Geforceerde miR-486-3p overexpressie onderdrukt proliferatie-geassocieerde activiteit, clonogene groei, wondsluiting en Matrigel-traversaal in A549- en H358-longadenocarcinoomcellen. Deze effecten gaan gepaard met een verminderde expressie van WNT5B, DVL1, β-catenin en BCL-2, wat wijst op een in vitro associatie met Wnt-gerelateerde veranderingen zonder directe targeting of causale paden vast te stellen.
Onderzoeksartikel
miR-486-3p onderdrukt maligne fenotypes en is geassocieerd met een verminderde expressie van WNT5B, DVL1 en β-catenine in cellen van longadenocarcinoom
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Longadenocarcinoom (LUAD) is het dominante histologische subtype van niet-kleincellig longcarcinoom en blijft geassocieerd met aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit. Eerdere studies hebben tumoronderdrukkende functies van miR-486-3p in LUAD geïdentificeerd, maar de relatie met expressieveranderingen van WNT5B, DVL1 en β-cathenine is nog niet duidelijk gedefinieerd. Hier werd de basale abundantie van miR-486-3p onderzocht in A549- en H358-LUAD-cellen en vergeleken met die in Beas-2b-bronchiale epitheelcellen, onderhouden onder hun respectievelijke routinescondities. Stabiele miR-486-3p-overexpressiemodellen werden gegenereerd via lentivirale transductie. Celgroei-gerelateerde activiteit, klonogene groei, wondsluiting en het passeren van Matrigel-gecoate membranen werden geëvalueerd met behulp van Cell Counting Kit-8, kolonievormings-, wondgenezings- en Transwell-assays. De eiwitabundantie van WNT5B, DVL1, β-cathenine en BCL-2 werd bepaald via Western blotting, en de mRNA-niveaus van WNT5B, DVL1, CTNNB1 en BCL2 werden aanvullend onderzocht via RT-qPCR. Onder de gebruikte kweekcondities was de abundantie van miR-486-3p lager in A549- en H358-cellen dan in Beas-2b-cellen, en lentivirale transductie leidde tot een stabiele overexpressie in beide LUAD-cellijnen. Geforceerde miR-486-3p-overexpressie reduceerde het CCK-8-signaal, de kolonievorming, de wondsluiting en het passeren van Matrigel-gecoate membranen, en ging gepaard met een lagere eiwitabundantie van WNT5B, DVL1, totaal β-cathenine en BCL-2. RT-qPCR toonde verder een lagere transcriptabundantie van WNT5B, DVL1, CTNNB1 en BCL2 aan in beide LUAD-cellijnen na miR-486-3p-overexpressie. Deze bevindingen ondersteunen een in vitro associatie tussen geforceerde miR-486-3p-expressie, attenuatie van diverse maligne celread-outs en veranderde Wnt-gerelateerde expressie; zij stellen echter geen directe miRNA-targetbinding, pathway-activiteit of een causaal lineair signaleringsmechanisme vast.
Inleiding
Longadenocarcinoom (LUAD) is het meest voorkomende histologische subtype van niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) en draagt wereldwijd aanzienlijk bij aan de morbiditeit en mortaliteit gerelateerd aan longkanker1,2,3,4,5. Moleculaire classificatie en gerichte therapieën hebben de uitkomsten voor geselecteerde patiëntengroepen verbeterd, maar gevorderd LUAD blijft moeilijk te behandelen en is biologisch heterogeen1,2,3,4,5. Het definiëren van regulatoire processen die bijdragen aan het gedrag van maligne cellen blijft daarom relevant voor de ontwikkeling van testbare therapeutische hypothesen.
Wnt-signalering bestaat uit β-catenine-afhankelijke en β-catenine-onafhankelijke takken die proliferatie, overleving, polariteit en motiliteit reguleren6,7,8,9. WNT5B wordt het meest geassocieerd met niet-canonieke signalering, hoewel de biologische effecten variëren afhankelijk van de receptor en de cellulaire context10,11. DVL1 is een cytoplasmatisch signaaltransductie-eiwit dat door verschillende Wnt-takken wordt gedeeld en is gelinkt aan β-catenine-gerelateerd gedrag bij longkanker12. Bijgevolg mogen gelijktijdige veranderingen in WNT5B, DVL1 en β-catenine op zichzelf niet worden geïnterpreteerd als bewijs voor één enkel lineair pad.
Micro-RNA's (miRNA's) zijn korte niet-coderende RNA's die de genexpressie reguleren via sequentie-afhankelijke interacties met doeltranscripten13,14,15. Omdat één miRNA meerdere RNA's kan beïnvloeden, kan een gewijzigde miRNA-hoeveelheid diverse tumor-geassocieerde fenotypes beïnvloeden13,14,15,16,17,18. Diverse miRNA's zijn gekoppeld aan de groei, motiliteit en signalering van longkanker, en crosstalk tussen miRNA's en Wnt-gerelateerde netwerken is beschreven in meerdere kankercontexten16,17,18,19,20.
De MIR486 locus geeft aanleiding tot de mature strengen miR-486-3p en miR-486-5p. miR-486-3p heeft tumoronderdrukkende activiteit getoond bij mondkanker en glioblastoom, terwijl een tumorbevorderend effect is gerapporteerd bij plaveiselcelcarcinoom van de huid21,22,23,24,25. miR-486-3p werd voor de huidige studie geselecteerd via een hypothesegestuurde strategie op basis van de verminderde abundantie in openbare LUAD-data, de eerder gerapporteerde tumoronderdrukkende activiteit in LUAD en bio-informatische voorspellingen die het koppelen aan WNT-gerelateerde kandidaattranscripten. Tomioka et al. demonstreerden tumoronderdrukkende effecten van beide miR-486 strengen in LUAD en identificeerden GINS4 via genoombrede target-screening26. Daarom claimt de huidige studie niet de eerste demonstratie van een antitumorfenotype. In plaats daarvan wordt geëvalueerd of geforceerde miR-486-3p expressie gepaard gaat met veranderingen in de abundantie van WNT5B, DVL1 en β-catenin en met reproduceerbare fenotypische veranderingen in twee LUAD-cellijnen. Deze analyses beoordelen associaties en stellen geen directe targeting, pathway-activiteit of een lineair WNT5B/DVL1/β-catenin mechanisme vast.
Protocol
De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Table of Materials.
