Mapping Microglial Parameters Software (MMPS): Een open-source, gebruiksvriendelijke tool voor kwantitatieve microglia-morfologieanalyse

Samenvatting

Mapping Microglial Parameters Software (MMPS) is een gebruiksvriendelijke analysepijplijn die geen codeerexpertise vereist en semi-automatiseert single-cel microgliale morfologieanalyse op basis van immunofluorescentiebeelden. Gevalideerd in een door knaagdieren geïnduceerd neuro-inflammatiemodel, detecteert MMPS reproductief activatie-geassocieerde morfologische veranderingen en maakt gestandaardiseerde, schaalbare microgliale fenotypering mogelijk.

Samenvatting

Microglia zijn myeloïde-afgeleide immuuncellen van het centrale zenuwstelsel die weefselafbraak en -remodellering na neurologisch letsel begeleiden en zijn uitgegroeid tot veelbelovende therapeutische doelwitten bij verschillende neurodegeneratieve ziekten. Kwantitatieve analyse van microgliale morfologie kan subtiele verschillen tussen microgliale subpopulaties aan het licht brengen, terwijl belangrijke in situ informatie behouden blijft. Veel momenteel beschikbare microgliale morfologieanalyseplatforms zijn echter niet openbaar toegankelijk of vereisen gespecialiseerde computationele expertise, waardoor hun brede adoptie wordt beperkt. Om deze beperkingen aan te pakken, werd een open-source microgliale morfologie-analyseplatform ontwikkeld, genaamd Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), met gebruik van Python 3.11. MMPS is compatibel met op immunofluorescentie gebaseerde workflows en vereist geen codeerexpertise voor installatie of gebruik. De software automatiseert semi-cel microgliale morfologie-analyse via een toegankelijke grafische gebruikersinterface en bevat aanpasbare beeldverwerking en maskergeneratieworkflows. De studie omvat het valideren van MMPS met behulp van een door knaagdieren geïnduceerd neuro-inflammatiemodel (LPS). Kwantitatieve dieranalyse toonde aan dat microglia van met LPS behandelde dieren significant een vergroot soma-oppervlak vertoonden (p < 0,01) en een verminderde celomtrek (p < 0,05) vergeleken met controles met voertuigbehandelde controles, consistent met morfologische kenmerken die geassocieerd zijn met microgliale activatie en neuro-ontsteking. Al met al biedt MMPS een gestandaardiseerd, reproduceerbaar platform voor kwantitatieve analyse van microgliale morfologie in laboratoria.

Inleiding

Microglia zijn aangeboren immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CZS) die hun omgeving continu onderzoeken op pathogenen en weefselschade¹. Bij activatie trekken microglia hun processen terug en gaan over van een homeostatische, vertakte morfologie naar een amoeboïde fenotype ^2,3. Bij neurodegeneratieve ziekten zoals ischemische beroerte ^4,5 en de ziekte van Alzheimer ^6,7. Microglia houden neuro-ontsteking vaak in stand door aanhoudende cytokineproductie, uitgebreide weefselafbraak en fagocytose². Deze processen dragen bij aan verstoring van de neurovasculaire eenheid, waardoor microgliale activatie en CNS-letsel⁸ verder worden verergerd, waardoor microglia veelbelovende therapeutische doelen^{zijn 9,10}.

Een benadering om subtiele verschillen tussen microgliale subpopulaties bij neurodegeneratieve ziekten te identificeren, is door morfologische analyse. Dit wordt vaak uitgevoerd met Cx3CR1-GFP-dieren met in vivo tweefotonmicroscopie¹¹ of via immunofluorescentie (IF) labeling van gevestigde microgliale markers zoals het geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul-1 (Iba1) of P2Y purinoceptorreceptor¹². Hoewel microglia na een letsel vaak overgaan tussen homeostatische en amoeboïde morfologieën, hebben eerdere studies aangetoond dat microglia ook aanvullende fenotypes kunnen aannemen, waaronder hyperverramde microglia ^3,13, honingraatmicroglia ^3,14, reactieve microglia¹⁵ en staafmicroglia ^3,16. Microgliale morfologiestudies zijn echter vaak gebaseerd op handmatige categorisering van homeostatische en amoeboïde fenotypen. Deze benaderingen vereisen gespecialiseerde analysepijplijnen die vaak geen standaardisatie tussen laboratoria hebben en het onderscheid maken tussen vergelijkbare morfologieën, zoals homeostatische versus hypervertakke fenotypen, zelfs voor getraind personeel^{moeilijk 17}. Bovendien vereist IF-gebaseerde analyse van subtiele morfologische veranderingen beeldvorming met hoge resolutie, wat extra technische uitdagingen kan opleveren.

