Dit protocol beschrijft een volledig geïntegreerde methode op basis van een microfluidische chip en LAMP, die point-of-care detectie mogelijk maakt van 15 pathogenen die lagere luchtweginfecties veroorzaken bij IC-patiënten binnen één uur.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Snelle point-of-care detectie van pathogenen voor infecties van de onderste luchtwegen bij IC-patiënten
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Infecties van de lagere luchtwegen (LRTIs) behoren tot de belangrijkste oorzaken van klinische achteruitgang en overlijden bij kritiek zieke patiënten. Op de intensive care (IC) is een tijdige identificatie van de veroorzakende pathogeen essentieel voor een passende antimicrobiële therapie; conventionele kweekmethoden duren echter 3 tot 5 dagen en hebben suboptimale positiviteitspercentages, in het bijzonder voor schimmels. Moleculaire benaderingen zoals PCR verkorten de doorlooptijd, maar zijn nog steeds afhankelijk van handmatige extractie van nucleïnezuren en thermocycling, wat hun geschiktheid voor gebruik aan het bed beperkt. Dit protocol beschrijft een point-of-care workflow rondom een volledig geïntegreerde, schijfvormige microfluidische chip (CD-chip) die magnetische kraal-gebaseerde zuivering van nucleïnezuren koppelt aan loop-mediated isotherme amplificatie (LAMP). Na een vereenvoudigde handmatige liquefactie- en lysestap wordt het bewerkte monster samen met twee vooraf verpakte reagens vials op de chip geladen. Het instrument voert vervolgens autonoom de extractie, amplificatie bij 65 °C en real-time fluorescentie-uitlezing uit, waarbij kwalitatieve resultaten voor 15 targets worden geretourneerd — namelijk 11 bacteriën, 3 schimmels en 1 atypische pathogeen — binnen 45 min instrument-run-tijd (ongeveer 1 u voor de complete sample-to-answer workflow, inclusief de handmatige voorbehandelingsstap). We presenteren detectiegegevens van 10 IC-monsters, waaronder sputum, bronchiale aspiraten en bronchoalveolaire lavagevloeistof, omvattend zowel enkelvoudige pathogeen- als polymicrobiële co-infecties met tot 7 organismen op één chip. Het gesloten cartridge-ontwerp minimaliseert het risico op aerosolcontaminatie, en de enkele laadstap vereist geen gespecialiseerde training, waardoor dit systeem een praktisch diagnostisch instrument aan het bed is voor IC-teams.
Inleiding
Onder kritiek zieke patiënten op de IC blijven infecties van de onderste luchtwegen, met ventilator-geassocieerde pneumonie (VAP) als belangrijkste vorm, een aanhoudende oorzaak van morbiditeit, verlengde mechanische ventilatie en overmatige mortaliteit1,2. Het microbiologische landschap van op de IC verworven infecties van de onderste luchtwegen (LRTIs) verschilt aanzienlijk van dat van in de gemeenschap verworven ziekten. Multiresistente Gram-negatieven (Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumannii) overheersen, vaak in polymicrobiële constellaties die empirische behandelregimes bemoeilijken3,4. Opportunistische schimmels voegen een extra laag complexiteit toe. Invasieve pulmonale aspergillose, ooit beschouwd als een kenmerk van diepe immunosuppressie, wordt nu met toenemende frequentie vastgesteld bij niet-neutropene IC-patiënten, met name na ernstige influenza en COVID-195. Bestaande diagnostische algoritmen voor aspergillose combineren kweekmethoden met een lage opbrengst met galactomannan (GM) antigeentests, maar de GM-assay wordt beperkt door goed gedocumenteerde diagnostische vensters en een variabele sensitiviteit bij niet-neutropene gastheren6. Elk uur vertraging bij het starten van een passende antimicrobiële therapie voor sepsis is geassocieerd met een meetbare toename in mortaliteit7. Gezameld gezien vereisen de snelheid en complexiteit van IC-infecties diagnostische instrumenten die kunnen voldoen aan de klinische urgentie.
Standaard microbiologische kweek is onmisbaar voor gevoeligheidstesten, maar is fundamenteel beperkt door de snelheid: de doorlooptijd bedraagt 3 tot 5 dagen, veeleisende organismen worden gemist en de positiviteit van schimmelkweken blijft laag8. Metagenomische next-generation sequencing (mNGS) biedt een onbevooroordeeld alternatief, maar de klinische adoptie wordt belemmerd door de kosten, verwerkingstijden van 24 tot 48 uur, de afhankelijkheid van bioinformatica-pipelines en de beperkte haalbaarheid aan het bed van de patiënt (point-of-care)9. PCR-gebaseerde panels hebben de tijdkloof verkleind, maar vereisen nog steeds een extractie van nucleïnezuren in meerdere stappen, thermocyclus-instrumentatie en, voor conventionele formaten, elektforese na amplificatie10. Geen van deze platforms voldoet volledig aan de convergente eisen van de ICU: een snelheid van minder dan één uur, minimale handmatige tijd, gemultiplexte pathogeendekking inclusief schimmels en een operationele eenvoud die voldoende is voor niet-laboratoriumpersoneel.
