Geoptimaliseerd protocol voor reverse transfectie voor de aflevering van telomerase-mRNA aan vroeg-senescente menselijke fibroblasten

Sukanta Jash; John Sedivy

doi:10.3791/71538

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Geoptimaliseerd protocol voor reverse transfectie voor de aflevering van telomerase-mRNA aan vroeg-senescente menselijke fibroblasten

126 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71538

⸱

18 augustus 2026

Sukanta Jash^*¹ , John Sedivy^*¹

¹Center on the Biology of Aging, and Department of Molecular Biology, Cell Biology, and Biochemistry, Brown University

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit artikel presenteert een geoptimaliseerd protocol voor reverse transfectie voor de efficiënte aflevering van nucleoside-gemodificeerd menselijk telomerase reverse transcriptase (hTERT) mRNA (hTERT mRNA) in senescente menselijke fibroblasten. Het vooraf coaten van kweekoppervlakken met hTERT mRNA-lipidcomplexen verbetert de opname, wat telomerase-activatie, telomeerverlenging en gedeeltelijke verjonging mogelijk maakt. Culturen keren uiteindelijk terug naar senescentie of crisis zonder immortalisatie.

Samenvatting

Cellulaire senescentie is geassocieerd met ingrijpende veranderingen in de cellulaire fysiologie, waaronder een verminderde membraanvloeibaarheid, een verstoord endosomaal transport, een verminderde endocytische capaciteit en een verhoogde extracellulaire RNase-activiteit, die gezamenlijk een efficiënte mRNA-aflevering belemmeren. Deze barrières hebben de toepassing van RNA-gebaseerde benaderingen in senescente cellen beperkt, in het bijzonder voor de aflevering van grote therapeutische transcripten. Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde reverse-transfectiemethode voor de efficiënte aflevering van gemodificeerd messenger-RNA (mRNA) in senescente menselijke fibroblasten. Hoewel menselijk telomerase reverse transcriptase (hTERT) mRNA als modeltranscript werd gebruikt, is de workflow breed toepasbaar op andere mRNA's. In tegenstelling tot conventionele transfectiemethoden, waarbij RNA-lipidencomplexen aan het cultuurmedium worden toegevoegd na aanhechting van de cellen, brengt reverse-transfectie de complexen aan op het cultivoppervlak vóór het uitzaaien van de cellen, waardoor directe interactie tussen hechtende cellen en transfectiecomplexen mogelijk wordt. Om de transfectie-efficiëntie te maximaliseren, bevat het protocol nucleoside-gemodificeerd mRNA met pseudouridine en 5-methylcytidine, verlengde poly(A)-staarten, een geoptimaliseerde timing voor complexvorming, RNase-inhibitie, een tijdelijke verhoging van de endosomale pH met chloroquine, een verhoogde celzaaidichtheid en verlengde incubatieperioden. Met deze benadering werden transfectie-efficiënties van ongeveer 50%–80% bereikt in senescente fibroblasten na aflevering van een 5 kb hTERT mRNA-transcript. De piek van de telomerase-activiteit werd gedetecteerd 24–48 h na transfectie. Eén enkele transfectiecyclus produceerde meetbare telomeerverlenging, terwijl drie opeenvolgende transfecties resulteerden in aanzienlijke maar eindige telomeerextensie. Gedeeltelijke omkeer van senescentie-geassocieerde fenotypen was detecteerbaar binnen 72–96 h, waaronder verminderde senescentie-geassocieerde β-galactosidase-activiteit, verlaagde p16- en p21-expressie, herstel van de celmorfologie en verlenging van de replicatieve levensduur. Het afgeleverde hTERT mRNA werd binnen 72–96 h afgebroken en er werd geen immortalisatie waargenomen. Dit protocol biedt een praktische benadering voor transiënte mRNA-aflevering in senescente cellen en kan aanpasbaar zijn voor een breed scala aan celtypen en soorten.

Inleiding

De methode van reverse transfectie vormt een cruciale methodologische aanpassing voor senescente cellen, waarmee de fundamentele barrières die deze cellen opwerpen voor standaard transfectiemethoden worden overwonnen. In tegenstelling tot forward transfectie, waarbij cellen vooraf worden geplaat door en zich hechten voordat de transfectiecomplexen worden toegevoegd, houdt reverse transfectie in dat cellen in suspensie direct op vooraf gevormde hTERT mRNA-lipidcomplexen worden geplaatst. Deze techniek verhoogt de transfectie-efficiëntie in senescente cellen aanzienlijk door de blootstelling aan transfectiecomplexen te maximaliseren tijdens de kritieke aanhechtingsfase, wanneer membraanremodellering het meest actief is.

