Isolatie, zuivering en karakterisering van functionele mitochondriën afkomstig van muisskeletspieren voor mitochondriale transplantatie

Summary

Er werd een gestandaardiseerd protocol opgesteld dat trypsindigestie en differentiële centrifugatie combineert voor de isolatie, zuivering en functionele karakterisering van mitochondriën uit muisskeletspieren, evenals voor het evalueren van hun toepassing bij mitochondriale transplantatie.

Abstract

Mitochondriën zijn essentiële organellen die het energiemetabolisme, signaaltransductie en cellulaire homeostase in eukaryote cellen reguleren. Mitochondriale disfunctie draagt bij aan de pathogenese van talrijke ziekten en heeft geleid tot de ontwikkeling van mitochondriale transplantatie als regeneratieve therapeutische strategie. De succesvolle toepassing van mitochondriale transplantatie is afhankelijk van de beschikbaarheid van sterk gezuiverde en functioneel intacte mitochondriën. Skeletspier is een geschikte donorbron vanwege het hoge mitochondriale gehalte, de metabole activiteit en de toegankelijkheid. Deze studie stelde een gestandaardiseerd, reproduceerbaar protocol vast voor de isolatie, zuivering en karakterisering van functionele mitochondriën uit muisskeletspieren en evalueerde hun gebruik bij mitochondriale transplantatie. De procedure bestond uit twee hoofdfasen. Eerst werden mitochondriën geïsoleerd uit de skeletspier van C57BL/6-muizen met behulp van trypsindigestie, gevolgd door differentiële centrifugatie. Ten tweede werden de geïsoleerde mitochondriën gekarakteriseerd om zuiverheid, ultrastructuur en functionele activiteit te evalueren. De zuiverheid van mitochondria werd beoordeeld met behulp van bicinchonininezuur (BCA) eiwitkwantificatie en Western blot-analyse. De ultrastructurele integriteit werd onderzocht met transmissie-elektronenmicroscopie. Functionele activiteit werd geëvalueerd met behulp van JC-1 en mitochondriale fluorescerende labeling, samen met metingen van zuurstofverbruik, ATP-productiecapaciteit en ademhalingscontroleratio met behulp van een hoogresolutie respirometriesysteem. De geïsoleerde mitochondriën vertoonden behouden membraanpotentiaal, intacte ultrastructuur en stabiele ademhalingsactiviteit, wat wijst op geschiktheid voor latere functionele studies en mitochondriale transplantatietoepassingen.

Introduction

Mitochondriën zijn de primaire plaatsen van adenosinetrifosfaat (ATP) productie en spelen centrale rollen in apoptose, calciumhomeostase en het metabolisme van reactieve zuurstofsoorten (ROS). De functionele integriteit van mitochondriën is daarom cruciaal voor het behouden van cellulaire homeostase en het bepalen van cellot ^1,2. Mitochondriale disfunctie, waaronder mutaties in mitochondriaal DNA (mtDNA) en afwijkingen in de elektronentransportketen (ETC), leidt tot een verstoorde energiemetabolisme, oxidatieve stress en ontregelde apoptose ^3,4. Deze afwijkingen zijn geassocieerd met een breed scala aan ziekten, waaronder erfelijke mitochondriale aandoeningen, neurodegeneratieve ziekten en hart- en vaatziekten ^5,6. Conventionele therapeutische strategieën voor mitochondriale disfunctie, zoals antioxidanten en metabole cofactoren, bieden over het algemeen beperkte effectiviteit omdat ze symptomen verlichten zonder direct de mitochondriale functie^{te herstellen 7,8}. Daarom is mitochondriale transplantatie uitgegroeid tot een veelbelovende therapeutische benadering in de regeneratieve geneeskunde. Deze strategie houdt in dat intacte exogene mitochondriën worden toegediend aan beschadigde of disfunctionele cellen om mitochondriale activiteit en het cellulaire energiemetabolisme^te herstellen. Eerdere studies hebben aangetoond dat exogene mitochondriën door ontvangende cellen kunnen worden geïnternaliseerd en opgenomen kunnen worden in het endogene mitochondriale netwerk, wat resulteert in verbeterde bio-energetische functie en een verbeterde celoverleving 11,12,13.

Skeletspier wordt beschouwd als een geschikte donor voor mitochondriale isolatie vanwege het hoge mitochondriale gehalte, metabole activiteit en toegankelijkheid 14,15,16. Mitochondriale transplantatie vereist verschillende cruciale stappen, waaronder mitochondriale isolatie, zuivering, functionele karakterisering en efficiënte levering in ontvangende cellen. Toch blijft er aanzienlijke methodologische variabiliteit bestaan tussen de tot nu toe gerapporteerde protocollen, met name bij procedures die weefselhomogenisatie, enzymatische vertering, temperatuurregeling en zuivering betreffen. Dergelijke variabiliteit kan de mitochondriale opbrengst, zuiverheid en functionele integriteit beïnvloeden, waardoor de experimentele reproduceerbaarheid wordt beperkt.

Om de methodologische consistentie en reproduceerbaarheid te verbeteren, presenteert deze studie een gestandaardiseerd protocol voor het isoleren en karakteriseren van functionele mitochondriën uit muisskeletspieren met behulp van trypsindigestie en differentiële centrifugatie. De geïsoleerde mitochondriën werden geëvalueerd op zuiverheid, ultrastructurele integriteit en functionele activiteit met behulp van bicinchonininezuur (BCA) eiwitkwantificatie, Western blotting, transmissie-elektronenmicroscopie, fluorescentie-gebaseerde membraanpotentiaaltests en hoogresolutie respirometrie. Daarnaast werd de opname van geïsoleerde mitochondriën door ontvangende cellen beoordeeld om hun geschiktheid voor mitochondriale transplantatietoepassingen te evalueren. Dit protocol biedt een reproduceerbare workflow voor het verkrijgen van functionele mitochondriën afgeleid van skeletspieren voor latere experimentele studies.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in een specifieke pathogenevrije (SPF) faciliteit en goedgekeurd door de Commissie voor Dierethiek en Gebruik van het Derde Geaffilieerde Ziekenhuis van de Air Force Medical University (Goedkeuringsnummer: IACUC-2024kq-065).