Loop-gemedieerde isotherme amplificatie (LAMP) lost verschillende van deze beperkingen op. De methode, voor het eerst beschreven door Notomi et al., amplificeert doel-DNA bij een constante temperatuur van 65 °C met behulp van een set van vier tot zes primers die zes verschillende regio's herkennen, aangestuurd door een strand-displacing polymerase11. De reactie genereert karakteristieke stem-loop en bloemkoolachtige ampliconstructuren die detecteerbaar zijn via real-time fluorescentie, wat leidt tot S-vormige curven binnen enkele minuten na het overschrijden van de drempelwaarde. De gevoeligheid bij lage templateconcentraties is hoog, en het multi-primer ontwerp biedt een selectiviteit die fout-positieven beperkt12,13. Wanneer LAMP wordt gekoppeld aan microfluidische chipplatforms, kan het proces geparalleliseerd worden over meerdere doelwitten vanuit één enkel monster14. Eerder werk heeft aangetoond dat LAMP-chipsystemen respiratoire pathogenen detecteren met een doorlooptijd van ruim onder de drie uur15. Een belangrijke beperking van deze systemen is echter hun afhankelijkheid van aparte, handmatige DNA-extractie, wat tijd, operationele complexiteit en het risico op contaminatie toevoegt.
Het hier beschreven systeem elimineert deze bottleneck. Het systeem is gebouwd rond een microfluïdische chip voor eenmalig gebruik in de vorm van een schijf (86 mm in diameter) en integreert monsterladen, zuivering van nucleïnezuren op basis van magnetische kralen en 16-plex LAMP-amplificatie in één enkele afgesloten cartridge (Figuur 1). De operator voert slechts een korte handmatige liquefactie-lysisstap uit met een speciaal ontworpen verwerkingsbuis en laadt vervolgens het lysaat en twee reagensflesjes op de chip (Figuur 2). Vanaf dat moment verzorgt het instrument autonoom de extractie, isotherme amplificatie bij 65 °C en fluorescentieacquisitie, waarbij binnen 45 min kwalitatieve uitslagen worden geleverd voor 15 klinisch relevante targets, namelijk 11 bacteriën, 3 schimmels (Aspergillus spp., Candida albicans, Pneumocystis jirovecii) en 1 atypisch pathogeen (Mycoplasma pneumoniae). Een neuroblastoma breakpoint family (NBPF)-gen, dat als interne controle dient, valideert de geschiktheid van het monster en de integriteit van de reactie in elke assay. Dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor de volledige workflow, van monsterafname op de ICU via de voorbewerking, het laden van de chip en geautomatiseerde detectie tot de interpretatie van de resultaten, bedoeld voor zowel klinisch laboratoriumpersoneel als teams aan het bed op de ICU.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle monsters zijn verzameld volgens een protocol dat is goedgekeurd door de Ethiekcommissie van het Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (goedkeuringsnummer I-24PJ1778). Voorafgaand aan de monstername is schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen van elke deelnemer of diens wettelijk gemachtigde vertegenwoordiger. Het panel met doelpathogenen en de toewijzing van de reactieputjes staan vermeld in Tabel 1, en de verbruiksartikelen die tijdens de monstervoorbewerking zijn gebruikt, staan vermeld in Tabel 2.
1. Afname van klinische monsters uit de onderste luchtwegen op de ICU
- Sputumverzameling
- Spoel de mondholte drie keer met schoon water of steriele fysiologische zoutoplossing om voedselresten en commensale orale flora te verwijderen.
- Instrueer de patiënt om twee tot drie keer diep adem te halen en vervolgens krachtig te hoesten om sputum uit de diepe luchtwegen rechtstreeks in een steriel opvangbekertje uit te stoten.
OPMERKING: Een acceptabel monster bestaat uit viskeus, purulent of bloedbesmeurd materiaal van onder de trachea; helder speeksel of postnasale drip is onvoldoende en kan de daaropvolgende detectie in gevaar brengen.