De kern van de conceptuele verschuiving in dit protocol is om senescente cellen te behandelen als een specifiek afleveringsprobleem, en niet simpelweg als moeilijk te transfecteren versies van jonge cellen. Tijdens senescentie veranderen globale wijzigingen in de samenstelling van membraanlipiden, waaronder fosfolipiden, sfingolipiden en cholesterol, de membraanvloeibaarheid, kromming en proteïne-lipide-interacties, terwijl ze tegelijkertijd bijdragen aan het senescentie-geassocieerde secretorisch fenotype¹^,²^,³. Senescente cellen vertonen daarnaast een verminderde clathrine- en caveolae-gemedieerde receptor-endocytose en een gewijzigde endocytaire route, mede gedreven door de downregulatie van amphiphysin-1 en compensatoire veranderingen in de expressie van caveoline, wat de receptor-gemedieerde opname en signalering remt⁴^,⁵^,⁶. Parallel daaraan raken de door Rab7 gereguleerde late endosoom-lysosoom-as en het bredere endosoom-autofagie-lysosoom (EAL) netwerk gedereguleerd, waarbij Rab7 fungeert als een hoofdregelaar van de endolysosomale rijping en de fusie van autofagosoom en lysosoom, processen die verstoord zijn bij veroudering en neurodegeneratie⁷.

Senescente cellen reguleren doorgaans meerdere componenten van het lysosomale verwerkings- en adaptatiesysteem (LYPAS) op, waaronder TFEB/TFE3-gestuurde lysosomale biogenese en chaperone-gemedieerde autofagie, waardoor de lysosomale massa toeneemt. Echter vertonen individuele lysosomen vaak een verhoogde luminale pH, membraanschade en een veranderde proteolytische capaciteit, wat bijdraagt aan lysosomale dysfunctie ondanks hun toegenomen overvloed⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹. Collectief kunnen deze veranderingen geïnternaliseerd materiaal efficiënter naar degradatieve endolysosomale compartimenten leiden, waardoor de kans toeneemt dat afgeleverd RNA of eiwit wordt afgebroken voordat er een productieve cytosolische release plaatsvindt⁹^,¹⁰^,¹¹. Omgekeerde transfectie richt zich direct op het vroegste venster waarin membranen worden herstructureerd, tijdens de adhesie, wat een aanhoudend contact met een hoge aviditeit tussen cellen en mRNA-lipidcomplexen afdwingt en ten minste gedeeltelijk de verstoorde steady-state endocytose in volledig adherente senescente cellen omzeilt⁴^,⁵^,⁶^,¹².

Wat betreft het RNA-ontwerp gaat het protocol ervan uit dat in een context van veroudering een eenvoudige baseline van cap + staart onvoldoende is: volledige nucleoside-modificatie (bijvoorbeeld pseudouridine of N1‑methylpseudouridine plus 5‑methylcytidine) wordt beschouwd als ononderhandelbaar om translatie te ontkoppelen van endosomale Toll-like receptor-detectie en type I interferon-inductie. Fundamenteel werk heeft aangetoond dat de incorporatie van gemodificeerde nucleosiden in RNA de activering van TLR3, TLR7 en TLR8 onderdrukt en de cytokineproductie door dendritische cellen aanzienlijk vermindert, wat een mechanistische basis biedt voor de verminderde aangeboren immunogeniciteit van huidige nucleoside-gemodificeerde mRNA-platforms¹³. Recentere reviews over mRNA–LNP-vaccins en mRNA-geneesmiddelen benadrukken de gecoördineerde engineering van de 5′ cap, UTR's, coderende sequentie en poly(A)-staart om de stabiliteit en translatie in vivo te verhogen, terwijl de activering van het aangeboren immuunsysteem wordt geminimaliseerd¹⁴. In het bijzonder zijn de lengte en architectuur van de poly(A)-staart naar voren gekomen als sleutelfactoren voor de stabiliteit en translationele output van in vitro getranscribeerd mRNA, wat leidde tot verlengde of engineered poly(A)-ontwerpen in therapeutisch mRNA¹⁵.

Hierop voortbouwend bevat het protocol expliciet bescherming tegen extracellulaire en endosomale RNases tijdens de complexvorming en opname, samen met een gedefinieerd venster voor endosomale ontsnapping door gebruik van een transiënt lysosomotroop middel zoals chloroquine¹⁶^,¹⁷. Chloroquine wordt al lang gebruikt als functionele probe voor endosomale barrières en kan de target-interactie en silencing door siRNA of antisense-oligonucleotiden aanzienlijk verhogen door disruptie van het endosomale membraan en ontsnapping van de nucleïnezuurvracht naar het cytosol te bevorderen¹⁸. Tegelijkertijd heeft live-cell- en superresolutie-imaging van via LNP afgeleverd mRNA aangetoond dat productieve aflevering sterk wordt beperkt door zeldzame ontsnappingsgebeurtenissen uit vroege/recyclende endosomen, in plaats van door de initiële opname op zich, wat het belang onderstreept van het doelbewust ontwerpen van een stap voor endosomale ontsnapping voor mRNA-therapeutica¹⁹.

