Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
Geforceerde miR-486-3p overexpressie onderdrukt proliferatie-geassocieerde activiteit, clonogene groei, wondsluiting en Matrigel-traversaal in A549- en H358-longadenocarcinoomcellen. Deze effecten gaan gepaard met een verminderde expressie van WNT5B, DVL1, β-catenin en BCL-2, wat wijst op een in vitro associatie met Wnt-gerelateerde veranderingen zonder directe targeting of causale paden vast te stellen.
Longadenocarcinoom (LUAD) is het dominante histologische subtype van niet-kleincellig longcarcinoom en blijft geassocieerd met aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit. Eerdere studies hebben tumoronderdrukkende functies van miR-486-3p in LUAD geïdentificeerd, maar de relatie met expressieveranderingen van WNT5B, DVL1 en β-cathenine is nog niet duidelijk gedefinieerd. Hier werd de basale abundantie van miR-486-3p onderzocht in A549- en H358-LUAD-cellen en vergeleken met die in Beas-2b-bronchiale epitheelcellen, onderhouden onder hun respectievelijke routinescondities. Stabiele miR-486-3p-overexpressiemodellen werden gegenereerd via lentivirale transductie. Celgroei-gerelateerde activiteit, klonogene groei, wondsluiting en het passeren van Matrigel-gecoate membranen werden geëvalueerd met behulp van Cell Counting Kit-8, kolonievormings-, wondgenezings- en Transwell-assays. De eiwitabundantie van WNT5B, DVL1, β-cathenine en BCL-2 werd bepaald via Western blotting, en de mRNA-niveaus van WNT5B, DVL1, CTNNB1 en BCL2 werden aanvullend onderzocht via RT-qPCR. Onder de gebruikte kweekcondities was de abundantie van miR-486-3p lager in A549- en H358-cellen dan in Beas-2b-cellen, en lentivirale transductie leidde tot een stabiele overexpressie in beide LUAD-cellijnen. Geforceerde miR-486-3p-overexpressie reduceerde het CCK-8-signaal, de kolonievorming, de wondsluiting en het passeren van Matrigel-gecoate membranen, en ging gepaard met een lagere eiwitabundantie van WNT5B, DVL1, totaal β-cathenine en BCL-2. RT-qPCR toonde verder een lagere transcriptabundantie van WNT5B, DVL1, CTNNB1 en BCL2 aan in beide LUAD-cellijnen na miR-486-3p-overexpressie. Deze bevindingen ondersteunen een in vitro associatie tussen geforceerde miR-486-3p-expressie, attenuatie van diverse maligne celread-outs en veranderde Wnt-gerelateerde expressie; zij stellen echter geen directe miRNA-targetbinding, pathway-activiteit of een causaal lineair signaleringsmechanisme vast.
Longadenocarcinoom (LUAD) is het meest voorkomende histologische subtype van niet-kleincellig longcarcinoom (NSCLC) en draagt wereldwijd aanzienlijk bij aan de morbiditeit en mortaliteit gerelateerd aan longkanker1,2,3,4,5. Moleculaire classificatie en gerichte therapieën hebben de uitkomsten voor geselecteerde patiëntengroepen verbeterd, maar gevorderd LUAD blijft moeilijk te behandelen en is biologisch heterogeen1,2,3,4,5. Het definiëren van regulatoire processen die bijdragen aan het gedrag van maligne cellen blijft daarom relevant voor de ontwikkeling van testbare therapeutische hypothesen.
Wnt-signalering bestaat uit β-catenine-afhankelijke en β-catenine-onafhankelijke takken die proliferatie, overleving, polariteit en motiliteit reguleren6,7,8,9. WNT5B wordt het meest geassocieerd met niet-canonieke signalering, hoewel de biologische effecten variëren afhankelijk van de receptor en de cellulaire context10,11. DVL1 is een cytoplasmatisch signaaltransductie-eiwit dat door verschillende Wnt-takken wordt gedeeld en is gelinkt aan β-catenine-gerelateerd gedrag bij longkanker12. Bijgevolg mogen gelijktijdige veranderingen in WNT5B, DVL1 en β-catenine op zichzelf niet worden geïnterpreteerd als bewijs voor één enkel lineair pad.
