Kwantificatie van embryonale dodelijkheidsgraad bij Caenorhabditis elegans

Samenvatting

Dit protocol biedt een eenvoudige, goedkope procedure om het tempo van embryonale dodelijkheid bij Caenorhabditis elegans te kwantificeren. Het maakt eenvoudige detectie van embryonale afwijkingen in populaties mogelijk zonder gespecialiseerde apparatuur of wormplukexpertise. Het protocol kan worden gebruikt om de effecten van genetische mutaties, RNA-interferentie-gemedieerde gen-knockdowns en dieet te kwantificeren.

Samenvatting

Embryonale lethaliteit is een hoeksteen fenotype dat wordt gebruikt in onderzoek naar Caenorhabditis elegans om ontwikkelingsafwijkingen te karakteriseren die voortkomen uit factoren zoals toxische blootstelling en genetische mutaties. Daarom is het nauwkeurig kwantificeren van de penetrantie van embryonale dodelijkheid cruciaal om de mechanismen en impact van deze verstoringen op de ontwikkeling van dieren te begrijpen. Hoewel geautomatiseerde scoreplatforms bestaan, vereisen deze benaderingen vaak aanzienlijke financiële investeringen en gespecialiseerde hardware of software. Dit artikel beschrijft een low-tech, goedkope assay die embryonale dodelijkheid kwantificeert door het percentage embryo's te meten dat succesvol niet uitkomt. Opvallend is dat deze versie van de assay de noodzaak van een wormpluik overbodig maakt, waardoor het uitzonderlijk geschikt is voor beginners. Een extra voordeel van deze aanpak is dat elke technische test assays van meerdere dieren repliceert, waardoor de mogelijke biases van enkelworm-assays worden vermeden. Dit protocol bevat een bespreking van kritieke parameters, zoals het minimale aantal nakomelingen dat nodig is om fenotypepenetrantie nauwkeurig vast te leggen en de onderbouwing van de methodologie. Tot slot geven we richtlijnen voor het aanpassen van de assay om de effecten van gen-knockdown te beoordelen via RNA-interferentie, farmacologische behandelingen of voedingssupplementen, waarmee we een veelzijdig en toegankelijk hulpmiddel toevoegen aan de toolkit van C. elegans-onderzoekers .

Inleiding

Embryonale dodelijkheid is een cruciaal fenotype voor het beoordelen van de rollen van genen en omgevingsfactoren in de vroege ontwikkeling. C. elegans is een krachtig model voor het bestuderen van ontwikkelingsprocessen vanwege zijn invariante cellijn, transparante lichaam en snelle levenscyclus¹. C. elegans embryonale letaliteit kan worden gebruikt om de ontwikkelingsintegriteit te beoordelen onder chemische, farmacologische, nutritionele en genetische verstoringen 2,3,4,5. Daarom zouden toegankelijke en veelzijdige methoden om embryonale dodelijkheid nauwkeurig te kwantificeren de onderzoeksgemeenschap ten goede komen.

Geavanceerde high-throughput en high-content methoden die embryogenese bestuderen, zijn afhankelijk van gespecialiseerde beeldvormingssystemen en software, wat vaak aanzienlijke financiële investeringen vereist ^4,6,7, terwijl eenvoudigere high-throughput benaderingen voornamelijk kwalitatieve uitlezingen^{leveren 8,9}. Klassieke methoden daarentegen gebruiken een handmatige, goedkope aanpak waarbij doorgaans herhaalde overdracht van individuele hermafrodieten met een wormpriem wordt gebruikt om de embryonale dodelijkheid van het hele broed^te beoordelen. Deze methode kan echter technisch uitdagend zijn voor beginners en heeft beperkte schaalbaarheid. Daarnaast kwantificeren klassieke broedgrootte-gebaseerde assays de embryonale levensvatbaarheid bij de nakomelingen van een alleenstaande moeder, wat onbedoelde bias kan introduceren.

Het algemene doel van deze methode is om een alternatieve, eenvoudige, kosteneffectieve en veelzijdige benadering te bieden voor het kwantificeren van embryonale levensvatbaarheid bij gemiddelde doorvoer. Deze methode meet de mate van embryonale dodelijkheid bij de nakomelingen van meerdere dieren per replica, vereist geen wormpriem en vermijdt gespecialiseerde of kostbare apparatuur. De studie laat ook zien hoe de methode kan worden toegepast op veelvoorkomende verstoringen, zoals RNA-interferentie en geneesmiddel- of nutriëntentests.