- Verzameling van bronchiale aspiraten (BAS)
- Voer bij niet-geintubeerde patiënten een steriele zuigcatheter in (een 10–12 Fr catheter, waarbij de zuigbron is ingesteld op een druk van −0,0267 MPa, equivalent aan −200 mmHg) via de nasale of orale route tot een diepte van ongeveer 30 cm.
- Pas zuigkracht toe terwijl de catheter wordt gedraaid en trek de catheter langzaam terug. Verzamel de geaspireerde secreten in een steriele monsteropvangval.
OPMERKING: Als er weinig secreet aanwezig is, breng dan ongeveer 5 mL steriele zoutoplossing via de catheter aan voordat er wordt gezogen. - Selecteer bij mechanisch geventileerde patiënten de zuigcatheter op basis van de grootte van de endotracheale tube: gebruik een 10 Fr catheter voor een tube van 7,0–7,5 mm en een 12 Fr catheter voor een tube van 8,0 mm.
- Pre-oxygeneer de patiënt met 100% zuurstof gedurende 30–60 s voor het zuigen. Koppel het ventilatiecircuit los en voer de geselecteerde catheter via de kunstmatige luchtweg in totdat er weerstand wordt gevoeld.
- Pas een negatieve druk van −0,0267 MPa toe (equivalent aan −200 mmHg) en beperk elke zuigbeurt, en daarmee de tijd dat de ventilator is losgekoppeld, tot maximaal 15 s om derecrutement en hypoxemie te minimaliseren; re-oxygeneer de patiënt na het zuigen gedurende 30–60 s met 100% zuurstof.
- Breng 1–2 mL steriele zoutoplossing via de catheter aan en wacht 3 s.
- Pas zuigkracht toe en trek de catheter terug. Verzamel de geaspireerde secreten in een steriele monsteropvangval. Koppel het ventilatiecircuit onmiddellijk na monsterverzameling weer aan.
OPMERKING: Een strikte aseptische techniek is gedurende het hele proces essentieel om nosocomiale contaminatie van het monster te voorkomen.
- Verzameling van bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF)
- Identificeer het doelsegment op thoraxbeelden. Voer het bronchoscoop verder in en klem deze in de juiste segmentale of subsegmentale bronchus.
- Breng snel aliquots van 20–50 mL steriele zoutoplossing aan, voor 3–5 aliquots (totaal 60–120 mL). Pas na elke aliquot zachte zuigkracht toe en verzamel de teruggewonnen vloeistof in een steriele, afgesloten container.
WAARSCHUWING: Continue hemodynamische en ventilatoire monitoring is verplicht tijdens BAL bij ICU-patiënten. Pas de ventilatorinstellingen naar behoefte aan voor mechanisch geventileerde proefpersonen.
OPMERKING: Het typische herstel is 40–60% van het aangebrachte volume. Bij een geringe return kan het noodzakelijk zijn om de tip van de bronchoscoop opnieuw te positioneren.
2. Liquefactie en pathogenenlyse
- Zuig met de wegwerppipet #2 het monster op tot de markeerlijn (ongeveer 1 mL) en breng dit over in de liquefactiebuis. Knijp herhaaldelijk in de pipetbulb om al het viskeuze materiaal over te dragen en sluit daarna de buis met de dop.
OPMERKING: Gebruik bij BALF of waterig sputum twee pipetvolumes om voldoende pathogeneninput te garanderen. - Schud de liquefactiebuis 1 min lang krachtig met de hand. Inspecteer het monster visueel en blijf schudden totdat er geen zichtbare slijmklonten meer aanwezig zijn en het monster zonder weerstand door de wegwerppipet #1 stroomt (een uniforme, waterachtige consistentie). Schud gedurende minimaal 1 min; verleng deze tijd indien nodig voor zeer viskeuze monsters totdat aan deze criteria is voldaan.
- Open de afsluitdop van de lysisbuis.
- Zuig ongeveer 0,5 mL van het gehomogeniseerde monster op met de wegwerppipet #1 en breng het monster over in de lysisbuis.
- Sluit de afsluitdop en controleer of de tipdop stevig is aangedraaid.
- Plaats de lysisbuis in het Sample Preprocessing-apparaat (SP-apparaat) en druk naar beneden tot deze stevig vastzit. Druk op Start.
- Laat het SP-apparaat de geautomatiseerde liquefactie-lysiscyclus voltooien (parameters in Tabel 3), wat ongeveer 15 min duurt.
OPMERKING: Open of verwijder de buis niet tijdens het proces.
3. Chipbelading en geautomatiseerde detectie
- Laden van reagentia en monster
- Haal de CD-chip uit de opslag bij 4 °C en laat deze 10 min lang equilibreren op kamertemperatuur (ongeveer 25 °C).
