. Om de functionele impact van de mutatie te valideren, werden infectieassays met kikkererwten uitgevoerd, waaruit bleek dat de nodulatie in planten geïnoculeerd met ΔnodC M. ciceri was verminderd in vergelijking met de wildtype-stam. Over het algemeen biedt dit protocol een efficiënt en reproduceerbaar kader voor precieze gen-disruptie en functionele genomica-studies in Mesorhizobium.

Inleiding

Het Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)-associated protein 9 (Cas9) nuclease-systeem, oorspronkelijk geïdentificeerd als een adaptief immuunmechanisme in prokaryoten, is aangepast tot een effectieve en betrouwbare tool voor genoomredigering1,2. Het systeem maakt gebruik van een synthetisch gids-RNA (sgRNA) om doel-DNA-sequenties te identificeren via Watson-Crick basenparing. Het sgRNA bestaat uit 20 nucleotiden die complementair zijn aan de genomische regio grenzend aan de protospacer adjacent motif (PAM) sequentie NGG. Cas9 veroorzaakt een dubbelstrengs breuk (DSB) op een specifieke locatie binnen de doelsequentie, doorgaans 3 basenparen (bp) stroomopwaarts van de PAM-site1. De resulterende DSB's kunnen worden hersteld via non-homologe end joining of via homology-directed repair (HDR) met behulp van een donormaat3,4. Deze strategie is op grote schaal toegepast voor gen-disruptie, knock-in en knock-out benaderingen in bacteriën5,6,7,8. Het hoofddoel van dit protocol is het ontwikkelen van een efficiënte methode voor genoomredigering van Mesorhizobium ciceri met behulp van een CRISPR-Cas9-systeem met een breed gastheerspectrum.

M. ciceri is een Gram-negatieve bodembacterie die functioneert als een essentiële stikstoffixerende endosymbiont van de kikkererwt (Cicer arietinum)9. Eén stam, M. ciceri CC1192, vertoont een hoge nodulatie-efficiëntie en het genoom hiervan is gesequenced10. Ondanks het agrarische belang blijft genetische manipulatie van Mesorhizobium-soorten beperkt. CRISPR-gebaseerde systemen zijn eerder geïmplementeerd in andere rhizobia, waaronder CRISPR-interferentie (CRISPRi) in Rhizobium etli11, genoomredigering in Sinorhizobium meliloti12 en base-editing in S. meliloti13. Er is echter nog geen robuust platform voor genoomredigering voor M. ciceri gerapporteerd. Conventionele benaderingen zijn afhankelijk van homologe recombinatie via suicide-plasmiden, wat arbeidsintensief is, meerdere selectierondes vereist en vaak antibiotica-resistentiemarkers als genomische littekens achterlaat14.

Om deze beperkingen aan te pakken, werd het pCasPP-vectorsysteem, oorspronkelijk ontwikkeld voor Paenibacillus polymyxa, aangepast voor gebruik in M. ciceri15. Het pCasPP-raamwerk maakt gebruik van een Streptococcus pyogenes Cas9 die codon-geoptimaliseerd is voor actinomyceten met een hoog GC-gehalte en bevat een lacZ-cassette voor blauw-wit screening van sgRNA-klonering onder de constitutieve gapdh-promotor8. Biparentale paring werd uitgevoerd tussen de donorstam Escherichia coli en de recipientstam Mesorhizobium om de editeervector over te dragen16. Om de screeningsefficiëntie te verhogen, werd de groen fluorescerende eiwitvariant (GFP) bjGFP, oorspronkelijk codon-geoptimaliseerd voor Bradyrhizobium diazoefficiens, opgenomen in het HDR-donormodel16. Deze op fluorescentie gebaseerde screeningsstrategie werd toegepast om de essentiële nodC-locus te targeten, welke vereist is voor de vroege stadia van symbiotische signalering tussen de bacterie en de kikkererwt17,18.

Dit protocol biedt een nauwkeurig en efficiënt alternatief voor methoden voor willekeurige chemische of ultraviolette (UV) mutagenese. In validatie-experimenten vertoonden meer dan 80% van de herwonnen kolonies GFP-fluorescentie, en representatieve bewerkte kolonies werden verder bevestigd middels polymerasekettereactie (PCR) en Sanger-sequencing. De resulterende ΔnodC M. ciceri mutanten vormen een nuttige bron voor het bestuderen van symbiotische signalering en gastheer-microbe interacties. Over het algemeen biedt dit raamwerk de rhizobium-onderzoeksgemeenschap een efficiënte en schaalbare benadering voor functionele genomica-studies in Mesorhizobium.

Protocol

Alle experimentele protocollen met betrekking tot plantengroei, microbiële inoculatie en het hanteren van genetisch gemodificeerde bacteriën werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en regelgeving. De plantkweek en bacteriële inoculaties werden uitgevoerd onder gecontroleerde groei-kamercondities. De M. ciceri stam die in deze studie is gebruikt, is geclassificeerd als een Biosafety Level 1 (BSL-1) micro-organisme. Omdat alle experimenten werden uitgevoerd onder gecontroleerde laboratoriumomstandigheden zonder veldoutlaat, was formele institutionele biosafety-goedkeuring niet vereist in overeenstemming met het institutionele biosafety-beleid. Al het biologisch afval dat tijdens de studie is gegenereerd, werd geautoclaveerd vóór verwijdering.

1. Preparatie van competente cellen

Chemisch competente E. coli DH5α en E. coli S17-1λpir cellen werden bereid en gevalideerd volgens de procedure beschreven in Aanvullend bestand 1.