Protocol

1. C. elegans-onderhoud

OPMERKING: Gedetailleerde richtlijnen over de verzorging van C. elegans zijn te vinden in WormBook¹¹.

1. Bereid onderhoudsplaten voor Nematode Growth Medium (NGM).
   1. Om 1 L NGM te maken, combineer je 3 g NaCl, 2,5 g bacteriologische pepton en 17 g agar in een fles van 2 liter. Voeg 975 ml gedestilleerd water en een roerreep toe, en autoclave dan 20 minuten bij 121 °C.
   2. Laat het medium afkoelen tot 55 °C in een waterbad. Plaats de fles op een roerplaat en voeg met behulp van de aseptische techniek 25 mL 1 M kaliumfosfaatbuffer en 1 ml elk van de volgende toe: 1 M MgSO₄, 1 M CaCl₂ en 5 mg/mL cholesterol. Giet ongeveer 25 ml in elke 100 mm plaat.
2. Bereid nachtelijke E. coli OP50-kweeken voor.
   1. Met behulp van aseptische techniek vul je een 1 L Erlenmeyer-kolf tot een vijfde van het volume (200 mL) met LB-medium. Inoculeer het medium met een enkele kolonie E. coli OP50 met behulp van een steriele inoculatielus. Incubeer 's nachts bij 37 °C op een orbitale shaker bij 200 rpm.
3. Zaad-NGM-onderhoudsplaten met E. coli OP50 (Figuur 1A).
   1. Overbreng de E. coli OP50-cultuur in autoclaveerde centrifugeflessen en centrifugeer deze gedurende 30 minuten bij 3.500 x g bij kamertemperatuur. Suspendeer de bacteriële pellet opnieuw in een twintigste van het oorspronkelijke volume. Gebruik 1–1,5 mL geconcentreerde cultuur om elke 100 mm NGM-plaat te zaaien.
   2. Incubeer de platen een nacht op kamertemperatuur zodat de bacteriën kunnen groeien.
      OPMERKING: Deze onderhoudsplaten hebben een hoge dichtheid aan bacteriën om tot 4.000 wormen per plaat te ondersteunen, wat wenselijk is bij het uitvoeren van veel assays of het werken met een langzaam groeiende stam van C. elegans. Met zaden bezaaide onderhoudsplaten kunnen tot 1 maand in de koelkast worden bewaard op 4 °C.
4. Vestig een primaire C. elegans-cultuur (Figuur 1A).
   1. Gebruik een steriele pipettip om een klein stukje agar met ~1.000 wormen van een verhongerde onderhoudsplaat te verwijderen. Leg het agarblok op een gezaadde NGM-plaat.
   2. Plaats het nieuwe bord in een plastic bakje en broed het uit bij 20 °C gedurende 3 dagen, totdat de wormen zwanger zijn en eieren leggen. Zorg ervoor dat het bacteriële gazon voldoende is en dat de wormenpopulatie niet verhongert. Op dit punt is de wormpopulatie klaar voor het experiment.

2. Voorbereiding van experimentele media en bacterieculturen

OPMERKING: In deze stap gaat u door met Methode 1 om het effect van RNAi-gemedieerde genknockdown te testen, of Methode 2 om voedingssupplementen te onderzoeken.