Om deze beperkingen aan te pakken, zijn er verschillende analytische platforms ontwikkeld die semi-automatisch¹¹ of¹⁸ microglia detecteren en meerdere binaire representaties van de cellen genereren, aangeduid als "maskers", over door de gebruiker gedefinieerde doelgebieden (bijv. 200–800 μm²). Deze benaderingen verminderen gebruikersbias, verbeteren de reproduceerbaarheid en verhogen de analytische efficiëntie. Ondanks deze vooruitgang hebben veel momenteel beschikbare softwareplatforms beperkingen die brede adoptie beperken, waaronder een gebrek aan open-source toegankelijkheid¹⁷, eisen voor codeerexpertise 11,19,20, afhankelijkheid van in vivo twee-foton microscopiesystemen^11,19, afwezigheid van intuïtieve grafische gebruikersinterfaces 11,21,22, traag verwerkingssnelheden¹¹, of afhankelijkheid van commerciële softwareplatforms 12,19,21. Hoewel recente studies verschillende van deze kwesties zijn gaan behandelen, blijven veel bestaande platforms slecht geschikt voor IF-gebaseerde workflows, die nog steeds veel worden gebruikt voor het bestuderen van microgliale morfologie.

Hier wordt een gebruikersgericht microgliale morfologieanalyseplatform gepresenteerd genaamd Mapping Microglial Parameters Software (MMPS). MMPS vereist geen programmeerexpertise, integreert met gevestigde ImageJ-gebaseerde workflows en is specifiek ontworpen voor gebruik met IF-images. De software is ontwikkeld in Python 3.11 en bevat concepten van eerder gepubliceerde open-source morfologieplatforms¹¹. MMPS beschikt over een intuïtieve grafische gebruikersinterface waarmee gebruikers grote hoeveelheden IF-afbeeldingen kunnen importeren en verwerken met behulp van meerdere aanpasbare beeldverwerkingsopties. Het platform bevat ook handmatige celselectie om overbemonsteringsartefacten die tijdens IF-beeldvorming worden geïntroduceerd te minimaliseren, evenals handmatige soma-omlijning om de opname van cellulaire processen in soma-metingen te voorkomen. Daarnaast bevat MMPS aanpasbare parameters voor maskergeneratie en meerdere kwaliteitsborgingsfuncties om de nauwkeurigheid van het masker te verbeteren. De software berekent verschillende veelgebruikte morfologische parameters, waaronder omtrek, gemiddelde zwaartepuntafstand, maskeroppervlak, excentriciteit, rondheid en soma-oppervlak. Voor meer geavanceerde studies zijn MMPS-gegenereerde outputs compatibel met meerdere ImageJ-plugins en kunnen ze verder worden geanalyseerd met bijbehorende plugins voor fractale, skelet- en rompanalyses.

MMPS werd gevalideerd met behulp van een door knaagdieren geïnduceerd neuro-inflammatiemodel door microgliale veranderingen in corticale laag IV te onderzoeken. Kwantitatieve analyse toonde aan dat LPS-toediening het microgliale soma oppervlak significant vergrootte terwijl de celperimeter werd verkleind in vergelijking met voertuigbehandelde controles, wat aangeeft dat MMPS subtiele morfologische veranderingen die samenhangen met microgliale activatie nauwkeurig detecteert.

Protocol

Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met het West Virginia University Institutional Animal Care and Use Committee (protocol #2109047180) en de Gids voor de Zorg en het Gebruik van Laboratoriumdieren, ondersteund door de National Institutes of Health. De apparatuur, reagentia en software die bij deze methode worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Proefdieren

1. Haal 10 mannelijke Sprague-Dawley ratten (2-3 maanden oud). Zodra ratten bij de dierenfaciliteit aankomen, moeten ze gegroepeerd worden gehuisvest onder een licht/donker-cyclus van 12 uur met ad libitum toegang tot voedsel en water. Bij aankomst worden ratten drie dagen geacclimeerd voordat ze worden gebruikt.
2. Wijs ratten willekeurig toe aan voertuig- of LPS-behandelde groepen (n = 5 ratten per groep).
   OPMERKING: Vanwege het kleine aantal ratten dat gebruikt wordt, kan een eenvoudige randomisatiestrategie worden toegepast, met computergegenereerde willekeurige getallen om de ratten aan een behandelgroep toe te wijzen.
3. Houd ratten in de gaten na behandeling van "ziektegedrag": gewichtsverlies (>15%), porfyrinesecretie, ademhalingsafwijkingen of verminderde activiteit.
   OPMERKING: Symptomen van ziektegedrag treden vaak binnen de eerste 12 uur na toediening op, dus injecteer middelen vroeg in de ochtend (6-8 uur), monitor het gedrag gedurende de dag en breng de ratten laat op de dag terug naar de faciliteit (17-19 uur).