Micro-RNA's (miRNA's) zijn korte niet-coderende RNA's die de genexpressie reguleren via sequentie-afhankelijke interacties met doeltranscripten13,14,15. Omdat één miRNA meerdere RNA's kan beïnvloeden, kan een gewijzigde miRNA-hoeveelheid diverse tumor-geassocieerde fenotypes beïnvloeden13,14,15,16,17,18. Diverse miRNA's zijn gekoppeld aan de groei, motiliteit en signalering van longkanker, en crosstalk tussen miRNA's en Wnt-gerelateerde netwerken is beschreven in meerdere kankercontexten16,17,18,19,20.
De MIR486 locus geeft aanleiding tot de mature strengen miR-486-3p en miR-486-5p. miR-486-3p heeft tumoronderdrukkende activiteit getoond bij mondkanker en glioblastoom, terwijl een tumorbevorderend effect is gerapporteerd bij plaveiselcelcarcinoom van de huid21,22,23,24,25. miR-486-3p werd voor de huidige studie geselecteerd via een hypothesegestuurde strategie op basis van de verminderde abundantie in openbare LUAD-data, de eerder gerapporteerde tumoronderdrukkende activiteit in LUAD en bio-informatische voorspellingen die het koppelen aan WNT-gerelateerde kandidaattranscripten. Tomioka et al. demonstreerden tumoronderdrukkende effecten van beide miR-486 strengen in LUAD en identificeerden GINS4 via genoombrede target-screening26. Daarom claimt de huidige studie niet de eerste demonstratie van een antitumorfenotype. In plaats daarvan wordt geëvalueerd of geforceerde miR-486-3p expressie gepaard gaat met veranderingen in de abundantie van WNT5B, DVL1 en β-catenin en met reproduceerbare fenotypische veranderingen in twee LUAD-cellijnen. Deze analyses beoordelen associaties en stellen geen directe targeting, pathway-activiteit of een lineair WNT5B/DVL1/β-catenin mechanisme vast.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Table of Materials.
Celkweek
Er werd gebruikgemaakt van de humane longadenocarcinoom (LUAD) cellijnen A549 en H358, en de geïmmortaliseerde bronchiale epitheellipse Beas-2b. A549 (KRAS G12S) en H358 (KRAS G12C; STK11-deficiënt) werden geselecteerd als veelgebruikte LUAD-modellen met verschillende KRAS-mutante achtergronden, terwijl Beas-2b werd geïncludeerd als niet-maligne bronchiale epitheliale comparator. A549- en H358-cellen werden gekweekt in RPMI-1640 medium, en Beas-2b-cellen in DMEM; elk medium bevatte 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine. Cellen werden gekweekt bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂. Aangezien de tumorcellijnen en de epitheliale comparatorcellijn in verschillende routinematige media werden onderhouden, werden de basisexpressievergelijkingen tussen de cellijnen met voorzichtigheid geïnterpreteerd.
Lentivirale transductie en selectie van stabiele cellen
Lentivirale vectoren die de hsa-miR-486-3p precursor bevatten (LV-miR-486-3p) of een gescrambelde negatieve controlesequentie (LV-NC) werden gebruikt in een stabiel gain-of-function ontwerp. A549- en H358-cellen werden gezaaid in 6-well platen met 5 × 104 cellen/well en gedurende de nacht gekweekt. De volgende dag werden de cellen blootgesteld aan het lentivirus met een multiplicity of infection (MOI) van 10 in aanwezigheid van 8 µg/mL polybrene. Na 24 u werd het virale inoculum vervangen door vers compleet medium. Getransduceerde cellen werden 7 dagen geselecteerd met 2 µg/mL puromycine. Na selectie kregen de overlevende cellen de tijd om te herstellen en werden ze uitgebreid voor de daaropvolgende moleculaire en functionele assays. Er is geen miR-486-3p inhibitor-arm opgenomen omdat de huidige studie specifiek was ontworpen om de effecten van stabiele geforceerde overexpressie te evalueren.
OPMERKING: De MOI, de blootstellingstijd aan polybrene en de puromycineselectiecondities moeten identiek worden gehouden tussen de LV-NC- en LV-miR-486-3p-groepen om behandelingsgerelateerde verschillen in de cellevensvatbaarheid te minimaliseren.
