Specnuezhenide verlicht diabetische nefropathie bij db/db-muizen, wat geassocieerd wordt met verbeterde nierfunctie, integriteit van de darmbarrière en verminderde ontsteking en oxidatieve stress.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Specnuezhenide verlicht diabetische nefropathie bij db/db-muizen, wat geassocieerd wordt met verbeterde nierfunctie, integriteit van de darmbarrière en verminderde ontsteking en oxidatieve stress.
De pathogenese van diabetische nefropathie (DN) is multifactorieel en omvat ontsteking, oxidatieve stress en de darm-nieras. Specnuezhenide is het belangrijkste actieve bestanddeel van Ligustri Lucidi Fructus en vertoont antineoplastische, antioxiderende en ontstekingsremmende werkingen. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de effecten op DN moeten echter verder worden bestudeerd. Deze studie heeft daarom als doel de moleculaire mechanismen van Specnuezhenide op DN te onderzoeken. Er werd een DN-muismodel opgesteld met behulp van db/db-muizen, en zij kregen 8 weken lang Specnuezhenide toegediend. De effecten van Specnuezhenide op deze muizen werden beoordeeld via serumglucose- en nierfunctie-evaluaties. Histopathologische veranderingen werden geëvalueerd met behulp van hematoxyline- en eosine kleuring. Er werd een enzym-gekoppelde immunosorbentassay gebruikt om de niveaus van inflammatoire cytokines te kwantificeren. De Nrf2-route en A20/NF-κB-routes werden geanalyseerd via western blotting (WB), terwijl de expressie van intestinale tight junction-eiwitten werd beoordeeld met behulp van WB en immunofluorescentie. Veranderingen in de darmmicrobiota werden onderzocht met high-throughput 16S rRNA-sequencing. In vergelijking met de modelcontrole verbeterde Specnuezhenide de nierfunctie bij db/db-muizen, waarbij de bloedglucose (van 37,13 mmol/L naar 28,96 mmol/L), het urineazuurgehalte in het bloed (van 18,27 mmol/L naar 15,15 mmol/L) en urine-eiwit (van 28,5 mg naar 20,41 mg) in de hogedosisgroep werd verlaagd. Ondertussen toonde de analyse van darmmicrobiota een verhoogde microbiële abundantie en verlaagde lipopolysaccharideniveaus na toediening van Specnuezhenide. Ondertussen kan Specnuezhenide de expressie van intestinale tight junction-eiwitten verhogen, waardoor de integriteit van de darmbarrière wordt versterkt. Specnuezhenide kan de expressie van Nrf2 en A20 verhogen, en de expressie van NF-κB omreguleren. Bovendien kan Specnuezhenide nierfunctieschade verhelpen terwijl het de Nrf2- en A20/NF-κB-routes reguleert.
Diabetes is een belangrijke oorzaak van nierziekten; met de toename van het aantal diabetespatiëntenneemt de prevalentie toe. Traditionele behandelingen voor diabetische nefropathie (DN) zijn aangetoond de progressie van chronische nierziekte te vertragen2. Er blijft echter behoefte aan het identificeren van effectievere medicijnen voor de preventie en behandeling van DN. De pathogenese van DN is veelzijdig en omvat ontsteking, oxidatieve stress en de darm-nieras1. Met zijn multi-target benadering heeft Traditionele Chinese Geneeskunde (TCM) opmerkelijke effectiviteit aangetoond bij de behandeling van chronische metabole ziekten. Bovendien heeft het groeiende onderzoek naar TCM bij de preventie en behandeling van DN veelbelovenderesultaten laten zien.
Diabetes mellitus is een complexe stofwisselingsstoornis, waarbij de darmen een centrale rol spelen in de pathofysiologie via interacties met metabole organen4. De wisselwerking tussen de gastheer en de darmmicrobiota is cruciaal voor het in stand houden van de homeostase van de gastheer. Verstoring van een gezonde microbiotastructuur kan toxines produceren die de nieren beschadigen, terwijl een verminderde nierzuivering het microbiële metabolisme en de samenstelling kan veranderen 5,6. De darmbarrière functioneert zowel als chemische als fysieke verdediging en wordt in stand gehouden door epitheliale dichte verbindingen en een slijmlaag bestaande uit mucin5. Bewijs suggereert een correlatie tussen DN en een verstoorde intestinale barrièrefunctie7, die de translocatie van toxines en bacteriële bijproducten, zoals lipopolysaccharide (LPS), in de bloedbaan mogelijk maakt 8,9. LPS-translocatie over de gecompromitteerde barrière kan ontregeling van adaptieve en aangeboren immuunresponsen veroorzaken en de productie van pro-inflammatoire cytokinesstimuleren 7,10, wat uiteindelijk leidt tot een chronische ontstekingstoestand die kenmerkend is voor DN11,12.