2. Neuro-inflammatiemodel

1. Maak LPS (O111:B4) voorraadoplossing (10 mg/mL) door 50 mg LPS op te lossen in 5 mL fosfaatgeborrelde zoutoplossing.
   OPMERKING: LPS is een endotoxine. Onderzoekers moeten de SOP van hun instelling volgen voor het omgaan en afvoeren.
2. Weeg ratten en injecteer vervolgens intraperitoneaal met LPS (10 mg/kg) of PBS (voertuig).
3. Op basis van het gewicht van de ratten wordt een injectievolume tussen 150–300 μL verwacht.
4. Euthanaser ratten 24 uur na injectie via hartperfusie, gevolgd door onthoofding.
5. Verdoof ratten met ingeademde isoflurane (5%_{in O2}) gedurende 5–10 minuten. Bevestig de verdoving door het ontbreken van de terugtrekkingsreflex van het pedaal.
6. Terwijl je onder narcose is, maak je een incisie in de thoracale middenlijn om het middenrif en het borstbeen bloot te leggen. Klem het xiphoïedproces af met hemostaten om de thoracale holte bloot te leggen.
7. Snijd het middenrif en de ribbenkast naar de voorpoten toe om het hart bloot te leggen.
8. Klem de dalende aorta en de onderste vena cava af met hemostaten. Steek een 25-gauge winged needle in de linker ventrikel.
9. Perfuser ratten met ijskoude PBS (25 mL bij 30 mL/min) met behulp van een peristaltische pomp. Increer het linker atrium binnen enkele seconden na het starten van perfusie om de doorstromingsdrainage mogelijk te maken.
10. Perfusratten met 4% paraformaldehyde (25 mL bij 30 mL/min).
    VOORZICHTIG: Behandel paraformaldehyde met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen in een goed geventileerde omgeving. Voer paraformaldehydeafval af volgens institutionele en lokale regelgeving.
11. Onthoofd ratten met een guillotine na de perfusie.
    OPMERKING: Volg de richtlijnen van uw instelling met betrekking tot het loggen van onthoofdingen en het slijpen van messen.
12. Maak de schedel bloot door de hoofdhuid naar de oorschelp toe te trekken.
13. Breek het frontale been met behulp van hemostaten of rongeuren die in de oogkassen worden ingebracht.
14. Steek de pincet in het foramen magnum en haal de pariëtale botten eraf.
15. Verwijder de hersenen met fijne tangen en breng ze een nacht uit in 4% paraformaldehyde.
16. Hersenen achtereenvolgens overbrengen naar 20% sucrose en 30% sucrose 's nachts voor cryobescherming.

3. Immunofluorescentie

1. Bevries cryobeschermde hersenen in Tissue Tek O.C.T. Compound op droogijs.
2. Hersenen doorsnijden op 30 μm met behulp van een cryostaat.
3. Verzamel secties in PBS en plaats ze in netputten die in een plaat met 12 putten worden geplaatst.
4. Selecteer ten minste twee secties per rat die de voorste dorsale hippocampus bevatten.
5. Was secties in PBS gedurende 5 minuten twee keer tijdens het wiegen.
6. Permeabiliseer secties in 0,3% Triton X-100/PBS gedurende 45 minuten terwijl ik wieg.
   OPMERKING: Gebruik 3 mL oplossing per was- of incubatiestap, tenzij anders vermeld.
7. Was secties twee keer 5 minuten in PBS.
8. Verdun de antigeenophaaloplossing tot 1x in PBS en voeg 2 mL per put toe.
9. Broed secties uit bij 80°C gedurende 20 minuten met een waterbad.
10. Laat secties afkoelen tot kamertemperatuur voordat je verder gaat.
11. Was secties twee keer 5 minuten in PBS.
12. Blok secties in 10% ezelserum/0,05% Triton X-100/PBS gedurende 2 uur bij 37°C terwijl je schudt op 75 rpm.
13. Was secties in 1% donkey serum/0,05% Triton X-100/PBS gedurende 5 minuten drie keer.
14. Secties overbrengen in een nieuwe 12-wellplaat zonder de netputten die 500 μL primaire anti-Iba1-antistofoplossing bevatten, bereid in 1% donkey serum/0,05% Triton X-100/PBS.
15. Bereid negatieve controles voor door het primaire antilichaam uit de incubatieoplossing te laten.
16. Breng alle secties 's nachts uit bij 4°C op een orbitale rocker
17. Geef secties terug naar netputten.
18. Was secties drie keer in 1% ezelserum/0,05% Triton X-100/PBS gedurende 10 minuten.
19. Incubeer secties met anti-konijn secundair antilichaam (1:1000 verdunning) in 1% ezelserum/0,05% Triton X-100/PBS gedurende 1,5 uur bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Minimaliseer de lichtblootstelling tijdens alle volgende procedures en wikkel platen in aluminiumfolie om afbraak van fluoroforen te voorkomen.
20. Was secties twee keer 5 minuten in PBS.
21. Bevestig secties op microscoopobjectobjecten.
22. Luchtdroog glijdplaten in het donker gedurende >2 uur.
23. Coverslip-secties met wateroplosbare verbindingen.
24. Bereid negatiefcontrole-slides voor met behulp van een montagemedium.
25. Bewaar de dia's in een slidebox op kamertemperatuur in een donkere omgeving.

4. Beeldvorming

1. Identificeer de pixelgrootte van een beeldsysteem bij 40x vergroting. Als de schaal niet wordt gevonden, voeg dan een schaalbalk toe aan elke afbeelding.
2. Gebruik DAPI-kleuring om een dichte band van corticale kernen met lage vergroting te identificeren, overeenkomend met corticale laag IV.
3. Focus het beeld op het geïdentificeerde corticale gebied.
4. Schakel over op de 40x vergroting.
5. Pas de belichtingsinstellingen van het kanaal aan om de scheiding van DAPI- en Iba1-signaal van achtergrondfluorescentie te maximaliseren.
6. Verkrijg Z-stack beelden (> 30 stappen) die de volledige diepte van de microglia beslaan.
7. Genereer en sla een composiet projectiebeeld met maximale intensiteit op van de verkregen Z-stack van beide vlekken.
   OPMERKING: Optimaliseer de belichtings- en Z-stack-instellingen voor elke afbeelding om de signaalafstand tussen DAPI/Iba1 en achtergrondfluorescentie te maximaliseren. Slechte signaalafscheiding vermindert de nauwkeurigheid van maskergeneratie.