1. Methode 1: Bereid experimentele NGM-platen voor RNAi voor door te voeden.
   1. Bereid 1 L NGM zoals beschreven in stap 1.1, voeg vervolgens met behulp van de aseptische techniek 1 ml 1 M IPTG en 1 ml 50 mg/mL ampicilline toe. Giet ongeveer 5 ml in elke 35 mm plaat.
   2. Inoculeer het gewenste aantal E. coli HT115 RNAi-voedingsklonen met L4440-plasmiden die gericht zijn op C . elegans-genen van interesse, samen met de lege vectorcontrole. Kies een enkele kolonie met een inoculatielus en breng deze over in 1,5 mL LB met 50 μg/mL ampicilline. Incubeer 18 uur bij 37 °C op een orbitale shaker bij 200 rpm.
   3. Zaad 35 mm NGM-platen met ampicilline en IPTG met 100 μL nachtelijke E. coli HT115-cultuur, waarbij per conditie twee technische replica's worden voorbereid. Incubeer de platen een nacht op kamertemperatuur om bacteriële groei mogelijk te maken en de productie van dubbelstrengs RNA te induceren. Bewaar een gelijk aantal ongezaaide borden op 4 °C voor later gebruik bij het overzetten van de eieren.
2. Methode 2: Bereid experimentele NGM-platen voor met een voedings- of medicijnsupplement.
   1. Bereid 1,5x geconcentreerd NGM door de instructies in stap 1.1 te volgen, maar voeg 642 mL gedestilleerd water toe in plaats van 975 mL. Bewaar het bereide medium in een waterbad van 55 °C.
   2. Maak een watergebaseerde bouillon van het aanvullend supplement van 3 keer de streefwaarde (bijvoorbeeld, om platen met 40 mM natriumformiat te bereiden, maak een bouillon van 120 mM). Bereken het benodigde voorraadvolume door het aantal experimentele platen te vermenigvuldigen met 1,666 mL (een derde van het plaatvolume). Gebruik een spuitfilter om de bouillon te filtersteriliseren en verwarm hem vervolgens tot 55 °C in een waterbad.
   3. In een 50 mL conische buis mix je 2 delen 1,5x NGM met 1 deel supplement. Voor geen supplementencontrole, meng 2 delen 1,5x NGM met 1 deel heet, steriel water. Meng voorzichtig door de buis 10 keer om te draaien, en giet vervolgens met aseptische techniek snel ongeveer 5 ml medium in elke 35 mm plaat.
      OPMERKING: 1,5x NGM wordt gebruikt om middelmatige verdunning te compenseren wanneer grote hoeveelheden supplement worden toegevoegd. Als het geneesmiddel of de metabolietvoorraad echter geconcentreerd is tot 100× of meer van de uiteindelijke concentratie, kan gewone NGM worden gebruikt in plaats van 1,5× NGM. Bij het suppleren met een organisch zuur helpt het gebruik van natriumzout om een daling van de gemiddelde pH te voorkomen.
   4. Met aseptische techniek vul je een Erlenmeyer-kolf van 50 ml tot een vijfde van het volume (10 mL) met LB-medium. Inoculeer met een kolonie E. coli OP50 en breng 's nachts uit bij 37 °C op een orbitale shaker bij 200 toeren.
   5. Zaad 35 mm NGM-platen met 100 μL nachtelijke E. coli OP50-cultuur, waarbij per conditie twee technische replica's worden voorbereid. Breng de platen een nacht uit op kamertemperatuur. Bewaar een gelijk aantal ongezaaide borden op 4 °C voor later gebruik bij het overzetten van de eieren.

3. Het verkrijgen van een gesynchroniseerde populatie van L1-larven

1. Bereid alkalische bleekoplossing voor door 7 ml steriel water, 2 mL 5% natriumhypochlorietoplossing en 1 mL 5 N NaOH te mengen.
2. Bereid de M9-buffer voor door 3 g KH₂PO₄, 6 g Na₂HPO₄ en 5 g NaCl op te lossen in 1 L gedestilleerd water, en pas vervolgens de pH aan op 6,5. Autoclaaf 20 minuten bij 121 °C, laat de oplossing afkoelen en voeg dan aseptisch 1 mL van 1 M MgSO4 toe.
3. Was zwangere volwassen wormen (stap 1.4.2) van de plaat met M9-buffer en doe ze over in een 15 mL conische buis. Centrifugeer op 350 x g gedurende 2 minuten, aspireer het supernatant en vul de buis met verse M9-buffer. Herhaal de wash twee keer.
4. Voeg 2 ml M9-buffer en 2 ml alkalische bleekoplossing toe aan de wormpellet. Vortex en schudden krachtig, controleer periodiek onder de microscoop totdat bijna alle wormen zijn opgelost.
5. Vul de buis met M9-buffer en centrifugeer op 350 x g gedurende 2 minuten. Verwijder het supernatant door de buis om te draaien en was daarna vier keer met M9 buffer. Zorg ervoor dat de eerste wasbeurt direct na het lyseren van de wormen plaatsvindt om overbleeking te voorkomen. Na de laatste wasbeurt vul je de buis met 8 mL M9-buffer en broeed je 18–20 uur op een wipstoel, totdat de eieren uitkomen.

4. Het cultiveren van moederlijke populaties

1. Plaats vijf druppels wormsuspensie van 3 μL op een glazen schuilplaats en tel het aantal uitgekomen L1-larven onder een microscoop. Deel het totale aantal door 15 om de concentratie per microliter te verkrijgen.
2. Plaats 30 L1-larven op elke gezaaide 35 mm plaat en bevrucht 72 uur bij 20 °C. Als de experimentele omstandigheden een ontwikkelingsachterstand veroorzaken, verleng dan de broedtijd totdat de wormen zwanger worden en beginnen met het leggen van eieren (Figuur 1B).