2. Ontwerp van gids-RNA

  1. Ontwerp van Guide RNA's
    1. Open het Benchling-platform (https://benchling.com/). Meld u aan bij een bestaand Benchling-account of maak een nieuw account aan.
    2. Maak een nieuw project aan en open de CRISPR Guide Design Tool.
    3. Upload of plak de volledige target-DNA-sequentie voor het ontwerp van het guide RNA. Selecteer de optie “Single Guide” en stel de guidelengte in op 20 bp.
    4. Selecteer het genoomreferentie uit de beschikbare opties. Selecteer voor het ontwerp van guide RNA gericht op M. ciceri Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 als referentiegenoom. Gebruik NGG als de protospacer adjacent motif (PAM)-sequentie die vereist is voor de activiteit van Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9).
    5. Gebruik het algoritme van Hsu et al.19 om de voorspelde off-target knippfrequenties te berekenen. Hanteer een drempelwaarde van ≥50 om aspecifieke splitsing over de achtergrond van het referentiegenoom te minimaliseren.
    6. Gebruik het Doench-Root-algoritme20 om de voorspelde on-target efficiëntiescores te berekenen. Stel een drempelwaarde voor target-selectie in van ≥60 om guides te identificeren met een gunstige voorspelde Cas9-splitsingsefficiëntie op de target-locus.
    7. Klik op “Finish” om de lijst met kandidaat guide RNA's te genereren.
  2. Selectie van Guide RNA's
    1. Open het resultatenpaneel van het guide RNA.
    2. Geef prioriteit aan kandidaat sgRNA's waarvan voorspeld wordt dat ze een dubbelstrengse breuk veroorzaken binnen 100 bp van het translationele startcodon (ATG), om de kans op het produceren van een niet-functioneel eiwit te vergroten.
    3. Evalueer de off-target en on-target scores. Geef prioriteit aan een hogere off-target score boven een iets hogere on-target score om het risico op onbedoelde off-target splitsing te verminderen.
    4. Selecteer één of twee kandidaat single-guide RNA's (sgRNA's) die voldoen aan alle selectiecriteria.
  3. Preparatie van gRNA-oligonucleotiden
    1. Genereer de reverse-complement sequentie van het geselecteerde guide RNA.
    2. Voeg de sequentie 5′-ACGC toe aan het 5′-uiteinde van het guide RNA en voeg de sequentie 5′-AAAC toe aan het 5′-uiteinde van de reverse-complement streng.
    3. Bestel beide oligonucleotiden met 5′-fosforylering en PAGE-zuivering bij een syntheseschaal van 25 nmol.
  4. Annealing van gRNA-oligonucleotiden
    1. Bereid 30 mM HEPES-buffer door 7,15 g HEPES-vrij zuur op te lossen in ongeveer 800 mL gedestilleerd water. Stel de pH bij naar 7,8 met natriumhydroxide en vul aan tot een eindvolume van 1 L.
    2. Resuspendeer elk gefosforyleerd oligonucleotide in nuclease-vrij water tot een eindconcentratie van 100 µM. Combineer 5 µL van elk oligonucleotide met 90 µL 30 mM HEPES-buffer in een steriele microcentrifugebuis.
    3. Vortex kort en centrifugeer om de vloeistof te verzamelen. Anneal de oligonucleotiden in een thermocycler door te incuberen bij 95°C gedurende 5 min en af te koelen tot 4°C met een afkoelsnelheid van 0,1°C/s.
    4. Verdun de geannealde oligonucleotiden 10-voudig met nuclease-vrij water.
  5. Assemblage van gRNA in pCasPP-vector
    1. Verkrijg de pCasPP-vector zoals eerder beschreven door Rütering et al.15.
    2. De plasmidsequentie werd verstrekt door Jochen Schmid, en het construct dat in deze studie werd gebruikt, werd verkregen via Dr. Syed Shams Yazdani (ICGEB).  
    3. Stel een Golden Gate-reactie samen bestaande uit 100 ng pCasPP-vector, 0,3 µL geanneald oligonucleotide-insert, 2 µL 10× T4 DNA-ligasebuffer, 1 µL T4 DNA-ligase, 1 µL BbsI-restrictie-enzym en nuclease-vrij water tot een eindvolume van 20 µL.
    4. Bereid een negatieve-controle-reactie voor door het insert te vervangen door nuclease-vrij water.
    5. Meng de reacties voorzichtig en centrifugeer kort.
  6. Cycluseringscondities voor Golden Gate-assemblage
    1. Plaats de reactiebuisjes in een thermocycler. Voer negen cycli uit bestaande uit 37°C gedurende 10 min gevolgd door 16°C gedurende 10 min.
    2. Incubeer de reacties bij 50°C gedurende 5 min en daarna bij 65°C gedurende 20 min. Bewaar de reacties bij 4°C tot gebruik.
  7. Transformatie van assemblagereacties
    1. Ontdooi 50 µL competente Escherichia coli DH5α-cellen op ijs gedurende 10–15 min.
    2. Voeg 3 µL van elke Golden Gate-assemblagereactie toe aan de competente cellen. Verwerk de negatieve-controle-reactie parallel. Incubeer de mengsels op ijs gedurende 30 min.
    3. Voer een hitte-shock uit op de cellen bij 42°C gedurende 45 s en plaats de buisjes onmiddellijk terug op ijs voor 2 min. Voeg 950 µL Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC)-medium toe.
    4. Bereid SOC-medium bestaande uit 0,5% gistextract, 2% trypton, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ en 20 mM glucose. Steriliseer het medium door filtratie met een 0,4 µm spuitfilter onder aseptische omstandigheden.
    5. Incubeer de culturen bij 37°C en 180 rpm gedurende 1 u.
  8. Selectie van positieve transformanten
    1. Bereid LB-agarplaten voor aangevuld met 50 µg/mL neomycine, 0,2 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en 32 mg/L 5-broom-4-chloor-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal). Plaats 100 µL van de herstelcultuur op de selectieve platen. Incubeer de platen bij 37°C gedurende 12–16 u.
    2. Selecteer witte kolonies en verwijdert de blauwe kolonies. Verifieer dat de negatieve-controleplaat minder dan vijf kolonies bevat.
  9. Screening en expansie van positieve klonen
    1. Ent drie tot vier onafhankelijke witte kolonies op verse selectieve LB-agarplaten.
    2. Incubeer de platen bij 37°C gedurende 12–16 u. Inoculeer individuele kolonies in 10 mL LB-medium aangevuld met 50 µg/mL neomycine.
    3. Verwerk elk guide RNA-construct onafhankelijk gedurende de verdere workflow.
  10. Validatie van pCasPP-gRNA-constructs
    1. Oogst de bacteriële culturen door centrifugatie. Isoleer plasmid-DNA met een silica-kolom plasmid-zuiveringskit.
    2. Verteer het geïsoleerde plasmid-DNA met XbaI en EcoRI in de geschikte reactiebuffer gedurende 1 u bij 37°C.
    3. Scheid de digestieproducten op een 1% agarosegel bereid in 1× Tris-acetaat-EDTA (TAE)-buffer bevattend ethidiumbromide bij een eindconcentratie van 0,5 µg/mL.
    4. Run de gel bij 90–110 V totdat het kleurfront over ongeveer 70–80% van de gellengte is gemigreerd. Visualiseer de DNA-fragmenten met een UV-transilluminator.
    5. Bevestig positieve klonen door detectie van een fragment van 1.280 bp, en identificeer lege-vector-controles door detectie van een fragment van 1.630 bp. De lege pCasPP-vector is ongeveer 9.663 bp en bevat een lacZ-gen; insertie van het 24 bp gRNA-oligonucleotide verwijdert het lacZ-fragment, wat resulteert in een kleiner gRNA-bevattend pCasPP-construct. De XbaI- en EcoRI-restrictieplaatsen die de lacZ-regio flankeren, worden gebruikt voor diagnostische bevestiging van gRNA-cloning.
  11. Preparatie van glycerolstocks
    1. Kweek een bevestigde positieve kloon in selectief LB-medium.
    2. Bereid een glycerolstock door 700 µL log-fase cultuur te mengen met 300 µL steriel 50% glycerol. Breng het mengsel over in steriele cryovials. Bewaar de glycerolstocks bij −80°C.
      OPMERKING: Vermijd herhaalde vries-dooi-cycli. Bereid meerdere aliquots om de plasmidstabiliteit en bacteriële levensvatbaarheid te behouden. De voltooide Golden Gate-assemblagereactie kan overnacht bij 4°C of gedurende 1–2 weken bij −20°C worden bewaard vóór transformatie.