5. Software voor het in kaart brengen van microgliale parameters (MMPS)

1. Sla alle samengestelde afbeeldingen op in één afbeeldingsmap.
2. Maak een aparte uitvoermap aan voor door MMPS gegenereerde resultaten.
3. Download het MMPS standalone pakket of MMPS.py script uit de GitHub-repository.
4. Installeer alle afhankelijkheden die in het requirements.txt-bestand staan als je MMPS via MMPS.py start.
5. Open het MMPS-pakket of voer MMPS.py script uit.
6. Selecteer "Selecteer de afbeeldingsmap" en kies de afbeeldingsmap.
7. Selecteer "Selecteer Uitvoermap" en kies de uitvoermap.
8. Verleen maptoegangsrechten als het besturingssysteem daarom vraagt.
   OPMERKING: Aanvullende installatie-instructies, probleemoplossingsrichtlijnen en gebruiksvoorbeelden worden verstrekt in de aanvullende documentatie en de GitHub-repository.
9. Selecteer "Afbeeldingslabeling" en wijs dieridentificaties en behandelgroepen toe aan elke afbeelding.
   OPMERKING: Als afbeeldingslabeling wordt overgeslagen, vraagt MMPS om behandelgroep- en dieridentificaties voordat gegevens worden geëxporteerd.
10. Voer de pixelgrootte in onder het tabblad "Parameters".
11. Selecteer "Kalibreren vanaf schaalbalk" als de pixelgrootte onbekend is. Selecteer het begin- en eindpunt van de toonladderbalk wanneer daarom wordt gevraagd. Voer de bekende schaalstaafafstand in micrometers in.
12. Selecteer het fluorescentiekanaal met het microgliale signaal.
13. Selecteer afbeeldingen voor verwerking door het vakje naast elke afbeeldingsnaam aan te vinken. Verwerk beelden afzonderlijk wanneer achtergrondfluorescentie aanzienlijk verschilt tussen beelden.
14. Bekijk de tabbladen "Origineel", "Preview", "Verwerkt" en "Maskers" om beeldverwerkingsfasen te vergelijken.
15. Selecteer "Voortouw van de huidige afbeelding" om de instellingen voor beeldverwerking te evalueren.
16. Pas de rollen van de rollende achtergrond aftrek, denoising en verscherping aan waar nodig.
17. Gebruik rolling-ball-waarden tussen 5–150 pixels voor achtergrondaftrekking.
18. Gebruik denoiserende waarden tussen 3–7 pixels om ongelijkmatige verlichtingsartefacten te verminderen.
19. Gebruik scherppuntwaarden tussen 1–2 om de randdefinitie te verbeteren.
20. Selecteer "Verwerk geselecteerde afbeeldingen" na optimalisatie van de beeldverwerkingsinstellingen.
    OPMERKING: De verwerkingstijd van het beeld varieert afhankelijk van het aantal beelden en geselecteerde parameters.
21. Selecteer "Kies Somas (Alle Afbeeldingen)."
22. Selecteer "Kleur weergeven (C)" om RGB-composietafbeeldingen weer te geven. Selecteer "Kanalen..." en selecteer ongebruikte kanalen als de kleurvorming van het beeld vervormd lijkt.
23. Selecteer microgliale somas die DAPI- en Iba1-colocalisatie weergeven. Vermijd het selecteren van cellen die beeldgrenzen raken. Verwijder verkeerd geselecteerde soma-markers met de toets "Backspace" of "Delete".
24. Druk op "Enter" of "Return" om naar de volgende afbeelding te gaan.
25. Selecteer "Outline Somas (All)" nadat de soma-selectie is voltooid.
26. Schetsen de soma perimeter van elke geselecteerde microgliale cel. Sluit cellulaire processen uit de soma omtrek uit en gebruik minstens acht omlijningspunten per soma. Verwijder verkeerd geplaatste omlijnpunten met "Laatste punt ongedaan maken", "verwijderen" of "Backspace".
27. Pers "Enter," "Return," dubbelklik of rechtsklik om elke soma schets af te ronden.
28. Selecteer "Laatste overzicht opnieuw doen" om de vorige soma omzet te herhalen indien nodig.
29. Selecteer "Genereer alle maskers" na voltooiing van het soma outline.
30. Pas een minimale drempelwaarde toe om de opname van laag-intensiteit achtergrondpixels in maskers te beperken.
    OPMERKING: Hogere waarden behouden de nauwkeurigheid van soma ten koste van vertakkingen, terwijl lagere waarden de nauwkeurigheid van vertakkingen behouden ten koste van soma. Drempelwaarden tussen 10–30% zorgen doorgaans voor evenwichtige achtergrondonderdrukking en takbehoud.
    OPMERKING: De tijd van het maken van maskers varieert afhankelijk van het aantal geselecteerde cellen.
31. Selecteer "QA Alle maskers" om te beginnen met de kwaliteitsborging van maskers.
32. Reviewmaskers presenteerden van het grootste (800 μm²) tot het kleinste (200 μm²).
33. Vergelijk elk masker met de bijbehorende microglia met behulp van de tabbladen "Verwerkt" en "Masker".
34. Accepteer maskers met de sneltoets "A". Weiger maskers met de sneltoets "R". Druk op "B" om een acceptatie of afwijzing ongedaan te maken. Navigeer door de maskergroottes met de pijltjestoetsen op het toetsenbord.
35. Kies het grootste acceptabele masker dat microgliale vertakkingen nauwkeurig vastlegt zonder naburige cellen, overmatige achtergrond, beeldranden of schaalbalken toe te voegen.
    OPMERKING: Weiger maskers als er onzekerheid is over hun nauwkeurigheid.
    OPMERKING: Selecteer "Alle maskers verwijderen" en genereer de maskers opnieuw met een andere drempelwaarde als de meeste onnauwkeurig zijn.
36. Selecteer "Bereken eenvoudige kenmerken" nadat de kwaliteitscontrole van het masker is voltooid tot
    Bereken de gemiddelde zwaartepuntafstand, maskeroppervlak, omtrek, excentriciteit, rondheid en SOMA-grootte met behulp van geaccepteerde maskers en SOMA-omlijnen.
37. Zie Tabel 1 voor parameterdefinities en microgliale trends bij neuro-inflammatie.
38. Download "Sholl.py", "FractalAnalysis_ImageJ.py," en "SkeletonAnalysisImageJ.py" om aanvullende analyses uit te voeren.
39. Open "FractalAnalysis_ImageJ.py" als een Fiji-plugin voor fractale en rompanalyses.
40. Voer de locatie en pixelgrootte van de output directory in wanneer daarom wordt gevraagd. Selecteer de optie "alleen voor het grootste masker" als analyse van alleen het grootste geaccepteerde masker gewenst is.
41. Open "Sholl.py" als een Fiji-plugin voor Sholl-analyse.
42. Voer de locatie en pixelgrootte van de output directory in wanneer daarom wordt gevraagd.
43. Voer de gewenste Sholl-analyse stapgrootte in. Selecteer "Gebruik soma radius als startstraal" om MMPS-afgeleide soma radii als startradius voor Sholl-analyse te gebruiken. Voer een vaste soma-radius in als MMPS-afgeleide soma-radius niet worden gebruikt.
44. Open "SkeletonAnalysisImageJ.py" als een Fiji-plugin voor skeletanalyse.
45. Voer de locatie van de uitvoermap, pixelgrootte en de locatie van de maskermap in wanneer daarom wordt gevraagd.
46. Exporteer alle door plugins gegenereerde resultaten als CSV-bestanden naar de uitvoermap zodra je klaar bent.

