Methodenartikel

Micro-injectie van interleukine-6 in de bloedbaan van TSC-zebravislarven om neuropsychiatrische aandoeningsachtige gedragingen te bestuderen

170 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71524

⸱

26 juni 2026

 , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, International Institute of Molecular Mechanisms and Machines, IMol, Polish Academy of Sciences, 2Warsaw-4-PhD doctoral school, International Institute of Molecular and Cell Biology in Warsaw

In dit artikel

Samenvatting

Om te modelleren hoe ontstekingssignalen de neuroontwikkeling beïnvloeden bij genetisch gevoelige organismen, presenteren we een protocol voor het microinjecteren van IL-6 in het kanaal van Cuvier (de algemene kardinaalader) van zebravislarven, waardoor gecontroleerde inductie van ontsteking en beoordeling van de ontwikkelingsimpact in de context van tubereuze sclerosecomplex (TSC) mogelijk is.

Samenvatting

Patiënten met tuberous sclerosecomplex (TSC1/TSC2-mutaties) vertonen een variabele expressiviteit van autismespectrumstoornis (ASS), en het is bekend dat het immuunactivatie van de moeder het risico op ASS verhoogt. Interleukine-6 (IL-6) is een pleiotroop cytokine met goed gevestigde rollen in immuunregulatie, ontsteking en neuro-inflammatoire processen. Het wordt geproduceerd door meerdere immuunceltypen als reactie op infectie of weefselbeschadiging, en wordt vaak gekarakteriseerd als een pro-inflammatoire mediator. Opmerkelijk is dat IL-6 de bloed-hersenbarrière kan passeren en in verband is gebracht met neuro-ontsteking en ontstekingsgerelateerde neuropsychiatrische aandoeningen, waaronder autismespectrumstoornis (ASS) en verstandelijke beperking (ID). Hier beschrijven we een protocol om systemische ontstekingssignalering bij zebravissen op te wekken door IL-6 via injectie in het kanaal van Cuvier in de bloedbaan af te voeren. Deze benadering maakt gecontroleerde en reproduceerbare ontstekingsreacties mogelijk om ontstekingsgedreven veranderingen in de vroege ontwikkeling te bestuderen. Het protocol beschrijft de essentiële stappen voor IL-6 voorbereiding, micro-injectie en downstream experimentele toepassingen in zebravismodellen van ziekte en neuroontsteking, inclusief studies die zijn ontworpen om interacties tussen gen en omgeving te onderzoeken. Door gecontroleerde inductie van systemische ontstekingssignalering mogelijk te maken, biedt deze aanpak een veelzijdig platform om te onderzoeken hoe genetische vatbaarheid en ontstekingsblootstelling elkaar kruisen en ontwikkelingsuitkomsten vormen.

Inleiding

Begrijpen hoe ontstekingssignalen vroege neuroontwikkeling vormgeven is essentieel om mechanismen achter neuro-ontwikkelingsstoornissen te ontleden, vooral in genetisch gevoelige contexten. Het primaire doel van dit protocol is het bieden van een precieze, reproduceerbare aanpak voor het induceren van systemische ontstekingssignalering bij zebravislarven door directe micro-injectie van interleukine-6 (IL-6) in het kanaal van Cuvier (de gemeenschappelijke kardinaalader).

Tuberous sclerosecomplex (TSC) is een voorbeeld van dergelijke gen-omgeving interacties. TSC is een zeldzame genetische aandoening veroorzaakt door mutaties in TSC1 of TSC2, die respectievelijk hamartine en tuberine coderen, eiwitten die een complex vormen dat normaal gesproken mTORC1-signaaloverdracht onderdrukt. Het verlies van deze remming leidt tot hyperactivatie van de mTORC1-route, wat resulteert in abnormale celgroei en een breed spectrum aan klinische manifestaties, waaronder autismespectrumstoornis (ASD)1,2. ASS wordt geschat op ~1,5% van de mensen met een gemiddelde diagnoseleeftijd van ~3 jaar in ontwikkelde landen3. ASS wordt gekenmerkt door repetitief gedrag, verminderde sociale interacties en verminderde cognitieve flexibiliteit4, en patiënten presenteren vaak extra neurogedragsproblemen zoals angst, depressie of verstandelijke beperking3. Opmerkelijk is dat 40%-60% van de mensen met TSC ASS-gerelateerde kenmerkenvertonen 2, maar de ernst van de symptomen varieert sterk – zelfs tussen patiënten met vergelijkbare mutaties – wat suggereert dat omgevingsfactoren genetisch gedreven risico beïnvloeden.

Een van die factoren is ontsteking. Hoewel de oorzaak van ASS grotendeels onbekend blijft, wordt neuro-ontsteking in meerdere hersengebieden al lange tijd in verband gebracht5. Toenemend preklinisch en klinisch bewijs wijst erop dat foetale neuro-ontsteking veroorzaakt door activatie van het moederimmuunsysteem (MIA) en de daaruit voortvloeiende verhoging van cytokinesignalering aanzienlijk kan bijdragen aan de pathogenese van ASD6. Het modelleren van blootstelling aan inflammatoire cytokines in genetisch gevoelige systemen, zoals TSC, biedt dus een krachtig kader om te onderzoeken hoe immuunsignalen elkaar kruisen met verstoorde mTORC1-regulatie om de vroege hersenontwikkeling te beïnvloeden.