3. Assemblage van het sjabloon voor homologiericht herstel

  1. Voorbereiding van het groen fluorescent eiwit (GFP) insert
    1. Verkrijg het plasmide pRJPaph-bjGFP dat de fluorescente reportercassette bevat16 (Tabel 1)10,15,16,21,22,23. Het plasmide werd geleverd door Prof. Hans-Martin Fischer (ETH Zürich, Zwitserland) en is verkrijgbaar via Addgene (Plasmide #67032).
    2. Exciteer de gfp-cassette uit pRJPaph-bjGFP door restrictiedigestie met SacI en KpnI zoals beschreven in Aanvullend Bestand 2 (Stap 3.1). De gfp-sequentie in pRJPaph-bjGFP is een synthetisch bjGFP-gen dat codon-geoptimaliseerd is voor Bradyrhizobium diazoefficiens.
    3. Purificeer het verwachte gfp-fragment van 1081 bp.
  2. Constructie van pUC18-gfp
    1. Verkrijg de pUC18-backbone (Addgene plasmide #50004)21.
    2. Lineariseer pUC18 met SacI en KpnI zoals beschreven in Aanvullend Bestand 2 (Stap 3.2).
    3. Ligeer het gepurificeerde gfp-fragment in de gelineariseerde pUC18-vector zoals beschreven in Aanvullend Bestand 2 (Stap 3.2).
    4. Transformeer competente E. coli DH5α-cellen met de transformatieprocedure beschreven in Stap 2.7, waarbij het ligatiemengsel gegenereerd in Stap 3.2.3 wordt gebruikt in plaats van de Golden Gate assembly-reactie.
    5. Selecteer positieve transformanten en verifieer de gfp-insertie via kolonie-polymerasekettingreactie (PCR) zoals beschreven in Aanvullend Bestand 2 (Stap 3.2).
  3. Amplificatie van homologie-armen
    1. Ontwerp primers voor de amplificatie van stroomopse (UHA) en stroomafse (DHA) homologie-armen van ongeveer 400–500 bp uit genomisch DNA van M. ciceri (Tabel 2).
    2. Incorporeer SacI/EcoRI-restrictieplaatsen in de UHA-primers en XbaI/KpnI-restrictieplaatsen in de DHA-primers. Gebruik primers F_nodC_Up_EcoRI en R_nodC_Up_SacI voor de amplificatie van de UHA en primers F_nodCdown_KpnI en R_nodCdown_XbaI voor de amplificatie van de DHA (Tabel 2).
    3. Isoleer genomisch DNA van M. ciceri volgens Weerakkody et al.25.
    4. Amplificeer en purificeer de UHA- en DHA-fragmenten zoals beschreven in Aanvullend Bestand 2 (Stap 3.3).
  4. Constructie van pUC18-UHA-gfp
    1. Kloon het UHA-fragment in pUC18-gfp met EcoRI en SacI zoals beschreven in Aanvullend Bestand 2 (Stap 3.4).
    2. Bevestig de correcte assemblage van het plasmide door restrictiedigestie met XbaI en KpnI. Een succesvolle assemblage moet fragmenten van ongeveer 500 en 3725 bp genereren.
    3. Ga verder met één geverifieerde kloon.
  5. Constructie van pUC18-UHA-gfp-DHA
    1. Kloon het DHA-fragment in pUC18-UHA-gfp met KpnI en XbaI zoals beschreven in Aanvullend Bestand 2 (Stap 3.5).
    2. Bevestig de correcte assemblage door restrictiedigestie met SacI en EcoRI. Een succesvolle assemblage moet fragmenten van ongeveer 400 en 4271 bp genereren.
    3. Verifieer 5–6 kandidaatklonen via Sanger-sequencing met de primers F_nodC_Up_EcoRI, BjGFP_BP_F1 en R_nodCdown_XbaI (Tabel 2), die samen het grootste deel van de Homology-Directed Repair (HDR)-cassettesequentie bestrijken.
  6. Amplificatie en purificatie van het definitieve HDR-sjabloon
    1. Amplificeer de volledige HDR-cassette met de primers F_FL_nodCgfp_XbaI en R_nodCdown_XbaI (Tabel 2).
    2. Purificeer het verwachte HDR-fragment van 2012 bp en digereer het gepurificeerde PCR-product met XbaI zoals beschreven in Aanvullend Bestand 2 (Stap 3.6).
  7. Voorbereiding van pCasPP-gRNA-vectoren
    1. Haal de in Stap 2 gegenereerde pCasPP-gRNA1- en pCasPP-gRNA2-plasmiden op.
    2. Lineariseer de plasmiden met XbaI en defosforyleer de vector-backbone zoals beschreven in Aanvullend Bestand 2 (Stap 3.7).
  8. Kloneren van het HDR-sjabloon in pCasPP-gRNA-vectoren
    1. Ligeer de HDR-cassette in XbaI-gelineariseerde pCasPP-gRNA1 of pCasPP-gRNA2 zoals beschreven in Aanvullend Bestand 2 (Stap 3.8).
    2. Transformeer competente E. coli DH5α-cellen en selecteer transformanten op LB-agar bevattend 50 µg/mL neomycine.
  9. Screening van HDR-bevattende klonen
    1. Screen transformanten op GFP-fluorescentie met een fluorescentiestereomicroscoop uitgerust met een standaard GFP-filterset (excitatie 470–488 nm; emissie 507–510 nm).
    2. Classificeer kolonies als GFP-positief op basis van de aanwezigheid van een duidelijke, uniforme groene fluorescentie die duidelijk sterker is dan de zwakke autofluorescentie waargenomen in niet-bewerkte negatieve-controlekolonies.
    3. Breid GFP-positieve klonen uit en isoleer het plasmide-DNA.
  10. Validatie van de HDR-vectorassemblage
    1. Bevestig de HDR-insertie door restrictiedigestie met XbaI.
    2. Verifieer de succesvolle assemblage door het vrijkomen van het verwachte HDR-fragment van 2012 bp samen met een pCasPP-gRNA-vectorbackbone van ongeveer 9.300 bp.
      OPMERKING: Na hitte-inactivering van de restrictie-enzymen en fosfatase kunnen reactiemengsels gedurende één nacht bij 4°C of tot 1 maand bij −20°C worden bewaard. Bewaar bevestigde plasmideconstructen bij −20°C voor langdurige bewaring.
Stam of plasmideBeschrijvingReferentie
Mesorhizobium ciceri CC1192Recipiëntstam gebruikt voor CRISPR-Cas9 genoomredigering en assays voor nodulatie van kikkererwtenHaskett et al.10
pCasPPCRISPR-Cas9 genoombewerkingsvector gebruikt voor gids-RNA-klonering en HDR-sjabloonafleveringRütering et al.15
pRJPaph-bjGFPGFP-reporterplasmide gebruikt als bron van de GFP-cassette
(Addgene plasmide #67032)		Ledermann et al.16
pUC18Algemene kloningsvector gebruikt voor de assemblage van HDR-templates
(Addgene plasmide #50004)		Norrander et al.21
Escherichia coli S17-1λpirDonorstam gebruikt voor biparentale conjugatieSimon et al.22
Escherichia coli DH5αKloongast gebruikt voor plasmidpropagatieHanahan et al.23

Tabel 1: Bacteriële stammen en plasmiden gebruikt in deze studie. Deze tabel vermeldt de bacteriële stammen en plasmiden die zijn gebruikt voor plasmidpropagatie, CRISPR-Cas9-gemedieerde genoomredactie, assemblage van homology-directed repair (HDR) templates, biparentale paring en fluorescentielabeling van Mesorhizobium ciceri CC1192.

CategorieNaamsequentie (5′ figure-protocol-1 3′) of beschrijving
Bacteriële stamEscherichia coli DH5αKloonwaardstam
Bacteriële stamEscherichia coli S17-1λpirDonorstam voor biparentale paring
KloonvectorpUC18Kloonbackbone-vector
CRISPR-vectorpCasPPCRISPR-Cas9-vector met breed gastbereik
ReporterplasmidpRJPaph-bjGFPGFP-reporterplasmid
PrimerF_guide1_BbsIpACGCTGTTTACAGAGGCATGCAAG
PrimerR_guide1_BbsIpAAACCTTGCATGCCTCTGTAAACA
PrimerF_guide2_BbsIpACGCGCTTGTTCGGATCCGACCGT
PrimerR_guide2_BbsIpAAACACGGTCGGATCCGAACAAGC
PrimerF_nodC_Up_EcoRIAAAGAATTCCTCATTGCAAGCCAGCAGT
PrimerR_nodC_Up_SacIAAAGAGCTCCGGAAAGCTTGTTTCGGATCC
PrimerF_nodCdown_KpnIAAAGGTACCTCGAGAGCACCGCATAAGAC
PrimerR_nodCdown_XbaIAATTCTAGATGGTTCGGTACTTTCGTGCA
PrimerF_FL_nodCgfp_XbaIAAATTCTAGACTCATTGCAAGCCAGCCAGT
PrimerBjGFP_BP_F1GAAGTTCATCTGCACCACCG
PrimerBjGFP_BP_R1GTCCTTGAACGAGATGGTGC
PrimerBjGFP_BP_F2CCAACTTCAAGATCCGCCAC
PrimerGFP_RCCAACTTCAAGATCCGCCAC
PrimerBjGFP_BP_R2CTTGTACAGCTCGTCCATGC
Primer16S_F1ATCCTGGCTCAGAACGAACG
Primer16S_R1ATTCCCACGCGTTACTCACC
Primer16S_F2AGTCCGAGAGGGTGAGTGG
Primer16S_R2GTCAGTACCGAGCCAGTGAG
PrimerF1_nodCCGATTTCCAGAACCGTCGTC
PrimernodC_RCGATTTCCAGAACCGTCGTC
PrimerR1_nodCTCCCCTGCTACAATGAGGAC
PrimerF2_nodCAGTGACTCCGCAATTCCAGA
PrimerR2_nodCTGTCGGTAAAAGTGTTTCCC
PrimerF1_nodBTGGTTCGGTACTTTCGTGCA
PrimerR1_nodBAGTCGCGTGGATCAATGGAC
PrimerF1_nodATGATCGTCGCTGAATTGGGC
PrimerR1_nodACAACTGATGGAGCACTGGGT
PrimerF1_nodDTGGCCTTAAGAGACGTGTCG
PrimerR1_nodDAAATGCCTGACCAGCCGTAA

Tabel 2: Bacteriële stammen, plasmiden en oligonucleotide primers gebruikt in deze studie. Deze tabel bevat de bacteriële stammen, plasmiden en oligonucleotide primers die zijn gebruikt voor de constructie van single-guide RNA (sgRNA), assemblage van homology-directed repair (HDR) templates, diagnostische polymerasekettingreactie (PCR), Sanger-sequencing en reverse transcription kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Primersequenties worden weergegeven in de 5′ figure-protocol-2 3′ oriëntatie. Opmerking: BjGFP_BP_F2 en GFP_R verwijzen naar dezelfde oligonucleotide sequentie, maar worden onder verschillende primernamen vermeld omdat ze in verschillende experimentele assays zijn gebruikt.