Collectief creëren deze senescentie-geassocieerde veranderingen in membraandynamiek, endocytisch transport, lysosomale verwerking en activatie van de aangeboren immuniteit aanzienlijke barrières voor een efficiënte mRNA-afgifte. De hier beschreven reverse-transfectiestrategie is ontwikkeld om deze beperkingen aan te pakken door geoptimaliseerde mRNA-engineering, RNase-bescherming, verbeterde endosomale ontsnapping en directe blootstelling van hechtende cellen aan vooraf gevormde mRNA-lipidcomplexen te combineren. Hoewel hTERT mRNA als modelvracht wordt gebruikt, is de workflow breed toepasbaar voor de afgifte van andere grote therapeutische mRNA-transcripten in senescente en moeilijk te transfecteren celpopulaties²⁰^,²¹^,²².

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. In vitro transcriptie van hTERT mRNA

In vitro transcriptie (IVT) met ARCA en ΨUTP
1. Bereid een IVT-reactie van 20 µL voor volgens Tabel 1. Schaal de reactie lineair op indien een hogere opbrengst vereist is.
2. Combineer alle reactiecomponenten, behalve T7 RNA-polymerase, in een RNase-vrije buis. Voeg als laatste T7 RNA-polymerase toe, meng voorzichtig en centrifugeer de buis kortstondig.
3. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 0,5–4 u.
  OPMERKING: Pas de incubatietijd aan op basis van de lengte van het template. Incubeer reacties met kortere templates (ongeveer 500 bp) gedurende ongeveer 30 min en reacties met grotere templates (ongeveer 4 kb) gedurende 3–4 u.
DNase-behandeling
1. Voeg 1 µL RNase-vrij DNase I direct toe aan het IVT-reactiemengsel.
2. Incubeer de reactie bij 37 °C gedurende 15 min.
  OPMERKING: De DNase-behandeling moet direct in de IVT-reactie worden uitgevoerd zonder voorafgaande zuivering van het gesynthetiseerde mRNA.
mRNA-zuivering
1. Voeg 115 µL nuclease-vrij H₂O toe om het reactiemengsel te verdunnen.
2. Zuiver het mRNA met een RNA-cleanupkit volgens de instructies van de fabrikant.
3. Elueer het gezuiverde mRNA in 20–30 µL nuclease-vrij H₂O.
4. Meet de mRNA-zuiverheid via spectrofotometrie en verifieer de RNA-integriteit via elektroforese op een denaturerende agarosegel van 1,0–1,5% of een polyacrylamidegel met een laag percentage.
Poly(A)-tailing
1. Bereid een poly(A)-tailingreactie van 50 µL voor volgens Tabel 2. Meng de reactiecomponenten voorzichtig en incubeer bij 37 °C gedurende 30–60 min.
  OPMERKING: Pas de incubatietijd aan op basis van de hoeveelheid input RNA.
2. Beëindig de reactie door 2 µL 0,5 M EDTA (pH 8,0) toe te voegen.
Finale zuivering en kwaliteitscontrole
1. Zuiver het poly(A)-getailde mRNA met een RNA-cleanupkit volgens de instructies van de fabrikant.
2. Elueer het gezuiverde mRNA in 20–30 µL nuclease-vrij H₂O.
3. Beoordeel de mRNA-kwaliteit voordat u overgaat tot transfectie
  1. Meet de mRNA-concentratie bij 260 nm en bepaal de zuiverheid met behulp van de A260/A280- en A260/A230-ratio's. Gebruik mRNA-preparaten met A260/A280-waarden van ongeveer 2,0 en A260/A230-waarden groter dan 2,0.
  2. Evalueer de mRNA-integriteit met gel-elektroforese of een RNA-analysesysteem volgens de instructies van de fabrikant.
  3. Bevestig de lengte van de poly(A)-staart via RT-PCR of Bioanalyzer-analyse. Verifieer dat de lengte van de poly(A)-staart tussen de 120 en 200 nucleotiden ligt.
  4. Verdeel het gezuiverde mRNA in aliquots en bewaar deze bij −80 °C om vries-dooi-cycli te minimaliseren.