De reden voor het ontwikkelen van dit protocol komt voort uit het groeiende besef dat door cytokinen gemedieerde ontsteking, inclusief IL-6-signalering, kan interageren met genetische kwetsbaarheden en zo neuro-ontwikkelingstrajecten kan beïnvloeden. Cytokinen zijn laag-moleculair gewicht glycoproteïnen die de communicatie binnen het immuunsysteem coördineren. Bij ASS hebben meerdere studies consequent verhoogde niveaus van pro-inflammatoire cytokines gerapporteerd, waaronder IL-6 in perifeer bloed 7,8,9,10, wat de hypothese ondersteunt dat ontregelde IL-6-signalering kan bijdragen aan de neurodevelopmentele en gedragskenmerken die kenmerkend zijn voor de aandoening. IL-6 is een belangrijke mediator van immuunactivatie die wordt geproduceerd door diverse immuunceltypen als reactie op infectie of weefselschade. Omdat IL-6 de bloed-hersenbarrière kan passeren en direct invloed kan uitoefenen op neuronen, astrocyten en microglia, is een aanhoudende verhoging van deze cytokine betrokken bij veranderingen van neuro-ontwikkelingsroutes, synaptische plasticiteit en neuro-immuunhomeostase – mechanismen die steeds vaker worden onderzocht in de ASD-pathofysiologie11,12. Deze verbanden worden verder versterkt door MIA-studies, waarbij een verhoogd maternale IL-6 tijdens de zwangerschap de ontwikkeling van de foetale hersenen verstoort en het ASS-gerelateerd risicoverhoogt. De bestaande gewerveldenmodellen vertrouwen echter vaak op systemische immuunstimulatie via pathogeen-geassocieerde moleculen of maternale blootstellingsparadigma's, die variabiliteit kunnen introduceren, meerdere immuunroutes gelijktijdig kunnen activeren en het vermogen kunnen beperken om de specifieke bijdrage van IL-6 te isoleren. Directe IL-6 micro-injectie in zebravissen overwint deze beperkingen door gerichte manipulatie van één cytokine binnen een transparant, genetisch behandelbaar organisme mogelijk te maken.

Zebravissen bieden verschillende voordelen bij het bestuderen van cytokine-gedreven ontwikkelingseffecten. Hun optische transparantie maakt realtime visualisatie van immuun- en neurale reacties mogelijk; hun snelle ontwikkeling maakt experimenten met hoge doorvoer mogelijk; en hun geconserveerde cytokine-signaalroutes maken ze tot een krachtig gewerveldenmodel voor het ontleden van ontstekingsmechanismen 14,15,16,17,18. In experimentele studies is het noodzakelijk om exogene materialen (bacteriën, kankercellen, DNA, nanodeeltjes, enz.) in zebravislarven af te voeren. Een methode houdt in dat larven worden blootgesteld aan een oplossing met het materiaal van interesse, waardoor passieve opname via de huid, kieuwen of het maag-darmkanaal mogelijk wordt. De tweede en directere methode is micro-injectie, waarbij externe materialen in specifieke embryonale of larvale compartimenten worden gebracht met fijne glazen naalden 19,20,21. Belangrijk is dat micro-injectie in het kanaal van Cuvier een betrouwbare route biedt voor systemische toediening, waardoor een snelle verspreiding van IL-6 door de circulatie wordt gegarandeerd zonder de verstorende effecten van immuunstimulatie door het hele organisme.

In dit protocol presenteren we een stapsgewijze procedure, van de voorbereiding van injectiespuiten tot de injecties van IL-6 in de bloedbaan via de Cuvier-buis van zebravislarven 2 en 3 dagen na bevruchting (dpf). Deze methode is vooral nuttig voor onderzoekers die onderzoeken hoe specifieke ontstekingssignalen vroege ontwikkelingsprocessen, gen-omgeving interacties in modellen van neuro-ontwikkelings- of immuungerelateerde aandoeningen, de cellulaire en moleculaire gevolgen van cytokine-blootstelling in vivo, of de wisselwerking tussen genetische mutaties en ontstekingssignaleringsroutes beïnvloeden. Door een gecontroleerde, cytokine-specifieke en ontwikkelingsprecieze benadering te bieden, biedt dit protocol een veelzijdig platform om de mechanismen te onderzoeken waarmee IL-6 en gerelateerde immuunsignalen vroege immuun-, neurale en gedragsuitkomsten vormgeven.

Protocol

Voor de hier beschreven procedure werd de tsc2vu242/+ zebravislijn22,23 gebruikt. Alle uitgevoerde experimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met alle relevante wetgeving, en er is geen aanvullende goedkeuring van de ethische commissie vereist, specifiek omdat de gebruikte ontwikkelingsfase (<5 dpf) buiten het bereik van verplichte ethische beoordeling valt. Figuur 1 toont een schema van het protocol.

1. Trekken van micropipetten

  1. Bereid microinjectienaalden voor uit borosilicaatglazen capillairen met een micropipettrekker, volgens vastgestelde procedures24.
  2. Gebruik 10 cm lange borosilicaatglazen capillairen (1,0 mm buitendiameter, dunwandig) en laad deze in een micropipettrekker.
  3. Positioneer de capillaire zorgvuldig binnen de trekkerwagen, zorg voor nauwkeurige uitlijning binnen de aangewezen groef, en zet deze stevig vast met de instrumentklemmen om beweging tijdens het trekken te voorkomen.
  4. Stel de capillaire aan zodat deze gecentreerd is binnen de verwarmingsfilament, zodat de verwarming langs het te trekken gebied gelijkmatig wordt gecreëerd voor een consistente naaldvorming.
  5. Start het trekprogramma met geoptimaliseerde parameters (bijv. voor Sutter-instrumentgebruik warmte: 533, trek: 50, snelheid: 60, vertraging: 90 en druk: 200) om fijnpuntige microinjectienaalden te genereren.
    VOORZICHTIG: Micronaalden die uit glazen capillairen worden getrokken zijn fragiel en kunnen gemakkelijk barsten, verstoppen of onregelmatige puntvormen ontwikkelen die het injectievolume veranderen. Controleer elke naald onder een stereomicroscoop vóór gebruik, vermijd het aanraken van de punt tegen harde oppervlakken en vervang de naalden onmiddellijk als weerstand, lekkage of een inconsistente druppelgrootte wordt waargenomen.
    OPMERKING: Na het trekken worden taps toelopende naaldpunten gevormd aan beide uiteinden van de capillair. Voor gebruik moet de tip voorzichtig worden geopend door deze voorzichtig te breken met fijne pincetten onder een stereomicroscoop om de gewenste diafragmagrootte voor microinjectie te bereiken.