Celkweek
Er werd gebruikgemaakt van de humane longadenocarcinoom (LUAD) cellijnen A549 en H358, en de geïmmortaliseerde bronchiale epitheellipse Beas-2b. A549 (KRAS G12S) en H358 (KRAS G12C; STK11-deficiënt) werden geselecteerd als veelgebruikte LUAD-modellen met verschillende KRAS-mutante achtergronden, terwijl Beas-2b werd geïncludeerd als niet-maligne bronchiale epitheliale comparator. A549- en H358-cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium, en Beas-2b-cellen in DMEM; elk medium bevatte 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine. Cellen werden gekweekt bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂. Aangezien de tumorcellijnen en de epitheliale comparatorcellijn in verschillende routinematige media werden onderhouden, werden de basisexpressievergelijkingen tussen de cellijnen met voorzichtigheid geïnterpreteerd.
Lentivirale transductie en selectie van stabiele cellen
Lentivirale vectoren die de hsa-miR-486-3p precursor bevatten (LV-miR-486-3p) of een gescrambelde negatieve controlesequentie (LV-NC) werden gebruikt in een stabiel gain-of-function ontwerp. A549- en H358-cellen werden gezaaid in 6-well platen met 5 × 104 cellen/well en gedurende de nacht gekweekt. De volgende dag werden de cellen blootgesteld aan het lentivirus met een multiplicity of infection (MOI) van 10 in aanwezigheid van 8 µg/mL polybrene. Na 24 u werd het virale inoculum vervangen door vers compleet medium. Getransduceerde cellen werden 7 dagen geselecteerd met 2 µg/mL puromycine. Na selectie kregen de overlevende cellen de tijd om te herstellen en werden ze uitgebreid voor de daaropvolgende moleculaire en functionele assays. Er is geen miR-486-3p inhibitor-arm opgenomen omdat de huidige studie specifiek was ontworpen om de effecten van stabiele geforceerde overexpressie te evalueren.
OPMERKING: De MOI, de blootstellingstijd aan polybrene en de puromycineselectiecondities moeten identiek worden gehouden tussen de LV-NC- en LV-miR-486-3p-groepen om behandelingsgerelateerde verschillen in de cellevensvatbaarheid te minimaliseren.
RT-qPCR
RT-qPCR werd uitgevoerd om de expressieniveaus van miR-486-3p te bepalen en om de efficiëntie van lentivirale overexpressie in A549- en H358-cellen te bevestigen. Totaal RNA werd geïsoleerd met TRIzol-reagens volgens de instructies van de fabrikant. De RNA-concentratie en zuiverheid werden spectrofotometrisch geëvalueerd, waarbij een A260/A280-verhouding van 1,8–2,1 als acceptabel werd beschouwd. Voor mRNA-analyse werd 1 µg totaal RNA omgezet in cDNA via reverse transcriptie met een commerciële cDNA-synthesekit volgens het protocol van de fabrikant. Voor microRNA-analyse werd de cDNA-synthese uitgevoerd met een miRNA-specifieke stem-loop reverse transcriptie-primer. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd in een totaal reactievolume van 20 µL bestaande uit 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, 0,4 µM van elke primer en 2 µL cDNA-template. Het amplificatieprotocol bestond uit een initiële denaturatiestap bij 95 °C gedurende 5 min, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s en annealing/extensie bij 60 °C gedurende 30 s. Vervolgens werd een smeltcurve-analyse uitgevoerd om de amplificatiespecificiteit te verifiëren. U6 klein nucleair RNA diende als interne controle voor miRNA-kwantificering, terwijl GAPDH werd gebruikt als referentiegen voor mRNA-normalisatie. Relatieve expressieniveaus werden bepaald met de 2−ΔΔCq methode.
De miRNA-primersequenties waren als volgt: stem-loop reverse-transcriptieprimer, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; miR-486-3p forward-primer, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; universele reverse-primer, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; U6 forward-primer, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; en U6 reverse-primer, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Primersequenties voor WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 en GAPDH, samen met ampliconlengtes en amplificatie-efficiënties, zijn opgenomen in Tabel 1. mRNA-expressie werd genormaliseerd naar GAPDH, terwijl miR-486-3p-expressie werd genormaliseerd naar U6. Elk experiment omvatte drie onafhankelijke biologische replicaten, met drie technische replicaten per biologisch replicaat.
Western blotting
Na voltooiing van de 7-daagse puromycineselectie en een herstelperiode werden de cellen gelyseerd in RIPA-buffer met proteaseremmers. Proteïneconcentraties werden bepaald met een BCA-proteïne-assay. Gelijke hoeveelheden proteïne (20 µg per lane) werden gescheiden op 10% SDS-PAGE-gels en via wet transfer overgedragen naar PVDF-membranen bij 300 mA gedurende 120 min. De membranen werden 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere melk bereid in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST). De membranen werden overnacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-catenin (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) of β-actin (1:5.000). De fabrikanten en catalogusnummers van alle antilichamen zijn opgenomen in de Tabel van Materialen. Na drie wasbeurten van 10 min met TBST werden de membranen 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met een HRP-geconjugeerd geiten anti-rabbit IgG secundair antilichaam, verdund 1:5.000. De membranen werden vervolgens drie keer gewassen met TBST, waarna de proteïnebanden werden gevisualiseerd met een chemiluminescent substraat en vastgelegd met een gel-documentatie- en imagesysteem. De bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ. De hoeveelheid van elk doeleiwit werd genormaliseerd ten opzichte van het overeenkomstige β-actin-signaal van hetzelfde biologische monster. Alleen belichtingen binnen het lineaire, niet-verzadigde detectiebereik werden gebruikt voor de densitometrische analyse. Er zijn drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd.
Cell Counting Kit-8 assay
A549- en H358-cellen die stabiel waren getransduceerd met LV-NC of LV-miR-486-3p werden gezaaid in 96-wells platen met 1,5 × 104 cellen/well in 100 µL compleet medium. Na een nacht hechten werd het medium vervangen en werd de 0-uurs absorbentie direct gemeten na toevoeging van Cell Counting Kit-8-reagens. Op 0 u, 24 u, 48 u, 72 u en 96 u werd 10 µL reagens per well toegevoegd en 1 u geincubeerd bij 37 °C voordat de absorbentie werd uitgelezen bij 450 nm. Voor de herziene tijdreeksanalyse werd elke groep genormaliseerd naar de eigen 0-uurs waarde voordat de gegevens werden uitgezet. Er werden drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd, waarbij de technische wells binnen elk experiment werden gemiddeld voorafgaand aan de statistische analyse.
Kolonievormingassay
Stabiel geselecteerde A549- en H358-cellen werden klaargezet als enkelcel-suspensies met een concentratie van 5 × 102 cellen/mL. Eén milliliter cel-suspensie werd in elke put van een 6-wells plaat gezaaid, gevolgd door 3 mL compleet medium. De cellen werden 14 dagen gekweekt, waarbij het medium elke 5 dagen werd vervangen. Kolonies werden gewassen met PBS, 20 min gefixeerd met 4% paraformaldehyde, 20 min gekleurd met kristalviolet, gewassen en aan de lucht gedroogd. Kolonies met ten minste 50 cellen werden geteld in ImageJ. Er werden drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd.