Mannelijke C57BL/6 muizen (6-8 weken oud, 18-20 g) zijn gekocht bij het Laboratory Animal Center van de Air Force Medical University (productievergunning: SCXK (Shaanxi) 2024-002). De muizen werden gehuisvest in individueel geventileerde kooien (IVC's) onder positieve druk en schone omstandigheden, met een temperatuur van 20-26 °C, relatieve luchtvochtigheid 40%-70%, een licht-donkercyclus van 12 uur en minstens 15 luchtverversingen per uur. Er werden gesteriliseerd dieet, drinkwater en milieuverrijking verzorgd.

De reagentia, chemicaliën en experimentele instrumenten die in het protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Dierenoffers en weefselverzameling

1. Plaats de muis in een luchtdichte euthanasiekamer en euthanasen via geleidelijke inademing van kooldioxide (CO₂), 30%-70% kamervolume per minuut.
2. Bevestig de dood door het stoppen van spontane ademhaling en hartslag, verlies van pupilreflexen en geen reactie op mechanische stimulatie.
3. Dompel de geëuthanaseerde C57BL/6-muizen 5 minuten in 75% ethanol voor desinfectie.
   OPMERKING: Om alcoholgeïnduceerde weefselfixatie en celbeschadiging te voorkomen, beperk de onderdompelingstijd tot 10 minuten. Gebruik gedurende het protocol vers weefsel omdat bevriezen de mitochondriale levensvatbaarheid en functionele integriteit aantast.
4. Plaats de muis in een steriele petrischaal binnen een laminaire stroomkap met de buik naar boven gericht om de buik- en achterpootgebieden volledig bloot te leggen.
5. Til de huid van de onderbuik nabij het genitale gebied met een tang en maak een kleine incisie. Voer een stomp dissectie uit om de huid van het onderliggende weefsel te scheiden. Verleng de incisie bovenaan langs de middenlijn naar de enkel en lateraal naar beide achterpoten om de spiergroepen van de achterpooten volledig bloot te leggen.
6. Identificeer de quadriceps femoris-spier aan de voorzijde van het dij en scheid de spier zorgvuldig in de richting van de spiervezels met behulp van een stomp dissectie. Snijd het distale patellaire ligament en de proximale pees door om het spierweefsel volledig te isoleren.
   OPMERKING: Was het weefsel drie keer in voorgekoelde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 2% penicilline-streptomycine met een verse petrischaal voor elke wasbeurt om besmetting te minimaliseren.
7. Plaats het geïsoleerde spierweefsel direct in voorgekoelde PBS en spoel grondig af om haar en bloed van het weefseloppervlak te verwijderen.
8. Dep voorzichtig overtollig vocht uit het weefsel met steriel gaas. Verdeel het weefsel in 1,5 mL microcentrifugebuizen en weeg de monsters. Gebruik ongeveer 100 mg weefsel per monster om consistentie tussen de voorbereidingen te behouden.

2. Weefselversnippering en homogenisatie

1. Plaats de microcentrifugebuis met het weefsel uit Stap 1.8 op ijs. Snijd het weefsel in kleine fragmenten van ongeveer 1-2 mm³ inch met een steriele schaar.
2. Voeg 8 volumes voorgekoelde 0,25% trypsine toe en verteerde de weefselfragmenten op ijs gedurende 15 minuten.
   OPMERKING: Bereken het benodigde trypsinvolume op basis van weefselmassa (1 mg ≈ 1 μL). Voeg bijvoorbeeld 640 μL 0,25% trypsine toe aan 80 mg weefsel.
3. Centrifugeer het mengsel op 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en houd het weefselpelletje vast. Suspendeer de pellet opnieuw in 1 mL voorgekoelde mitochondriale isolatiebuffer met D-mannitol (215 mM), sucrose (75 mM), HEPES (20 mM), EGTA (1 mM) en vetzuurvrije rundserumalbumine (0,5% w/v).
4. Breng de suspensatie over naar een glashomogenisator die op ijs wordt gehouden. Homogeniseer het weefsel met 10-12 zachte op-en-neer bewegingen totdat de suspensie troebel wordt.
   OPMERKING: Vermijd het lateraal draaien van de glazen stamper aan de onderkant van de homogenisator, omdat overmatige mechanische kracht mitochondriale membranen kan beschadigen en de mitochondriale functie kan verstoren.

3. Differentiële centrifugatie

1. Breng het homogenaat over in een 1,5 mL microcentrifugebuis en centrifugeer op 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
2. Breng het supernatant over in een verse 1,5 mL microcentrifugebuis en centrifugeer op 12.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C om de ruwe mitochondriale pellet te verkrijgen.
   OPMERKING: Verzamel het supernatant voorzichtig met een 1 mL spuit, terwijl je verstoring van de pellet en restweefselresten vermijdt.

4. Mitochondriale zuivering en opslag

1. Suspendeer de ruwe mitochondriale pellet voorzichtig opnieuw in een voorgekoelde washbuffer met sucrose (250 mM), HEPES (10 mM, pH 7,4), EGTA (1 mM) en runderserumalbumine (0,15% w/v). Centrifugeer de suspensie op 1.000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
2. Breng het supernatant over in een verse centrifugebuis en centrifugeer op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C om de gezuiverde mitochondriale pellet te verkrijgen.
   OPMERKING: Gebruik vers geïsoleerde mitochondriën zo snel mogelijk onmiddellijk. Kortetermijnopslag bij 4 °C of langdurige opslag bij −80 °C in mitochondriale opslagbuffer met sucrose (0,25 m), Tris-MOPS (10 mM, pH 7,4) en EGTA (0,1 mM) is haalbaar. Echter kan bevriezing de mitochondriale enzymatische activiteit en ademhalingsfunctie aantasten. Gebruik vooral ingevroren monsters voor eiwitanalyse.