RT-qPCR
RT-qPCR werd uitgevoerd om de expressieniveaus van miR-486-3p te bepalen en om de efficiëntie van lentivirale overexpressie in A549- en H358-cellen te bevestigen. Totaal RNA werd geïsoleerd met TRIzol-reagens volgens de instructies van de fabrikant. De RNA-concentratie en zuiverheid werden spectrofotometrisch geëvalueerd, waarbij een A260/A280-verhouding van 1,8–2,1 als acceptabel werd beschouwd. Voor mRNA-analyse werd 1 µg totaal RNA omgezet in cDNA via reverse transcriptie met een commerciële cDNA-synthesekit volgens het protocol van de fabrikant. Voor microRNA-analyse werd de cDNA-synthese uitgevoerd met een miRNA-specifieke stem-loop reverse transcriptie-primer. Kwantitatieve PCR werd uitgevoerd in een totaal reactievolume van 20 µL bestaande uit 10 µL 2× SYBR Green Master Mix, 0,4 µM van elke primer en 2 µL cDNA-template. Het amplificatieprotocol bestond uit een initiële denaturatiestap bij 95 °C gedurende 5 min, gevolgd door 40 cycli van denaturatie bij 95 °C gedurende 10 s en annealing/extensie bij 60 °C gedurende 30 s. Vervolgens werd een smeltcurve-analyse uitgevoerd om de amplificatiespecificiteit te verifiëren. U6 klein nucleair RNA diende als interne controle voor miRNA-kwantificering, terwijl GAPDH werd gebruikt als referentiegen voor mRNA-normalisatie. Relatieve expressieniveaus werden bepaald met de 2−ΔΔCq methode.
De miRNA-primersequenties waren als volgt: stem-loop reverse-transcriptieprimer, 5′-GTCGTATCGACTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCAGTCGATACGAC
ATCCTG-3′; miR-486-3p forward-primer, 5′-CGCGGGGCAGCTCAGTA-3′; universele reverse-primer, 5′-ACTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′; U6 forward-primer, 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′; en U6 reverse-primer, 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′. Primersequenties voor WNT5B, DVL1, CTNNB1, BCL2 en GAPDH, samen met ampliconlengtes en amplificatie-efficiënties, zijn opgenomen in Tabel 1. mRNA-expressie werd genormaliseerd naar GAPDH, terwijl miR-486-3p-expressie werd genormaliseerd naar U6. Elk experiment omvatte drie onafhankelijke biologische replicaten, met drie technische replicaten per biologisch replicaat.
Western blotting
Na voltooiing van de 7-daagse puromycineselectie en een herstelperiode werden de cellen gelyseerd in RIPA-buffer met proteaseremmers. Proteïneconcentraties werden bepaald met een BCA-proteïne-assay. Gelijke hoeveelheden proteïne (20 µg per lane) werden gescheiden op 10% SDS-PAGE-gels en via wet transfer overgedragen naar PVDF-membranen bij 300 mA gedurende 120 min. De membranen werden 1 uur bij kamertemperatuur geblokkeerd met 5% magere melk bereid in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST). De membranen werden overnacht bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen tegen WNT5B (1:1.000), DVL1 (1:1.000), β-catenin (1:1.000), BCL-2 (0,5 µg/mL) of β-actin (1:5.000). De fabrikanten en catalogusnummers van alle antilichamen zijn opgenomen in de Tabel van Materialen. Na drie wasbeurten van 10 min met TBST werden de membranen 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met een HRP-geconjugeerd geiten anti-rabbit IgG secundair antilichaam, verdund 1:5.000. De membranen werden vervolgens drie keer gewassen met TBST, waarna de proteïnebanden werden gevisualiseerd met een chemiluminescent substraat en vastgelegd met een gel-documentatie- en imagesysteem. De bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ. De hoeveelheid van elk doeleiwit werd genormaliseerd ten opzichte van het overeenkomstige β-actin-signaal van hetzelfde biologische monster. Alleen belichtingen binnen het lineaire, niet-verzadigde detectiebereik werden gebruikt voor de densitometrische analyse. Er zijn drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd.
Cell Counting Kit-8 assay
A549- en H358-cellen die stabiel waren getransduceerd met LV-NC of LV-miR-486-3p werden gezaaid in 96-wells platen met 1,5 × 104 cellen/well in 100 µL compleet medium. Na een nacht hechten werd het medium vervangen en werd de 0-uurs absorbentie direct gemeten na toevoeging van Cell Counting Kit-8-reagens. Op 0 u, 24 u, 48 u, 72 u en 96 u werd 10 µL reagens per well toegevoegd en 1 u geincubeerd bij 37 °C voordat de absorbentie werd uitgelezen bij 450 nm. Voor de herziene tijdreeksanalyse werd elke groep genormaliseerd naar de eigen 0-uurs waarde voordat de gegevens werden uitgezet. Er werden drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd, waarbij de technische wells binnen elk experiment werden gemiddeld voorafgaand aan de statistische analyse.