4. Biparentale paring voor overdracht van plasmide naar M. ciceri CC1192

  1. Transformatie van Donor E. coli-cellen
    1. Transformeer E. coli S17-1λpir-cellen met pCasPP-gRNA1-HDR- of pCasPP-gRNA2-HDR-constructen volgens de procedure beschreven in Supplementary File 3 (Stap 4.1).
    2. Selecteer transformanten op LB-agar bevattende 50 µg/mL neomycine.
    3. Screen transformanten op GFP-fluorescentie met excitatie bij ongeveer 488 nm en emissiedetectie bij ongeveer 510–520 nm.
    4. Classificeer kolonies als GFP-positief indien zij een uniforme, duidelijke groene fluorescentie vertonen die afwezig is bij niet-getransformeerde E. coli S17-1λpir-controlekolonies wanneer deze onder identieke microscoopinstellingen worden onderzocht.
    5. Bereid glycerolstocks voor van bevestigde GFP-positieve donorclonen.
  2. Bereiding van Seed- en Startculturen
    1. Bereid donor E. coli S17-1λpir- en recipiënte M. ciceri-startculturen volgens Supplementary File 3 (Stap 4.2).
    2. Kweek startculturen tot een OD₆₀₀ van 0,3–0,4, wat overeenkomt met een geschatte celdichtheid van ongeveer 1 × 108 CFU/mL.
  3. Bereiding van Subculturen voor Biparentale Paringsreacties
    1. Bereid donor- en recipiënte subculturen en kweek deze tot de vereiste exponentiële groeifase volgens Supplementary File 3 (Stap 4.3).
    2. Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) met een UV-vis spectrophotometer volgens de procedure voor optische dichtheidsmeting beschreven in Supplementary File 1 (Stap 1.2.3).
  4. Procedure voor Biparentale Paringsreacties
    1. Voer biparentale paring uit via membraanfiltratie volgens Supplementary File 3 (Stap 4.4).
    2. Pipetteer vier aliquots van de paringssuspensie op een steriel 0,22 µm polyvinylidefluoride (PVDF) membraanfilter (47 mm diameter), waarbij voldoende ruimte tussen de spots wordt gelaten om menging te voorkomen.
  5. Herstel en Selectie van Transconjuganten
    1. Herstel transconjuganten en voer dubbele antibioticaselectie uit volgens Supplementary File 3 (Stap 4.5).
    2. Passageer transconjuganten herhaaldelijk op medium met enkel carbenicilline om residuele plasmiden te elimineren.
    3. Bevestig het verlies van plasmiden door het uitblijven van groei van kolonies op medium bevattende neomycine en door diagnostische PCR die de afwezigheid van de pCasPP-backbone aantoont, terwijl de chromosomaal geïntegreerde HDR-cassette behouden blijft.
      OPMERKING: Successieve passaging is vereist om de stabiliteit van de geïntegreerde modificatie te verifiëren en residuele episomale plasmiden te elimineren.
  6. Screening van GFP-Positieve Kolonies
    1. Screen gezuiverde transconjuganten op GFP-fluorescentie en vergelijk deze met wild-type M. ciceri-controles volgens Supplementary File 3 (Stap 4.6).
    2. Selecteer fluorescerende kolonies als vermeende HDR-positieve stammen.
    3. Classificeer kolonies als GFP-positief indien zij een uniforme, duidelijke groene fluorescentie vertonen die afwezig is bij wild-type M. ciceri-kolonies onder identieke microscoopinstellingen en belichtingscondities.
    4. Bevestig GFP-positieve kolonies via diagnostische PCR voordat wordt overgegaan tot verdere validatie.
    5. Bewaar bevestigde kolonies op gist-mannitol (YM) agar bij 4°C voor kortstondig onderhoud of als glycerolstocks bevattende 20%–25% glycerol bij −80°C voor langdurige bewaring.

5. Validatie van nodC-mutanten

  1. Validatie van GFP-integratie op de nodC-locus
    1. Inoculeer een enkele GFP-expresserende M. ciceri kolonie in 10 mL gist-mannitolbouillon (YMB) aangevuld met 100 µg/mL carbenicilline24Incubeer de cultuur bij 28°C met schudden bij 180 rpm gedurende 20–24 u.
    2. Oogst de bacteriële cellen door centrifugatie bij 8.000 × g gedurende 10 min bij 25°CVerzamel het celpellet en isoleer genomisch DNA volgens Weerakkody et al.25.
    3. Voer diagnostische PCR uit met genomisch DNA als template (Tabel 2). Bereid een 10 µL PCR-reactie bestaande uit 5 µL 2× PCR-mastermix, 0.2 µM F1_nodB- en nodC_R-primers of F1_nodB- en gfp_R-primers, en 50 ng genomisch DNA.
    4. Programmeer de thermocycler voor een initiële denaturatie bij 95°C gedurende 5 min, gevolgd door 35 cycli van 95°C gedurende 1 min, 62°C gedurende 30 s, en 72°C gedurende 45 s, met een laatste extensie bij 72°C gedurende 5 min.
    5. Scheid de PCR-producten op een 1% (w/v) agarosegel zoals eerder beschreven. Bevestig de GFP-integratie door middel van de detectie van een product van ongeveer 430 bp in het wildtype (WT) en een product van ongeveer 1500 bp in de gedisrupteerde mutant met behulp van F1_nodB/nodC_R, en een product van ongeveer 1000 bp in de mutant (geen product in WT) met behulp van F1_nodB/gfp_R.
    6. Voeg geschikte controles toe tijdens de PCR-validatie. Gebruik plasmide-DNA dat de doelsequentie bevat als positieve controle en een no-template-controle (NTC) met nucleasevrij water als negatieve controle.
  2. Kwantificering van GFP-expressie via reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR)
    1. Isoleer totaal RNA uit WT en mutant M. ciceri culturen met TRIzol-reagens volgens de instructies van de fabrikant.
    2. Behandel het RNA met DNase I volgens de instructies van de fabrikant om contaminerende genomisch DNA te verwijderen. Verifieer de volledige verwijdering van DNA met een controle zonder reverse transcriptase (−RT) tijdens de qPCR.
    3. Synthetiseer cDNA van de eerste streng uit 1 µg totaal RNA met behulp van een commercieel verkrijgbare kit voor cDNA-eerste-strengsynthese volgens de instructies van de fabrikant. Bereid een 20 µL reactiemengsel bevattende RNA, oligo(dT)-primers, dNTP's, reactiebuffer, RNase-remmer en reverse transcriptase.
    4. Incubeer de cDNA-synthesereactie bij 42°C gedurende 60 min, gevolgd door hitte-inactivering bij 70°C gedurende 5 min. Bewaar cDNA bij −20°C tot gebruik.
    5. Bereid de RT-qPCR-reacties in technische triplicaten voor. Stel samen 10 µL reacties die ... bevatten 5 µL 2× SYBR Green Master Mix, 0.2 µM BjGFP_BP_F1- en BjGFP_BP_R1-primers voor GFP-amplificatie, of 16S_F1- en 16S_R1-primers voor amplificatie van het referentiegen (Tabel 2), 2 µL cDNA-template (ongeveer 20 ng) en nucleasevrij water.
    6. Voer RT-qPCR uit met de volgende cycluseringscondities: initiële denaturatie bij 95°C gedurende 2 min, gevolgd door 40 cycli van 95°C gedurende 15 s en 58°C gedurende 45 s, gevolgd door een smeltcurve-analyse vanaf 65°C naar 95°C.
    7. Voer qRT-PCR uit met een Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR Detection System. Analyseer amplificatieplots, Ct waarden en smeltcurven met behulp van Bio-Rad CFX Manager-software.
    8. Bereken de relatieve genexpressie met behulp van de 2−ΔΔCt methode. Normaliseer de expressie ten opzichte van het 16S rRNA-referentiegen en gebruik de WT M. ciceri stam als kalibratie monster. Analyseer drie biologische replica's, die elk in technisch triplikaat worden gemeten.
  3. Beoordeling van het nodulatiepotentieel
    1. Bereiding van het bacteriële inoculum
      1. Inoculeer enkele kolonies van WT- en mutantstammen in selectief YMB bevattend 100 µg/mL carbenicilline. Incubeer de culturen bij 28°C onder schudding bij 180 rpm gedurende 30–36 u.
      2. Verdun de culturen 1:100 in vers selectief YMB en volg de groei door de OD te meten600 met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer. Nul het instrument met niet-geïnoculeerde YMB en zet de incubatie voort totdat de culturen een OD600 van 0,3–0,4 bereiken, wat overeenkomt met ongeveer 1 × 108 kbe/ml
      3. Gebruik 3 mL van de gestandaardiseerde bacteriële suspensie voor de inoculatie van elke plant.
    2. Infectieassay voor kikkererwtplanten
      1. Verkrijg zaden van C. arietinum cultivar BDG25618,24 van het ICAR–Indian Agricultural Research Institute (IARI), New Delhi, India.
      2. Was de zaden grondig met stromend kraanwater, gevolgd door Milli-Q gezuiverd water. Steriliseer het oppervlak van de zaden in 1% natriumhypochloriet gedurende 5 minuten onder agitatie en spoel vijf keer na met steriel gezuiverd water.
      3. Behandel de zaden gedurende 2–3 uur bij kamertemperatuur met 0,1% Bavistin-fungicide (50% carbendazim benatbaar poeder). Was de behandelde zaden tweemaal met steriel gezuiverd water.
      4. Plaats zaden op vochtig steriel filterpapier in steriele Petrischalen (110 mm) × 40 mm), afsluiten met Parafilm en in het donker incuberen bij 28°C ± 2°C gedurende 3 dagen.
      5. Verplaats de ontkiemde zaailingen individueel naar steriel zand. Steriliseer zand bij 121°C en 15 psi gedurende 20 min voor gebruik.
      6. Bereid stikstofvrije McKnight-voedingsoplossing door 6,0 g CaSO₄, 1,0 g MgSO4₄·7H₂O, 1,0 g KH₂PO₄, 1,5 g KCl, 14,3 mg H₃BO₃, 0,4 mg CuSO4₄·5H₂O, 0,08 mg MnSO₄₄·4H₂O, 0,45 mg H₂MoO₄, en 1,1 mg ZnSO4₄·7H₂O in steriel gedestilleerd water tot een eindvolume van 5 L.
      7. Kweek zaailingen in potten met een diameter van 10 cm gevuld met steriel zand, waarbij vier planten per pot worden aangehouden. Bewater elke pot twee keer per week met 20 mL stikstofvrije McKnight-oplossing.
      8. Houd planten onder gecontroleerde omstandigheden van 22°C ± 2°C (dag), 18°C ± 2°C (nacht), 55%–60% relatieve vochtigheid, een fotoperiode van 16 u licht/8 u donker en een lichtintensiteit van 200 µmol fotonen m⁻2 s⁻1Kweek de zaailingen 6–7 dagen voordat de inoculatie plaatsvindt.
      9. Breng 3 mL bacteriële suspensie direct aan op elke zaailing. Houd mock-behandelde controles aan door 3 mL steriel YMB aan te brengen. Gebruik 16 biologische replica-planten per behandelingsgroep.
      10. Oogst de wortels en scheuten 20 dagen na inoculatie. Tel de nodules handmatig en noteer de verse biomassa direct na de oogst.
      11. Droog de weefsels bij 65°C totdat een constant gewicht is bereikt. Definieer constant gewicht als twee opeenvolgende metingen, verkregen na droogintervallen van 24 uur, die verschillen met <0,01 g, noteer vervolgens de droge biomassa.
      12. Druk de resultaten uit als gemiddelde ± standaardfout (SE). Voer een eenweg-ANOVA uit, gevolgd door de Tukey-toets voor meervoudige vergelijkingen met behulp van GraphPad Prism versie 10.0, waarbij P < 0,05 statistisch significant.
        OPMERKING: Handhaaf gedurende de gehele sterilisatie van zaden, kieming, inoculatie en plantengroei steriele omstandigheden.
        WAARSCHUWING: Hanteer natriumhypochloriet- en fungicide-oplossingen met gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen en oogbescherming.