2. Reverse transfectie

Dag −1: Voorbereiding op de transfectie
1. Verificatie van het senescente fenotype
  1. Voer een senescence-associated β-galactosidase (SA-β-gal) kleuring uit op een representatief celmonster. Verifieer dat meer dan 70% van de cellen positief is.
  2. Bevestig de expressie van senescence-markers (p16 en p21) via qRT-PCR of immunofluorescentie.
  3. Bepaal de celviabiliteit en verifieer dat de viabiliteit 90% overschrijdt.
2. Voorbereiding van reagentia
  1. Warm het complete kweekmedium voor tot 37 °C.
  2. Warm fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) voor tot 37 °C.
  3. Bereid vers Opti-MEM I medium.
    OPMERKING: Voeg geen RNase-remmer toe aan Opti-MEM I vóór gebruik.
Dag 0: Transfectiedag
OPMERKING: Houd rekening met ongeveer 3 u tussen de bereiding van de reagentia en de incubatie van de getransfecteerde cellen.
1. Voorbereiding van hTERT mRNA
  1. Ontdooi hTERT mRNA op ijs. Meet de mRNA-concentratie en gebruik preparaten met concentraties tussen 0,5 en 1,0 µg/µL.
  2. Verdun de gewenste hoeveelheid hTERT mRNA in Opti-MEM I op basis van het gebruikte kweekformaat (Tabel 3). Voeg RNase-remmer toe tot een eindconcentratie van 0,5–1,0 U/µL en meng voorzichtig.
  3. Bewaar het verdunde mRNA op ijs tot aan de complexvorming.
    OPMERKING: Voeg de RNase-remmer vlak voor gebruik toe. Bewaar mRNA niet met een RNase-remmer, aangezien de activiteit ervan afneemt na invriezing.
2. Voorbereiding van het transfectiereagens
  1. Meng 6,0 µL transfectiereagens met 100 µL Opti-MEM I in een steriele, RNase-vrije buis. Meng voorzichtig door te pipetteren.
  2. Incubeer het mengsel 5 min bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Voor grote hTERT mRNA-constructen (~5 kb) dient de reagens-mRNA-verhouding geoptimaliseerd te worden tussen 0,4 en 0,6 µL reagens per 100 ng mRNA.
3. Vorming van mRNA-lipidcomplexen
  1. Voeg de verdunde hTERT mRNA-oplossing (100 µL) toe aan de verdunde transfectiereagensoplossing (106 µL). Meng voorzichtig door 5–6 keer te pipetteren.
  2. Incubeer het mengsel 15–20 min bij kamertemperatuur.
  3. Overschrijd de complexatietijd van 30 min niet.
  4. Verifieer de succesvolle complexvorming aan de hand van het verschijnen van een licht troebele oplossing.
    OPMERKING: Voer de celvoorbereiding uit tijdens de complexatieperiode.
4. Celvoorbereiding voor reverse transfectie
  1. Aspireer het kweekmedium uit de senescente celculturen.
  2. Was de cellen één keer met voorverwarmde PBS (2 mL per well van een 6-well plaat).
  3. Voeg 500 µL 0,05% trypsine-EDTA per well toe.
  4. Incubeer de cellen 3–5 min bij 37 °C.
  5. Neutraliseer de trypsine met 3 mL compleet medium dat serum bevat.
  6. Tritureer de cellen voorzichtig om een suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.
  7. Bepaal het celgetal met een hemocytometer of een automatische celteller.
  8. Bereid een suspensie voor met 2,0–2,5 × 10⁵ cellen per well in compleet medium.
    OPMERKING: Vermijd langdurige trypsinisatie omdat senescente cellen zeer gevoelig zijn voor mechanische stress. Houd de cellen in suspensie; plaat ze niet vooraf vóór de reverse transfectie.
5. Reverse transfectie
  1. Voorbereiding van de kweekplaat
    1. Voeg 500 µL 0,01% poly-L-lysine toe aan elke well van een 6-well plaat en incubeer dit 30 min bij kamertemperatuur.
    2. Aspireer de coating-oplossing vlak voor gebruik.
    3. Voeg 200 µL van het hTERT mRNA-lipidcomplex toe in het midden van elke well.
    4. Incubeer de plaat 30 min bij 37 °C en 5% CO₂.
      OPMERKING: Voer de plating-coating parallel uit aan de complexvorming en de celvoorbereiding.
  2. Voorbereiding van de celsuspensie
    1. Suspendeer 2,0–2,5 × 10⁵ cellen in 1800 µL antibioticavrij compleet medium.
    2. Resuspendeer de cellen voorzichtig om een uniforme suspensie van enkelvoudige cellen te verkrijgen.
      OPMERKING: Gebruik antibioticavrij medium tijdens de transfectie.
  3. Uitplaten van cellen op de complexen
    1. Voeg 1800 µL van de celsuspensie direct toe aan de vooraf gevormde hTERT mRNA-lipidcomplexen.
    2. Kantel de plaat voorzichtig 2–3 keer in elke richting om de cellen gelijkmatig te verdelen.
      OPMERKING: Pipetteer de suspensie na toevoeging van de cellen niet, omdat dit de mRNA-lipidcomplexen kan verstoren.
  4. Celincubatie
    1. Incubeer de cellen 6–8 u bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂.
    2. Controleer de celaanhechting met een lichtmicroscoop 2–3 u na transfectie.
    3. Verifieer dat de cellen gelijkmatig verdeeld zijn en beginnen aan te hechten aan het kweekoppervlak.
      OPMERKING: Een overmatig aantal zwevende cellen of cellulair debris kan wijzen op transfectie-gerelateerde cytotoxiciteit.