2. Bereiding van buffers en voorraadoplossing

  1. Bereid een 60× bouillonoplossing van E3 embryomedium voor (zie Tabel 1). Steriliseer de oplossing door autoclavering en bewaar bij 4 °C. Voor gebruik verdunn je de standaardoplossing in ultrazuiver water om 1× E3 werkoplossing te verkrijgen.
    OPMERKING: 60× voorraadoplossing van E3 embryomedium kan worden opgeslagen bij 4 °C voor langdurige opslag.
  2. Bereid een 20x bouillonoplossing tricaïne (MS-222) zoals beschreven in Tabel 1. Bewaar de oplossing in het donker op 4 °C om degradatie te voorkomen. Verdun voor gebruik tot 1× werkconcentratie in E3-medium.
    OPMERKING: Stel de pH van tricaïne-voorraadoplossing aan naar 7,5 met 1 M Tris pH 9,0. Deze oplossing kan worden gealiquoteerd en bewaard worden in -20 °C (bevroren) voor langdurige opslag of opgeslagen bij 4 °C. Tricaïne breekt af bij RT en onder licht tot een giftige verbinding.
    VOORZICHTIGHEID: Er moet speciale voorzichtigheid worden betracht bij het gebruik van tricaïne (MS-222) voor anesthesie, aangezien zowel onder- als overmatige blootstelling de larvale fysiologie en het gedrag nadelig kunnen beïnvloeden. Overmatige blootstelling kan de hartfunctie verlagen en later gedrag veranderen, terwijl onvoldoende anesthesie het risico op letsel tijdens het monteren verhoogt. Gebruik alleen de minimale effectieve concentratie en duur, en laat volledig herstel in het verse embryomedium toe vóór gedragsonderzoeken.
  3. Maak een agaroseoplossing van 1% (met v) in E3-medium door te verwarmen tot deze volledig is opgelost.
    OPMERKING: Indien vooraf bereid, kan de oplossing worden bewaard bij 4 °C en opnieuw worden verwarmd vóór gebruik. Op de dag van het experiment moet de agarose vloeibaar worden gehouden op 55–60 °C om voortijdige stolling te voorkomen.
  4. Bereid een NaCl-oplossing van 0,9% (met v) voor en bewaar tot 1 week bij kamertemperatuur of bij 4 °C voor langdurige opslag. Voor gebruik moet je de oplossing in evenwicht brengen tot kamertemperatuur of incuberen bij 28,5 °C om aan te sluiten bij de fysiologische omstandigheden van de embryo's.
  5. Bereid een IL-6-oplossing van 2 pg/nL voor in 0,9% NaCl. Aliquot de oplossing om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen en te bewaren bij -20 °C. Ontdooi het voor gebruik en breng de aliquot op kamertemperatuur.
  6. Bereid een 0,5 mg/mL werkoplossing van pronase in E3-medium uit een 20 mg/mL bouillonoplossing bereid in ultrazuiver water.

3. Het verkrijgen en opvoeden van embryo's tot 2 dpf

  1. Zet groepspaaien op door meerdere tsc2vu242/vu242 volwassen zebravissen in een paaibak te plaatsen.
    OPMERKING: Mannetjes en vrouwtjes kunnen 's nachts gescheiden worden met een scheidingswand om voortijdig paaien te voorkomen, waarbij de scheidingswand de volgende ochtend wordt verwijderd om gesynchroniseerde paring te stimuleren. Alternatief kunnen vissen zonder verdelaar worden gehouden in een lichtgecontroleerde omgeving, waar de overgang van donker (nacht) naar licht (ochtend) fungeert als paai-cue.
  2. Verwijder de volgende dag de scheidingswand (indien gebruikt) en laat het paaien ongeveer 1 uur doorgaan.
  3. Verzamel bevruchte embryo's snel en plaats ze in 100 mm petrischaaltjes met 40 mL E3-embryomedium, waarbij een dichtheid van maximaal ~60 embryo's per schaal wordt behouden om optimale ontwikkeling te garanderen.
  4. Incubeer embryo's bij 28,5 °C onder een gecontroleerde dagcyclus van 14 uur licht en 10 uur donker.
  5. Bij 1 dpf en 2 dpf onderzoekt u embryo's onder een stereomicroscoop en verwijdert u dode embryo's, onbevruchte eicellen en afval om de cultuurkwaliteit te behouden.
  6. Vervang het E3-medium door een verse oplossing om afvalophoping te minimaliseren en de normale embryonale ontwikkeling te ondersteunen.

4. Voorbereiding van agaroseplaten voor micro-injecties en dechorionatie

  1. Maak een agaroseoplossing van 1% (met v/v) in E3-medium en verwarm deze totdat de agarose volledig is opgelost en de oplossing helder wordt.
  2. Laat de oplossing kort afkoelen en giet vervolgens ongeveer 30 mL in een 100 mm petrischaal, zodat er een egale laag over het oppervlak ligt.
  3. Terwijl de agarose nog vloeibaar is maar begint te stollen, plaats je voorzichtig een siliconenmal op het oppervlak om gelijkmatige groeven te creëren.
    OPMERKING: Hier worden siliconenmallen met piramidevormige patronen (Figuur 2) gebruikt om putten te genereren die overtollig E3 kunnen vasthouden tijdens micro-injectie. Deze putten zijn ontworpen om tijdelijk stabiliteit te bieden tijdens het hanteren en injecteren door voldoende vocht te behouden om uitdroging te voorkomen en de levensvatbaarheid van het embryo enkele minuten buiten de standaard incubatieomstandigheden te waarborgen.
  4. Bereid agarose-gecoate Petrischalen voor enzymatische dechorionatie (50 mm diameter) door ongeveer 5 mL gesmolten 1% (w/v) agaroseoplossing te gieten en de schaal voorzichtig te draaien om het oppervlak gelijkmatig te bedekken.
  5. Verwijder overtollige agarose.
  6. Laat de agarose 10–15 minuten bij kamertemperatuur stollen. Eenmaal gestold zijn de schalen klaar voor gebruik bij de enzymatische dechorionatie van embryo's.