Resultaten

In dit protocol is CRISPR-Cas9 genoomredigering aangepast voor M. ciceri CC1192 door het nodC-locus te targeten. Om functieverlies te bevorderen, werden sgRNA's ontworpen om de 5′-proximale regio van de coderende sequentie van nodC te targeten, waardoor een DSB binnen de initiële coderende regio wordt geïntroduceerd om de translatie van het gecodeerde eiwit te verstoren (Figuur 1A).

figure-results-1
Figuur 1. Ontwerp van single-guide RNA's (sgRNA's) gericht op de nodC locus in Mesorhizobium ciceri. (A) Schematische weergave van de M. ciceri nodC locus waarop de posities van de twee 20-bp sgRNA's zijn aangegeven die zijn ontworpen voor CRISPR-Cas9-gemedieerde targeting. De targetsites van de sgRNA's zijn in het blauw weergegeven. (B) Nucleotidevolgordes van sgRNA1 en sgRNA2 gericht op de nodC locus. Het protospacer adjacent motif (PAM; 5′-NGG-3′) is in het rood aangegeven, en het vertaalstartcodon (ATG) van nodC is geel gemarkeerd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Twee targetsequenties van 20 bp werden geïdentificeerd direct stroomopwaarts van een 5′-NGG-3′ PAM-sequentie (Figuur 1B). In silico analyse van deze kandidaat-sgRNA's met behulp van het algoritme van Hsu et al.19 leverde specificiteitsscores van 100 op, wat wijst op een hoge voorspelde targetspecificiteit zonder dat er significante off-target complementariteit werd gedetecteerd binnen het M. ciceri genoom. Er werden kleine verschillen waargenomen in de voorspelde on-target efficiëntiescores van de geselecteerde sgRNA's (Tabel 3), wat de selectie van de guides voor verdere experimentele evaluatie heeft bepaald.

Doelpositie
(bp)		StrengsgRNA-sequentie (5'′ figure-results-2 3′)PAMSpecificiteitsscoreEfficiëntiescore
77+TGTTTACAGAGGCATGCAAGCGG10043.58
139+GCTTGTTCGGATCCGACCGTTGG99.747.63

Tabel 3: Kandidaat single-guide RNA's (sgRNA's) ontworpen voor CRISPR-Cas9-gemedieerde bewerking van het nodC-gen in Mesorhizobium ciceri. Kandidaat sgRNA's werden ontworpen met de Benchling CRISPR Guide Design Tool, waarbij Bradyrhizobium diazoefficiens USDA 110 als referentiegenoom diende. Guides werden gerangschikt op basis van de voorspelde specificiteit en on-target efficiëntiescores; hierbij werden die geselecteerd die gericht waren op sequenties nabij het translationele startcodon van nodC en die het vereiste NGG protospacer adjacent motif (PAM) voor Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) bevatten.

Om HDR en fluorescentiegebaseerde screening van vermeende mutanten te vergemakkelijken, werd een HDR-cassette samengesteld met behulp van de pUC18-cloningsvector (Figuur 2). De gfp-reportercassette werd uit pRJPaph-bjGFP geknipt door restrictiedigestie met SacI en KpnI en geligeerd in het gelineariseerde pUC18-backbone (Figuur 2A). Na transformatie in E. coli werden vermeende positieve klonen geïdentificeerd via blue-white screening. De integratie van het gfp-insert in het pUC18-backbone werd verder gevalideerd door PCR-amplificatie met gen-specifieke primers, wat in positieve klonen het verwachte amplicon van 500 bp opleverde (Figuur 2A).

figure-results-3
Figuur 2. Constructie van het CRISPR-Cas9 homology-directed repair (HDR)-systeem voor de disruptie van nodC. (A) Constructie en validatie van het pUC18-gfp tussenplasmide. Het bovenste paneel toont de plasmidekaart van pUC18-gfp, gegenereerd door insertie van de green fluorescent protein (gfp)-cassette in de pUC18-backbone. Het middelste paneel toont representatieve kolonies na blauw-wit screening. Het onderste paneel toont colony polymerase chain reaction (PCR) validatie met behulp van het BjGFP_BP_F1 en BjGFP_BP_R2 primerpaar. (B) Sequentiële assemblage van het HDR-sjabloon in de pUC18-backbone. Plasmidekaarten en restrictie-digestieanalyses bevestigen de insertie van de upstream homology arm (UHA), de downstream homology arm (DHA) en de volledige UHA-gfp-DHA HDR-cassette. (C) Klonering en validatie van de UHA-gfp-DHA HDR-cassette in de pCasPP CRISPR-Cas9 vector. Het bovenste paneel toont de uiteindelijke pCasPP-HDR plasmidekaart, en het onderste paneel toont de restrictie-digestie die de insertie van de HDR-cassette bevestigt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het HDR-construct werd vervolgens geassembleerd door nodC homologiearmen rondom de gfp-cassette te introduceren. Een UHA van 500 bp en een DHA van 400 bp, gepositioneerd naast de voorspelde Cas9-splitsingsplaats, werden sequentieel in het pUC18-gfp-construct gekloond via restrictiedigestie en ligatie (Figuur 2B). De assemblage van de UHA-gfp-DHA-cassette werd bevestigd door restrictiedigestieanalyse, waarbij het verwachte fragment van 2012 bp werd verkregen (Figuur 2B). De volledige HDR-cassette werd vervolgens gesubkloond in de CRISPR-vector pCasPP met een breed gastheerbereik (Figuur 2C). Restrictiedigestieanalyse bevestigde de integriteit van het uiteindelijke construct en de succesvolle assemblage van de genome-editing-aflevervector voor M. ciceri (Figuur 2C).