OPMERKING: Een uniforme enkelcellige suspensie en minimale verstoring van de plaat tijdens de vestiging van kolonies zijn vereist om kunstmatige clustering van cellen te voorkomen.
Celmigratie-assay
Stabiel getransduceerde A549- en H358-cellen werden uitgezaaid in 6-wells platen en gekweekt tot er een confluente monoclaag was gevormd. Er werd een rechte kras gemaakt met een steriele 10 µL pipetpunt, losgekoekte cellen werden verwijderd en dezelfde gemarkeerde velden werden gefotografeerd op 0 h, 24 h, 48 h en 72 h. Het wondoppervlak werd gemeten in ImageJ en de wondsluiting werd berekend als (oppervlak op 0 h − oppervlak op het aangegeven tijdstip) / oppervlak op 0 h × 100%. Er werden drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd. Er is geen farmacologische proliferatieblokker gebruikt; daarom werd deze assay geïnterpreteerd als een maat voor wondsluiting in plaats van een specifiek resultaat voor migratie.
OPMERKING: Krasjes moeten met een consistente breedte en druk worden gemaakt, en gedurende het gehele tijdverloop moeten dezelfde velden worden gevolgd.
Celinvasie-assay
Transwell-invasie-assays werden uitgevoerd met behulp van polycarbonate membraaninserts van 24 wells met een poriegrootte van 8 µm. Het bovenste oppervlak van elke insert werd gecoat met 100 µL Matrigel basaalmembraanmatrix, verdund 1:8 in serumvrij DMEM tot een geschatte uiteindelijke proteïneconcentratie van 1 mg/mL, en gedurende 4 u geïncubeerd bij 37 °C. A549- en H358-cellen werden geresuspendeerd in serumvrij RPMI-1640-medium bij dichtheden van respectievelijk 8 × 105 cellen/mL en 4 × 105 cellen/mL. Een aliquot van 200 µL van de celsuspensie werd toegevoegd aan de bovenkamer, wat overeenkomt met 1,6 × 105 A549-cellen of 8 × 104 H358-cellen per insert. De onderkamer werd gevuld met 500 µL RPMI-1640-medium met 20% foetaal runderserum als chemoattractant. Na incubatie bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ gedurende 48 u, werden niet-invaderende cellen die op het bovenste oppervlak van het membraan waren gebleven voorzichtig verwijderd met een wattenstaafje. Cellen die door het membraan waren geïnvadeerd, werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 20 min en gekleurd met 0,1% kristalviolet gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Voor elke insert werden vijf willekeurig gekozen microscopische velden gefotografeerd, en het aantal geïnvadeerde cellen werd gekwantificeerd met ImageJ. Het gemiddelde aantal cellen uit de vijf velden werd beschouwd als één waarde per insert, waarbij de insert, in plaats van een individueel microscopisch veld, als experimentele eenheid werd behandeld. Er werden drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd.
OPMERKING: Verwijder de niet-invaderende cellen voorzichtig en consistent om te voorkomen dat het membraan beschadigd raakt of dat cellen die naar het onderste oppervlak zijn gemigreerd, worden losgemaakt.
Statistische analyse
Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, en n staat voor onafhankelijke biologische experimenten, tenzij anders aangegeven. Technische replicaten of meerdere microscopische velden van dezelfde experimentele eenheid werden gemiddeld vóór de inferentiële toetsing. Voor de vergelijking tussen de drie cellijnen werd eenweg-variantieanalyse gevolgd door Tukey-gecorrigeerde paarsgewijze vergelijkingen gebruikt. Voor de CCK-8 en wondsluiting-tijdreeksen werd een tweeweg-variantieanalyse met herhaalde metingen gebruikt om de effecten van behandeling, tijd en de interactie tussen behandeling en tijd te evalueren, gevolgd door Šídák-gecorrigeerde vergelijkingen op individuele tijdstippen. Vergelijkingen tussen twee groepen werden geanalyseerd met tweezijdige ongepaarde Student's t-toetsen. Statistische analyses en datavisualisatie werden uitgevoerd met behulp van software voor statistische analyse en grafieken. Exacte p-waarden worden vermeld in de figuurpanelen of de brongegevenstabellen. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, en ****p < 0,0001.
Resultaten
TCGA/starBase-analyse toont een verminderde abundantie van miR-486-3p in LUAD aan, en TargetScan identificeert potentiële bindingsplaatsen
TCGA-afgeleide expressiegegevens, berekend via starBase v3.0, toonden aan dat miR-486-3p de abundantie was significant lager in 512 longadenocarcinoom-monsters (LUAD) dan in 20 niet-tumorale longmonsters (Wilcoxon rank-sum test, p = 3.2 × 10⁻5; Figuur 1). TargetScanHuman identificeerde een slecht geconserveerde kandidaat 7mer-m8 site voor miR-486-3p op posities 468–474 van de DVL1 3′ niet-vertaalde regio (3′ UTR), met een context++-score van −0,23 en een context++-scorepercentiel van 80. Een slecht geconserveerde kandidaat 8mer-site werd geïdentificeerd op posities 913–920 van de WNT5B 3′ UTR, met een context++-score van −0,46 en een context++-scorepercentiel van 97 (Figuur 2). Deze computationeel voorspelde sites werden gebruikt om de experimentele hypothese op te stellen en werden niet beschouwd als bewijs voor directe miRNA-targetbinding. Bron-URL's zijn opgenomen in Tabel 2.
De abundantie van miR-486-3p is verlaagd in LUAD-cellijnen en neemt merkbaar toe na lentivirale transductie
Onder hun respectievelijke routine-kweekcondities toonde RT-qPCR-analyse aan dat de abundantie van miR-486-3p lager was in A549- en H358-cellen dan in Beas-2b bronchiale epitheelcellen. Tukey-gecorrigeerde vergelijkingen na eenweg-variantieanalyse toonden significante verschillen aan tussen A549- en Beas-2b-cellen (p < 0,01) en tussen H358- en Beas-2b-cellen (p < 0,01; Figuur 3A).
Stabiele transductie met LV-miR-486-3p verhoogde de abundantie van miR-486-3p aanzienlijk ten opzichte van de overeenkomstige LV-NC-groepen. De expressie nam ongeveer 1.470-voudig toe in A549-cellen en 20-voudig in H358-cellen, waarbij beide vergelijkingen statistisch significant waren (p < 0,01; Figuur 3B,C). Deze resultaten bevestigden de succesvolle vestiging van stabiele celmodellen met overexpressie van miR-486-3p.