5. Mitochondriale en cytosolische eiwitextractie en BCA-kwantificatie

1. Mitochondriale eiwitextractie
   1. Susselt de gezuiverde mitochondriale pellet opnieuw in 50 μL RIPA-lysebuffer per 100 mg startweefsel en incubeer de suspensie op ijs gedurende 15 minuten.
   2. Centrifugeer het lysaat op ongeveer 14.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Breng het supernatant over naar een verse 1,5 mL microcentrifugebuis om de mitochondriale eiwitfractie te verkrijgen.
2. Cytosolische eiwitextractie
   1. Centrifugeer het cytosolische supernatant verkregen in stap 4.2 op 12.000 × g gedurende 15 minuten bij 4 °C. Verwijder het supernatant en behoud de pellet als de verrijkte cytosolische fractie.
   2. Susse de cytosolische pellet opnieuw in 50 μL RIPA-lysebuffer en verwerk het monster zoals beschreven in stappen 5.1.1-5.1.2.
      OPMERKING: Bereid de lysisbuffer vers voor met proteaseremmers en voer alle procedures op ijs uit om eiwitafbraak te minimaliseren. Mitochondriën die in deze stap worden gebruikt, kunnen vers of bevroren zijn.
3. BCA-eiwitkwantificatie
   1. Bereid de BCA-werkoplossing voor door reagens A en reagens B te mengen in een verhouding van 50:1 (v/v). Voeg 200 μL werkoplossing toe aan elke put van een 96-put plaat.
      OPMERKING: Bereid de BCA-werkoplossing direct voor gebruik voor en gebruik deze binnen 1 uur bij kamertemperatuur.
   2. Verdun de bovine serumalbumine (BSA) voorraadoplossing (2 mg/mL) tot 0,5 mg/mL en laat de oplossing ijs staan tot gebruik.
   3. Bereid de standaardcurve voor door 20, 19, 18, 16, 12, 8, 4 of 0 μL BSA-oplossing toe te voegen aan afzonderlijke putten. Stel het eindvolume aan op 20 μL met behulp van een NaCl-oplossing.
   4. Voeg 4 μL mitochondriaal eiwit en 16 μL NaCl-oplossing toe aan één set putten. Voeg 4 μL cytosolisch eiwit en 16 μL NaCl-oplossing toe aan een andere set putten.
   5. Voeg 200 μL BCA-werkoplossing toe aan elke put en incubeer de plaat bij 37 °C in het donker gedurende 30 minuten. Meet de absorptie bij 562 nm met een microplaatlezer.
   6. Bouw een eiwitstandaardcurve met een correlatiecoëfficiënt (R²) ≥ 0,999. Bereken eiwitconcentraties (μg/μL) door absorptiewaarden van de standaardcurve te interpoleren.

6. Zuiverheidsbeoordeling van skeletspier-afgeleide mitochondriën

1. Verdun mitochondriale en cytosolische eiwitmonsters tot een uiteindelijke concentratie van 1,5 μg/μL. Bereid 20 μL reactiemengsels voor met 30 μg eiwit en 4 × laadbuffer. Stel het resterende volume aan met NaCl-oplossing. Kook de monsters 10 minuten en bewaar ze op −80 °C tot gebruik.
2. Splits eiwitmonsters met 4%-20% gradient precast gels. Voer elektroforese uit op 140-150 V gedurende 50 minuten.
3. Activeer het PVDF-membraan (0,22 μm) in methanol gedurende 1 minuut. Eiwitoverdracht via de rapid transfer buffer bij 400 mA gedurende 30 minuten.
4. Verwijder het PVDF-membraan uit de transfersandwich en was het 5 minuten in TBST. Blokkeer het membraan met 5% magere melk op kamertemperatuur gedurende 1 uur en schud.
5. Verdun primaire antilichamen (COX IV, cytochroom c, β-actine) 1:1.000 in de antilichaamverdunningsbuffer. Incubeer het membraan met primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C.
6. Was het membraan drie keer met TBST gedurende 10 minuten per was.
7. Incubeer het membraan met een secundair antilichaam verdund 1:10.000 bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
8. Was het membraan drie keer met TBST gedurende elk 10 minuten. Ontwikkel de blot en leg de beelden vast.

7. MitoTracker-kleuring van skeletspier-afgeleide mitochondriën

1. Verdun de kleuringswerkoplossing tot een eindconcentratie van 200 nM in voorverwarmd medium direct voor gebruik.
2. Sus de mitochondriale pellet opnieuw in 100 μL van de werkoplossing en incubeer bij 37 °C in het donker gedurende 20 minuten.
3. Voeg na de incubatie vijf volumes voorgekoelde opslagbuffer toe. Centrifugeer de suspensie op 12.000 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C en gooi het supernatant met ongebonden kleurstof weg.
4. Breng een aliquot van de bevlekte mitochondriale suspensie over op een glazen glaasje en bedek het monster met een dekmantel.
5. Maakt fluorescentiebeelden met een laserscanning confocale microscoop met de juiste excitatie- en emissieinstellingen voor detectie van rode fluorescerende mitochondriale kleurstoffen.

8. Beoordeling van het mitochondriale membraanpotentiaal met behulp van JC-1 kleuring

1. CCCP (carbonylcyanide m-chlorofenylhydrazon) behandelgroep
   1. Behandel de mitochondriale suspension met CCCP bij een uiteindelijke concentratie van 10 μM en incubeer 20 minuten om het mitochondriale membraanpotentiaal te dissiperen.
   2. Incubeer de met CCCP behandelde mitochondriale suspensie met 250 μL JC-1 kleuroplossing bij 37 °C gedurende 20 minuten met zachte roering.
2. JC-1 behandelgroep
   1. Sussief de mitochondriale pellet opnieuw in 100 μL JC-1 werkoplossing en incubeer bij 37 °C gedurende 20 minuten, beschermd tegen licht.
   2. Bereid een 1× JC-1 kleurbuffer voor door de 5× bouillonoplossing te verdunnen met gedestilleerd water in een verhouding van 2:8 (v/v) en houd de buffer op ijs.
   3. Verwijder de kleuroplossing en was de mitochondriale pellet twee keer met voorgekoelde 1× JC-1 kleurbuffer.
   4. Suspendeer de gekleurde mitochondriën opnieuw in PBS en beeld ze af met een laserscanning confocale microscoop. Gebruik geschikte excitatie- en emissie-instellingen voor de detectie van groene fluorescerende JC-1 monomeren en rode fluorescerende JC-1 aggregaten.

9. Ultrastructurele analyse van geïsoleerde skeletspiermitochondriën door transmissie-elektronenmicroscopie

1. Fixeer vers geïsoleerde mitochondriën in 2,5% glutaraldehyde, bereid in 0,2 M fosfaatbuffer (pH 7,4) en incubeer de monsters een nacht bij 4 °C.
2. Was de monsters met 0,1 M fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS, pH 7,4) en fixeer de monsters 1 uur lang in 1% osmiumtetroxide bij kamertemperatuur.
3. Dehydrateer de monsters via een gegradueerde ethanolreeks, gevolgd door infiltratie, inbedding en polymerisatie in epoxyhars.
4. Snijd de ingebedde monsters op een dikte van 50-70 nm met behulp van een ultramicrotoom.
5. Kleur de secties dubbel met uranylacetaat en loodcitrat. Observeer en beeld de monsters af met een transmissie-elektronenmicroscoop.