3. Mitigatie van cytotoxiciteit

Verkort de blootstellingsperiode van de transfectie tot 48 h indien het celverlies meer dan 20% bedraagt.
Supplementeer de culturen met 10 µM ROCK-remmer Y-27632 tijdens de transfectieperiode om de celoverleving te verbeteren.
Aspirer na 6–8 h transfectie voorzichtig het transfectiemedium, waarbij verstoring van gedeeltelijk gehechte cellen tot een minimum wordt beperkt. Laat ongeveer 100 µL residu medium achter in elke well.
Voeg 1 mL vers voorverwarmd compleet groeimedium gesupplementeerd met 15% FBS toe aan elke well.
Voeg direct na vervanging van het medium chloroquine toe tot een eindconcentratie van 10–20 µM.
Incubeer de culturen nog 2 h bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂.
Vervang het medium dat chloroquine bevat door vers compleet groeimedium.
Plaats de culturen terug in de incubator voor verdere groei.
OPMERKING: Controleer de celmorfologie en viabiliteit gedurende de gehele herstelperiode. Overmatige celdetachement of debris kan wijzen op transfectie-geassocieerde cytotoxiciteit.

4. Analyse na transfectie

Beoordeel de TERT-proteinexpressie 24–48 u na transfectie.
Meet de TERT-proteineniveaus via western blotting of immunofluorescentiekleuring volgens standaard laboratoriumprocedures.
Meet de telomerase-activiteit gedurende hetzelfde interval met behulp van een geschikte telomerase-activiteitsassay.
OPMERKING: Telomerase-activiteit neemt doorgaans na 48 u af vanwege degradatie van het transient geleverde hTERT mRNA.
Beoordeel de telomeerlengte 48–72 u na transfectie met monochrome multiplex kwantitatieve PCR (MMqPCR) of een equivalente methode voor telomeerlengteanalyse.
OPMERKING: Na succesvolle aflevering van hTERT mRNA kan detecteerbare telomeerverlenging worden waargenomen.
Evalueer senescentie-geassocieerde en rejuvenatie-geassocieerde fenotypes 7 dagen na transfectie
1. Meet de senescentie-geassocieerde β-galactosidase (SA-β-gal) activiteit.
2. Meet de expressieniveaus van p16 en p21.
3. Beoordeel de Ki67-expressie.
4. Onderzoek de cellulaire morfologie via lichtmicroscopie.
  OPMERKING: Vergelijk behandelde culturen met onbehandelde of mock-getransfecteerde senescente controles om veranderingen in senescentie-geassocieerde fenotypes en proliferatieve kenmerken te beoordelen.

5. Protocol voor herhaalde dosering (Optioneel)

Voer de initiële transfectie uit zoals beschreven in secties 2–4.
Herhaal de transfecties volgens het volgende schema: Dag 0: eerste transfectie; Dag 5: tweede transfectie; Dag 10–12: derde transfectie.
Houd de cellen aan als adherente culturen en trypsiniseer ze niet vóór de volgende transfecties.
Bereid verse hTERT mRNA–lipidcomplexen zoals beschreven in secties 2.2.1–2.2.3.
Aspireer het cultuurmedium uit elke put.
Voeg 200 µL hTERT mRNA–lipidcomplexen direct toe aan elke put.
Voeg onmiddellijk na toevoeging van de complexen 800 µL vers volledig F-10 medium toe.
Incubeer de cellen gedurende 4–6 h bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂.
Vervang het transfectiemedium door vers volledig medium.
OPMERKING: Beperk de behandeling tot maximaal drie transfectiecycli om de cumulatieve transfectie-geassocieerde cytotoxiciteit te minimaliseren.

6. Protocol voor forward transfectie (2 µg/mL, 6-wells formaat)

Dag −1: Uitplaten van cellen
1. Detach senescente of vroeg-senescente fibroblasten met behulp van 0,05% trypsine-EDTA.
2. Neutraliseer de trypsine met volledig kweekmedium.
3. Bepaal het celgetal en de levensvatbaarheid.
4. Plate de cellen uit in 6-wells platen met een dichtheid van 2,0–2,5 × 10⁵ cellen per well.
5. Incubeer de cellen overnacht bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂ totdat ze een confluentie van ongeveer 60–80% bereiken.
Dag 0: Bereiding van hTERT mRNA–reagenscomplexen
1. Ontdooi een aliquot nucleoside-gemodificeerd hTERT mRNA op ijs.
2. Verdun het hTERT mRNA in Opti-MEM tot een eindconcentratie van 2 µg/mL in een steriele RNase-vrije buis (Buis A).
3. Voeg RNase-remmer toe aan Buis A tot een eindconcentratie van 0,5–1,0 U/µL en meng voorzichtig.
4. Verdun het transfectiereagens in Opti-MEM in een tweede RNase-vrije buis (Buis B) met gebruik van 0,4–0,6 µL reagens per 100 ng mRNA.
5. Voeg de inhoud van Buis B druppelsgewijs toe aan Buis A onder voorzichtig mengen.
6. Incubeer het mengsel gedurende 15–20 min bij kamertemperatuur.
Dag 0: Forward transfectie
1. Bevestig dat de cellen 60–80% confluent zijn en een gezonde morfologie vertonen.
2. Aspireer het kweekmedium.
3. Was de cellen één keer met 1–2 mL voorverwarmde PBS.
4. Voeg 0,5 mL voorverwarmd volledig of serum-gereduceerd medium toe aan elke well.
5. Voeg optioneel chlorochine toe tot een eindconcentratie van 10–20 µM.
6. Voeg 0,5 mL van de hTERT mRNA–reagenscomplexen, bereid in stap 6.2.6, toe aan elke well.
7. Schud de plaat voorzichtig om de complexen gelijkmatig te verdelen.
8. Incubeer de cellen gedurende 4–6 h bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂.
  OPMERKING: Verleng de incubatieperiode indien nodig naar 6–8 h voor senescente cellen.
9. Aspireer het transfectiemedium.
10. Voeg 2,0 mL vers volledig medium toe aan elke well.
11. Voer de post-transfectieanalyses uit zoals beschreven in Sectie 4.
  OPMERKING: Gebruik dezelfde batch hTERT mRNA, hetzelfde transfectiereagens en dezelfde nominale dosis bij het vergelijken van forward en reverse transfectiecondities.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het d2EGFP-T2A-hTERT modRNA werd ontwikkeld als een hybride open leesraam waarin een gedestabiliseerde EGFP (d2EGFP) reporter via een zelfklievend T2A-peptide was gekoppeld aan menselijk TERT. De volledige nucleotide- en eiwitsequenties van alle constructen zijn opgenomen in Supplementary File 1. De coderende sequentie werd geflankeerd door een synthetische 5′-onvertaalde regio (UTR) en de 3′-UTR van menselijk β-globine om de translationele efficiëntie en mRNA-stabiliteit te verhogen (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie herdefinieert cellulaire senescentie als een specifiek afleveringsprobleem in plaats van een geringe variatie van proliferatieve fysiologie, en ontwikkelt een telomerase mRNA-transfectiestrategie die is afgestemd op de biofysische en immunologische beperkingen van de senescente staat. Senescente cellen vertonen verstevigde, cholesterolrijke membranen en een verminderde endocytische activiteit, wat een aanzienlijke barrière vormt voor een efficiënte aflevering van nucleïnezuren. Door een reverse-transfectieben...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