Geforceerde miR-486-3p-expressie is geassocieerd met een verminderde expressie van WNT5B, DVL1, β-catenin en BCL-2
Western blotting toonde een lagere eiwitovervloed van WNT5B, DVL1, totaal β-catenin en BCL-2 aan in LV-miR-486-3p-getransduceerde cellen dan in de respectievelijke LV-NC controles (Figuur 4A–E). In A549-cellen was geforceerde expressie van miR-486-3p geassocieerd met een verminderde eiwitovervloed van β-catenin (p = 0,02), WNT5B (p = 0,08), DVL1 (p = 0,019) en BCL-2 (p = 0,017). Overeenkomstige reducties werden ook waargenomen in H358-cellen voor β-catenin (p = 0,01), WNT5B (p = 0,002), DVL1 (p = 0,03) en BCL-2 (p = 0,018).
Vervolgens werd RT-qPCR uitgevoerd om vast te stellen of veranderingen op transcriptniveau gepaard gingen met de bevindingen op proteïneniveau (Figuur 4F–I). In A549-cellen reduceerde geforceerde expressie van miR-486-3p CTNNB1 mRNA tot 0,26-voudig ten opzichte van de LV-NC-groep (p = 0,04), WNT5B mRNA tot 0,180-voudig (p = 0,04), DVL1 mRNA tot 0,278-voudig (p = 0,06) en BCL2 mRNA tot 0,259-voudig (p = 0,003).
Vergelijkbare veranderingen op transcriptniveau werden gedetecteerd in H358-cellen. CTNNB1 mRNA werd gereduceerd tot 0,28-voudig ten opzichte van de LV-NC-groep (p = 0,028), WNT5B mRNA tot 0,250-voudig (p = 0,019), DVL1 mRNA tot 0,271-voudig (p = 0,020), en BCL2 mRNA tot 0,534-voudig (p = 0,03). De richting van de veranderingen op transcriptniveau was dus consistent met de overeenkomstige bevindingen op proteïneniveau in beide cellijnen. Deze resultaten tonen gecoördineerde expressieveranderingen aan, maar bewijzen geen directe targeting of de activiteit van een lineair WNT5B/DVL1/β-catenine signaleringsmechanisme.
Geforceerde expressie van miR-486-3p vermindert het met groei geassocieerde CCK-8-signaal
CCK-8-metingen werden genormaliseerd naar de overeenkomstige 0-uurs waarde voor elke experimentele groep. Het genormaliseerde CCK-8-signaal nam in de loop van de tijd toe in zowel LV-NC- als LV-miR-486-3p-getransduceerde cellen, maar over het algemeen werden lagere waarden waargenomen na geforceerde miR-486-3p-expressie (Figuur 5).
In A549-cellen lieten Šídák-gecorrigeerde vergelijkingen na een two-way repeated-measures analyse van variantie significant lagere CCK-8-signalen zien in de LV-miR-486-3p-groep op 24, 48 en 96 u vergeleken met de LV-NC-groep (p < 0,05), terwijl het verschil op 72 u niet statistisch significant was (Figuur 5A). In H358-cellen was het CCK-8-signaal significant lager in de LV-miR-486-3p-groep op 24, 48, 72 en 96 u (p < 0,05; Figuur 5B). Deze bevindingen geven aan dat geforceerde miR-486-3p-expressie de groei-gerelateerde metabole activiteit verminderde, met een consistenter effect gedurende het tijdverloop in H358-cellen.
Geforceerde expressie van miR-486-3p vermindert clonogene groei
Kolonievormingassays werden uitgevoerd om de langetermijn clonogene groei te beoordelen. A549-cellen getransduceerd met LV-miR-486-3p vormden significant minder koloniën dan de overeenkomstige LV-NC-cellen (p = 0,013; Figuur 6A). Een significante afname in het aantal koloniën werd ook waargenomen in H358-cellen (p = 0,06; Figuur 6B). De afname was sterker in H358-cellen dan in A549-cellen, wat aangeeft dat de omvang van het clonogene effect verschilde tussen de twee LUAD-modellen.
Geforceerde expressie van miR-486-3p vermindert wondsluiting
Wondsluiting werd gekwantificeerd op 24 u, 48 u en 72 u na het krassen (Figuur 7). In A549-culturen vertoonde de LV-miR-486-3p-groep een significant lagere wondsluiting dan de LV-NC-groep op 24, 48 en 72 u (p < 0,05 voor elke vergelijking; Figuur 7A,C).
Op soortgelijke wijze was de wondsluiting verminderd in LV-miR-486-3p-getransduceerde H358-culturen na 24 u en 48 u (p < 0,05) en na 72 u (p < 0,01; Figuur 7B,D). Omdat de assay werd uitgevoerd zonder een farmacologische proliferatieremmer, werden deze resultaten geïnterpreteerd als een verminderde wondsluiting in plaats van als bewijs voor een uitsluitend migratiespecifiek effect.
Geforceerde miR-486-3p-expressie vermindert de traverse van Matrigel-gecoate membranen
Het vermogen van de cellen om door Matrigel-gecoate Transwell-membranen te migreren, werd na 48 u geëvalueerd. Er werden significant minder met kristalviolet gekleurde cellen gedetecteerd op het onderste membraanoppervlak in de A549 LV-miR-486-3p groep dan in de A549 LV-NC groep (p = 0,001; Figuur 8A). Een soortgelijke afname werd waargenomen bij H358-cellen (p = 0,07; Figuur 8B).
Voor elk insert werden vijf microscopische velden gemiddeld, en het insert werd beschouwd als de experimentele eenheid. Deze bevindingen tonen een verminderde traverse van met Matrigel gecoate membranen aan na geforceerde expressie van miR-486-3p onder de in deze assay gebruikte condities.
DATABESCHIKBAARHEID:
Alle brondata ten grondslag aan de figuren zijn opgenomen in Aanvullend Bestand 1, inclusief bronbestanden van de database, RT-qPCR-gegevens, ongesneden Western blots, densitometrie-waarden, microscopiebeelden, telgegevens, CCK-8-metingen en bestanden van de statistische analyse.