10. Cellulaire opname van mitochondriën afkomstig van skeletspieren

1. Kweek NCTC-kloon 929 (L929; RRID: CVCL_0462) cellen verkregen van een commerciële leverancier in een volledig medium met MEM Alpha, aangevuld met 10% foetaal rundserum en 1% penicilline-streptomycine.
2. Wanneer de cellen 80%-90% samenvloeiing bereiken, aspireer je het medium en was je de cellen twee keer met voorverwarmde PBS. Voeg trypsine-EDTA toe en incubeer tot de cellen loskomen.
3. Voeg een volledig medium toe om de spijsvertering te beëindigen en een eencelige suspensie te genereren door zacht pipetteren. Centrifugeer de suspensie op 1.000 × g gedurende 5 minuten en gooi het supernatant weg.
4. Suspendeer de celpellet opnieuw in een vers, volledig medium en zaad de cellen in nieuwe kweekschaaltjes met een geschikte dichtheid. Incubeer de cellen op 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂.
5. Plaats 5 (P5) cellen in schaaltjes met een glazen bodem van 35 mm en kweek de cellen een nacht.
6. Label geïsoleerde mitochondriën met een mitochondriën-specifiek rood fluorescerende kleurstof bij 37 °C in het donker gedurende 20 minuten en was de mitochondriën met PBS om ongebonden kleurstof te verwijderen.
7. Voeg rode fluorescerende kleurstof-gelabelde mitochondriën (20 μg mitochondriaal eiwit per schaal) toe aan de cellen en incubeer 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂.
8. Kleur de cellen 30 minuten met een fluorescerende actineprobe om het actinecytoskelet en de tegenkleurkernen te visualiseren met een fluorescerende nucleaire kleurstof.
   OPMERKING: Controleer de serumconcentratie tijdens co-incubatie zorgvuldig, omdat te veel serum de opname van mitochondriale capaciteit kan verminderen. De mitochondriën die in deze stap worden gebruikt, zijn vers.

11. Meting van mitochondriale ademhalingsfunctie met behulp van hoogresolutie respirometrie

1. Instrumentvoorbereiding
   1. Maak de ademhalingskamers, elektrodecompartimenten en stoppers schoon.
   2. Plaats een magnetische roerbalk in elke kamer en controleer de integriteit van het zuurstofelektrodemembraan.
2. Instrumentkalibratie
   1. Voeg 2,1 mL mitochondriale ademhalingsbuffer (MiR05, pH 7,10) toe aan elke ademhalingskamer en zorg ervoor dat er geen luchtbellen aanwezig zijn.
   2. Breng het hoogresolutie-respirometriesysteem in evenwicht bij 37 °C gedurende 30 minuten en voer dagelijkse luchtkalibratie uit na stabilisatie van de zuurstofbasis.
      OPMERKING: Vermijd het inbrengen van luchtbellen in de ademhalingskamer, omdat deze de zuurstofelektrodesignalen verstoren en de gegevenskwaliteit aantasten. De mitochondriën die in deze stap worden gebruikt, zijn vers.
3. Monsterbelasting en equilibratie
   1. Voeg vers geïsoleerde mitochondriën met ongeveer 30 μg eiwit toe aan de ademhalingskamer en sluit de kamer af.
   2. Evenwichtig zijn kamer 5-8 minuten en registreer het basale zuurstofverbruik.
      OPMERKING: Houd mitochondriën op ijs en voer direct na isolatie ademhalingsmetingen uit om activiteit te behouden.
4. SUIT-protocol
   1. Voeg achtereenvolgens 5 μL pyruvaat (2 M), 10 μL glutamaat (2 M) en 10 μL malaat (400 mM) toe. Stabiliseer de reactie gedurende 5 minuten en neem de ademhaling van CI-lekken op.
   2. Voeg 10 μL ADP (500 mM) toe om oxidatieve fosforylering te induceren en de CI OXPHOS-ademhaling te registreren. Voeg 10 μL magnesiumchloride (0,3 M) toe.
   3. Voeg 20 μL succinaat (1 M) toe en registreer CI+CII OXPHOS ademhaling na stabilisatie.
   4. Voeg 2 μL ATP-synthase-inhibitor toe (0,01 mM) en registreer de ademhaling van protonlekken.
   5. Voeg CCCP (1 mM) incrementeel toe in drie toevoegingen van 2 μL op 2 minuten intervallen totdat het zuurstofverbruik een plateau bereikt. Registreer de maximale capaciteit van het elektronenoverdrachtsysteem.
   6. Voeg 1 μL rotenon (1 mM) toe om de activiteit van complex I te remmen.
   7. Voeg 1 μL antimycine A (5 mM) toe om de activiteit van complex III te remmen en het resterende zuurstofverbruik te registreren.
   8. Voeg 5 μL ascorbaat (800 mM) en 5 μL N,N,N',N'-tetramethyl-p-fenyleendiamine (200 mM) toe. Registreer maximale complexe IV-ademhalingsactiviteit na stabilisatie.
      OPMERKING: Aliquot alle reagentia vóór het invriezen om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen. Voeg CCCP geleidelijk toe, omdat overmatig ontkoppelen de mitochondriale ademhaling remt.
5. Data-analyse
   1. Verkrijg mitochondriale ademhalingsparameters, waaronder CI Leak, CI OXPHOS, CI+CII OXPHOS, CI+CII Leak, CI+CII ET, CII ET en CIV, met behulp van de data-analysesoftware.
   2. Bereken de ademhalingscontrole ratio (RCR; Staat 3 ademhaling/Staat 4 ademhaling) en ATP productiecapaciteit. Houd alle waarden vast tot drie significante cijfers voor statistische analyse. De software die werd gebruikt voor data-analyse was Oroboros Datlab 8 (Oroboros Instruments).