J.M.S. is medeoprichter en voorzitter van de SAB van Transposon Therapeutics.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health (NIH) subsidies P01 AG051449, R01 AG016694 en R01 AG078925 toegekend aan JS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ham's F-10 Nutrient Mix	Thermo Fisher	11550043	Celkweekmedium.
3´-O-Me-m7G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog	New England Biolab	S1411L	Voor de meeste RNA's verhoogt de cap-structuur de stabiliteit, vermindert de vatbaarheid voor exonuclease-degradatie en bevordert de vorming van mRNA-initiatiecomplexen.
5-Methyl-Cytidine-5´-Triphosphate (5-Methyl-CTP)	New England Biolab	N0432S	Gemodificeerde NTP's worden veelvuldig gebruikt om de immunogeniciteit van in vitro getranscribeerd RNA te verminderen.
6-well plaat	Corning	351146	Voor het kweken en behandelen van middelgrote tot grote volumes adherente cellen of suspensiecellen onder onafhankelijke experimentele condities.
Anti-Ki67 antilichaam (SP6)	abcam	ab16667	Ki67 komt hoofdzakelijk tot expressie in prolifererende cellen.
Cellular Senescence Assay Kit (SA-beta-gal kleuring)	cellbiolabs	CBA-230	Identificatie van senescente cellen met de SA-β-gal kleuringsassay
DNA LoBind 0,5 ml buisjes	Eppendorf	022431005	Voor het efficiënt terugwinnen van DNA en RNA zonder verlies
DNA LoBind 1,5 ml buisjes	Eppendorf	22431021	Voor het efficiënt terugwinnen van DNA en RNA zonder verlies
DNase I, RNase-vrij (1 U/μL)	Thermo Fisher	EN0521	DNase I, RNase-vrij is een endonuclease die enkel- en dubbelstrengs DNA afbreekt.
E. coli Poly(A) Polymerase	New England Biolab	M0276S	In Escherichia coli fungeert Poly(A) Polymerase I (PAP I) primair als katalysator voor de template-onafhankelijke additie van adenosinemonofosfaat (AMP)-residuen aan het 3'-uiteinde van RNA-moleculen.
Fetaal runderserum	Thermo Fisher	A5256701	Serumsupplement voor celkweek
HiScribe T7 ARCA mRNA Kit	New England Biolab	E2065S	De HiScribe T7 ARCA mRNA Kit (met tailing) is ontworpen voor de snelle in vitro productie van ARCA-gecapte en poly(A)-getailed mRNA. Gecapte mRNA's worden gesynthetiseerd door co-transcriptionele incorporatie van Anti-Reverse Cap Analog (ARCA) met behulp van T7 RNA-polymerase.
HiScribe T7 mRNA Kit met CleanCap Reagent AG	New England Biolab	E2080S	De HiScribe T7 mRNA Kits met CleanCap Reagent AG maken de snelle en gestroomlijnde productie van één of meerdere transcripten mogelijk, met typische opbrengsten van ≥90 μg per reactie,
LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase	New England Biolab	M0534S	LongAmp Hot Start Taq DNA Polymerase biedt uitzonderlijke prestaties bij lange amplicons.
M-MuLV Reverse Transcriptase	New England Biolab	M0253L	M-MuLV Reverse Transcriptase synthetiseert een complementaire DNA-streng beginnend vanaf een primer, gebruikmakend van RNA (cDNA-synthese) of enkelstrengs DNA als template.
Monarch Spin RNA Cleanup Kit (50 μg)	New England Biolab	T2040L	De hoofdfunctie van de Monarch® Spin RNA Cleanup Kit (50 μg) is het zuiveren en concentreren van maximaal 50 μg hoogwaardig RNA uit enzymatische reacties of extractiemengsels.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	New England Biolab	E2621L	NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix maakt naadloze assemblage van meerdere DNA-fragmenten mogelijk, ongeacht de fragmentlengte of compatibiliteit van de uiteinden. Het is nuttig voor de synthetische biologiegemeenschap, evenals voor één-stap klonering van meerdere fragmenten vanwege het gebruiksgemak, de flexibiliteit en het eenvoudige master-mix formaat.