Kolonievormingassay
Stabiel geselecteerde A549- en H358-cellen werden klaargezet als enkelcel-suspensies met een concentratie van 5 × 102 cellen/mL. Eén milliliter cel-suspensie werd in elke put van een 6-wells plaat gezaaid, gevolgd door 3 mL compleet medium. De cellen werden 14 dagen gekweekt, waarbij het medium elke 5 dagen werd vervangen. Kolonies werden gewassen met PBS, 20 min gefixeerd met 4% paraformaldehyde, 20 min gekleurd met kristalviolet, gewassen en aan de lucht gedroogd. Kolonies met ten minste 50 cellen werden geteld in ImageJ. Er werden drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd.
OPMERKING: Een uniforme enkelcellige suspensie en minimale verstoring van de plaat tijdens de vestiging van kolonies zijn vereist om kunstmatige clustering van cellen te voorkomen.
Celmigratie-assay
Stabiel getransduceerde A549- en H358-cellen werden uitgezaaid in 6-wells platen en gekweekt tot er een confluente monoclaag was gevormd. Er werd een rechte kras gemaakt met een steriele 10 µL pipetpunt, losgekoekte cellen werden verwijderd en dezelfde gemarkeerde velden werden gefotografeerd op 0 h, 24 h, 48 h en 72 h. Het wondoppervlak werd gemeten in ImageJ en de wondsluiting werd berekend als (oppervlak op 0 h − oppervlak op het aangegeven tijdstip) / oppervlak op 0 h × 100%. Er werden drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd. Er is geen farmacologische proliferatieblokker gebruikt; daarom werd deze assay geïnterpreteerd als een maat voor wondsluiting in plaats van een specifiek resultaat voor migratie.
OPMERKING: Krasjes moeten met een consistente breedte en druk worden gemaakt, en gedurende het gehele tijdverloop moeten dezelfde velden worden gevolgd.
Celinvasie-assay
Transwell-invasie-assays werden uitgevoerd met behulp van polycarbonate membraaninserts van 24 wells met een poriegrootte van 8 µm. Het bovenste oppervlak van elke insert werd gecoat met 100 µL Matrigel basaalmembraanmatrix, verdund 1:8 in serumvrij DMEM tot een geschatte uiteindelijke proteïneconcentratie van 1 mg/mL, en gedurende 4 u geïncubeerd bij 37 °C. A549- en H358-cellen werden geresuspendeerd in serumvrij RPMI-1640-medium bij dichtheden van respectievelijk 8 × 105 cellen/mL en 4 × 105 cellen/mL. Een aliquot van 200 µL van de celsuspensie werd toegevoegd aan de bovenkamer, wat overeenkomt met 1,6 × 105 A549-cellen of 8 × 104 H358-cellen per insert. De onderkamer werd gevuld met 500 µL RPMI-1640-medium met 20% foetaal runderserum als chemoattractant. Na incubatie bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ gedurende 48 u, werden niet-invaderende cellen die op het bovenste oppervlak van het membraan waren gebleven voorzichtig verwijderd met een wattenstaafje. Cellen die door het membraan waren geïnvadeerd, werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 20 min en gekleurd met 0,1% kristalviolet gedurende 20 min bij kamertemperatuur. Voor elke insert werden vijf willekeurig gekozen microscopische velden gefotografeerd, en het aantal geïnvadeerde cellen werd gekwantificeerd met ImageJ. Het gemiddelde aantal cellen uit de vijf velden werd beschouwd als één waarde per insert, waarbij de insert, in plaats van een individueel microscopisch veld, als experimentele eenheid werd behandeld. Er werden drie onafhankelijke biologische experimenten uitgevoerd.
OPMERKING: Verwijder de niet-invaderende cellen voorzichtig en consistent om te voorkomen dat het membraan beschadigd raakt of dat cellen die naar het onderste oppervlak zijn gemigreerd, worden losgemaakt.