Figuur 1miR-486-3p-abundantie in LUAD- en normale longmonsters uit TCGA/starBase. Op TCGA gebaseerde expressiedata werden in mei 2026 opgehaald via starBase v3.0 en bevatten 512 monsters van longadenocarcinoom (LUAD) en 20 normale longmonsters. De groepen werden vergeleken met behulp van de Wilcoxon-rangsomtoets (p = 3.2 × 10⁻5). LUAD, longadenocarcinoom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2door TargetScan voorspelde kandidaat-bindingsplaatsen voor miR-486-3p in de DVL1 en WNT5B 3′-UTR's. TargetScanHuman identificeerde een kandidaat 7mer-m8-site op posities 468–474 van de DVL1 3′-onvertaalde regio (3′-UTR) en een kandidaat 8mer-site op posities 913–920 van de WNT5B 3′ UTR. Bron-URL's zijn vermeld in Tabel 2Deze computationele voorspellingen werden gebruikt voor hypothesevorming en vormen geen experimenteel bewijs voor directe binding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3Basisgehalte van miR-486-3p en verificatie van lentivirale overexpressie. (A) RT-qPCR-analyse van miR-486-3p overvloed in A549-, H358- en Beas-2b-cellen die zijn gekweekt in hun respectievelijke routine culturemedia. (B,C) RT-qPCR-verificatie van miR-486-3p overexpressie in A549 (B) en H358 (C) cellen getransduceerd met LV-NC of LV-miR-486-3p. De expressie werd genormaliseerd naar U6. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische experimenten. (A) werd geanalyseerd met een één-weg ANOVA, gevolgd door Tukey-gecorrigeerde meervoudige vergelijkingen. (B,C) werden geanalyseerd met behulp van een tweezijdige ongepaarde Student's U heeft geen brontekst verstrekt om te vertalen. Voer aub de Engelse tekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben.-tests. *p < 0.01; **p < 0.01. LV-NC, negatieve controle lentivirus; RT-qPCR, reverse-transcriptie kwantitatieve PCR; SD, standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4Geforceerde miR-486-3p-expressie is geassocieerd met een verminderde expressie van kandidaatgenen. (A) Representatieve Western blots die de abundantie van β-cathenine, WNT5B, DVL1, BCL-2 en β-actine tonen in A549- en H358-cellen getransduceerd met LV-NC of LV-miR-486-3p. Moleculaire massa's zijn aangegeven in kilodaltons. (B–E) Densitometrische kwantificering van β-catenine (B), WNT5B (C), DVL1 (D), en BCL-2 (E), genormaliseerd naar β-actine. (F–I) RT-qPCR-analyse van CTNNB1 (F), WNT5B (G), DVL1 (H), en BCL2 (I) transcriptovervloed, genormaliseerd naar GAPDHGegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische experimenten; individuele punten representeren onafhankelijke biologische replicaten. Groepen werden vergeleken met behulp van een tweezijdige ongepaarde Student's Het lijkt erop dat u geen tekst heeft ingevoerd om te vertalen. Voer a.u.b. de Engelse brontekst in die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben.-tests. Exact p-waarden en fold changes worden weergegeven in de overeenkomstige panelen. kDa, kilodalton; LV-NC, negatieve-controle lentivirus; RT-qPCR, reverse-transcriptie kwantitatieve PCR; SD, standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5Gedwongen miR-486-3p-expressie vermindert de groeigerelateerde CCK-8-signalen in de loop van de tijd. A549 (A) en H358 (B) cellen die waren getransduceerd met LV-NC of LV-miR-486-3p werden geanalyseerd op 0 u, 24 u, 48 u, 72 u en 96 u. OD450-waarden werden genormaliseerd naar de overeenkomstige waarde op 0 u binnen elke groep. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD uit drie onafhankelijke biologische experimenten. De effecten van de behandeling, de tijd en de interactie tussen behandeling en tijd werden geanalyseerd met een two-way repeated-measures ANOVA, gevolgd door Šídák-gecorrigeerde vergelijkingen tussen groepen op elk tijdstip. *p < 0,05. CCK-8, Cell Counting Kit-8; LV-NC, negatieve-controle lentivirus; OD450, optische dichtheid bij 450 nm; SD, standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6Geforceerde expressie van miR-486-3p vermindert de clonogene groei. Representatieve beelden van de volledige putjes en kwantitatieve kolonietellingen worden getoond voor A549 (A) en H358 (B) cellen getransduceerd met LV-NC of LV-miR-486-3p. Koloniën werden gekwantificeerd met ImageJ met identieke analyse-instellingen voor alle groepen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische experimenten en werden geanalyseerd met behulp van een tweezijdige ongepaarde Student's t-testen. Exact pp-waarden zijn weergegeven in de overeenkomstige panelen. LV-NC, negatieve-controle lentivirus; SD, standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7Geforceerde expressie van miR-486-3p vermindert wondsluiting. Representatieve afbeeldingen en kwantitatieve metingen van de wondsluiting worden getoond voor A549 (A,C) en H358 (B,D) cellen op 0 u, 24 u, 48 u en 72 u na het maken van de kras. De wondsluiting werd als volgt berekend: (wondoppervlak op 0 u − wondoppervlak op het aangegeven tijdstip) / wondoppervlak op 0 u × 10%. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD uit drie onafhankelijke biologische experimenten. De effecten van de behandeling, de tijd en de interactie tussen behandeling en tijd werden geanalyseerd met behulp van een two-way repeated-measures ANOVA, gevolgd door Šídák-gecorrigeerde vergelijkingen tussen groepen op elk tijdstip. Schaalbalken, 200 µm. *p < 0.05; **p < 0,01. LV-NC, negatieve controle lentivirus; SD, standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8Gedwongen miR-486-3p-expressie vermindert de passage door met Matrigel gecoate Transwell-membranen. Representatieve microscopische velden gekleurd met kristalviolet en kwantitatieve celstanden op insertniveau worden getoond voor A549 (A) en H358 (B) cellen getransduceerd met LV-NC of LV-miR-486-3p. Transwell-inserts met een 8-µm poregrootte werden gebruikt. Vijf microscopische velden werden gemiddeld voor elk insert, en elk insert werd behandeld als één experimentele eenheid. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische experimenten en zijn geanalyseerd met behulp van tweezijdige, niet-gepaarde Student's Omdat u geen brontekst heeft verstrekt, kan ik geen vertaling maken. Voer aub de Engelse tekst in die u vertaald wilt hebben naar het Nederlands.-tests. Schaalbalken, 200 µmExact p-waarden zijn weergegeven in de bijbehorende panelen. LV-NC, negatieve-controle lentivirus; SD, standaarddeviatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Gen | Primersequenties | Ampliconlengtes | Amplificatie-efficiënties | |
| WNT5B | Forward: 5'-AAATGCCACGGCGTCTCG-3', | 18 bp | 101% | |
| Omgekeerd: 5'-GGGTGAAGCGGCTGTTGA-3' | ||||
| DVL1 | Voorwaarts: 5'-GAGGGTGCTCACTCGGATG-3', | 158 bp | 95.60% | |
| Omgekeerd: 5'-GTGCCTGTCTCGTTGTCCA-3' | ||||
| CTNNB1 | Voorwaarts: 5'- GCGCCATTTTAAGCCTCG -3', | 140 bp | 96.30% | |
| Omgekeerd: 5'-AAATACCCTCAGGGGAACAGG-3' | ||||
| BCL2 | Voorwaarts: 5'- GTCATGTGGAGAGCGT-3', | 139 bp | 97.20% | |
| Omgekeerde sequentie: 5'-ATAGTTCCACAAAGGCATCC-3' | ||||
| GAPDH | Voorwaarts: 5'-GACTTCAACAGCAACTCCCACTC-3', | 107 bp | 98.30% | |
| Omgekeerd: 5'-TAGCCGTATTCATTGTCATACCAG-3' | ||||
Tabel 1: Primersequenties gebruikt voor RT-qPCR.