Results

Een schematisch overzicht van de mitochondriale isolatie- en zuiveringsworkflow is weergegeven in Figuur 1. Alle procedures werden uitgevoerd bij 4 °C om de mitochondriale integriteit en functionele activiteit te behouden. Vers geïsoleerd skeletspierweefsel werd gemalen en verteerd met trypsine om weefseldissociatie te bevorderen, waarna het gehomogeniseerd werd in isotone isolatiebuffer met behulp van een glashomogenisator. Daarna werd differentiële centrifugatie uitgevoerd om mitochondriën te scheiden van weefselresten en cytosolische verontreinigingen. Initiële centrifugatie bij 1.000 × g verwijderde kernen en grote resten van het puin, terwijl latere centrifugatie bij 12.000 × g een ruwe mitochondriale pellet opleverde. Extra was- en centrifugatiestappen verminderden de cytosolische besmetting verder, waardoor gezuiverde mitochondriën ontstonden die geschikt zijn voor structurele en functionele analyses stroomafwaarts (Figuur 1).

Figuur 1: Schematisch diagram van mitochondriale isolatie en zuivering. Mitochondriën van hoge zuiverheid werden geïsoleerd door een gecombineerde aanpak van gecontroleerde trypsindigestie en differentiële centrifugatie. Alle procedures werden uitgevoerd bij 4 °C om de mitochondriale structurele en functionele integriteit te behouden. Vers geïsoleerd skeletspierweefsel werd onderworpen aan enzymatische vertering, homogenisatie en sequentiële centrifugatiestappen om gezuiverde mitochondriën te verkrijgen die geschikt zijn voor latere functionele en structurele analyses. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De functionele activiteit van geïsoleerde mitochondriën werd geëvalueerd met JC-1-kleuring en fluorescerende mitochondriale labeling (Figuur 2). JC-1-kleuring toonde sterke rode fluorescentie aan in vers geïsoleerde mitochondriën onder basale omstandigheden, wat wijst op behoud van het mitochondriale membraanpotentiaal. Na behandeling met carbonylcyanide m-chlorophenylhydrazone (CCCP) nam de rode fluorescentie af en de groene fluorescentie toe, wat consistent is met de depolarisatie van het mitochondriale membraan. Deze bevindingen bevestigden dat de geïsoleerde mitochondriën de responsiviteit van het membraanpotentiaal behielden en functioneel actief bleven na isolatie. Fluorescerende labeling toonde verder aan dat mitochondriën verschenen als discrete, gelijkmatig verdeelde punctate structuren over het hele veld, zonder duidelijke aggregatie of kleurstofprecipitatie. De lage achtergrondfluorescentie en het uniforme kleuringspatroon suggereerden behoud van mitochondriale integriteit en membraanpotentiaal na isolatie.

Figuur 2: Karakterisering van functionele activiteit van geïsoleerde mitochondriën. (A) Beoordeling van het mitochondriale membraanpotentiaal door JC-1 kleuring. Gezuiverde mitochondriën werden gekleurd met JC-1 en waargenomen onder fluorescentiemicroscopie. Duidelijke rode fluorescerende aggregaten werden waargenomen in de controlemitochondriëngroep, wat wijst op het potentieel van het geconserveerde mitochondriale membraan. Na behandeling met de ontkoppelaar CCCP verschoof de fluorescentie voornamelijk naar groene JC-1 monomeren, wat wijst op membraandepolarisatie en instorting van het membraanpotentiaal (schaalbalk = 50 μm). (B) Mitochondriale fluorescerende etikettering van gezuiverde mitochondriën. Fluorescentie-gelabelde mitochondriën verschenen als verspreide, gepuncteerde structuren zonder duidelijke aggregatie en met minimale achtergrondfluorescentie, wat wijst op behouden mitochondriale integriteit en een stabiel membraanpotentiaal (schaalbalk = 100 μm). (C) Kwantitatieve analyse van JC-1 fluorescentie-intensiteitsverhoudingen in verschillende groepen na JC-1 kleuring. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 3). De statistische significantie werd geanalyseerd met een ongepaarde t-test (****P < 0,0001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De ultrastructurele integriteit van geïsoleerde mitochondriën werd onderzocht met transmissie-elektronenmicroscopie (Figuur 3). Beeldvorming met lage vergroting toonde gezuiverde mitochondriën met overwegend ovale morfologie, terwijl beeldvorming met hoge vergroting intacte buitenmembranen en duidelijk gedefinieerde cristae-structuren aantoonde. Er werd geen duidelijke zwelling, ruptuur of structurele verstoring waargenomen. Voor kwantitatieve beoordeling werden vijf willekeurig geselecteerde velden geanalyseerd met ongeveer 40-60 mitochondriën per veld. Deze observaties toonden aan dat de isolatieprocedure de mitochondriale ultrastructuur effectief behield en mitochondriën genereerde die geschikt waren voor latere functionele studies.

Figuur 3: Ultrastructurele integriteit van geïsoleerde skeletspiermitochondriën beoordeeld met transmissie-elektronenmicroscopie. (Links) Representatief TEM-beeld bij lage vergroting (4.000×; schaalbalk = 2 μm) toont gezuiverde mitochondriën met overwegend ovale morfologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

(Rechts) Hoogvergroting TEM-beeld (40.000×; schaalbalk = 200 nm) toont gladde en continue buitenste mitochondriale membranen en duidelijk gedefinieerde cristae-structuren. Gele pijlen duiden op intacte buitenste mitochondriale membranen, terwijl witte pijlen goed georganiseerde mitochondriale cristae aangeven. Er werd geen bewijs van zwelling, ruptuur of structurele verstoring waargenomen. Vijf willekeurig geselecteerde velden met ongeveer 40-60 mitochondriën per veld werden geanalyseerd. Deze bevindingen tonen aan dat het isolatieprotocol de mitochondriale ultrastructurele integriteit behield en een betrouwbare structurele basis bood voor downstream functionele assays.