Statistische analyse
Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD, en n staat voor onafhankelijke biologische experimenten, tenzij anders aangegeven. Technische replicaten of meerdere microscopische velden van dezelfde experimentele eenheid werden gemiddeld vóór de inferentiële toetsing. Voor de vergelijking tussen de drie cellijnen werd eenweg-variantieanalyse gevolgd door Tukey-gecorrigeerde paarsgewijze vergelijkingen gebruikt. Voor de CCK-8 en wondsluiting-tijdreeksen werd een tweeweg-variantieanalyse met herhaalde metingen gebruikt om de effecten van behandeling, tijd en de interactie tussen behandeling en tijd te evalueren, gevolgd door Šídák-gecorrigeerde vergelijkingen op individuele tijdstippen. Vergelijkingen tussen twee groepen werden geanalyseerd met tweezijdige ongepaarde Student's t-toetsen. Statistische analyses en datavisualisatie werden uitgevoerd met behulp van software voor statistische analyse en grafieken. Exacte p-waarden worden vermeld in de figuurpanelen of de brongegevenstabellen. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05; *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, en ****p < 0,0001.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
TCGA/starBase-analyse toont een verminderde abundantie van miR-486-3p in LUAD aan, en TargetScan identificeert potentiële bindingsplaatsen
TCGA-afgeleide expressiegegevens, berekend via starBase v3.0, toonden aan dat miR-486-3p de abundantie was significant lager in 512 longadenocarcinoom-monsters (LUAD) dan in 20 niet-tumorale longmonsters (Wilcoxon rank-sum test, p = 3.2 × 10⁻5; Figuur 1). TargetScanHuman identificee...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De huidige gain-of-function studie evalueerde de effecten van stabiele, geforceerde miR-486-3p expressie in A549 en H358 longadenocarcinoom (LUAD) cellen. In beide modellen was miR-486-3p overexpressie geassocieerd met verminderde groeigerelateerde CCK-8 signalen, afgenomen clonogene groei, een lagere wondsluiting en minder cellen die door Matrigel-gecoate Transwell-membranen migreerden. Deze fenotypische veranderingen gingen gepaard met een verminderde abundantie van WNT5B, DVL1, totaal β-cathenine en BCL-2 eiwitten, sa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.
Het Zhejiang Provincial Medical and Health Science and Technology Plan (2025KY349) en de Jiaxing City Key Supporting Discipline (2023-zc-014) boden financiële ondersteuning voor deze studie.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1 M Tris-HCl (pH 6.8) | Solarbio | T1020 | Bereiding van SDS-PAGE stapelgel |
| 1,5 M Tris-HCl (pH 8,8) | Solarbio | T1010 | Bereiding van SDS-PAGE scheidingsgel |
| 20× TBS-buffer | Solarbio | 71080 | Voorraadbuffer voor western blot wassing en antilichaamverdunning |
| 30% acrylamide/bis-acrylamide oplossing (29:1) | Solarbio | A1010 | Bereiding van SDS-PAGE gels |
| 4% paraformaldehyde fixatief | Servicebio | G1101 | Fixatie voor colony-formation en Transwell assays |
| 5× eiwitlaadbuffer | Beyotime | P0015 | Eiwitmonsterbereiding voor SDS-PAGE |
| Ammoniumpersulfaat | Solarbio | 427A038 | Polymerisatie-initiator voor SDS-PAGE gel |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0009-1 | Bepaling van eiwitconcentratie |
| BCL-2 antilichaam | Boster Biological Technology | A00040-2 | Konijn polyclonaal antilichaam; western blotting bij 1:5.000 |
| Cell Counting Kit-8 (CCK-8) | TargetMol | C0005 | Metabole activiteitsassay geassocieerd met celgroei; 10 μL per 100 μL cultuurmedium |
| Chemiluminescentie-beeldvormingssysteem | Bio-Rad | ChemiDoc MP | Western blot beeldvorming |
| Chloroform | Servicebio | G3005 | Fasescheiding tijdens TRIzol-gebaseerde RNA-extractie |
| Kristalviolet kleuringsoplossing | Servicebio | G1014 | Kleuring van kolonies en Transwell-membraan |
| DMEM | Servicebio | G4511 | Routine cultuurmedium voor Beas-2b cellen |