6. Formules gebruikt in MMPS voor microglia-morfologieberekeningen

OPMERKING: Alle berekeningen worden automatisch uitgevoerd door MMPS wanneer "Bereken eenvoudige kenmerken" wordt ingedrukt. Parameterberekeningen worden hieronder weergegeven.

1. Perimeter
   1. Bereken de omtrek met de volgende vergelijking:
      
   2. Definieer als omtrek, als het aantal randpixels, en als pixelgrootte in μm.
2. Gemiddelde zwaartepuntafstand
   OPMERKING: De gemiddelde centroideafstand wordt ook wel celverspreiding¹¹ genoemd.
   1. Identificeer vier vertakkingseindpunten op basis van celcoördinaten:
      bovenste tak: minimale y-coördinaat,
      onderste tak: maximale y-coördinaat,
      linker tak: minimale x-coördinaat,
      Rechtertak: maximale X-coördinaat.
   2. Bereken de centroïdecoördinaten met behulp van de volgende vergelijkingen:
      
      
   3. Definieer c_x en c_y als zwaartepuntcoördinaten, x_i en y_i als pixelcoördinaten, en als het totale aantal pixels.
   4. Bereken de afstand van de vertakking met de volgende vergelijking:
      
   5. Definieer d als takafstand, x_i en y_i als tak-eindcoördinaten, en c_x en c_y als zwaartepuntcoördinaten.
   6. Bereken de gemiddelde zwaartepuntafstand met behulp van de volgende vergelijking:
      
   7. Definieer als de gemiddelde zwaartepuntafstand, als vertakkingsafstand, d_i en als pixelgrootte in μm.
3. Maskergebied
   1. Bereken het maskeroppervlak met de volgende vergelijking:
      
   2. Definieer als maskeroppervlak in μm², als het aantal pixels binnen het masker, en als pixelgrootte in μm.
4. Excentriciteit
   1. Bereken tweede centrale momenten met behulp van de volgende vergelijkingen:
      
      
      
   2. Definieer μ₂₀, μ₀₂ en μ₁₁ als tweede centrale momenten, x_i en y_i als pixelcoördinaten, c_x en c_y als zwaartepuntcoördinaten, en N als het totale aantal pixels.
   3. Bereken covariantiematrix-eigenwaarden met de volgende vergelijking:
      