5. Enzymatische dechorionatie van 2 dpf vissen

  1. Breng ongeveer 100 embryo's in chorionen bij 2 dpf over in een kleine (50 mm) met agarose bedekte Petrischaal.
  2. Verwijder zoveel mogelijk E3-medium om verdunning van de enzymatische oplossing te minimaliseren en efficiënte dechorionatie te garanderen.
  3. Voeg 4 mL vers bereide pronase-oplossing (voorraadconcentratie: 20 mg/mL [bereid in ultrazuiver water], werkconsumptie: 0,5 mg/mL [verdund in E3]) toe aan het gerecht, zodat embryo's volledig ondergedompeld zijn.
    VOORZICHTIG: Pronasebehandeling moet zorgvuldig worden gecontroleerd, omdat oververtering het larvale weefsel kan beschadigen, wat leidt tot een grotere kwetsbaarheid tijdens het hanteren en mogelijk invloed heeft op overleving of gedrag. Gebruik alleen de minimale effectieve blootstellingstijd en spoel de embryo's daarna grondig om voortzetting van enzymatische activiteit te voorkomen.
  4. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3–5 minuten, waarbij de afgifte van chorions onder een stereomicroscoop wordt gevolgd.
  5. Draai of draai de schaal voorzichtig af en toe om de enzymatische verwijdering van chorionen te vergemakkelijken. Ga door totdat het merendeel van de embryo's uit hun chorions is vrijgekomen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de naakte embryo's altijd in oplossing worden ondergedompeld; anders kan de dooierzak scheuren, wat leidt tot de dood van de embryo's.
  6. Zodra de dechorionatie is bereikt, was u de embryo's grondig door ze door 5–6 keer vers E3-medium te verplaatsen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de naakte embryo's altijd in oplossing worden ondergedompeld; anders kan de dooierzak scheuren, wat leidt tot de dood van de embryo's.
  7. Zorg ervoor dat alle chorionen en pronaseresiduen worden verwijderd om schade aan de larven te voorkomen en optimale kweekomstandigheden te behouden.
  8. Overbreng ~50 gedechorioneerde larven in een 100 mm petrischaal met 40 ml E3-medium met behulp van een glazen Pasteur-pipet.
  9. Houd de larven in deze omstandigheden totdat ze worden gemicroïnjecteerd.

6. Het injecteren van zebravisembryo's

  1. Onder een stereomicroscoop (≥150× vergroting) wordt fijne pincetten gebruikt om voorzichtig de punt van de getrokken glazen capillaire (sectie 1) te breken, waardoor een micropipet ontstaat met een opening van ongeveer 3 μm in diameter.
    OPMERKING: Een geschikte micropipet kan worden herkend door ervoor te zorgen dat de punt fijn geopend is, zonder zichtbare afvlakking of een groot open oppervlak aan de punt. Als de punt te breed wordt gebroken, dringt deze niet effectief door de vishuid en kan dit leiden tot slechte of inconsistente injecties. Daarom moet het openen van de tip zorgvuldig worden uitgevoerd onder een stereomicroscoop met hoge vergroting, zodat een minimale, gecontroleerde breuk aan het uiteinde van de capillaire wordt gegarandeerd.
  2. Bereid injectieoplossingen voor van 0,9% (w/v) NaCl (controle) of IL-6 (2 pg/nL) in 0,9% NaCl en voeg 1 μL 0,1% trypanblauw toe aan elke 10 μL oplossing om de visualisatie tijdens de injectie te vergemakkelijken.
  3. Vul de voorbereide micropipet met ~3 μL van de injectieoplossing met behulp van een microloader-tip, zodat er geen luchtbellen worden toegevoegd.
  4. Bevestig de geladen micropipet in de capillaire houder (Figuur 2) die is aangesloten op het microinjectiesysteem.
  5. Plaats een klein druppeltje minerale olie op een kalibratieslide.
  6. Kalibreer het injectievolume door druppels in de minerale olie te persen en hun diameter te meten met een kalibratieslide (Figuur 2) op een schaal van 0,01 mm. Pas de injectiedruk aan (tussen 300–500 hPa) om een druppelvolume van ~1 nL te bereiken.
  7. Voeg tricaïne (MS-222) toe aan het E3-medium met larven tot een uiteindelijke concentratie van 1× voor anesthesie. Om stress te minimaliseren en consistente sedatie te garanderen, gebruik larven in kleine hoeveelheden.
  8. Breng individuele 2 dpf-larven over op een gestolde agarose-injectieplaat. Meerdere larven (bijvoorbeeld tot 10) kunnen per schotel worden geplaatst, afhankelijk van de hanteerbaarheid.
  9. Plaats de schotel onder de stereomicroscoop. Met een glazen pipet oriënteer je elke larve voorzichtig zodat het kanaal van Cuvier duidelijk zichtbaar en toegankelijk is.
    OPMERKING: Bij het werken met meerdere larven, zorg ervoor dat het agaroseoppervlak gehydrateerd blijft door periodiek druppels E3-medium met tricaïne (1×) toe te voegen om uitdroging te voorkomen.
  10. Plaats de micropipettip bij het ingangspunt van het kanaal van Cuvier (zoals weergegeven in Figuur 3), herkenbaar door de bloedcellen te volgen die naar het hart bewegen onder de stereomicroscoop.
  11. Injecteer twee opeenvolgende druppels (~1 nL elk) van de voorbereide oplossing in het Cuvier-kanaal, met een interval van ongeveer 20 seconden tussen de injecties om een juiste distributie mogelijk te maken.
  12. Na injectie worden de larven voorzichtig van de agaroseplaat overgebracht in een verse 100 mm Petrischaal met 40 mL E3-medium. Minimaliseer de mechanische belasting tijdens het overplaatsen.
  13. Breng de larven terug naar de broedmachine bij 28,5 °C voor herstel.
  14. Herhaal de volgende dag (3 dpf) de microinjectieprocedure zoals beschreven in stappen 6.8–6.13.
    OPMERKING: Een enkele injectie levert slechts kortstondige signalering op en geen consistente gedragsrespons, terwijl de tweede injectie zorgt voor aanhoudende activatie van ontstekingspaden binnen het vroege larvale ontwikkelingsvenster dat relevant is voor neuroontwikkeling en gedragsveranderingen veroorzaakt zoals beschreven in de sectie Representative results.
  15. Bij 5 dpf gebruik je de larven voor latere toepassingen, waaronder gedragstests, hersenbeeldvorming of immunofluorescentieanalyse.