Ligustri Lucidi Fructus wordt klinisch gebruikt voor de behandeling van diabetische nefropathie (DN)13, waarbij Specnuezhenide is geïdentificeerd als een belangrijk actief bestanddeel14. Specnuezhenide, een uniek secoiridoïdglycoside15, vertoont ontstekingsremmende, antioxidante en immunomodulerende eigenschappen 16,17,18,19. De db/db-muis is een goed gevestigd spontaan type 2 DN-model dat belangrijke menselijke DN-kenmerken recapituleert, waaronder persistente hyperglykemie, albuminurie en mesangiale matrixexpansie20. Een eerdere studie meldde dat Specnuezhenide renoprotectieve effecten uitoefende bij DN-ratten21; de moleculaire mechanismen blijven echter grotendeels onontgonnen. Opmerkelijk is dat Specnuezhenide een lage orale biobeschikbaarheid heeft (ongeveer 1,93%)22, wat het moeilijk maakt om de farmacologische effecten uitsluitend via directe opname te verklaren. Nieuw bewijs suggereert dat Specnuezhenide snel kan worden gemetaboliseerd door de darmmicrobiota, en dat de farmacologische activiteit ervan mogelijk wordt gemedieerd via darmmicrobiota-afhankelijke routes19. Op basis van deze overwegingen werd de hypothese gesteld dat Specnuezhenide DN verlicht door de darmmicrobiota en de downstream ontstekings- en oxidatieve stressroutes te moduleren. Om deze hypothese te testen, evalueerden we de dosisafhankelijke effecten van Specnuezhenide bij db/db-muizen, waarbij we doseringen selecteerden op basis van voorlopige experimenten en eerdere farmacologische studies.
Daarom was deze studie bedoeld om het potentiële effect en mechanisme van Specnuezhenide in de context van DN te evalueren, met de nadruk op het vermogen om nierontsteking en oxidatieve stress via de darm-nieras te verminderen. Deze studie draagt bij aan het verduidelijken van de mechanismen waarmee Specnuezhenide bijdraagt aan de preventie en behandeling van DN.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De ethische commissie van de Shanxi University of Chinese Medicine keurde deze studie goed (2022DW167). De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
Dierproeven
Mannelijke db/db-muizen, 8–9 weken oud, werden uit een commerciële bron verkregen. De muizen werden ondergebracht in de dierenkamer op SPF-niveau van het Experimental Management Center van de Shanxi University of Chinese Medicine en werden gehandhaafd op een stabiele luchtvochtigheid van 55% ± 5% en een comfortabele omgeving van 25 °C ± 1 °C met een 12/12-uur licht/donker cyclus en ad libitum toegang tot voedsel en water. Voor het experiment werden alle muizen 7 dagen geaccliereerd. Humane eindpunten: Muizen die >20% lichaamsgewicht verloren, in een dovende toestand of het onvermogen om voedsel/water te bereiken, werden op humane wijze geëuthanaseerd vóór het geplande eindpunt. Euthanasie: Alle muizen werden geëuthanaseerd door intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium, gevolgd door een cervicale ontwrichting, volgens institutioneel goedgekeurde protocollen.