| Doelwit | Voorspellingsinformatie | [Geen brontekst opgegeven. Voeg de tekst toe die u wilt laten vertalen.] | ||
| DVL1 | 7mer-m8, posities 468–474 | TargetScan-URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST0397196.2&taxid=9606&leden=miR-486-3p&tooncnc=1& getoondc=1&getoond_nc=1&getoondcf1=1&showncf2=1&subset=1) | ||
| WNT5B | 8mer, posities 913–920 | TargetScan URL (https://www.targetscan.org/cgi-bin/targetscan/vert_80/view_gene.cgi? rs=ENST0378891.5&taxid=9606&leden=miR-486-3p&tooncnc=1& getoondnc=1&shownc_nc=1&getoondcf1=1&getoondcf2=1&subset=1) | ||
Tabel 2: TargetScan-database en bijbehorende URL.
Aanvullend bestand 1: Gegevens ter ondersteuning van de resultaten van deze studie.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
De huidige gain-of-function studie evalueerde de effecten van stabiele, geforceerde miR-486-3p expressie in A549 en H358 longadenocarcinoom (LUAD) cellen. In beide modellen was miR-486-3p overexpressie geassocieerd met verminderde groeigerelateerde CCK-8 signalen, afgenomen clonogene groei, een lagere wondsluiting en minder cellen die door Matrigel-gecoate Transwell-membranen migreerden. Deze fenotypische veranderingen gingen gepaard met een verminderde abundantie van WNT5B, DVL1, totaal β-cathenine en BCL-2 eiwitten, samen met lagere transcriptniveaus van WNT5B, DVL1, CTNNB1 en BCL2. Gezamenlijk ondersteunen deze bevindingen een associatie tussen geforceerde miR-486-3p expressie, attenuatie van verschillende maligne cel-fenotypen en gecoördineerde veranderingen in geselecteerde Wnt-gerelateerde moleculen. Ze stellen echter geen directe miRNA-doelbinding, pathway-activiteit of een causale signaleringssequentie vast.
Het algemene tumorsuppressieve fenotype dat in deze studie is waargenomen, is consistent met eerdere rapporten en dient niet te worden geïnterpreteerd als de belangrijkste nieuwe bevinding. Tomioka et al. hebben eerder aangetoond dat zowel miR-486-3p als miR-486-5p maligne fenotypen in LUAD-cellen onderdrukken en hebben GINS4 geïdentificeerd via een onbevooroordeelde target-screeningstrategie26. De bijdrage van de huidige studie is specifieker: geforceerde expressie van miR-486-3p ging gepaard met reducties in de abundantie van WNT5B, DVL1 en β-catenin in twee LUAD-celmodellen. Daarnaast biedt de studie een geïntegreerde experimentele workflow die stabiele lentivirale transductie, RT-qPCR, Western blotting, CCK-8-analyse, colony formation, wound closure en Matrigel-gecoate Transwell-assays combineert. Dit onderscheid is belangrijk omdat het huidige werk de moleculaire observaties geassocieerd met miR-486-3p-overexpressie uitbreidt, zonder te claimen de eerste demonstratie van de antitumoractiviteit in LUAD te zijn.
De bevindingen met betrekking tot Wnt vereisen een voorzichtige interpretatie. WNT5B wordt gewoonlijk beschreven als een niet-canonieke Wnt-ligand en kan, afhankelijk van de receptor en de context, de planaire celpolariteit- of Wnt/Ca2⁺-signalering activeren. In sommige cellulaire omgevingen kan niet-canonieke Wnt-signalering ook de β-cathenine-afhankelijke signalering antagoniseren10,11. DVL1 is een gedeelde intracellulaire mediator die kan deelnemen aan zowel canonieke als niet-canonieke Wnt-signalering en is geassocieerd met β-cathenine-gerelateerde fenotypes bij niet-kleincellig longcarcinoom12. Daarom bewijst de gelijktijdige afname van WNT5B, DVL1 en totaal β-cathenine geen lineaire WNT5B→DVL1→β-cathenine-route. De huidige gegevens wijzen in plaats daarvan op gelijktijdige afnames in de expressie van WNT5B en in de hoeveelheid DVL1 en β-cathenine na geforceerde expressie van miR-486-3p.
De resultaten op transcriptniveau waren in dezelfde richting consistent met de bevindingen van de Western blot. Geforceerde expressie van miR-486-3p verminderde de abundantie van de transcripten van WNT5B, DVL1 en CTNNB1 in zowel A549- als H358-cellen. Deze overeenstemming suggereert dat de geobserveerde eiwitveranderingen mogelijk gepaard gaan met een gewijzigde transcriptabundantie, in plaats van dat ze uitsluitend het resultaat zijn van veranderingen in de eiwitstabiliteit. Desondanks bewijzen verminderde transcript- en eiwitniveaus geen directe binding van miR-486-3p aan de voorspelde 3′ niet-vertaalde regio's. Dual-luciferase reporter-assays met wild-type en gemuteerde bindingsplaatsen, samen met rescue-experimenten, zouden nodig zijn om te bepalen of WNT5B of DVL1 direct wordt gereguleerd door miR-486-3p. Op dezelfde manier wijst de afname van de BCL-2-abundantie op een wijziging in een overlevingsgeassocieerd eiwit, maar kan dit, bij afwezigheid van gevalideerde assays voor celdood, niet worden geïnterpreteerd als bewijs voor verhoogde apoptose.
De functionele assays hebben ook assay-specifieke beperkingen. CCK-8 meet de cellulaire metabole activiteit in plaats van het direct bepalen van het aantal cellen, en veranderingen in de absorptie kunnen wijzen op veranderingen in de proliferatie, het metabolisme of de levensvatbaarheid. Kolonievorming biedt een maatstaf voor de clonogene capaciteit op langere termijn, maar de omvang van het effect verschilde tussen de twee cellijnen, met een bescheiden afname in A549-cellen en een grotere afname in H358-cellen. Dit verschil suggereert dat de respons op geforceerde miR-486-3p-expressie kan afhangen van de moleculaire en cellulaire context.