5. Het overplaatsen van embryo's naar uitkomplaten

1. Haal de niet-ontzaaide 35 mm platen uit de koelkast en laat ze op kamertemperatuur komen.
2. Onderzoek de wormplaten onder een microscoop en bevestig dat ze meer dan 100 embryo's bevatten, zonder dat er uitgekomen L1-larven aanwezig zijn.
3. Vul de plaat voorzichtig met M9-buffer. Gebruik een vacuümlijn om de vloeistof te aspireren en de moederlijke populatie te verwijderen. Zorg ervoor dat er geen volwassen wormen op het bord achterblijven.
4. Vul een micropipettip met 200 μL M9-buffer en pipetteer krachtig op en neer om embryo's los te maken van het bacteriële gazon. Terwijl je door de microscoop kijkt, leid je de pipetpunt naar embryo-dichte gebieden.
5. Neem een onontzaaide plaat en pipetteer een druppel embryo-suspensie in het midden. Bekijk de druppel onder de microscoop. Als het niet 100–300 embryo's bevat, voeg dan meer embryo-suspension toe totdat dit bereik is bereikt. Zorg ervoor dat er geen wormen van de ouderpopulatie met de embryo's worden overgedragen.
6. Laat de vloeistof drogen en becubeer de transferplaten vervolgens bij 20 °C gedurende minstens 24 uur.
   OPMERKING: Als L1-larven al aanwezig zijn op de experimentele plaat, gebruik dan een vacuümlijn in plaats van een M9-wash om de gehele moederpopulatie één voor één te verwijderen. Dit voorkomt dat L1-jongen worden weggespoeld, die niet aan het bacteriële gazon blijven plakken zoals embryo's dat doen. Ga verder met de overdracht van nakomelingen, die nu zowel embryo's als L1-larven zal omvatten. Zorg ervoor dat dezelfde aanpak op alle omstandigheden wordt toegepast.

Figuur 1: Experimentele tijdlijn en schema van de belangrijkste stappen in de embryonale lethaliteitsassay. (A) Stroomdiagram tijdlijn dat de volledige duur van het experimentele protocol weergeeft, van voorbereiding van onderhoudsmedia tot het scoren van uitslagplaten. Belangrijke procedures worden aangegeven voor de overeenkomstige dagen van het experiment. (B) Schema van de embryonale lethaliteitstest (stappen 4–6). Op dag 4 worden gesynchroniseerde L1-larven toegevoegd aan de experimentele RNAi- of supplementplaten om een moederpopulatie vast te stellen. Na 72 uur, op dag 7, zodra wormen eieren hebben gelegd, wordt de moederpopulatie weggespoeld terwijl embryo's aan het bacteriële gazon blijven vastzitten. Embryo's worden vervolgens met een pipet van het gazon gespoeld en overgebracht op een uitkomstplaat, met minstens 100 embryo's per plaat. Na 24 uur broeden worden uitgekomen larven en niet-uitgekomen embryo's geteld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Scoreplaten

1. Gebruik een permanente stift om een raster van ongeveer 4 mm × 4 mm op het deksel van een 35 mm petrischaal te tekenen, en plaats het deksel dan onder het bord. Gebruik het raster als leidraad en tel onder een microscoop het aantal L1-larven en niet-uitgekomen embryo's met een handheld klikteller.
2. Combineer de tellingen van technische replicates om een passende weging van elke replicate te garanderen op basis van het aantal nakomelingen. Specifiek tel je het aantal niet-uitgekomen embryo's en uitgekomen larven op over technische replica's.
3. Bereken één embryonale dodelijkheidssnelheid per biologische replica door het aantal embryo's (niet-uitgekomen wormen) te delen door het totale aantal wormen en embryo's, en vermenigvuldigen met 100 om de waarde als percentage uit te drukken.
   OPMERKING: Als een plaat alleen uitgekomen larven of alleen embryo's bevat, kan deze telstap worden overgeslagen, aangezien de embryonale dodelijkheidsgraad respectievelijk 0 (0%) of 1 (100%) is.