   4. Definieer λ₁ ≥ λ₂.
   5. Bereken de lengtes van grote en kleine as met behulp van de volgende vergelijkingen:
      
   6. Definieer a als de lengte van de hoofdas en b als de lengte van de kleine as.
   7. Bereken excentriciteit met de volgende vergelijking:
      
   8. Definieer excentriciteit.
5. Rondheid
   1. Bereken rondheid met de volgende vergelijking:
      
   2. Definieer als ronding, als hoofdaslengte en als lengtelengte van de kleine as.
6. Soma-grootte
   1. Bereken het soma-oppervlak met de volgende vergelijking:
      
   2. Definieer Sa als soma-oppervlakte in μm², als het aantal pixels binnen het soma-masker, en S als pixelgrootte in μm.

7. Statistische analyse

1. Voer alle statistische analyses uit met R versie 4.3.2.
2. Filter datasets met het grootste geaccepteerde masker voor elke cel.
3. Gemiddelde cellulaire parameters op dierniveau vóór statistische analyse.
4. Beoordeel normaliteit en variantie met behulp van de Shapiro–Wilk- en Levene-tests.
5. Voer Student's t-tests of herhaalde gemiddelden ANOVA uit met post-hoc Holm-gecorrigeerde gekoppelde t-tests wanneer datasets voldoen aan parametrische aannames.
6. Voer Wilcoxon-rank-som- of Friedman-tests uit met Holm-gecorrigeerde gepaarde Wilcoxon-teken-rank tests wanneer datasets niet voldoen aan parametrische aannames.
7. Definieer statistische significantie als p < 0,05.

Resultaten

Een open-source, zelfstandig microgliale morfologie-analyseplatform, genaamd Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), werd ontwikkeld om een toegankelijke, gestandaardiseerde workflow te bieden voor IF-gebaseerde microgliale morfologieanalyse. Het platform bouwt voort op eerdere morfologie-analysemethoden, vereist geen programmeerexpertise en bevat een toegankelijke grafische gebruikersinterface. MMPS is ontworpen om de detectie van subtiele microgliale vertakkingen te verbeteren, terwijl meerdere waarborgen worden geïntegreerd om de overschatting van microgliale maskers te minimaliseren.

MMPS werd gevalideerd met behulp van een door LPS geïnduceerd model van knaagdierneuroontsteking. Na weefselverwerking en beeldverwerving (Figuur 1) werd IF-specificiteit bevestigd met negatieve controlesecties zonder primaire antistofkleuring (Aanvullende Figuur 1). MMPS-verwerking begint met het importeren van IF-afbeeldingen in de software-interface (Figuur 2A). De software biedt meerdere beeldverwerkingsopties om microgliale signaaldetectie en achtergrondscheiding te verbeteren. Verplichte achtergrondaftrekking wordt uitgevoerd met het rolling-ball-algoritme dat is geïmplementeerd in het Scikit-image-pakket, terwijl optionele denois- en verscherpingsfilters beschikbaar zijn via SciPy-gebaseerde Gaussische filtering. Na beeldverwerking worden microgliale soma's handmatig geselecteerd en geïdentificeerd met rode selectiemarkeringen (Figuur 2B). Soma-grenzen worden vervolgens handmatig omschetst voor downstream morfologische berekeningen (Figuur 2C).

Figuur 1: Grafisch overzicht van het neuroontstekingsmodel en -verwerking. Ratten kregen LPS of PBS en werden 24 uur per dag verzameld met een cardiale perfusie gevolgd door onthoofding. Hersenen werden extraherend en in secties van 30 μm gesneden om vervolgens te worden gebruikt in IF voor microgliale marker Iba1, die vervolgens met MMPS werden verwerkt. Gemaakt met Biorender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Overzicht van het gebruik van MMPS. (A) Voorbeeld van een afbeelding van corticale microglia (rood, Iba1) met celkernen (blauw, DAPI) die in MMPS wordt geraadpleegd (schaalbalk = 75 μm, 40x). Na beeldverwerking met MMPS wordt de achtergrond verkleind en worden nauwkeurige morfologieën beoordeeld (B). Na het verwerken van het beeld in MMPS worden somas handmatig geselecteerd met een rode cirkel die in de volgende stappen in de methoden wordt gebruikt (schaalbalk = 75 μm, 40x). (C) Twee representatieve microglia werden handmatig omlijnd en de opgeslagen soma omtrekbeelden worden hieronder weergegeven. (D) Maskergeneratie van geselecteerde cellen volgt automatisch microgliale takken tot 800 μm², maar vereist handmatige kwaliteitsborging. Hier tonen we het onnauwkeurige 800 μm² masker, gevolgd door het nauwkeurigere 700 μm² masker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Na het soma outlining genereert MMPS maskers iteratief over een groottebereik van 200–800 μm² , met behulp van adaptieve drempelwaarde, beperkt door door de gebruiker gedefinieerde minimumintensiteitsdrempels. Kleinere maskers volgen de door de gebruiker gedefinieerde drempel nauwer, terwijl grotere maskers de drempelbeperkingen geleidelijk versoepelen om de incorporatie van de tak te maximaliseren. Gegenereerde maskers ondergaan een handmatige kwaliteitscontrole om te voorkomen dat aangrenzende cellen, overmatige achtergrondinbouw of afkorting door beeldranden of schaalbalken worden ingesloten. Zoals getoond in Figuur 2D, strekte het masker van 800 μm² voor een representatieve microgliale cel zich uit naar een naburige cel. Het afstoten van het 800 μm^2-masker en het selecteren van het 700 μm^2-masker corrigeerden de segmentatiefout, terwijl de nauwkeurige afbakening van de doel-microglia behouden bleef.