Biparentale paring werd uitgevoerd tussen de donor E. coli S17-1λpir en de recipient M. ciceri-stam om het pCasPP-gRNA-HDR-construct in M. ciceri over te brengen (Figuur 3A). Figuur 3B illustreert de organisatie van het nod-operon en de voorspelde vervanging van de nodC-locus door de gfp-cassette via homologe recombinatie met behulp van het HDR-sjabloon. Transconjugant-kolonies werden aanvankelijk geïdentificeerd door GFP-fluorescentiescreening na de biparentale paring (Figuur 3B en 3C). Meer dan 80% van de teruggewonnen kolonies vertoonde GFP-fluorescentie met gRNA2, en meer dan 65% van de kolonies vertoonde fluorescentie na introductie van gRNA1 (Figuur 3C). Omdat fluorescentiescreening alleen geen onderscheid kan maken tussen plasmidische GFP-expressie en succesvolle genomische integratie, werd er naderhand moleculaire validatie uitgevoerd om de locus-specifieke insertie van de reportercassette te bevestigen.

figure-results-4
Figuur 3. CRISPR-Cas9-gemedieerde disruptie van de nodC locus in Mesorhizobium ciceri. (A) Schematische illustratie van de biparentale mating die werd gebruikt om het pCasPP-gRNA-HDR-construct over te dragen van Escherichia coli S17-1λpir donorcellen naar M. ciceri recipientcellen. (B) Diagram dat de homologie-gestuurde reparatie (HDR)-gemedieerde vervanging van de nodC locus door de gfp cassette illustreert na CRISPR-Cas9-splitsing. Het HDR-sjabloon bevat homologiearmen van ongeveer 500 bp upstream en 400 bp downstream die de gfp cassette flankeren. (C) Fluorescentie-gebaseerde screening van transconjugante M. ciceri kolonies. Representatieve fluorescentie- en bright-field stereomicroscopiebeelden van GFP-positieve kolonies worden getoond, samen met het percentage fluorescentie transconjuganten dat werd teruggewonnen na biparentale mating met gebruik van constructen die sgRNA1 of sgRNA2 bevatten. Foutenbalken representeren de standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de integratie van de gfp-cassette op de nodC-locus te valideren, werden representatieve GFP-positieve kolonies onderworpen aan PCR-analyse. Amplificatie van de genomische regio die nodB en nodC omvat, leverde een fragment van 1511 bp op in de bewerkte klonen, wat consistent is met de integratie van de reportercassette, terwijl de wild-type (WT) stam een amplicon van 430 bp produceerde (Figuur 4A). PCR-amplificatie met gfp-specifieke en nodC-flankerende primers genereerde een duidelijk fragment van 997 bp in de bewerkte klonen, terwijl er geen amplificatie werd gedetecteerd in de WT-controle, wat wijst op locus-specifieke insertie. De oriëntatie van de reportercassette werd bevestigd middels Sanger-sequencing. Daarnaast werd de GFP-expressie in de bewerkte stammen geëvalueerd met RT-qPCR, waaruit een verhoogde accumulatie van GFP-transcripten bleek ten opzichte van de WT-stam (Figuur 4B). Expressiewaarden werden berekend met de 2−ΔΔCt-methode en genormaliseerd ten opzichte van het referentiegen 16s, met de WT-stam als controle. De gegevens representeren het gemiddelde ± SD van drie biologische replica's (n = 3). Statistische significantie werd bepaald via eenweg-ANOVA gevolgd door de toets van Dunnett ten opzichte van de WT-controle.

De huidige beperking van de studie is de afwezigheid van een controlevector, zoals een lege-gRNA pCasPP-HDR, om de baseline recombinatiecoëfficiënt vast te stellen. Toekomstige studies dienen een dergelijke controle op te nemen.

figure-results-5
Figuur 4. Moleculaire validatie van ΔnodC Mesorhizobium ciceri mutanten. (A) PCR-gebaseerde bevestiging van de nodC disruptie. Het linkerpaneel toont amplificatie met het primerpaar F1_nodB en nodC_R. Baan M, DNA-ladder; banen 1–4, ΔnodC M. ciceri mutanten; baan WT, wild-type M. ciceri. Het rechterpaneel toont amplificatie met het primerpaar F1_nodB en gfp_R. Baan M, DNA-ladder; banen 1–4, ΔnodC M. ciceri mutanten; baan WT, wild-type M. ciceri. De verwachte amplicongroottes zijn aangegeven. (B) Relatieve expressie van groen fluorescent eiwit (GFP) in ΔnodC M. ciceri mutanten, bepaald via reverse transcription kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). De genexpressie werd genormaliseerd ten opzichte van het M. ciceri 16S ribosomaal RNA (16S rRNA) referentiegen en uitgedrukt relatief aan de wild-type (WT) controle met behulp van de 2^−ΔΔCt methode. De foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. De statistische significantie werd bepaald ten opzichte van de WT-controle. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De biologische impact van de disruptie van nodC werd geëvalueerd met behulp van infectie-assays bij kikkererwten. Planten geïnoculeerd met WT M. ciceri vormden zichtbare wortelknolletjes, terwijl planten geïnoculeerd met ΔnodC M. ciceri een duidelijke afname of afwezigheid van knolvorming vertoonden (Figuur 5A). De niet-geïnoculeerde controleplanten bleven vrij van knolletjes, wat de handhaving van steriele experimentele omstandigheden bevestigt (Figuur 5A). Kwantitatieve analyse van plantgroeiparameters toonde verder verschillen aan tussen planten geïnoculeerd met WT en ΔnodC M. ciceri, waaronder wortellengte, vers wortelgewicht, droog wortelgewicht, scheutlengte, vers scheutgewicht, droog scheutgewicht en het aantal knolletjes (Figuur 5B). Planten geïnoculeerd met WT vertoonden hogere aantallen knolletjes en verbeterde groeigerelateerde parameters in vergelijking met planten geïnoculeerd met ΔnodC M. ciceri en niet-geïnoculeerde controleplanten. Deze bevindingen zijn consistent met de disruptie van de nodC-geassocieerde knolvormingsfunctie en ondersteunen de toepasbaarheid van deze CRISPR-Cas9-gebaseerde workflow voor functionele genomische studies in M. ciceri. Kwantitatieve plantfenotypegegevens werden geëvalueerd om verschillen tussen de behandelingsgroepen te vergelijken. In totaal werden 90 biologische replica's in de analyse opgenomen (n = 30 planten per behandelingsgroep). Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Statistische significantie werd beoordeeld met behulp van een eenweg-variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door de post hoc multiple comparison test van Tukey. Verschillen werden als statistisch significant beschouwd bij P < 0.05.

figure-results-6
Figuur 5. Functionele validatie van ΔnodC Mesorhizobium ciceri-mutanten middels een infectieassay met kikkererwten. (A) Representatieve kikkererwtenplanten (Cicer arietinum) 20 dagen na inoculatie met wild-type M. ciceri, ΔnodC M. ciceri, of niet-geïnoculeerde controles. (B) Kwantitatieve analyse van plantengroei en nodulatieparameters, waaronder wortellengte, vers wortelgewicht, droog wortelgewicht, scheutlengte, vers scheutgewicht, droog scheutgewicht en het aantal wortelknolletjes. De gegevens worden gepresenteerd voor planten geïnoculeerd met wild-type M. ciceri, ΔnodC M. ciceri, of niet-geïnoculeerde controles. Foutenbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie. Statistische significantie werd bepaald door middel van een eenweg-variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door de Tukey-toets voor meervoudige vergelijkingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1. Gedetailleerd protocol voor de preparatie en validatie van chemisch competente Escherichia coli-cellen.Dit aanvullende bestand bevat de volledige procedure voor het prepareren en valideren van chemisch competente Escherichia coli DH5α- en E. coli S17-1λpir-cellen, inclusief de preparatie van de bacteriële cultuur, inductie van competentie, het oogsten van cellen, wassen met CaCl₂–glycerolbuffer, het verdelen in aliquoten, cryopreservatie en validatie door middel van transformatie-efficiëntietests. Kritische kwaliteitscontrolemaatregelen, bewaaradviezen en acceptatiecriteria voor competentie zijn tevens opgenomen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2. Gedetailleerd protocol voor de constructie van homology-directed repair (HDR)-templates en de assemblage van CRISPR-Cas9 genoombewerkingsvectoren. Dit aanvullende bestand bevat gedetailleerde procedures voor de excisie van de green fluorescent protein (GFP)-cassette, de constructie van het pUC18-gfp intermediair plasmide, de amplificatie en klonering van upstream en downstream homologiearmen, de assemblage van het volledige homology-directed repair (HDR)-template, de preparatie van pCasPP-guide RNA (gRNA)-vectoren, de insertie van HDR-templates in CRISPR-Cas9 plasmiden, fluorescentie-gebaseerde kloonscreening en de validatie van recombinante plasmiden via restrictieanalyse en Sanger-sequencing. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3. Gedetailleerd protocol voor biparentale paring en generatie van GFP-getagde Mesorhizobium ciceri transconjuganten.Dit aanvullende bestand beschrijft de preparatie van donor- en recipiëntstammen, biparentale paring via membraanfiltratie, herstel en antibiotische selectie van transconjuganten, procedures voor plasmid-curing, fluorescentie-gebaseerde screening van recombinante kolonies, moleculaire bevestiging van genoom-bewerkte stammen, en korte- en langetermijnbewaring van bevestigde GFP-positieve M. ciceri transconjuganten. Gedetailleerde kweekcondities, paringsparameters en selectieprocedures worden verstrekt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De vestiging van een CRISPR-Cas9 genoombewerkingssysteem in M. ciceri pakt een belangrijke technische beperking aan bij de genetische manipulatie van deze landbouwkundig belangrijke stikstofbindende symbiont. Door het nodC-locus te verstoren met behulp van een gfp-reporter en HDR, biedt deze workflow een fluorescentie-ondersteund kader voor gerichte genomische modificatie in M. ciceri.