Opti-MEM - Serum-arm medium	Thermo Fisher	31985070	Om de transfectie-efficiëntie van cellen te maximaliseren tijdens de vorming van lipide-payload complexen. Het dient als een geoptimaliseerde, chemisch gedefinieerde omgeving die zoogdiercellen zeer levensvatbaar houdt, terwijl de behoefte aan standaard serumsupplementen wordt verminderd
PBS, pH 7,4	Thermo Fisher	10010023	Het primaire functionele gebruik van fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij pH 7,4 is het handhaven van een stabiele pH en osmotische balans voor zoogdiercellen en biologische moleculen.
PCR-strips	Thermo Fisher	AB0776	Het primaire functionele gebruik van PCR-stripbuisjes (meestal in een 8-strip of 12-strip formaat) is het bevatten van kleine volumes vloeistofreacties tijdens high-throughput thermische cycli.
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Millipore Sigma	P4707-50ML	Het primaire functionele gebruik van Poly-L-Lysine (PLL) Hydrobromide voor celhechting is het coaten van negatief geladen vaste oppervlakken (zoals glas of plastic) om een sterk adhesief, positief geladen substraat te creëren.
Pseudouridine-5´-Triphosphate (Pseudo-UTP- ΨUTP)	New England Biolab	N0433S	Pseudouridine-5´-Triphosphate (Pseudo-UTP) wordt veelvuldig gebruikt om de immunogeniciteit van in vitro getranscribeerd RNA te verminderen.
Ribonucleotide Solution Set	New England Biolab	N0450L	Vier afzonderlijke oplossingen van ATP, GTP, CTP en UTP
ROCK-remmer Y-27632 (Dihydrochloride)	Stem cell technologies	72302	Y-27632 is een celpermeabele, zeer potente en selectieve remmer van Rho-geassocieerde, coiled-coil bevattende proteïnekinase (ROCK). Y-27632 remt zowel ROCK1 (Ki = 220 nM) als ROCK2 (Ki = 300 nM) door te concurreren met ATP voor binding aan de katalytische site
RT-PCR Grade Water	Thermo Fisher	AM9935	Het primaire functionele gebruik van RT-PCR Grade Water (vaak aangeduid als nuclease-vrij water) is om te dienen als ultra-puur oplosmiddel voor gevoelige enzymatische assays waarbij elke contaminatie het monster zou degraderen of de amplificatie zou remmen.
SUPERase·In RNase-remmer	Thermo Fisher	AM2694	SUPERase In RNase-remmer is een eiwitgebaseerde remmer van niet-humane oorsprong die niet-covalent bindt aan en de meest voorkomende en problematische RNases remt, waaronder RNase A, B, C, 1 en T1.
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain	Thermo Fisher	S7563	Het primaire functionele gebruik van SYBR™ Green I Nucleic Acid Gel Stain is het visualiseren en kwantificeren van dubbelstrengs DNA (dsDNA) in agarose- of polyacrylamidegels.
TransIT-mRNA Transfectie Kit	Mirusbio/ Millipore Sigma	MIR 2250	Een hoog-efficiënte transfectiereagens met lage toxiciteit voor groot RNA
TRAPeze Telomerase Detection Kit	Millipore Sigma	S7700	De TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) assay is een veelgebruikte en gevoelige PCR-gebaseerde methode voor het detecteren en meten van telomerase-activiteit in zoogdiercellen en weefselmonsters. Deze omvat drie hoofdstappen: extensie van telomere repeats door telomerase, amplificatie van deze producten met behulp van PCR en daaropvolgende detectie.
Trypsine-EDTA (0,05%), fenolrood	Thermo Fisher	25300054	Om adherente zoogdiercellen los te maken van kweekvaten tijdens routineuze celpassaging (subcultivatie) en oogsten.