Resultaten

Om de effecten van IL-6 microinjectie op larvale fysiologie en gedrag te evalueren, vergeleken we IL-6 geïnjecteerde larven met NaCl-geïnjecteerde controles over overleving en twee gedragsmetingen die vaak worden gebruikt om angstachtig en repetitief gedrag bij zebravissen te beoordelen. IL-6 micro-injectie had geen invloed op de levensvatbaarheid van de larval vergeleken met NaCl-injecties (Figuur 4A). De overlevingspercentages bij 5 dpf waren niet te onderscheiden tussen IL-6 geïnjecteerde en NaCl-geïnjecteerde groepen, wat aangeeft dat het doseringsregime goed wordt verdragen en geen niet-specifieke toxiciteit introduceert. Micro-injecties verminderden zelf de levensvatbaarheid iets ten opzichte van niet-geïnjecteerde broers en zussen, wat wijst op een bescheiden effect op het hanteren onafhankelijk van de blootstelling aan IL-6. Dit bevestigt dat het protocol geschikt is voor downstream gedragsanalyses.

Om te valideren dat het IL-6 microinjectieparadigma een meetbare ontstekingsrespons induceert bij 5 dpf, hebben we prostaglandine E2 (PGE2) gekwantificeerd, een downstream mediator van cytokine-gedreven ontstekingssignalering25. De tsc2-/- homozygote mutanten vertoonden verhoogde basisniveau PGE2-niveaus, zelfs zonder IL-6-injectie, aanzienlijk hoger dan hun wildtype (WT) tsc2+/+ broers en zussen (Figuur 4B). Heterozygote tsc2+/- mutanten vertoonden een bescheiden, niet-significante toename van de basislijn PGE2 vergeleken met WT-larven, maar belangrijk was dat hun PGE2-niveaus scherp stegen na IL-6 micro-injectie. Dit patroon is consistent met ons doel om interacties tussen gen × omgeving te modelleren: WT-larven blijven grotendeels onaangetast door milde, tijdelijke blootstelling aan IL-6, terwijl genetisch vatbare tsc2+/- mutanten een uitgesproken ontstekingsreactie vertonen.

In lijn met deze genotype-afhankelijke verschillen in ontstekingstonus onderzochten we vervolgens of IL-6-geïnduceerde signalering zich vertaalde in meetbare gedragsveranderingen in de open-field assay. Open-field test bij 5 dpf (zoals eerder beschreven22) toonde aan dat tsc2-mutante larven een verhoogd angstachtig gedrag vertoonden in vergelijking met WT-broers en -zussen (Figuur 4C); micro-injecties van IL6 hadden echter geen effect op dit gedrag. Specifiek brachten tsc2+/- en tsc2-/- larven aanzienlijk meer tijd door in de buitenste zone van de arena en vertoonden ze minder centrumexploratie vergeleken met tsc2+/+, wat consistent is met vastgestelde angstgerelateerde fenotypes bij zebravislarven.

IL-6-injecties verhoogden repetitie, stereotiepe zwempatronen, vooral bij tsc2+/- mutante larven (Figuur 4D–E), een gedragskenmerk dat vaak wordt gebruikt als ASD-relevante uitlezing in zebravismodellen26. Gedetailleerde kwantificering van repetitieve lussen, gedefinieerd als drie of meer opeenvolgende cirkelvormige zwemmen, toonde een significante toename aan in het aandeel IL-6-geïnjecteerde tsc2+/- mutanten die dit gedrag vertoonden vergeleken met NaCl-geïnjecteerde controlegroepen. Deze selectieve versterking van repetitief zwemmen bij genetisch vatbare larven ondersteunt verder een interactie tussen gen × omgeving, waarbij milde ontstekingsstimulatie ASS-achtige gedragsneigingen blootlegt of versterkt, specifiek in de tsc2+/- mutante achtergrond.