Een verminderde wondsluiting werd waargenomen in beide cellijnen, maar er werd geen proliferatieremmer gebruikt tijdens de assay. Omdat geforceerde miR-486-3p-expressie ook invloed had op groeigerelateerde metingen, kan een verminderde proliferatie hebben bijgedragen aan het fenotype van de wondsluiting. De bevindingen moeten daarom worden geïnterpreteerd als een verminderde wondsluiting in plaats van als een migratiespecifiek effect. Op dezelfde manier kan de 48-uurs Matrigel-gecoate Transwell-assay beïnvloed zijn door verschillen in membraanpassage, proliferatie, overleving of adhesie. De waargenomen afname van cellen op het onderste membraanoppervlak ondersteunt bijgevolg een belemmerde passage onder de geteste condities, maar isoleert geen specifiek invasiemechanisme.
Een aanvullende overweging is de omvang van de miR-486-3p-overexpressie. Lentivirale transductie verhoogde de abundantie van miR-486-3p met ongeveer 1.470-voudig in A549-cellen en 220-voudig in H358-cellen ten opzichte van de overeenkomstige controlegroepen. Een dergelijke suprafysiologische expressie kan de seed-afhankelijke off-target repressie verhogen, de beschikbaarheid van componenten van het RNA-induced silencing complex beïnvloeden of aspecifieke cellulaire stress induceren. Omdat er geen dosis-responsreeks is uitgevoerd, kon de relatie tussen de abundantie van miR-486-3p en de waargenomen fenotypes niet worden gedefinieerd. Bovendien verhindert de afwezigheid van een inhibitor-gebaseerd loss-of-function experiment conclusies over de endogene fysiologische rol van miR-486-3p in LUAD-cellen. De huidige resultaten moeten daarom specifiek worden geïnterpreteerd als de gevolgen van stabiele, geforceerde overexpressie.
Er moeten enkele beperkingen in overweging worden genomen. Er zijn slechts twee KRAS-mutante LUAD-cellijnen onderzocht, en het gebruik van verschillende routine-media beperkt de interpretatie van vergelijkingen met Beas-2b-cellen. Er is tijdens de studie geen authenticatie van de cellijnen of mycoplasmatest uitgevoerd, en U6 werd gebruikt als enige referentie voor de kwantificering van miR-486-3p. De studie miste bovendien loss-of-function-, dosis-respons-, reporter-, rescue- en functionele Wnt-signaalroute-assays. Daarnaast kunnen de resultaten van de wondsluiting en Transwell-assays beïnvloed zijn door verschillen in proliferatie, levensvatbaarheid of adhesie. Tot slot zijn er geen diermodellen, patiëntmonsters of klinische validatiecohorten opgenomen. Daarom zijn de bevindingen beperkt tot dit systeem van geforceerde expressie in vitro en stellen ze geen directe targeting, causale verbanden in de signaalroute of klinisch nut vast.
Concluderend verminderde een stabiele geforceerde expressie van miR-486-3p verschillende groeimetingen en mobiliteitsmetingen in A549- en H358-LUAD-cellen, wat gepaard ging met een lagere expressie van WNT5B, DVL1, totaal β-catenin en BCL-2. Deze bevindingen bieden een basis voor verder mechanistisch onderzoek, maar stellen WNT5B of DVL1 niet vast als directe targets, noch een lineair WNT5B/DVL1/β-catenin-pad, of de klinische waarde van miR-486-3p.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Dankbetuigingen
Het Zhejiang Provincial Medical and Health Science and Technology Plan (2025KY349) en de Jiaxing City Key Supporting Discipline (2023-zc-014) boden financiële ondersteuning voor deze studie.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | Bereiding van SDS-PAGE stapelgel |
| 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | Bereiding van SDS-PAGE scheidingsgel |
| 20× TBS-buffer | Solarbio | 71080 | Voorraadbuffer voor western blot wassing en antilichaamverdunning |
| 30% acrylamide/bis-acrylamide oplossing (29:1) | Solarbio | A1010 | Bereiding van SDS-PAGE gels |
| 4% paraformaldehyde fixatief | Servicebio | G1101 | Fixatie voor colony-formation en Transwell assays |
| 5× eiwitlaadbuffer | Beyotime | P0015 | Eiwitmonsterbereiding voor SDS-PAGE |
| Ammoniumpersulfaat | Solarbio | 427A038 | Polymerisatie-initiator voor SDS-PAGE gel |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0009-1 | Bepaling van eiwitconcentratie |
| BCL-2 antilichaam | Boster Biological Technology | A00040-2 | Konijn polyclonaal antilichaam; western blotting bij 1:5.000 |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Metabole activiteitsassay geassocieerd met celgroei; 10 μL per 100 μL cultuurmedium |
| Chemiluminescentie-beeldvormingssysteem | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Western blot beeldvorming |
| Chloroform | Servicebio | G3005 | Fasescheiding tijdens TRIzol-gebaseerde RNA-extractie |
| Kristalviolet kleuringsoplossing | Servicebio | G1014 | Kleuring van kolonies en Transwell-membraan |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Routine cultuurmedium voor Beas-2b cellen |
| DVL1 antilichaam | Signalway Antibody | 53180 | Konijn primair antilichaam; western blotting bij 1:5.000 |
| Foetaal runderserum (FBS) | Biosharp | BL203B | 10% (v/v) supplement voor routine celkweek; 20% (v/v) in de onderste Transwell-kamer |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | Grafiekbereiding en statistische analyse |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | SYBR Green-gebaseerde kwantitatieve PCR |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Reverse transcriptie voor mRNA RT-qPCR |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22.0 | Statistische analyse |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.53 | Western blot densitometrie, meting van wondoppervlak, colony counting en Transwell celcounting |
| Omgekeerde microscoop | Olympus | CKX53 | Beeldvorming van wound-healing en Transwell assays |
| Isopropanol | Servicebio | G3006 | RNA-precipitatie tijdens TRIzol-gebaseerde extractie |
| LV-miR-486-3p en LV-NC lentivirale preparaten | GenePharma | Custom synthesis | Stabiele miR-486-3p overexpressievector en scrambled negatieve-controlevector |
| Matrigel basaalmembraanmatrix | Corning | 354234 | Verdund 1:8 in serumvrij DMEM; uiteindelijke eiwitconcentratie van ongeveer 1 mg/mL |
| Methanol | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | PVDF-membraanactivatie |