Mitochondriale opbrengst en zuiverheid werden vervolgens geëvalueerd door eiwitkwantificatie en immunoblotanalyse (Figuur 4). Vergelijking tussen de trypsinedigestie (TD) en normale extractie (NE) methoden toonde aan dat de TD-methode ongeveer 2,3-2,4 μg mitochondriaal eiwit per mg weefsel opleverde, terwijl de NE-methode ongeveer 1,7-1,8 μg/mg weefsel opleverde. Immunoblotanalyse toonde een sterke verrijking van mitochondriale markers, cytochroom c oxidase en COX IV, in mitochondriale fracties, met minimale detectie in cytosolische fracties. Daarentegen vertoonde de cytosolische marker β-actine slechts zwakke signalen in mitochondriale fracties, wat wijst op beperkte cytosolische besmetting. Vergelijking tussen de TD- en NE-groepen suggereerde dat de vertering van trypsine de mitochondriale opbrengst en zuiverheid verbeterde. Gezamenlijk toonden deze bevindingen aan dat het protocol mitochondriën genereerde die geschikt waren voor downstream moleculaire en functionele analyses.

Figuur 4: Vergelijking van opbrengst en zuiverheid van gezuiverde mitochondriën. (A) Vergelijking van de opbrengst van mitochondriale eiwitten per eenheid weefselmassa verkregen met behulp van de trypsindigestie (TD) en normale extractie (NE) methoden. De TD-groep leverde ongeveer 2,3-2,4 μg/mg weefsel op, terwijl de NE-groep ongeveer 1,7-1,8 μg/mg weefsel opleverde. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 3). De statistische significantie werd geanalyseerd met een ongepaarde t-test (*P < 0,05). (B) Immunoblotanalyse van mitochondriale en cytosolische markereiwitten in mitochondriale fracties die zijn geïsoleerd met behulp van de TD- en NE-methoden. (C-D) Kwantitatieve analyse van mitochondriale markerproteïnen cytochroom c oxidase en COX IV. Mitochondriale markers waren sterk verrijkt in mitochondriale fracties, maar toonden minimale expressie in cytosolische fracties. De cytosolische marker β-actine vertoonde slechts zwakke expressie in mitochondriale fracties, wat wijst op efficiënte verwijdering van cytosolische verontreinigingen. In vergelijking met de NE-groep toonde de TD-groep een verbeterde mitochondriale zuiverheid. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 3). De statistische significantie werd geanalyseerd met een ongepaarde t-test (*P < 0,05; **P < 0,01). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de mitochondriale ademhalingsfunctie verder te evalueren, werd het zuurstofverbruik gemeten met hoogresolutie respirometrie (Figuur 5). Mitochondriën die geïsoleerd zijn met de TD-methode vertoonden een ademhalingscontroleverhouding (RCR) van ongeveer 9-10, terwijl mitochondriën die geïsoleerd zijn met de NE-methode RCR-waarden van ongeveer 8-9 vertoonden. Omdat RCR-waarden groter dan 4 over het algemeen worden beschouwd als indicatief voor geconserveerde mitochondriale respiratorische activiteit, toonden deze resultaten aan dat mitochondriën die met beide methoden geïsoleerd zijn functionele integriteit behielden. De hogere RCR-waarden die in de TD-groep werden waargenomen, suggereren een beter behoud van de mitochondriale ademhalingsfunctie dan in de NE-groep. De efficiëntie van de biochemische koppeling werd ook beoordeeld met behulp van de vergelijking 1 − (lekademhalingssnelheid/elektronenoverdrachtsrespiratiesnelheid), waarbij waarden van dichter bij 1 duiden op een nauwere ademhalingskoppeling en efficiëntere ATP-productie. Beide groepen vertoonden koppelingsefficiënties van bijna 1, wat aangeeft dat de bio-energetische functie van mitochondriale elementen behouden bleef na isolatie.

Figuur 5: Test van de ademhalingsfunctie in gezuiverde mitochondriën. (A) Vergelijking van de mitochondriale ademhalingscontroleverhouding (RCR) tussen de trypzine-vertering (TD) en normale extractie (NE) groepen. RCR-waarden in beide groepen waren hoger dan 4, wat wijst op behoud van mitochondriale respiratorische activiteit na isolatie. De TD-groep vertoonde iets hogere RCR-waarden dan de NE-groep, wat wijst op een beter behoud van de ademhalingsfunctie. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 3). De statistische significantie werd geanalyseerd met een ongepaarde t-test (**P < 0,01). (B) Vergelijking van mitochondriale biochemische koppelingsefficiëntie en ATP-synthesecapaciteit tussen de TD- en NE-groepen. De koppelingsefficiëntiewaarden benaderden in beide groepen 1, wat wijst op sterk gekoppelde ademhaling en efficiënte ATP-productie. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 3). De statistische significantie werd geanalyseerd met een ongepaarde t-test (*P < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De opname van geïsoleerde mitochondriën door ontvangende cellen werd geëvalueerd met L929-cellen (Figuur 6). Cellen werden samen geïncubeerd met rood fluorescerende kleurstof-gelabelde skeletspier-afgeleide mitochondriën, en het actine-cytoskelet werd zichtbaar gemaakt met een fluorescerende actineprobe. Confocale microscopie toonde punctate rode fluorescerende structuren verspreid over het cytoplasma, wat aangeeft dat L929-cellen exogene mitochondriën hadden opgenomen. Kwantitatieve analyse toonde een tijdsafhankelijke toename van mitochondriale opname aan na 12, 24 en 48 uur. Echter, er werd slechts een bescheiden toename waargenomen tussen 24 uur en 48 uur, wat suggereert dat de opname-efficiëntie na 24 uur de verzadiging naderde. Daarnaast vertoonden ontvangers L929-cellen een verhoogd mitochondriale membraanpotentiaal vermogen na mitochondriale opname, wat wijst op verbeterde mitochondriale functie. Deze bevindingen toonden aan dat mitochondriën die met dit protocol zijn geïsoleerd uit skeletspieren effectief door ontvangercellen geïnternaliseerd konden worden terwijl functionele activiteit behouden blijft.