figure-results-1
Figuur 1: Schema van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Micro-injectiewerkstation-opstelling. Schema van het micro-injectiewerkstation dat wordt gebruikt voor larvale zebravisinjecties. (1) Glazen micropipet gemonteerd op de injectorhouder; (2) met agarosen gecoate Petrischaal met gevormde putten voor larvale positionering; (3) minerale olie voor kalibratie; (4) trypanblauwe oplossing; (5) getrokken glazen naalden; (6) kalibratieslide; (7) verlengde pipettoppen; (8) Pasteurpipet; (9) Siliconen mal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Injectie in het kanaal van Cuvier. (A) Schematische weergave van de kanaal van Cuvier (de gemeenschappelijke kardinaalader) injectieplaats bij larvale zebravissen en representatieve open-veld lokomotorbanen bij 5 dpf. (B) Representatieve beelden van controle (niet geïnjecteerd), en injecties met NaCl en IL-6. Schaalbalk: 250 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Representatieve resultaten van interactie tussen gen x en omgeving met behulp van de tsc2-mutante lijn. (A) Overlevingspercentages (%) van tsc2vu242-larven gedurende het experiment in controlegroepen (ongeïnjecteerd), NaCl-geïnjecteerd en IL-6-geïnjecteerd. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM bij 5 dpf (n = 4 onafhankelijke experimentele replicata, elk genotype × behandelingscombinatie bevat 60–70 vissen). Statistische analyse werd uitgevoerd met ANOVA, gevolgd door de Tukey post hoc-test voor pargewijze vergelijking. Significante verschillen werden waargenomen tussen de controlegroep en de door IL-6 geïnjecteerde groepen (p = 0,00150) en tussen de controlegroep en de NaCl-geïnjecteerde groepen (p = 0,00243). (B) Boxplots die PGE2-niveaus in de tsc2-mutanten en broers en zussen weergeven, gemeten op 5 dpf met behulp van een enzymgekoppelde immunosorbentassay (ELISA) kit volgens het protocol van de fabrikant (2-weg ANOVA voor genotype: F = 7,4503; P = 0,01234). Elk monster bevat 20 koppen (munten werden gebruikt voor genotypering). Stippen in de boxplots vertegenwoordigen biologische replica's. (C) Boxplots van de resultaten van de open-veld test voor tsc2 mutante vissen die relatieve tijd naast de wanden tonen voor elk genotype na injecties met NaCl en IL-6 en voor niet-geïnjecteerde controles (2-weg ANOVA voor genotype: F = 7,021; P = 0,00106). De open-veld test werd uitgevoerd met behulp van een geautomatiseerde analysekamer (Materiaaltabel) volgens het eerder gerapporteerde protocol22. (D) Voorbeeldfiguur die willekeurig verkennend gedrag toont na NaCl-injectie en herhaalde lussing na IL-6-injecties. (E) Boxplots die het aantal dieren weergeven dat normaal en repetitief lusgedrag vertoont voor elk tsc2-genotype na injectie met NaCl of IL-6 en voor niet-geïnjecteerde controlevissen (2-weg ANOVA voor genotype: F = 5,7615; P = 0,005849). Drie onafhankelijke experimentele replicata, elk genotype × behandelingscombinatie met 60–70 vissen, werden hiervoor gebruikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

60 x E3 kolfoplossing
ReagensEindconcentratieBedrag
NaCl297 mM17,4 g
KCl10,7 mM0,8 g
CaCl219,6 mM2,18 g
MgCl2·6H2O24 mM4,89 g
Ultrapure H2 ON.v.t.Vul tot 1 L
TotaalN.v.t.1 L
Tricaïne-bouloplossing
ReagensEindconcentratieBedrag
Tricaïne15,3 mM1 g
1 M Tris-HCl pH 921 mM5,25 mL
Ultrapure H2 ON.v.t.244,75 mL
TotaalN.v.t.250 mL

Tabel 1: Samenstelling van E3- en Tricaïne-oplossingen.

Discussie

Zoals verwacht vertoonden tsc2 homozygote mutanten hoge basisniveaus van angstachtig, consistent met eerder gerapporteerde fenotypes22,27. Omdat deze larven al ernstige gedragsafwijkingen vertonen, verergerde IL-6-injectie hun fenotype niet verder. Daarentegen vertoonden tsc2-heterozygoten duidelijke door IL-6 geïnduceerde veranderingen. Deze selectieve gevoeligheid benadrukt het nut van dit protocol voor het onderzoeken van interacties tussen gen × omgeving, waarbij milde maar langdurige ontstekingssignalering interageert met onderliggende genetische kwetsbaarheid om neurogedragsuitkomsten te beïnvloeden.

LPS-blootstelling blijft het meest gebruikte inflammatie-opwekkende paradigma bij zebravissen en produceert betrouwbaar een brede, robuuste immuunrespons die wordt gekenmerkt door sterke inductie van pro-inflammatoire cytokines, rekrutering van aangeboren immuuncellen en dosisafhankelijke sterfte28. Hoewel krachtig, activeert LPS meerdere Toll-achtige receptorroutes gelijktijdig 28,29,30, waardoor het moeilijk is om de bijdrage van individuele cytokines aan downstream neuro-ontwikkelingseffecten te isoleren. Daarentegen biedt het hier beschreven IL-6 micro-injectieprotocol een gerichte en gecontroleerde aanpak door een enkele cytokine te verhogen waarvan bekend is dat het centraal staat in de immuunactivatie van de moeder. Belangrijk is dat IL-6-injecties de sterfte niet verhogen ten opzichte van met NaCl geïnjecteerde controles, waardoor gedrags- en moleculaire fenotypes kunnen worden onderzocht zonder verstorende toxiciteit. Bovendien veroorzaakt IL-6-microinjectie specifieke downstream ontstekingssignalering, zoals aangetoond door verhoogde PGE2-niveaus, en veroorzaakt meetbare gedragsveranderingen – met name meer herhaald zwemmen bij tsc2-heterozygote larven – waarbij genetische gevoeligheid samenwerkt met cytokineblootstelling. Samen benadrukken deze verschillen dat terwijl LPS globale immuunactivatie modelleert, IL-6 micro-injectie een nauwkeurige dissectie mogelijk maakt van cytokine-specifieke mechanismen die relevant zijn voor neuro-ontwikkelingsrisico.

De representatieve resultaten die hier worden gepresenteerd illustreren IL-6-effecten in een tsc2-mutant achtergrond, maar het protocol zelf is breed toepasbaar. De methode kan eenvoudig worden toegepast in wildtype-larven of andere genetische modellen om te onderzoeken hoe gedefinieerde ontstekingssignalen elkaar kruisen met diverse genetische contexten tijdens de vroege neuroontwikkeling. Voor toepassingen buiten het tsc2-model raden wij aan empirisch de optimale IL-6-dosis te bepalen, aangezien cytokinegevoeligheid en ontstekingsdrempels kunnen variëren per genotype en experimentele doelstelling.