Na MMPS-verwerking werd microgliale activatie beoordeeld met het grootste geaccepteerde masker per cel, omdat deze maskers distale vertakkingen het meest nauwkeurig vastlegden terwijl achtergrondincorporatie werd geminimaliseerd. Berekende morfologische parameters worden samengevat in Tabel 1 en weergegeven in Figuur 3. LPS-toediening verminderde significant de gemiddelde centroideafstand en celperimeter vergeleken met door voertuigen behandelde controles (p < 0,05; Figuur 3A,B), consistent met het terugtrekken van microgliale processen tijdens activatie. Er werden geen significante verschillen waargenomen in mondkapoppervlak, rondheid of excentriciteit tussen behandelgroepen (Figuur 3C–E), ondanks eerdere rapporten waarin deze parameters werden geassocieerd met geactiveerde microgliale fenotypes ^3,23. De huidige studie was niet statistisch onderbouwd om subtiele verschillen in somavorm of maskeroppervlak te detecteren, en microgliale subpopulaties kunnen heterogene inflammatoire morfologieën aannemen die deze trends niet uniform volgen³. Daarentegen was het soma-gebied significant vergroot bij met LPS behandelde dieren vergeleken met voertuigcontroles (p < 0,01; Figuur 3F), verder ondersteunend activatie-geassocieerde morfologische hermodellering²².

Figuur 3: Vergelijking van microgliale morfologische parameters. Voor alle panelen werden tests op normaliteit uitgevoerd (Shapiro-Wilk en Levene) waarbij in alle gevallen niet-significante waarden werden gevonden (p>0,05), wat leidde tot het gebruik van Student t-tests. Stippen vertegenwoordigen individuele dieren (n=5 per behandeling) (A) De gemiddelde centroideafstand was significant groter in de voertuiggroep vergeleken met de LPS-behandelgroep. (B) De perimeter van de microgliacel was significant groter in de voertuiggroep vergeleken met de LPS-behandelgroep. (C) Er was geen significant verschil in mondkapoppervlak tussen behandelgroepen. (D) Er was geen significant verschil in soma excentriciteit tussen groepen. (E) Er is geen significant verschil in rondheid van soma tussen behandelgroepen. (F) Er was een significante toename van het soma-gebied in de LPS-groep * p<0,05, ** p<0,01, *** p<0,001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Parameter	Definitie	Relatie tot microgliale activatie
Gemiddelde Centroidafstand	Gemiddelde afstand van de verste tak in de bovenste, rechter, onderste en linker posities	Afnames
Perimeter	Meting van de omtrek van de cel	Afnames
Maskergebied	Het daadwerkelijke gebied van de cel, niet het doelmaskergebied	Afnames
Excentriciteit	Een meting van de benaderde verlenging van de celsoma (0: cirkelvormig, 1: sterk verlengd)	Afnames
Rondheid	Een meting van de benaderde circulariteit van de celsoma (0: verlengd, 1: circulair)	Verhogingen
Soma-grootte	Het gebied van de celsoma	Verhogingen

Tabel 1: Berekende parameters van MMPS en voorspelde verandering als reactie op microglia-activatie. De tabel vat morfologische parameters samen die zijn berekend door Mapping Microglial Parameters Software (MMPS), waaronder omtrek, gemiddelde centroidafstand, maskeroppervlak, excentriciteit, rondheid en soma-oppervlakte.

De reproduceerbaarheid tussen gebruikers werd vervolgens geëvalueerd door dezelfde beeldset aan geblindeerde, voorheen ongetrainde gebruikers te geven voor onafhankelijke analyse (Aanvullende Figuur 2). Er werden geen statistisch significante verschillen tussen gebruikers vastgesteld, en alle gebruikers reproduceerden morfologische trends die overeenkwamen met microgliale activatie bij dieren behandeld met LPS.

MMPS ondersteunt daarnaast geavanceerde morfologische analyses stroomafwaarts. Correlatieve analyse van parameters gegenereerd uit Figuur 3 toonde relaties tussen verschillende morfologische kenmerken. Met voertuigen behandelde ratten vertoonden slechts een zwakke correlatie tussen de rondheid en de omtrek van microglia (R² = 0,17), terwijl met LPS behandelde ratten een sterkere correlatie vertoonden (R² = 0,64), wat suggereert dat verhoogde activatie van microgliale middelen geassocieerd was met gelijktijdige afnames in rondheid en omtrek (Figuur 4A). Daarnaast vertoonde het maskergebied sterke positieve correlaties met de gemiddelde centroideafstand in zowel voertuig- als LPS-behandelde groepen (R² = respectievelijk 0,71 en 0,88), wat consistent is met veranderingen in vertakkingscomplexiteit die samenhangt met microgliale activatiestatus (Figuur 4B).