Figuur 6: Cellulaire opname van skeletspier-afgeleide mitochondriën door L929-cellen. (A) Opname van gezuiverde mitochondriën door L929-cellen op verschillende incubatietijden (12 uur, 24 uur en 48 uur). Mitochondriën met fluorescerende kleurstof gelabelde mitochondriën (rood) werden aangetroffen in het cytoplasma van ontvangende cellen, terwijl falloïdinekleuring (groen) werd gebruikt om het actinecytoskelet te visualiseren. Nucleaire kleuring werd uitgevoerd met DAPI (blauw). Confocale microscopie bevestigde de internalisatie van exogene mitochondriën door L929-cellen (schaalbalk = 50 μm). (B) Kwantitatieve analyse van mitochondriale opname-efficiëntie door L929-cellen op verschillende tijdstippen. (C) JC-1 kleuringsanalyse van het mitochondriale membraanpotentiaal in L929-cellen na opname van skeletspier-afgeleide mitochondriën. (D) Kwantitatieve analyse van JC-1 aggregate-tot-monomeer fluorescentieverhoudingen in ontvanger L929-cellen na mitochondriale opname. Het potentiaal mitochondriaal membraan werd significant verhoogd na internalisatie van actieve skeletspier-afgeleide mitochondriën. De gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = 3). De statistische significantie werd geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA (*P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Mitochondriale transplantatie is een opkomende strategie in celtherapie en regeneratieve geneeskunde die de fysiologische functie herstelt in cellen met een verminderde energiemetabolisme door de levering van functioneel intacte mitochondriën. Naast het reguleren van het cellulaire energiemetabolisme kan deze techniek belangrijke biologische processen zoals apoptose en oxidatieve stress moduleren, waardoor nieuwe therapeutische mogelijkheden ontstaan voor diverse ziekten 4,17,18,19. De klinische vertaling van mitochondriale transplantatie kent echter nog steeds verschillende uitdagingen, waaronder het ontbreken van gestandaardiseerde, efficiënte en reproduceerbare mitochondriale isolatieprotocollen, wat een grote bottleneck blijft.

Om dit probleem aan te pakken, stelde de huidige studie een gestandaardiseerd en gevisualiseerd experimenteel protocol op gebaseerd op differentiële centrifugatie voor de efficiënte isolatie van functionele vrije mitochondriën uit C57BL/6 muizenskeletspieren. Door het zuiveringsproces te optimaliseren en trypsine vóór de vertering, het wassen en zuiveren van trypsine te integreren, verbetert deze methode effectief de weefseldissociatie, behoudt de mitochondriale structurele integriteit en vermindert besmetting door niet-doelcellulaire componenten.

Het voorgestelde protocol bereikt een gunstige balans tussen mitochondriale zuiverheid en opbrengst. In vergelijking met conventionele op maalen gebaseerde extractiemethoden is de huidige methode sneller, praktischer en kosteneffectiever, waardoor deze geschikt is voor routinematige laboratoriumtoepassingen en de voorbereiding van donormitochondriën. Bestaande mitochondriale isolatiebenaderingen hebben elk bepaalde beperkingen. Zo kunnen dichtheidsgradiëntcentrifugatie en immunoaffiniteitszuivering een hogere zuiverheid bereiken, maar zijn tijdrovend en kostbaar, terwijl nanoschaal-probe-gebaseerde methoden onvoldoende ontwikkeld zijn voor routinematig gebruik^20,21. Voor dichte weefsels zoals skeletspieren behoudt de geoptimaliseerde trypsine predigestiestap (0,25% trypsine bij 37 °C gedurende 10-15 minuten), gecombineerd met zachte homogenisatie, de mitochondriale integriteit beter dan conventionele differentiële centrifugatie alleen.

In deze studie werd een commercieel verkrijgbare differentiële centrifugatiekit gebruikt onder lage temperaturen gedurende de hele procedure en volgens een gestandaardiseerde workflow, waardoor snelle verwerving van structureel intacte mitochondriën mogelijk werd. Om mogelijke problemen tijdens het extractieproces aan te pakken, waaronder lage opbrengst, eiwitvervuiling en abnormale membraanpotentie, worden verschillende probleemoplossingsstrategieën voorgesteld.

Een laag mitochondriale opbrengst wordt vaak veroorzaakt door onvoldoende homogenisatie, onvoldoende weefselhoeveelheid of centrifugaal verlies. Deze problemen kunnen worden geminimaliseerd door voldoende voorvertering te waarborgen, voorzichtige homogenisatie uit te voeren (10-15 passes met een strak passende homogeniseerder), minstens 100-150 mg vers skeletspierweefsel te gebruiken, centrifugatiecondities strikt te controleren (1.000 × g voor afvalverwijdering en 10.000-12.000 g × voor mitochondriale pelletering), en monsters opnieuw te suspenderen met breedlooppipetten. Eiwitbesmetting is voornamelijk het gevolg van onvolledige verwijdering van afval of vetvetinterferentie; Daarom wordt aanbevolen om de centrifugatiestap van 1.000 × g te herhalen, twee extra wasstappen van 12.000 × g te bevatten, en het zorgvuldig verwijderen van vetweefsel. Abnormale mitochondriale membraanpotentiaal wordt vaak geassocieerd met mechanische schade of temperatuurschommelingen. Overmatige homogenisatie moet daarom worden vermeden, de gehele procedure moet op ijs worden uitgevoerd en binnen 60-90 minuten worden afgerond, en isolatiebuffers moeten worden aangevuld met EGTA en 0,5% BSA. Onvolledige homogenisatie kan worden verbeterd door te zorgen voor een adequate enzymatische vertering, het kiezen van een geschikte homogenisator en het uitvoeren van post-homogenisatiefiltratie.

Hoewel het huidige protocol de efficiëntie en zuiverheid van mitochondriale isolatie aanzienlijk verbetert, blijven er nog enkele beperkingen bestaan. Ten eerste is de procedure sterk afhankelijk van de versheid van het weefsel; Idealiter worden weefselmonsters binnen 1 uur postmortem verwerkt. Ten tweede kan residueel trypsine mitochondriale oppervlakteproteïnen, inclusief translocase-gerelateerde eiwitten, afbreken als het tijdens het wassen niet voldoende wordt verwijderd, wat de latere celopname-efficiëntie kan beïnvloeden. Ten derde blijft de mitochondriale opslagtijd beperkt, aangezien langdurige opslag bij 4 °C of cryopreservatie de mitochondriale activiteit aanzienlijk vermindert.