Traditionele benaderingen voor genetische manipulatie bij rhizobia waren primair gebaseerd op Tn5-gebaseerde willekeurige mutagenese of sacB-gemedieerde allelische uitwisseling19,26,27. Hoewel deze methoden waardevol blijven, zijn ze arbeidsintensief, vereisen ze vaak meerdere ronden van counter-selectie en kunnen ze antibioticaresistentiemarkers in het genoom achterlaten die daaropvolgende bewerkingsronden bemoeilijken. In tegenstelling hiermee biedt CRISPR-Cas9-gemedieerde genoommodificatie een gerichter en gestroomlijnder alternatief voor genomische engineering. Recente studies hebben CRISPR-gemedieerde base-editing en Cas12e-gebaseerde systemen in S. meliloti gerapporteerd om Cas9-geassocieerde toxiciteit te verminderen12,13, terwijl dCas9-gemedieerde transcriptionele repressie is onderzocht in R. etli11. Voor zover ons bekend vertegenwoordigt deze studie een van de eerste toepassingen van CRISPR-Cas9-gemedieerde chromosomale disruptie in M. ciceri. Het protocol omvat sgRNA-gestuurde targeting, biparentale plasmid-delivery en HDR-gemedieerde recombinatie voor locus-specifieke bewerking. Integratie van de gfp-reporter binnen de HDR-cassette vergemakkelijkt bovendien snelle fluorescentie-gebaseerde screening van vermoedelijk bewerkte kolonies, waardoor het aantal kolonies dat downstream moleculaire validatie vereist, wordt verminderd.

Verschillende factoren waren belangrijk voor de succesvolle implementatie van de workflow. De selectie van sgRNA's met een hoge voorspelde specificiteit minimaliseerde potentiële off-target effecten binnen het M. ciceri genoom, terwijl het behoud van de integriteit van de homologiearmen de HDR-gemedieerde recombinatie-efficiëntie ondersteunde. Daarnaast verbeterde het optimaliseren van de groeicondities voor donor en recipiënt tijdens de biparentale paring het herstel van transconjuganten. Screening op basis van fluorescentie maakte een snelle identificatie van vermeende mutanten mogelijk; moleculaire validatie middels PCR en Sanger-sequencing was echter nog steeds noodzakelijk om de locus-specifieke integratie van de reportercassette te bevestigen. Toekomstige studies zouden een lege-gRNA pCasPP-HDR vectorcontrole kunnen gebruiken om de basisrecombinatiecoëfficiënt te kwantificeren.

Naast methodologische vooruitgang kan dit platform toekomstige studies ondersteunen die symbiotische signalering en functionele genomica in rhizobia geassocieerd met kikkererwten onderzoeken28. De kikkererwt (Cicer arietinum L.) is een wereldwijd belangrijk peulvruchtengewas en een belangrijke bijdrage aan duurzame landbouwsystemen29,30. De in deze studie gegenereerde ΔnodC M. ciceri-stam biedt een potentieel nuttige genetische achtergrond voor het onderzoeken van gastheer-microbe-compatibiliteit en signaleringspaden geassocieerd met nodulatie. Eerdere studies hebben gesuggereerd dat sRNA's functioneren als regulatoire effectoren tijdens de vroege wortelknollesymbiose31. Bijgevolg kan de hier beschreven nodulatie-deficiënte ΔnodC M. ciceri-stam toekomstige studies faciliteren die gericht zijn op de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan rhizosfeercommunicatie en stikstoffixerende symbiose.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen of belangenverstrengelingen zijn.

Dankbetuigingen

Dit werk wordt ondersteund door de Department of Biotechnology (DBT)-MK Bhan Grant HRD-16016/15/2023-AFS-DBT voor dr. Nandita Pasari. Dit werk wordt daarnaast ondersteund door een Core Grant verstrekt aan dr. Senjuti Sinharoy door het National Institute of Plant Genome Research, New Delhi, India.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AgaroseGenetixPG-40005Gelelektroforese
AluminiumfolieRolia’sGF83048115Algemeen laboratoriumgebruik
Bacteriologische agarHiMediaGRM026Mediumbereiding
Benchling CRISPR Guide Design PlatformBenchlingN/AGuide RNA-ontwerp
BoorzuurHiMediaPCT0102Bereiding van McKnight’s oplossing
Conische kolf van borosilicaatglasSigmaCLS5100500Cultuurvoorbereiding
Buizen van borosilicaatglasSigmaDWK73500-1075Cultuurvoorbereiding
Calciumchloride-dihydraatHiMediaMB034Bereiding van competente cellen
Calciumsulfaat-dihydraatHiMediaGRM328Bereiding van McKnight’s oplossing
Carbenicilline-dinatriumDuchefa BiochemieDUC-C0109.005-18Gebruikt bij 100 µg/mL
cDNA-synthesekitThermo Fisher ScientificAB1543AcDNA-synthese
VershoudfolieOA10954049Algemeen laboratoriumgebruik
Kloneringskit/T4 DNA-ligaseThermo Fisher ScientificK1422Ligatiereacties
CongoroodHiMedia573-58-0Werk met microbiële culturen
Kopersulfaat-pentahydraatHiMediaPCT0104Bereiding van McKnight’s oplossing
KweekbuisBorosil9800U08Kweek van primaire bacteriële cultuur; 15 cm × 2,5 cm
Digitale pH-meterEutech InstrumentsEC PH TUTOR DSpH-aanpassing
DikaliumfosfaatHiMediaTC596MYMB-bereiding
DNA-ladderBIO-HELIXDM015-R500Gelelektroforese
DNase-verwijderingskitInvitrogenAM1907Verwijderen van DNA uit geïsoleerd RNA
dNTP-mixThermo ScientificR0181PCR-amplificatie
EthanolSigma-Aldrich1.00983.0511Gebruikt bij 75%
EthidiumbromideSigma-AldrichE1510DNA-gelkleuring
FastAP thermosensitieve alkalische fosfataseThermo Fisher ScientificEF0651Defosforylering van vector tijdens klonering
FastDigest-bufferThermo Fisher ScientificB64Restrictiedigesties
Watervrij ijzer(III)chlorideHiMediaTC583Bereiding van McKnight’s oplossing
Fluorescentie-stereomicroscoopNikonSMZ25GFP-screening
Fungicide, BavistinCrystal Crop ProtectionBavistin Carbendazim 50% WPZaadbehandeling
Gel-extractiekitQIAGEN28704DNA-zuivering
GlycerolThermo Fisher ScientificQ24505Competente cellen/glycerolstocks
Groei-incubator met orbitale schudkerMRCLOM-150Bacteriële cultuur
HandhandschoenenKimtech97612Persoonlijke beschermingsmiddelen
HEPESHiMediaMB016Annealing van oligonucleotiden
IPTGG BiosciencesRC1113DBlauw-wit screening
Lamineaire flowkastBiolinkBL-H1300Steriele behandeling
LB-agarHiMediaM1151Bacteriële cultuurplaten
LB-bouillonHiMediaG1245Bacteriële cultuur
MagnesiumsulfaatHiMediaGRM1281-500GYMB-bereiding
Magnesiumsulfaat-heptahydraatHiMediaPCT0008Bereiding van McKnight’s oplossing
Mangaan(II)sulfaat-tetrahydraatSigma-AldrichM3634Bereiding van McKnight’s oplossing
MannitolHiMediaMB198YMB-bereiding
McKnight’s oplossingIn laboratorium bereidN/APlantenvoedingsoplossing
Microtips, 0,2–10 µLTarsons521000Vloeistofbehandeling
Microtips, 2–200 µLTarsons521010Vloeistofbehandeling
Microtips, 200–1000 µLTarsons521020XVloeistofbehandeling
Microcentrifugebuis, 0,5 mLTarsons500000Monsterbehandeling
Microcentrifugebuis, 1,5 mLTarsons500010Monsterbehandeling
Microcentrifugebuis, 2,0 mLTarsons500020Monsterbehandeling
MolybdeenzuurSigma-Aldrich232084Bereiding van McKnight’s oplossing
NanoDrop-spectrofotometerThermo Fisher Scientific13-400-519DNA/RNA-kwantificering
NeomycineDuchefa BiochemieM0135Gebruikt bij 50 µg/mL
Nuclease-vrij waterHiMediaML064-100MLGebruik in moleculaire biologie
PCR-mastermixThermo Fisher ScientificK01712× mastermix
PCR-buisstrips, 0,2 mLTarsons610040PCR-opstelling
Petrischalen, 90 mmPSC2041Agarplaten
Pipet, 0,1–2,5 µLEppendorfN10178MVloeistofbehandeling
Pipet, 0,5–10 µLEppendorfH40069LVloeistofbehandeling
Pipet, 2–20 µLEppendorfH30046MVloeistofbehandeling
Pipet, 10–100 µLEppendorfI00395MVloeistofbehandeling
Pipet, 20–200 µLEppendorfM38186MVloeistofbehandeling
Pipet, 100–1000 µLEppendorfN20610MVloeistofbehandeling
Plasmid-DNA-extractiekitQIAGEN12143Plasmidisolatie
KaliumchlorideHiMediaTC010Bereiding van McKnight’s oplossing
Watervrij kaliumdihydrogenfosfaatHiMediaTC011MBereiding van McKnight’s oplossing
PVDF-membraanfilter, 0,22 µm, 47 mmMilliporeSigmaGVWP04700Biparentale paring
Kwantitatieve real-time PCR-apparaatBio-RadCFX96RT-qPCR
Gekoelde tafelcentrifugeEppendorf04-987-373Oogsten van cellen
Restrictie-enzym, BbsIThermo Fisher ScientificER1011gRNA-klonering
Restrictie-enzym, EcoRIThermo Fisher ScientificFD0274Klonering
Restrictie-enzym, KpnIThermo Fisher ScientificFD0524Klonering
Restrictie-enzym, SacIThermo Fisher ScientificFD1133Klonering
Restrictie-enzym, XbaIThermo Fisher ScientificFD0684Klonering
RNase-vrije DNaseQIAGEN79254RNA-reiniging
ZandRam SuratSandSubstraat voor plantengroei
SequencerApplied BiosystemsABI3730xl DNA AnalyzerSanger-sequencing
SOC-mediumIn laboratorium bereidN/AHerstel na transformatie
NatriumchlorideHiMediaTC046Mediumbereiding
NatriumhydroxideHiMediaPCT1325pH-aanpassing van HEPES
Steriel scalpelbladMedicare Surgical16020Gel-excisie/weefselbehandeling
Steriele spuitHMD Dispovan10ml syringe without needleSteriele filtratie
Steriel spuitfilter, 0,22 µmMerck Millex Durapore12766842Filtersterilisatie
SYBR Green mastermixNew England BiolabsM3003ERT-qPCR
TetracyclineDuchefa BiochemieT01050Gebruikt bij 5 µg/mL
Thermal cyclerApplied BiosystemsA24811PCR-amplificatie
PapierrolRolia’s07AAECR4885K1ZTAlgemeen laboratoriumgebruik
TRIzol-reagensInvitrogen15596026RNA-isolatie
UV-transilluminatorAnalytik JenaTW-43Gelvisualisatie
UV-Vis spectrofotometerEppendorfD30OD600-meting
Vis cuvettenEppendorf30079345OD600-meting
Vortex-mengerNeuationiSWIX-VTMonster menging
X-galG BiosciencesRC1233Blauw-wit screening
GistextractHiMediaRM668-500GMediumbereiding
Zinksulfaat-heptahydraatSigma-AldrichZ0251Bereiding van McKnight’s oplossing