Referenties

Millner A, Atilla-Gokcumen GE. Lipid players of cellular senescence. Metabolites. 2020;10(9):339.
Hamsanathan S, Gurkar AU. Lipids as regulators of cellular senescence. Front Physiol. 2022;13:796850.
Das UN. Cell membrane theory of senescence and the role of bioactive lipids in aging and aging-associated diseases and their therapeutic implications. Biomolecules. 2021;11(2):241.
Shin EY, Soung NK, Schwartz MA, Kim EG. Altered endocytosis in cellular senescence. Ageing Res Rev. 2021;68:101332.
Park JS, et al. Down-regulation of amphiphysin-1 is responsible for reduced receptor-mediated endocytosis in senescent cells. FASEB J. 2001;15(9):1625-1627.
Park SC. Functional recovery of senescent cells through restoration of receptor-mediated endocytosis. Mech Ageing Dev. 2002;123(8):917-926.
Stroupe C. This is the end: regulation of Rab7 nucleotide binding in endolysosomal trafficking and autophagy. Front Cell Dev Biol. 2018;6:129.
Curnock R, et al. TFEB-dependent lysosome biogenesis is required for senescence. EMBO J. 2023;42(9):e111241.
Guerrero-Navarro L, Jansen-Durr P, Cavinato M. Age-related lysosomal dysfunctions. Cells. 2022;11(12):1977.
Tan JX, Finkel T. Lysosomes in senescence and aging. EMBO Rep. 2023;24(11):e57265.
Rovira M, et al. The lysosomal proteome of senescent cells contributes to the senescence secretome. Aging Cell. 2022;21(10):e13707.
Kilroy G, Burk DH, Floyd ZE. High-efficiency lipid-based siRNA transfection of adipocytes in suspension. PLoS One. 2009;4(9):e6940.
Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Suppression of RNA recognition by Toll-like receptors: the impact of nucleoside modification and the evolutionary origin of RNA. Immunity. 2005;23(2):165-175.
Freund I, Eigenbrod T, Helm M, Dalpke AH. RNA modifications modulate activation of innate Toll-like receptors. Genes (Basel). 2019;10(2):92.
Chen H, et al. Branched chemically modified poly(A) tails enhance the translation capacity of mRNA. Nat Biotechnol. 2025;43(2):194-203.
Alshehri A, Grabowska A, Stolnik S. Pathways of cellular internalisation of liposome-delivered siRNA and effects on siRNA engagement with target mRNA and silencing in cancer cells. Sci Rep. 2018;8(1):3748.
Paramasivam P, et al. Endosomal escape of delivered mRNA from endosomal recycling tubules visualized at the nanoscale. J Cell Biol. 2022;221(2):e202110137.
Pandey E, Harris EN. Chloroquine and cytosolic galectins affect endosomal escape of antisense oligonucleotides after Stabilin-mediated endocytosis. Mol Ther Nucleic Acids. 2023;33:430-443.
Bettinger T, et al. Peptide-mediated RNA delivery: a novel approach for enhanced transfection of primary and post-mitotic cells. Nucleic Acids Res. 2001;29(18):3882-3891.
Granados-Riveron JT, Aquino-Jarquin G. Engineering of the current nucleoside-modified mRNA-LNP vaccines against SARS-CoV-2. Biomed Pharmacother. 2021;142:111953.
Hou X, Shi J, Xiao Y. mRNA medicine: recent progresses in chemical modification, design, and engineering. Nano Res. 2024;17(10):9015-9030.
Ramunas J, et al. Transient delivery of modified mRNA encoding TERT rapidly extends telomeres in human cells. FASEB J. 2015;29(5):1930-1939.
Majewska J, Krizhanovsky V. Immune surveillance of senescent cells in aging and disease. Nat Aging. 2025;5(8):1415-1424.
Ajoolabady A, et al. Hallmarks and mechanisms of cellular senescence in aging and disease. Cell Death Discov. 2025;11(1):364.
Lin J, et al. RNA and protein degradation in the aging process. Cell Signal. 2025;136:112166.
Anderson BR, et al. Incorporation of pseudouridine into mRNA enhances translation by diminishing PKR activation. Nucleic Acids Res. 2010;38(17):5884-5892.
Sugawara S, et al. RNaseH2A downregulation drives inflammatory gene expression via genomic DNA fragmentation in senescent and cancer cells. Commun Biol. 2022;5(1):1420.
Chatterjee S, Kon E, Sharma P, Peer D. Endosomal escape: a bottleneck for LNP-mediated therapeutics. Proc Natl Acad Sci U S A. 2024;121(11):e2307800120.
Li YY, Tay FR. The epigenetic rejuvenation promise: partial reprogramming as a therapeutic strategy for aging and disease. Ageing Res Rev. 2026;115:103009.
Zhang W, Qu J, Liu GH, Belmonte JCI. The ageing epigenome and its rejuvenation. Nat Rev Mol Cell Biol. 2020;21(3):137-150.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Geoptimaliseerd protocol voor reverse transfectie voor de aflevering van telomerase-mRNA aan vroeg-senescente menselijke fibroblasten

In dit artikel

Samenvatting

Samenvatting

Inleiding

Protocol

Resultaten

Discussie

Openbaarmakingen

Dankbetuigingen

Materialen

Referenties

Herprints en machtigingen

Tags