Op translationeel niveau blijven er aanvullende uitdagingen bestaan, waaronder het verbeteren van de efficiëntie van de levering in vivo , het begrijpen van langetermijnmechanismen van mitochondriale integratie en het verduidelijken van mogelijke interacties tussen getransplanteerde mitochondriën en het gastheergenoom. Met voortdurende vooruitgang in mitochondriale isolatie- en zuiveringstechnologieën worden verdere methodologische innovaties verwacht om de klinische vertaling van mitochondriale transplantatietherapie te versnellen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-Cytochrome C antibody	Abcam	EPR1327	Mitochondrial Characterization
Anti-fade mounting medium	PlantChemMed	PC-90016	Reduce photobleaching of fluorescent dyes
BCA Protein Assay Kit	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PQ003	Protein concentration assay
Beta-actin antibody	Cell Signaling technology	3700s	Beta-actin antibody was used to detect the purity of isolated mitochondria
BSA	Sigma	A6003	During isolation, it binds free fatty acids to protect mitochondrial activity.
Centrifuge	Eppendorf	5418R	4 °C Centrifugation
CCCP	Solarbio	C6700	to uncouple mitochondrial oxidative phosphorylation and induce maximal proton leakage
Confocal Laser Scanning Microscope	Olympus Corporation	FV4000	Immunofluorescence Staining Observation
COX IV polyclonal antibody	Proteintech	11242-1-AP	Mitochondrial Characterization
DAPI	Plant Chem Medicine	PC-90004	For nuclear counterstaining
D-mannitol	Solarbio	IM00402	maintain osmotic balance and prevent mitochondrial swelling during isolation
EGTA	Sigma	E4378	Commonly used in mitochondrial isolation buffers to protect mitochondrial function by specifically binding Ca2+
Fetal bovine serum	Every Green	11011-08611	Culture of L929 cells
Forceps	RWD Life Science Co., Ltd.	F11003-11	Used to grasp, hold and lift tissues
Glass homogenizer	Beyotime	FGH005	Used for tissue homogenization and isolation of mitochondria
Glutaraldehyde	LEAGENE	DF0151	It rapidly fixes and stabilizes cellular ultrastructure by cross-linking proteins, preventing autolysis to preserve the natural morphology of organelles.
HEPES	Thermo Fisher	J67485	Provides a stable pH environment.
Incubator	Thermo Fisher	51032874	Culture of L929 cells
JC-1	Solarbio	M8650	Detecting changes in the membrane potential of purified mitochondria.
L929 cell line	Procell	CL-0137	For mitochondrial endocytosis assay
Lead citrate	Sigma	15326	to stain ultrathin sections for fine subcellular structure observation.
MEM Alpha basic (1x)	Gibco	6125510	Culture of L929 cells
Methanol	Fuyu Chemical (China)	67-56-1	As a component of the transfer buffer, it is used to remove SDS and facilitate the transfer of proteins from the gel to the solid-phase membrane.
Microplate Reader	Thermo Fisher	Varioskan LUX	Measure the absorbance of JC-1-stained mitochondria
Mitochondrial Membrane Potential Detection Kit	Solarbio	M8650	Detection of Mitochondrial Membrane Potential in Skeletal Muscle
Mitochondrial isolation Buffer	Solarbio	SM0020	Kits for Extraction Based on Differential Centrifugation
Mitochondria Storage Buffer	Solarbio	SM0020	For mitochondrial preservation
Mito Tracker  Red CMXRos	Yeasen Biotechnology	40741ES50	Mitochondrial Characterization
MOPS	MedChemExpress	HY-D0859	AS a buffer in solution preparation
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Mouse Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAM001	RGAM001 targets Mouse IgG (H+L) in Western blot
Multi-rAb HRP-Goat Anti-Rabbit Recombinant Secondary Antibody (H+L)	Proteintech	RGAR001	RGAR001 targets to Rabbit IgG (H+L) in ELISA and Western blot
Non-fat dry milk	NCM Biotech	WB6503	It is mainly used as a blocking agent to reduce background signal by occupying non-specific binding sites on the membrane.
O2k-FluoRespirometer	Oroboros Instruments	O2K	Determine mitochondrial respiratory function and oxygen metabolism.
Osmium tetroxide	Sigma	75633	or postfixation to preserve lipids and enhance membrane contrast in TEM samples.
PBS (1x)	Plant Chem Medicine	PC-00003	Clean Muscle Tissue
Penicillin-Streptomycin	Procell	PB180120	Culture of L929 cells
Phalloidin-488	Beyotime	C1035	Label cytoskeletal F-actin for fluorescence microscopic imaging
Polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane	Millipore (Merck)	IPVH00010	Western blotting
PowerPac Basic	BIO-RAD	164-5050	For protein separation by SDS-PAGE electrophoresis
Precast gradient polyacrylamide gel (4–12%)	ACE Bioscience	ET12412LGel	Used for SDS-PAGE separation of mitochondrial and cellular total proteins
Protease inhibitor	Shaanxi Zhonghui Hecai Biomedical Technology	PL032	Inhibits the activity of endogenous and exogenous proteases, preventing the degradation of target proteins during sample processing.
RIPA lysis buffer	Zhonghui Hecai Biotechnology Co., Ltd.	PL001-2A	Used for total protein extraction of animal and cellular tissues
Sodium Chloride Injection (0.9%)	Xi’an Jingshuang Shuanghe Pharmaceutical Co., Ltd.	Approval No. H61020014	Cell/tissue experimental buffering, rinsing and osmotic pressure maintenance
Sterile gloves	Jiangsu Yangzi Lide Medical Devices Co., Ltd.	YMZ000-1	Isolate contamination and protect operators and experimental samples
Sucrose	Sucrose	S818048	Provides osmotic support and maintains mitochondrial morphology and functional integrity.
TBST	NCM Biotech	WB20500	Washing to reduce background, serving as a diluent for antibodies and blocking solutions, while protecting the stability of antigen-antibody binding by maintaining a stable pH and ionic environment.
Tissue Homogenate Assay Kit(contains Adenosine diphosphate (ADP),Succinate,Rotenone,Antimycin A,Oligomycin,Pyruvate,Malate, Glutamate,Ascorbate,N,N,N',N'- tetramethyl-p-phenylenediamine (TMPD))	Beijing Huawei Zhongyi Technology Co., Ltd.	023012	Detection of mitochondrial OCR in tissue homogenate adapted for Oroboros O2k respirometer
Tissue scissors	RWD Life Science Co., Ltd.	S12003-09	For cutting and dissecting soft tissues, separating organs and fascia in animal dissection
Transmission electron microscope	HITACHI	HT7800	Analyze the ultrastructural morphology of mitochondria
Trypsin	Plant Chem Medicine	PC-90001	Organ pre-digestion
Universal Antibody Diluent	NCM Biotech	WB100D	Antibody Diluent