Een belangrijke technische overweging in dit protocol is de consistentie van het injectievolume, aangezien de biologische effecten van IL-6 afhankelijk zijn van een nauwkeurige afgifte van ongeveer 1 nL per injectie. Variabiliteit in druppelgrootte ontstaat vaak door verschillen in naaldopening of injectiedruk. Als druppels te klein zijn, herstelt het geleidelijk verhogen van de druk of het licht verbreden van de naaldpunt onder hoge vergroting meestal de juiste doorstroming. Omgekeerd geven druppels die het beoogde volume overschrijden meestal aan dat de naaldopening te breed is, in welk geval het verminderen van de druk of het voorbereiden van een nieuwe naald met een smallere punt noodzakelijk is. Het handhaven van nauwkeurige injectievolumes is essentieel, omdat afwijkingen de ontstekingsbelasting kunnen veranderen en de reproduceerbaarheid kunnen belemmeren. Af en toe kunnen gebruikers situaties tegenkomen waarin geen oplossing uit de naald wordt verwijderd. Dit komt meestal door luchtbellen, vuil of blokkades bij de naaldpunt. Het inspecteren van de naald onder een stereomicroscoop en het controleren van het injectorsysteem op lekkages of losse verbindingen lost het probleem meestal op. Het zorgen voor een schone, onbelemmerde naaldtip is essentieel voor een consistente levering en om drukopbouw te voorkomen die de larven kan beschadigen.

Een andere belangrijke factor is de fysiologische tolerantie van het geïnjecteerde volume. Larven verdragen over het algemeen ~1 nL goed, maar grotere volumes kunnen de sterfte verhogen, vooral wanneer meerdere injecties over opeenvolgende dagen worden uitgevoerd. Voor experimenten die herhaalde dosering vereisen, is het cruciaal om mechanische stress te minimaliseren, voldoende hersteltijd tussen injecties toe te staan en de IL-6-concentratie aan te passen in plaats van het volume om de gewenste dosis te bereiken. Deze overwegingen helpen ervoor te zorgen dat waargenomen fenotypes cytokine-blootstelling weerspiegelen in plaats van injectiegerelateerde schade.

Tot slot kan de sterfte door injecties sterk variëren, afhankelijk van de gebruikerservaring. Hoewel ervaren gebruikers doorgaans een sterftecijfer van rond de 5% bereiken, kunnen onervaren gebruikers percentages tot wel 50% zien. De meeste verliezen ontstaan door mechanische schade tijdens het monteren, verkeerde plaatsing van de naald of per ongeluk doorboren de dooierzak of omliggende weefsels. Het oefenen van de procedure op wildtype-larven voordat experimentele injecties beginnen, verbetert de consistentie aanzienlijk en vermindert de sterfte. De juiste plaatsing van de larven om het kanaal van Cuvier duidelijk te kunnen visualiseren, gecombineerd met voorzichtige behandeling tijdens het opzetten en terughalen, minimaliseert verdere procedurele schade.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Wij danken Kevin Ess en Lilianna Solnica-Krezel (Vanderbilt University) voor tsc2vu242/+ vissen en de IIMCB ZCF voor de hulp met de volwassen vissen. Dit werk werd ondersteund door de SONATA BIS-subsidie nr. 2023/50/E/NZ3/00252, een subsidie aan JZ van het Nationaal Wetenschapscentrum, Polen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Borosilicate Glass capillaries (Outer diameter 1.0 mm/ inner diameter 0.75 mm)Sutter InstrumentBF150-75-10
CaCl2 (calcium chloride)Chempur118748703
Callibration Slide (1/100 mm)Bresser5916710
Capillary holder (Grip head set 4 size 0)Fertilart Sp. z o.o5196082001
Flaming/Brown micropipette pullerSutter InstrumentP-1000
HClChempur115752837
Human IL6Thermo Fischer Scientific200-06-20UGVoorraadconcentratie: 10 µg/mL, Werkconcentratie: 2 pg/nL (verdund in 0,9% NaCl)
Injector pump FemtoJet 4iEppendorfE5252000021
KCl (potassium chloride)Chempur117397402
MgCl2·6H2O (magnesium chloride hexahydrate)Chempur116120500
Femtotips Microloader Tips voor Femtojet MicroinjectorEppendorfEPE 5242956003
Microscope Leica M165 FC 1983 vergrotingLeica Microsysytemshttps://www.leica-microsystems.com/products/
light-microscopes/stereo-microscopes/p/leica-m165-fc/
Mineral oilSigma-AldrichM5904
NaCl (sodium chloride)Chempur117941206
PronaseSigma-AldrichP5147-1GVoorraadconcentratie: 20 mg/mL (bereide in ultrapuur water), Werkconcentratie: 0,5 mg/mL (verdund in E3)
TricaineSigma-Aldrich/MerckA-5040
Tris baseCarl Roth4855.3
Trypan BlueThermo Fischer Scientific15250061
UltraPure Low Melting Point AgaroseThermo Fischer Scientific16520050
ZebraBox uitbreiding - Photo Motor Response EZBPMRAnimalabhttps://animalab.eu/zebrabox-high-throughput-monitoring-system
ZebraboxViewPointhttps://www.viewpoint.fr/product/zebrafish/fish-behavior-monitoring/zebraboxGeautomatiseerde analysekamer