OPMERKING: Reagentiaflacons O en B en het voorbehandelde lysaat worden op kamertemperatuur gebruikt; de on-chip LAMP-amplificatie wordt uitgevoerd bij 65 °C (zie stap 3.2.3 en Tabel 3). - Open de foliezak en plaats de chip op een vlak oppervlak.
- Draai de dop tegen de klok in om de chip te openen.
- Tik tegen flacon O om de vloeistof onderin de flacon te verzamelen.
- Verwijder de dop van flacon O, steek de tuit in poort O en breng de volledige inhoud in de poort over.
- Gooi flacon O weg. Herhaal de procedure met flacon B en poort B.
- Verwijder de bewerkte lysisbuis uit het SP-apparaat en verwijder de dop van de tip.
- Lijn de tip van de buis uit met poort S en breng het volledige lysaatvolume in de chip over.
- Gooi de gebruikte lysisbuis weg.
- Draai de chipdop met de klok mee totdat twee hoorbare klikken een volledige afsluiting bevestigen.
OPMERKING: Onvolledig laden van een poort kan leiden tot storingen in individuele kanalen. Bevestig volledige dispensing voor het afsluiten. Om onvolledige afsluiting en contaminatierisico's te vermijden, dient u geen PE-handschoenen te dragen bij het afsluiten van de dop; latex- of nitrilhandschoenen worden in plaats daarvan aanbevolen.
- Haal de CD-chip uit de opslag bij 4 °C en laat deze 10 min lang equilibreren op kamertemperatuur (ongeveer 25 °C).
- Bediening van het instrument
- Zet de automatische nucleïnezuuranalyzer aan. Tik op Detect, scan de barcode op de foliezak van de chip en voer de patiëntgegevens en het monster-ID in.
- Plaats de chip op de rotatiespindel en druk naar beneden tot een klik bevestigt dat deze is vastgeklikt.
- Tik op Start. Het instrument voert autonoom centrifugale reagentiadistributie, extractie met magnetische beads, LAMP-amplificatie bij 65 °C en fluorescentieacquisitie uit. De looptijd bedraagt ongeveer 45 min (het laden van reagentia/monsters en de workflow van het instrument zijn samengevat in Figuur 3).
OPMERKING: Open het deksel niet tijdens de run.
- Interpretatie van resultaten
- De software identificeert het buigpunt van elke S-vormige amplificatiecurve via een second-derivative maximum analyse en rapporteert de corresponderende TP-waarde (tijd tot positiviteit).
- Vergelijk elke TP-waarde met de overeenkomstige drempelwaarde vermeld in Tabel 4. Classificeer kanalen met TP-waarden op of onder de drempelwaarde als positief en kanalen met TP-waarden boven de drempelwaarde als negatief.
- Verifieer of het interne controlekanaal (well 16) een S-vormige amplificatiecurve vertoont met een TP-waarde onder de 12 min.
- Wijs de run af als de interne controle faalt. Herhaal de test met een nieuwe chip of neem het monster opnieuw af.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Na voltooiing van een geldige run toonde het instrument real-time fluorescentiesporen voor alle 16 kanalen. Positieve kanalen vertoonden de verwachte S-vormige amplificatiekinetiek met automatisch geannoteerde TP-waarden, terwijl negatieve kanalen op de basislijn bleven. Het IC-kanaal (putje 16) leverde in alle geldige runs een S-vormige curve op met TP < 12 min.
Als pilot en proof-of-concept demonstratie van het protocol werden 10 representatieve monsters geselecteerd om de reeks klinisch...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Snelle identificatie van pathogenen is van cruciaal belang bij het beheer van infecties op de intensive care. Het hier beschreven systeem reduceert de tijd tot identificatie van de pathogeen van de 3 tot 5 dagen die doorgaans nodig zijn voor een kweek naar minder dan 1 uur, een tijdsbestek waarin eerstelijnsbeslissingen over antimicrobiële middelen vaak worden genomen7. Door nucleïnezurextractie, zuivering en 16-plex LAMP-amplificatie te integreren in één enkele verzegelde chip, elimineert deze wo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.