Referenties

  1. Doudna JA, Charpentier E. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 2014;346(6213):1258096.
  2. Jiang W, Bikard D, Cox D, Zhang F, Marraffini LA. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology. 2013;31(3):233-9.
  3. Bertrand C, Thibessard A, Bruand C, Lecointe F, Leblond P. Bacterial NHEJ: a never ending story. Molecular microbiology. 2019;111(5):1139-51.
  4. Loureiro A, da Silva GJ. Crispr-cas: Converting a bacterial defence mechanism into a state-of-the-art genetic manipulation tool. Antibiotics. 2019;8(1):18.
  5. Altenbuchner J. Editing of the Bacillus subtilis genome by the CRISPR-Cas9 system. Applied and environmental microbiology. 2016;82(17):5421-7.
  6. Wang Y, et al. Bacterial genome editing with CRISPR-Cas9: deletion, integration, single nucleotide modification, and desirable “clean” mutant selection in Clostridium beijerinckii as an example. ACS synthetic biology. 2016;5(7):721-32.
  7. Oh J-H, van Pijkeren J-P. CRISPR–Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic acids research. 2014;42(17):e131-e.
  8. Cobb RE, Wang Y, Zhao H. High-efficiency multiplex genome editing of Streptomyces species using an engineered CRISPR/Cas system. ACS synthetic biology. 2015;4(6):723-8.
  9. Wanjofu EI, et al. Nodulation and growth promotion of chickpea by Mesorhizobium isolates from diverse sources. Microorganisms. 2022;10(12):2467.
  10. Haskett T, et al. Complete genome sequence of Mesorhizobium ciceri strain CC1192, an efficient nitrogen-fixing microsymbiont of Cicer arietinum. Genome Announcements. 2016;4(3):10.1128/genomea. 00516-16.
  11. Bellahsen O, Díaz-Méndez R, Romero D. Genomic engineering in Rhizobium etli: implementation and evaluation of systems based on dCas9. Frontiers in Microbiology. 2025;16:1604430.
  12. Liu G, et al. An efficient CRISPR/Cas12e system for genome editing in Sinorhizobium meliloti. ACS Synthetic Biology. 2023;12(3):898-903.
  13. Wang L, Xiao Y, Wei X, Pan J, Duanmu D. Highly efficient CRISPR-mediated base editing in Sinorhizobium meliloti. Frontiers in Microbiology. 2021;12:686008.
  14. Schäfer A, et al. Small mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the Escherichia coli plasmids pK18 and pK19: selection of defined deletions in the chromosome of Corynebacterium glutamicum. Gene. 1994;145(1):69-73.
  15. Rütering M, et al. Tailor-made exopolysaccharides—CRISPR-Cas9 mediated genome editing in Paenibacillus polymyxa. Synthetic Biology. 2017;2(1):ysx007.
  16. Ledermann R, Bartsch I, Remus-Emsermann MN, Vorholt JA, Fischer H-M. Stable fluorescent and enzymatic tagging of Bradyrhizobium diazoefficiens to analyze host-plant infection and colonization. Molecular Plant-Microbe Interactions. 2015;28(9):959-67.
  17. Göttfert M. Regulation and function of rhizobial nodulation genes. FEMS microbiology reviews. 1993;10(1-2):39-63.
  18. Kant C, Pradhan S, Bhatia S. Dissecting the root nodule transcriptome of chickpea (Cicer arietinum L.). PLoS One. 2016;11(6):e0157908.
  19. Hsu PD, et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature biotechnology. 2013;31(9):827-32.
  20. Doench JG, et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nature biotechnology. 2016;34(2):184-91.
  21. Norrander J, Kempe T, Messing J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 1983;26(1):101-6.
  22. Simon R, Priefer U, Pühler A. A broad host range mobilization system for in vivo genetic engineering: transposon mutagenesis in gram negative bacteria. Bio/technology. 1983;1(9):784-91.
  23. Hanahan D, Jessee J, Bloom FR. [4] Plasmid transformation of Escherichia coli and other bacteria. Methods in enzymology. 1991;204:63-113.
  24. Alexandre A, et al. Natural populations of chickpea rhizobia evaluated by antibiotic resistance profiles and molecular methods. Microbial Ecology. 2006:128-36.
  25. Weerakkody LR, et al. A rapid, inexpensive and effective method for the efficient isolation of genomic DNA from Gram-negative bacteria. Molecular Genetics and Genomics. 2024;299(1):26.
  26. Selbitschka W, Niemann S, Pühler A. Construction of gene replacement vectors for Gram− bacteria using a genetically modified sacRB gene as a positve selection marker. Applied microbiology and biotechnology. 1993;38(5):615-8.
  27. Yadav A, Singh RP, Singh AL, Singh M. Identification of genes involved in phosphate solubilization and drought stress tolerance in chickpea symbiont Mesorhizobium ciceri Ca181. Archives of microbiology. 2021;203(3):1167-74.
  28. Dicenzo GC, et al. Multidisciplinary approaches for studying rhizobium–legume symbioses. Canadian Journal of Microbiology. 2019;65(1):1-33.
  29. Calia C, et al. A bibliometric analysis of chickpea agronomic practices in the world during 45 years of scientific research. Legume Science. 2024;6(1):e219.
  30. Sandhu J, Tripathi S, Chaturvedi S. Chickpea nutritional status and value chain for sustainable development.  Sustainable food value chain development: Perspectives from developing and emerging economies: Springer; 2023. p. 175-83.
  31. Ren B, Wang X, Duan J, Ma J. Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation. Science. 2019;365(6456):919-22.

Herprints en machtigingen

Tags

CRISPR-Cas9-editinghomologiericht herstelGFP-reporterfluorescentiemicroscopieSanger-sequencinginfectieassay bij kikkererwtenfunctionele genomica

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.