| Microplaatlezer | BioTek | ELx800 | Meting van absorptie bij 450 nm |
| Microvolume UV-Vis spectrofotometer | Allsheng | Nano-600 | RNA-concentratie en A260/A280 zuiverheidsbeoordeling |
| Penicilline-streptomycine | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% (v/v) supplement voor routine celkweek |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Servicebio | G0002 | Wassen van cellen en membranen |
| Proteaseremmer-cocktail | APExBIO | K1007 | Toegevoegd aan RIPA lysisbuffer |
| Eiwitladder | Biosharp | BL712A | Moleculaire gewichtsreferentie voor western blotting |
| PVDF-membraan | Millipore | K2MA8350E | Eiwittransfermembraan voor western blotting |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR Systeem | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | RT-qPCR data-acquisitie |
| RIPA lysisbuffer | Beyotime | P0013B | Totale cellulaire eiwitextractie |
| RNA-extractie-reagens (TRIzol-type) | Servicebio | G3013 | Totale RNA-extractie |
| RPMI 1640 medium | Servicebio | G4510 | Routine cultuurmedium voor A549 en H358 cellen en serumvrije Transwell celsuspensie |
| SDS | Solarbio | S8010 | SDS-PAGE reagens |
| Magere melkpoeder | BD | 2271470 | 5% blokkeringsoplossing voor western blotting |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | TCGA-afgeleide miR-486-3p expressieanalyse |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Voorspelling van kandidaat miR-486-3p bindingsplaatsen |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Polymerisatiekatalysator voor SDS-PAGE gel |
| Transwell inserts, 24-well, 8 μm poriegrootte | Corning | 3428 | Matrigel-gecoate membraantraverseringsassay |
| Trypsine | Servicebio | G4000 | Celdetachement |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Bereiding van western blot wasbuffer |
| Verticale elektroforese-systeem | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | SDS-PAGE eiwitscheiding |
| Western HRP substraat luminol reagens | Affinity Biosciences | KF001 | Chemiluminescente western blot detectie |
| Wet transfer systeem | Bio-Rad | 1703930 | Eiwittransfer naar PVDF-membraan |
| WNT5B antilichaam | Signalway Antibody | 56808 | Konijn primair antilichaam; western blotting bij 1:5.000 |
| β-actine antilichaam | Abcam | ab8227 | Laadcontrole; western blotting bij 1:5.000 |
| β-catenine antilichaam | Signalway Antibody | 21725 | Konijn primair antilichaam; western blotting bij 1:5.000 |
Referenties
- Herbst RS, Heymach JV, Lippman SM. Lung cancer. N Engl J Med. 2008;359(13):1367-1380.
- Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer statistics, 2019. CA Cancer J Clin. 2019;69(1):7-34.
- Han B, et al. Cancer incidence and mortality in China, 2022. J Natl Cancer Cent. 2024;4(1):47-53.
- Lin JJ, et al. Five-year survival in EGFR-mutant metastatic lung adenocarcinoma treated with EGFR-TKIs. J Thorac Oncol. 2016;11(4):556-565.
- She J, Yang P, Hong Q, Bai C. Lung cancer in China: challenges and interventions. Chest. 2013;143(4):1117-1126.
- Barker N, Clevers H. Mining the Wnt pathway for cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 2006;5(12):997-1014.
- Komiya Y, Habas R. Wnt signal transduction pathways. Organogenesis. 2008;4(2):68-75.
- Stewart DJ. Wnt signaling pathway in non-small cell lung cancer. J Natl Cancer Inst. 2014;106(1):djt356.
- Zhang Z, et al. Wnt/β-catenin signaling in the development and therapeutic resistance of non-small cell lung cancer. J Transl Med. 2024;22(1):565.
- Zhang Q, et al. WNT5B exerts oncogenic effects and is negatively regulated by miR-5587-3p in lung adenocarcinoma progression. Oncogene. 2020;39(7):1484-1497.
- Suthon S, et al. WNT5B in physiology and disease. Front Cell Dev Biol. 2021;9:667581.
- Ji H, et al. SPATA2 suppresses epithelial-mesenchymal transition to inhibit metastasis and radiotherapy sensitivity in non-small cell lung cancer via. impairing DVL1/β-catenin signaling. Thorac Cancer. 2023;14(11):969-982.
- Wang Y, Wang L, Chen C, Chu X. New insights into the regulatory role of microRNA in tumor angiogenesis and clinical implications. Mol Cancer. 2018;17(1):22.
- Iqbal MA, Arora S, Prakasam G, Calin GA, Syed MA. MicroRNA in lung cancer: role, mechanisms, pathways and therapeutic relevance. Mol Aspects Med. 2019;70:3-20.
- Lee YS, Dutta A. MicroRNAs in cancer. Annu Rev Pathol. 2009;4:199-227.
- Lin G, et al. MiR-26a enhances invasive capacity by suppressing GSK3β in human lung cancer cells. Exp Cell Res. 2017;352(2):364-374.
- Jiang W, et al. MicroRNA-1258 suppresses tumor progression via. GRB2/Ras/Erk pathway in non-small-cell lung cancer. Cell Prolif. 2018;51(6):e12502.
- Xie Y, Xue C, Guo S, Yang L. MicroRNA-520a suppresses pathogenesis and progression of non-small-cell lung cancer through targeting the RRM2/Wnt axis. Anal Cell Pathol (Amst). 2021;2021:9652420.
- Peng Y, Zhang X, Feng X, Fan X, Jin Z. The crosstalk between microRNAs and the Wnt/β-catenin signaling pathway in cancer. Oncotarget. 2017;8(8):14089-14106.
- Wang X, et al. MiR-214 inhibits cell growth in hepatocellular carcinoma through suppression of β-catenin. Biochem Biophys Res Commun. 2012;428(4):525-531.
- Lulli V, et al. MicroRNA-486-3p regulates γ-globin expression in human erythroid cells by directly modulating BCL11A. PLoS One. 2013;8(4):e60436.
- Chou ST, et al. MicroRNA-486-3p functions as a tumor suppressor in oral cancer by targeting DDR1. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):281.
- Wu H, et al. Overexpression of miR-486-3p promoted by allicin enhances temozolomide sensitivity in glioblastoma via. targeting MGMT. Neuromolecular Med. 2020;22(3):359-369.
- Garajei A, et al. Evaluation of the expression of miR-486-3p, miR-548-3p, miR-561-5p and miR-509-5p in tumor biopsies of patients with oral squamous cell carcinoma. Pathogens. 2022;11(2):211.
- Li X, et al. MicroRNA-486-3p promotes the proliferation and metastasis of cutaneous squamous cell carcinoma by suppressing flotillin-2. J Dermatol Sci. 2022;105(1):18-26.
- Tomioka Y, et al. The molecular pathogenesis of tumor-suppressive miR-486-5p and miR-486-3p target genes: GINS4 facilitates aggressiveness in lung adenocarcinoma. Cancers (Basel). 2023;15(13):3408.