Dankbetuigingen
Niet-overdraagbare chronische ziekten-Nationaal Wetenschaps- en Technologiehoofdproject (No. 2023ZD0516500), Nationale klinische onderzoeksfinanciering voor ziekenhuizen van hoog niveau (2026-PUMCH-A-103) en CMB Open Competition Program (24-561) en Peking Union Medical College Hospital Talent Cultivation Program (No.UGG11571).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Geautomatiseerde nucleïnezuuranalyzer | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-T80-01 | TurboFlow T; voert centrifugale reagensdistributie, extractie met magnetische beads, LAMP bij 65 °C en real-time fluorescentiedetectie uit (~45 min run) |
| #1 Wegwerppasteurpipet | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Wegwerpmateriaal; 0.5 mL; overbrengt gehomogeniseerd monster naar lysebuis |
| #2 Wegwerppasteurpipet | Zhongtai Experimental Equipment Factory (Haimen) | Custom-made | Wegwerpmateriaal; 2 mL; zuigt monster tot aan de markeerlijn op in de liquefactiebuis |
| CD-chip | Beijing Hongyang Chensheng Technology Co., Ltd | Custom-made | Wegwerpmateriaal; disc van 86 mm met centrale laadzone (poorten O, B, S), zone voor zuivering met magnetische beads en buitenring met 16 reactieputjes (15 pathogene targets + NBPF interne controle) |
| LAMP-reactiereagentia | Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd | 16730ES80 | LAMP-reactiereagentia vooraf opgeslagen in de CD-chip als gelyofiliseerde beads |
| Liquefactiebuis | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Wegwerpmateriaal; 2 mL/buis; ontvangt monster voor handmatige homogenisatie |
| Lysebuis | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | Custom-made | Wegwerpmateriaal; 0.5 mL/buis; samendrukbare siliconen behuizing met 200 µm filtermembraan; voorgevulde lysereagentia |
| Primers | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | Custom-made | Primermengsel ingebed in de reactiekamer van de CD-chip |
| Apparaat voor monster-preprocessering | Beijing Taihao Biotechnology Co., Ltd | THE-R10-02 | TS-2000; geautomatiseerde liquefactie–lysecyclus (~15 min) |
| Single-dose vial “B” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Wegwerpmateriaal; voorverpakt on-chip reagens; één per test; bewaard bij 4 °C en geëquilibreerd naar kamertemperatuur (~25 °C) vóór het laden |
| Single-dose vial “O” | Ruifu Biotechnology (Guangzhou) Co., Ltd | Custom-made | Wegwerpmateriaal; voorverpakt on-chip reagens; één per test; bewaard bij 4 °C en geëquilibreerd naar kamertemperatuur (~25 °C) vóór het laden |
Referenties
- GBD 2016 Lower Respiratory Infections Collaborators. Estimates of the global, regional, and national morbidity, mortality, and aetiologies of lower respiratory infections in 195 countries, 1990–2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Infect Dis. 2018;18(11):1191-1210.
- Niederman MS, Torres A. Respiratory infections. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220150.
- Weiser JN, Ferreira DM, Paton JC. Streptococcus pneumoniae: transmission, colonization and invasion. Nat Rev Microbiol. 2018;16(6):355-367.
- Reynolds D et al. The threat of multidrug-resistant/extensively drug-resistant gram-negative respiratory infections: another pandemic. Eur Respir Rev. 2022;31(166):220068.
- Schauwvlieghe AFAD et al. Invasive aspergillosis in patients admitted to the intensive care unit with severe influenza: a retrospective cohort study. Lancet Respir Med. 2018;6(10):782-792.
- Meersseman W et al. Galactomannan in bronchoalveolar lavage fluid: a tool for diagnosing aspergillosis in intensive care unit patients. Am J Respir Crit Care Med. 2008;177(1):27-34.
- Seymour CW et al. Time to treatment and mortality during mandated emergency care for sepsis. N Engl J Med. 2017;376(23):2235-2244.
- Noviello S, Huang DB. The basics and the advancements in diagnosis of bacterial lower respiratory tract infections. Diagnostics (Basel). 2019;9(2):37.
- Chiu CY, Miller SA. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 2019;20(6):341-355.
- Hanson KE et al. Molecular testing for acute respiratory tract infections: clinical and diagnostic recommendations from the IDSA's diagnostics committee. Clin Infect Dis. 2020;71(10):2744-2751.
- Notomi T et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000;28(12):E63.
- Soroka M, Wasowicz B, Rymaszewska A. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): the better sibling of PCR? Cells. 2021;10(8):1931.
- Parida M et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev Med Virol. 2008;18(6):407-421.
- Ou H et al. Rapid detection of multiple pathogens by the combined loop-mediated isothermal amplification technology and microfluidic chip technology. Ann Palliat Med. 2021;10(10):11053-11066.
- Lai JX et al. Rapid detection of bacterial pathogens causing lower respiratory tract infections via microfluidic-chip-based loop-mediated isothermal amplification. J Vis Exp. 2024;(205):e66677.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