De db/db-muis is een genetisch spontaan diabetisch model (geen geïnduceerd model). Het succes van het model werd bevestigd op 9 weken leeftijd door het meten van nuchtere bloedsuiker (≥16 mmol/L) en urinemicroalbumine (positief). Alle db/db-muizen voldeden aan de criteria en er werden geen dieren uitgesloten. Zodra het DN-model succesvol was opgesteld bij db/db-muizen, werden de muizen willekeurig toegewezen aan groepen met behulp van een computergegenereerde willekeurige volgorde. De onderzoeker die de experimenten uitvoerde, was blind voor groepstoewijzing. Elke kooi huisvestte slechts één behandelgroep om kruisbesmetting te voorkomen. De muizen werden willekeurig verdeeld in vier groepen (n = 10 per groep): de modelcontrolegroep (MC), irbesartan-groep (Irb), laag-dosis Specnuezhenide-groep (Spe-L) en hoog-dosis Specnuezhenide-groep (Spe-H), waarbij db/m-muizen (n = 10) als normale controlegroep (NC) werden gebruikt. De NC- en MC-groepen kregen gedestilleerd water toegediend. Ter vergelijking: de Irb-, Spe-L- en Spe-H-groepen kregen dagelijks orale gavage van respectievelijk 43,75 mg/kg Irbesartan, 57 mg/kg Specnuezhenide en 114 mg/kg Specnuezhenide, gedurende 8 weken. De gavagedosering werd verhoogd in verhouding tot lichaamsgewichtstoename. Na 8 weken toediening werden alle muizen een nacht (12 uur) gevast, met vrije toegang tot water vóór euthanasie en het serum (gecentrifugeerd op ~1500 x g gedurende 15 minuten en het supernatant werd verzameld), urine (opgenomen 24-uur urine in de metabole kooi), ontlasting en darm- en nierweefsel werden direct na euthanasie verzameld, snap-frozen in vloeibare stikstof, en opgeslagen bij -80 °C tot analyse. Na gegevensverzameling werd blinding doorbroken om statistische analyses uit te voeren.
Bloed- en urine-indicatoren
De serumwaarden van LPS, SCr en BUN werden gemeten volgens de instructies van de fabrikant. De 24-uurs urineconcentratie werd gedetecteerd volgens de instructies van de kit. Serumglucosewaarden werden gemeten met een automatische biochemische analyzer.
ELISA-detectie
De concentraties van TNF-α, IL-6 en IL-1β in het muisserum werden gemeten met een microplaatlezer van model 352 volgens de instructies van de fabrikant.
Pathologische observatie van muisnierweefsels
Het darm- en nierweefsel werd 48 uur vastgelegd in een 4% paraformaldehydeoplossing voordat het werd gewassen, gedehydrateerd en paraffine-inbedding werd ingebracht. Doorsneden (4 μm dik) werden verkregen met behulp van een paraffinemicrotoom. Na deparaffinisatie werden de secties gekleurd met hematoxyline en eosine (HE) en gescand met een digitale pathologie-slidescanner.
16S rRNA-sequencing
Bacterieel genomisch DNA werd uit cecal-inhoud geëxtraheerd met behulp van een magnetische kraal-gebaseerde bodem-DNA-extractiekit volgens het protocol van de fabrikant. De DNA-concentratie werd gemeten met een fluorometer.
De V3–V4 hypervariabele regio van het 16S rRNA-gen werd geamplificeerd met behulp van de primers 338F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) en 806R (5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′). De versterking werd uitgevoerd met een PCR Master Mix onder de volgende cyclische omstandigheden: een initiële denaturatie bij 95 °C gedurende 3 minuten; 5 cycli van 95 °C voor 30 s, 45 °C voor 30 s, en 72 °C voor 30 s; gevolgd door 20 cycli van 95 °C voor 30 s, 55 °C voor 30 s, en 72 °C voor 30 s; en een laatste verlenging bij 72 °C voor 5 minuten. De PCR-amplicons werden vervolgens gezuiverd met behulp van magnetische kralen-gebaseerde DNA-zuivering en grootteselectiekralen.
Bibliotheken werden gebouwd met behulp van Illumina-adapters en indexen, en de sequencing werd uitgevoerd op een benchtop next-generation sequencing (NGS) platform (2 × 250 bp paired-end). Ruwe reads werden samengesteld met behulp van paired-end sequencing read-merging software, kwaliteitsgefilterd en geclusterd in operationele taxonomische eenheden (OTU's) met 97% gelijkenis met amplicon sequentieanalysesoftware. Chimerische sequenties en singleton OTU's werden verwijderd. Taxonomie werd door BLAST toegewezen aan de hand van de RDP-database (voor bacteriën) en UNITE (voor schimmels).