7. Statistische analyse

1. Herhaal het hele experiment minstens drie keer om onafhankelijke biologische replica's te verkrijgen. Voor elke biologische replicatie wordt per conditie twee technische replicateplaten gebruikt, met minimaal 100 embryo's per technische replicatie.
2. Bepaal of embryonale dodelijkheidspercentages significant verschillen tussen aandoeningen met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door post-hoc paargewijze Student's t-tests met meervoudige testcorrectie, zoals de Benjamini-Hochberg-methode.
   OPMERKING: Het combineren van twee technische replicaten levert minimaal 200 embryo's per biologische replica op. Dit voldoet aan de steekproefgroottevereiste (~184 embryo's/conditie) geschat door de R-basisfunctie power.prop.test, om een verschil van 15 procent in lethaliteit te detecteren (bijvoorbeeld 20% versus 35%) met 90% vermogen en een significantieniveau van α = 0,05.

Resultaten

De embryonale lethaliteitstest werd uitgevoerd bij twee stammen: wildtype N2 en de RNAi-hypersensitieve stam rrf-3(pk1426). Met RNAi door voeding te gebruiken, hebben we genen uitgeschakeld die eerder embryonale lethaliteit veroorzaakten in high-throughput screens ^9,12. Figuur 2 geeft een representatieve demonstratie van de assayprestatie. T04G9.4 knockdown veroorzaakte bijna volledig penetrante embryonale lethaliteit bij zo...

Discussie

Verschillende stappen zijn cruciaal voor de reproduceerbaarheid en nauwkeurigheid van de assay. Ten eerste moet de bleekstap zorgvuldig worden getimed om volwassen wormen op te lossen zonder de embryo's te beschadigen. Een ander belangrijk punt is het overplaatsen van voldoende embryo's om te tellen: te weinig verminderen de precisie, terwijl te veel tellen onnodig saai maakt. Vervolgens moet de embryotransfer plaatsvinden voordat de embryo's beginnen uit te komen. Anders worden kuikens ...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ampicillin natriumzout	Sigma-Aldrich	A9518
Bacteriologische pepton	Fischer Scientific	DF0118-17-0
C. elegans N2	Caenorhabditis Genetics Center	N2	wild type
C. elegans NL2099	Caenorhabditis Genetics Center	NL2099	rrf-3(pk1426) II. RNAi-gevoelig
Calciumchloride, watervrij	Sigma-Aldrich	746495
Cholesterol	Sigma-Aldrich	C3045
Conische buizen, 15 mL	VWR	60818-725
Kweekbuisjes, 14 mL	VWR	470150-966
Diafragmavacuümpomp	Amazon	TC-100
Dissectiemicroscoop	AmScope	SM-2
Escherichia coli HT115	Caenorhabditis Genetics Center		RNAse III-deficiënt, gebruikt voor RNAi door voerexperimenten
Escherichia coli OP50	Caenorhabditis Genetics Center
Gegranuleerde agar	Fischer Scientific	BP97445
Handteller	LabDepot	HTCP01
IPTG, dioxaanvrij (Isopropyl-b-D-thiogalactoside)	US Biological	I8500
LB-bouillon (Miller)	US Biological	L1520	Om LB-medium te maken, lost u 25 g LB-poeder op in 1 L gedistilleerd water. Steriliseer gedurende 20 min bij 121,1 °C.
Luer Lok wegwerpspuit	BH Supplies	BH20LL
Magnesiumsulfaat	Sigma-Aldrich	M2643
Microscoopglaasjes	Sail Brand	7101
Petrischalen, 100 mm	Tritech Research	T3371
Petrischalen, 35 mm	Tritech Research	T3501
Kaliumfosfaatbuffer (PPB)			Om kaliumfosfaatbuffer (1 M) te maken, lost u 98 g kaliumfosfaat monobasisch en 48 g kaliumfosfaat dibasisch op in 1 L gedistilleerd water. Breng de pH op 6. Steriliseer gedurende 20 min bij 121 °C.
Kaliumfosfaat dibasisch	Sigma-Aldrich	795496
Kaliumfosfaat monobasisch	Sigma-Aldrich	529568
Wiegelaar (nutterende mixer)	Corning LSE	6720
Serologische pipetten, 25 mL	Corning	4489
Serologische pipetten, 5 mL	Celltreat	229235
Schudende incubator Infors Multitron	INFORS HT	NA
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S9888
Natriumhydroxideoplossing, 5 N	Fisher Scientific	SS256-500
Natriumhypochloriet, 5%	LabDepot	LC246302
Natriumfosfaat dibasisch	Sigma-Aldrich	S9763
Sorvall ST1 Plus Centrifuge	Thermo Scientific	75016030
Rolplaat	ONilab	ONi28-S
Spuitfilters	Semmerfeld	JQP033022QE1
Waterbad	FOUR E's Scientific	WB401