Referenties

  1. Winden, K., et al. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 12, 11(2026).
  2. Ramani, R., et al. The clinical interface of tuberous sclerosis complex and autism spectrum disorder: insights and future directions. Neurol Sci. 46 (6), 2571-2580 (2025).
  3. Lyall, K., et al. The changing epidemiology of autism spectrum disorders. Annu Rev Public Health. 38, 81-102 (2017).
  4. Nazeer, A., Ghaziuddin, M. Autism spectrum disorders: clinical features and diagnosis. Pediatr Clin North Am. 59, 19-25 (2012).
  5. Kern, J. K., Geier, D. A., Sykes, L. K., Geier, M. R. Relevance of neuroinflammation and encephalitis in autism. Front Cell Neurosci. 9, 519(2016).
  6. Careaga, M., Murai, T., Bauman, M. D. Maternal immune activation and autism spectrum disorder: from rodents to nonhuman and human primates. Biol Psychiatry. 81 (5), 391-401 (2017).
  7. Croonenberghs, J., Bosmans, E., Deboutte, D., Kenis, G., Maes, M. Activation of the inflammatory response system in autism. Neuropsychobiology. 45, 1-6 (2002).
  8. Girgis, R. R., Kumar, S. S., Brown, A. S. The cytokine model of schizophrenia: emerging therapeutic strategies. Biol Psychiatry. 75 (4), 292-299 (2014).
  9. Heuer, L. S., et al. An exploratory examination of neonatal cytokines and chemokines as predictors of autism risk: the early markers for autism study. Biol Psychiatry. 86 (4), 255-264 (2019).
  10. Sasayama, D., et al. Negative correlation between serum cytokine levels and cognitive abilities in children with autism spectrum disorder. J Intell. 5 (2), 19(2017).
  11. Banks, W. A., Kastin, A. J., Gutierrez, E. G. Penetration of interleukin-6 across the murine blood-brain barrier. Neurosci Lett. 179 (1-2), 53-56 (1994).
  12. Otkıran, G., Erdoğan, M. A., Uyanıkgil, Y., Erbaş, O. Prenatal interferon-alpha exposure induces autism-like neurobehavioral and neurochemical alterations in male offspring. J Neuroimmune Pharmacol. 21, 4(2026).
  13. Smith, S. E. P., Li, J., Garbett, K., Mirnics, K., Patterson, P. H. Maternal immune activation alters fetal brain development through interleukin-6. J Neurosci. 27 (40), 10695-10702 (2007).
  14. Bedell, V. M., Meng, Q. C., Pack, M. A., Eckenhoff, R. G. A vertebrate model to reveal neural substrates underlying the transitions between conscious and unconscious states. Sci Rep. 10, 15789(2020).
  15. Belo, M. A. A., et al. Zebrafish as a model to study inflammation: a tool for drug discovery. Biomed Pharmacother. 144, 112310(2021).
  16. Ka, J., Pak, B., Han, O., Lee, S., Jin, S. -W. Comparison of transcriptomic changes between zebrafish and mice upon high fat diet reveals evolutionary convergence in lipid metabolism. Biochem Biophys Res Commun. 530 (4), 638-643 (2020).
  17. Li, Y., Hu, B. Establishment of multi-site infection model in zebrafish larvae for studying Staphylococcus aureus infectious disease. J Genet Genomics. 39 (9), 521-534 (2012).
  18. Nicoli, S., Ribatti, D., Cotelli, F., Presta, M. Mammalian tumor xenografts induce neovascularization in zebrafish embryos. Cancer Res. 67 (7), 2927-2931 (2007).
  19. Cao, Z., et al. Carboxyl graphene oxide nanoparticles induce neurodevelopmental defects and locomotor disorders in zebrafish larvae. Chemosphere. 270, 128611(2021).
  20. Martini, D., Pucci, C., Gabellini, C., Pellegrino, M., Andreazzoli, M. Exposure to the natural alkaloid berberine affects cardiovascular system morphogenesis and functionality during zebrafish development. Sci Rep. 10, 17358(2020).
  21. Sun, M., et al. Robotic cardinal vein microinjection of zebrafish larvae based on 3D positioning. 2021 IEEE International Conference on Robotics and Automation (ICRA), Xi'an, China, , (2021).
  22. Kedra, M., et al. TrkB hyperactivity contributes to brain dysconnectivity, epileptogenesis, and anxiety in zebrafish model of tuberous sclerosis complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (4), 2170-2179 (2020).
  23. Kim, S. -H., Speirs, C. K., Solnica-Krezel, L., Ess, K. C. Zebrafish model of tuberous sclerosis complex reveals cell-autonomous and non-cell-autonomous functions of mutant tuberin. Dis Model Mech. 4 (2), 255-267 (2011).
  24. Konadu, B., Cox, C. K., Gibert, Y. Protocol for the microinjection of free fatty acids and triacylglycerol in zebrafish embryos. STAR Protoc. 5 (2), 103086(2024).
  25. Evans, S. S., Repasky, E. A., Fisher, D. T. Fever and the thermal regulation of immunity: the immune system feels the heat. Nat Rev Immunol. 15 (6), 335-349 (2015).
  26. Zabegalov, K. N., et al. Abnormal repetitive behaviors in zebrafish and their relevance to human brain disorders. Behav Brain Res. 367, 101-110 (2019).
  27. Scheldeman, C., et al. mTOR-related neuropathology in mutant tsc2 zebrafish: phenotypic, transcriptomic and pharmacological analysis. Neurobiol Dis. 108, 225-237 (2017).
  28. Ilyin, N. P., et al. Effects of intracerebroventricular lipopolysaccharide administration on behavioral, neurochemical, and neurogenomic responses in adult zebrafish. Behav Brain Res. 493, 115676(2025).
  29. Luo, R., Yao, Y., Chen, Z., Sun, X. An examination of the LPS-TLR4 immune response through the analysis of molecular structures and protein-protein interactions. Cell Commun Signal. 23, 142(2025).
  30. Grebennikova, D. V., Shandilya, U. K., Karrow, N. A. Beyond TLR4 and its alternative lipopolysaccharide (LPS) sensing pathways in zebrafish. Genes. 16 (9), 1014(2025).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

NeurowetenschappenEditie 232Editie 232AlleEditieAlleEditieDeze maand in JoVEEditieTuberous sclerosis complex TSCTSC geassocieerde neuropsychiatrische stoornissen TANDsInterleukine 6 IL 6Autismespectrumstoornis ASSneuro inflammatieductus CuvieriMaternale immuunactivatie MIA
Micro-injectie van interleukine-6 in de bloedbaan van TSC-zebravislarven om neuropsychiatrische aandoeningsachtige gedragingen te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.