Alpha-diversiteit werd berekend met Mothur v3.8.31. Bètadiversiteit werd geëvalueerd met principal coordinate analysis (PCoA) op basis van Bray-Curtis-afstanden met behulp van het R-veganistische pakket. Differentiële abundantieanalyse werd uitgevoerd met STAMP v2.1.3 en LEfSe v1.1.0. Functionele voorspelling werd uitgevoerd met PICRUSt v1.1.4.
Immunofluorescentiekleuring
Na het ontwaxen werden monsters 15 minuten gerept met natriumcitraat bij hoge temperaturen, gevolgd door een blok van 60 minuten met 5% BSA. Primaire antilichamen voor occludin en claudin-1 (1:500) werden vervolgens aangebracht op ileale en colonische weefsels en 's nachts geïncubeerd. Vervolgens werd er 60 minuten secundaire antistofkleuring uitgevoerd. Na een DAPI-kleuring van 10 minuten werden monsters bewaard met een anti-fluorescentie-afschrikmiddel, en werden immunofluorescentiebeelden gemaakt met behulp van een geautomatiseerd fluorescentiebeeldvormingssysteem.
Westelijke verplettering
Het totale eiwit werd geëxtraheerd met behulp van een RIPA-buffer en gekwantificeerd met een BCA-eiwitassaykit. Monsters (15 μL/put) werden ongeveer 2 uur elektroforese op een 8%–12% scheidingsgel geladen. Eiwitten werden vervolgens 2 uur lang overgebracht naar een PVDF-membraan onder koelomstandigheden bij 100 V met behulp van een nat transfersysteem. Na blokkeren met 5% magere melk werd het membraan 's nachts geïncubeerd met het primaire antilichaam bij 4 °C. Na washes werd een geschikt secundair antilichaam aangebracht en werd het membraan 1 uur op kamertemperatuur geïncubeerd. Ten slotte werden membranen ontwikkeld in een donkere kamer met ECL-chemiluminescentie en geanalyseerd met ImageJ-software. Voor normalisatie werd de gemiddelde waarde van de NC-groep als referentie ingesteld. De ruwe gegevens van elke individuele steekproef uit alle experimentele groepen werden vervolgens gedeeld door deze gemiddelde waarde, zodat het gemiddelde van de NC-groep 1 werd en alle andere waarden werden uitgedrukt als fold-change ten opzichte van NC.
Statistische analyse
Statistische analyse werd uitgevoerd met SPSS 26.0-software, en de experimentele gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelden ± SD. Biologische replicaten (n) vertegenwoordigen individuele muizen per groep (n = 10 voor fysiologische parameters; n = 3 voor Western blot, en n = 6 voor 16S-sequencing). Geen dieren of monsters werden uitgesloten van de analyse. Als de steekproef voldeed aan de aannames van een normale verdeling en homogeniteit van variantie, werd eenrichtingsanalyse van variantie gebruikt om meerdere groepen te vergelijken. Wanneer homogeniteit van variantie werd bevestigd, werd de least significant difference (LSD) test toegepast voor paargewijze vergelijkingen; anders werd Dunnetts T3-test gebruikt. Gezien het verkennende karakter van de studie werd er geen extra correctie toegepast voor meerdere vergelijkingen over verschillende eindpunten. Er werd een statistisch significant verschil aangegeven wanneer P < 0,05.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Toediening van specnuezhenide verlaagde de bloedsuikerspiegel, verbeterde de nierfunctie en verminderde nierschade bij muizen met DN
DN-modelmuizen werden 8 weken lang behandeld met Specnuezhenide na succesvolle modellering. De muizen in de MC-groep vertoonden duidelijke stijgingen van het serumglucoseniveau, terwijl die in de Specnuezhenide-groep significant verlaagd waren (Figuur 1B). De MC-groep vertoonde signi...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
DN, een aanhoudende microvasculaire complicatie van diabetes, wordt gekenmerkt door verhoogde uitscheiding van albumine in de urine en een verminderde nierfunctie24. Albuminurie is een veelgebruikte vroege klinische indicator van DN-progressie25. Patiënten met DN kunnen abnormale nierfunctie vertonen, zoals blijkt uit significant verhoogde SCr- en BUN-niveausvan 26. In deze studie toonde de Specnuezhenide-groep een a...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs geven aan dat zij geen bekende concurrerende financiële belangen of persoonlijke relaties hebben die het werk in dit artikel zouden kunnen beïnvloeden.