| DVL1 antilichaam | Signalway Antibody | 53180 | Konijn primair antilichaam; western blotting bij 1:5.000 |
| Foetaal runderserum (FBS) | Biosharp | BL203B | 10% (v/v) supplement voor routine celkweek; 20% (v/v) in de onderste Transwell-kamer |
| GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | Version 8 | Grafiekbereiding en statistische analyse |
| Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) | Yeasen Biotechnology | 11201ES08 | SYBR Green-gebaseerde kwantitatieve PCR |
| Hifair III 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR (gDNA digester plus) | Yeasen Biotechnology | 11141ES60 | Reverse transcriptie voor mRNA RT-qPCR |
| IBM SPSS Statistics | IBM | Version 22.0 | Statistische analyse |
| ImageJ | National Institutes of Health | Version 1.53 | Western blot densitometrie, meting van wondoppervlak, colony counting en Transwell celcounting |
| Omgekeerde microscoop | Olympus | CKX53 | Beeldvorming van wound-healing en Transwell assays |
| Isopropanol | Servicebio | G3006 | RNA-precipitatie tijdens TRIzol-gebaseerde extractie |
| LV-miR-486-3p en LV-NC lentivirale preparaten | GenePharma | Custom synthesis | Stabiele miR-486-3p overexpressievector en scrambled negatieve-controlevector |
| Matrigel basaalmembraanmatrix | Corning | 354234 | Verdund 1:8 in serumvrij DMEM; uiteindelijke eiwitconcentratie van ongeveer 1 mg/mL |
| Methanol | Xilong Scientific | GB/T 683-2006 | PVDF-membraanactivatie |
| Microplaatlezer | BioTek | ELx800 | Meting van absorptie bij 450 nm |
| Microvolume UV-Vis spectrofotometer | Allsheng | Nano-600 | RNA-concentratie en A260/A280 zuiverheidsbeoordeling |
| Penicilline-streptomycine | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15240062 | 1% (v/v) supplement voor routine celkweek |
| Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) | Servicebio | G0002 | Wassen van cellen en membranen |
| Proteaseremmer-cocktail | APExBIO | K1007 | Toegevoegd aan RIPA lysisbuffer |
| Eiwitladder | Biosharp | BL712A | Moleculaire gewichtsreferentie voor western blotting |
| PVDF-membraan | Millipore | K2MA8350E | Eiwittransfermembraan voor western blotting |
| QuantStudio 5 Real-Time PCR Systeem | Thermo Fisher Scientific | QuantStudio 5 | RT-qPCR data-acquisitie |
| RIPA lysisbuffer | Beyotime | P0013B | Totale cellulaire eiwitextractie |
| RNA-extractie-reagens (TRIzol-type) | Servicebio | G3013 | Totale RNA-extractie |
| RPMI 1640 medium | Servicebio | G4510 | Routine cultuurmedium voor A549 en H358 cellen en serumvrije Transwell celsuspensie |
| SDS | Solarbio | S8010 | SDS-PAGE reagens |
| Magere melkpoeder | BD | 2271470 | 5% blokkeringsoplossing voor western blotting |
| StarBase v3.0 | Sun Yat-sen University | https://rnasysu.com/encori/ | TCGA-afgeleide miR-486-3p expressieanalyse |
| TargetScanHuman | Whitehead Institute for Biomedical Research | https://www.targetscan.org/vert_80/ | Voorspelling van kandidaat miR-486-3p bindingsplaatsen |
| TEMED | Sigma-Aldrich | T8090 | Polymerisatiekatalysator voor SDS-PAGE gel |
| Transwell inserts, 24-well, 8 μm poriegrootte | Corning | 3428 | Matrigel-gecoate membraantraverseringsassay |
| Trypsine | Servicebio | G4000 | Celdetachement |
| Tween-20 | Solarbio | 815A043 | Bereiding van western blot wasbuffer |
| Verticale elektroforese-systeem | Liuyi Biotechnology | DYCZ-24DN | SDS-PAGE eiwitscheiding |
| Western HRP substraat luminol reagens | Affinity Biosciences | KF001 | Chemiluminescente western blot detectie |
| Wet transfer systeem | Bio-Rad | 1703930 | Eiwittransfer naar PVDF-membraan |
| WNT5B antilichaam | Signalway Antibody | 56808 | Konijn primair antilichaam; western blotting bij 1:5.000 |
| β-actine antilichaam | Abcam | ab8227 | Laadcontrole; western blotting bij 1:5.000 |
| β-catenine antilichaam | Signalway Antibody | 21725 | Konijn primair antilichaam; western blotting bij 1:5.000 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.