Dit onderzoek werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81973486 en 82173974), onderzoeksprojecten van de Shanxi Province Traditional Chinese Medicine Administration (nr. 2024ZYYA021) en het Discipline Project van de Shanxi University of Chinese Medicine (nr. 2026XK24).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Albustix | Guangzhou Huadu Gaoerbo Biotechnology Co., Ltd. | 20211203 | |
| Analytische weegschaal | Beijing Sartorius Instrument System Co., Ltd. | CPA | |
| antilichaam A20 | Cell Signalling Technology | 5630s | (1:1000) |
| antilichaam Bax | Cell Signalling Technology | 2772s | (1:1000) |
| antilichaam Bcl-2 | Cell Signalling Technology | 3498s | (1:1000) |
| antilichaam claudin 1 | Abcam | EPR25359-48 | (1:1000) |
| antilichaam COX2 | Proteintech Group | 12375-1-AP | (1:2000) |
| antilichaam GAPDH | Abcam | EPR16891 | (1:10000) |
| antilichaam GCLC | Proteintech Group | 12601-1-AP | (1:10000) |
| antilichaam HO-1 | Proteintech Group | 10701-1-AP | (1:10000) |
| antilichaam IκBα | Cell Signalling Technology | 4812s | (1:1000) |
| antilichaam Myd88 | Abcam | EPR21824 | (1:1000) |
| antilichaam NF-κB p65 | Cell Signalling Technology | 8242s | (1:1000) |
| antilichaam NLRP3 | Proteintech Group | 68102-1-Ig | (1:5000) |
| antilichaam NQO1 | Proteintech Group | 11451-1-AP | (1:5000) |
| antilichaam Nrf2 | Proteintech Group | 16396-1-AP | (1:5000) |
| antilichaam occludin | Cell Signalling Technology | 91131S | (1:1000) |
| antilichaam p-IκBα | Cell Signalling Technology | 2859s | (1:1000) |
| antilichaam p-NF-κB p65 | Cell Signalling Technology | 3033s | (1:1000) |
| antilichaam TAX1BP1 | Proteintech Group | 14424-1-AP | (1:2000) |
| antilichaam TLR4 | GeneTex | GTX75742 | (1:1000) |
| antilichaam TRAF6 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8409 | (1:1000) |
| antilichaam ZO-1 | Proteintech Group | 21773-1-AP | (1:10000) |
| Automatische biochemische analyzer voor bloedglucosemeting | Biobase Biodusty (Shandong) Co., Ltd. | BK-280 | |
| bloed ureum stikstof | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C03-2-1 | |
| Centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd | HI650 | |
| db/db muizen (8-9 weken oude mannetjes) | Changzhou Kavens Laboratory Animal Co., Ltd. | SCXK (Su) 2021-0013 | |
| IL-1β ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | EM0109 | |
| IL-6 ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | EM1158 | |
| Irbesartan | Zhejiang Huahai Pharmaceutical Co., Ltd. | 0000019353 | |
| LPS | Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. | MM-0634M1 | |
| microscoop | Olympus Corporation | BX53 | |
| microtoom | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM 2016 | |
| Georganiseerde pizza snijmolen | Wuhan Junjie Electronic Co., Ltd | JK-6 | |
| Paraffine snijmolen | RWD Life Science Co., Ltd. | S710 | |
| Pathologische diascanner | Ningbo Konfoong Bioinformation Tech Co., Ltd. | KFBIO PRO-005 | |
| serum creatinine | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C011-2-1 | |
| Specnuezhenide | National Institutes for Food and Drug Control | 39011-92-2 | zuiverheid >98% |
| SPSS statistics 26.0 | |||
| Weefsel Inbedding Center | Wuhan Junjie Electronic Co., Ltd | JB-P5 | |
| Weefsel Processor | Wuhan Junjie Electronic Co., Ltd | JT-12J | |
| TNF-α ELISA Kit | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | ER1393 | |
| urinaire eiwit | Wuhan Fine Biotech Co., Ltd. | EM0632 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.