Figuur 4: Geavanceerde analyse van microgliale parameters. Alle panelen zijn dierlijke lijnen van beste pasvorm, berekend met de gewone kleinste-kwadratenmethode, weergegeven met hun determinatiecoëfficiënt (R²) en geschaduwd met hun 95% betrouwbaarheidsinterval. (A) Microgliale soma rondheid en totale perimeterlengte nemen bij microglia een zwakke trend in de voertuiggroep (R² = 0,17), maar hebben een sterkere correlatie na LPS-blootstelling (R² = 0,64). (B) De gemiddelde centroideafstand correleert met het oppervlak van de microglia in de groepen (R² = 0,71) en LPS (R² = 0,88). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 1: Validatie van het IF-protocol via negatieve controle. Een hersenschijf van hetzelfde gebied voor elke rat onderging het IF-protocol zonder primaire antistoftoevoeging om het ontbreken van autofluorescentie te bevestigen (schaalbalk = 75 μm) (A) Representatief beeld van voertuiggekleurd weefsel voor DAPI (blauw). (B) Representatief beeld van voertuiggekleurd weefsel voor Iba1 (rood). (C) Representatief beeld van voertuiggekleurd weefsel voor DAPI (blauw) en Iba1 (rood). (D) Representatief beeld van LPS-gekleurd weefsel voor DAPI (blauw). (E) Representatief beeld van LPS-gekleurd weefsel voor Iba1 (rood). (F) Representatief beeld van LPS-gekleurd weefsel voor DAPI (blauw) en Iba1 (rood). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Beoordeling van MMPS Inter-User variatie. Verschillende geblindeerde gebruikers gebruikten MMPS op dezelfde monsters uit Figuur 3 en de resultaten op dierniveau werden vergeleken. Voor alle waren normaliteitstests (Shapiro-Wilk en Levene) niet-significant (p>0,05), wat leidde tot het gebruik van een herhaald-gemiddelde ANOVA met post-hoc Holm-gecorrigeerde gepaarde t-test (p>0,05). (A) Er was geen significant verschil in elke groep tussen gebruikers voor de gemiddelde centroidafstand (p>0,05). (B) Er was geen significant verschil tussen gebruikers per groep voor perimeter (p>0,05). (C) Er was geen significant verschil tussen gebruikers per groep voor mondkapoppervlak (p>0,05). (D) Er was geen significant verschil in elke groep tussen gebruikers voor excentriciteit (p>0,05). (E) Er was geen significant verschil tussen gebruikers in de groep voor rondheid (p>0,05). (F) Er was geen significant verschil tussen gebruikers per groep voor het soma-gebied (p>0,05). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het primaire doel van deze methodologie is het vergroten van de toegankelijkheid tot microgliale morfologieanalyse door veelvoorkomende technische barrières te verminderen, terwijl de sterke punten van gevestigde morfologische beoordelingsmethoden behouden blijven. MMPS maakt het mogelijk om subtiele microgliale morfologische veranderingen te detecteren, terwijl compatibiliteit behouden blijft met geavanceerde analyses, waaronder fractale, skelet-, romp- en Sholl-analyses. In vergelijking met eerder gepubliceerde benaderingen biedt MMPS een toegankelijke grafische gebruikersinterface, geïntegreerde berekeningen voor veelgebruikte morfologische parameters en het elimineren van coderingsvereisten, terwijl compatibiliteit met meer geavanceerde downstream-analyses behouden blijft.

Verschillende cruciale methodologische stappen hebben een sterke invloed op de analytische nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid. Hoogwaardige immunofluorescentie (IF) beeldvorming is essentieel voor betrouwbare maskergeneratie en morfologieberekeningen. Antistofspecificiteit is een belangrijke factor voor beeldkwaliteit, omdat niet-specifieke labeling de achtergrondfluorescentie verhoogt en de signaalscheiding tussen microglia en omringend weefsel vermindert. Evenzo kunnen suboptimale antistofconcentraties de fluorescentieintensiteit verminderen en de beeldresolutie verminderen. Het verkrijgen van Z-stack beelden is ook cruciaal, omdat het weglaten van Z-stack beeldvorming de schijnbare microgliale vertakkingscomplexiteit en procesverspreiding kunstmatig kan veranderen, waardoor morfologische berekeningen worden verstoord.

Verschillende aanvullende overwegingen zijn belangrijk tijdens de verwerking van MMPS. Hoewel MMPS batchbeeldverwerking ondersteunt, is individuele beeldoptimalisatie vaak te verkiezen omdat achtergrondkenmerken en kleurkwaliteit aanzienlijk kunnen variëren tussen beelden. De beeldkwaliteit beïnvloedt direct de nauwkeurigheid van maskergeneratie; Daarom verbetert optimalisatie tijdens beeldvoorbewerking de reproduceerbaarheid en robuustheid van downstream-analyses aanzienlijk. Zorgvuldige selectie van microgliale somas is ook belangrijk, met name het vermijden van cellen die beeldgrenzen raken, omdat partiele celselectie soma kunstmatig kan verminderen en de vorming van maskers kan vervormen. Tijdens de kwaliteitscontrole van maskers moeten maskers met aangrenzende cellen, overmatige achtergrond of beeldranden worden afgewezen. Omgekeerd mogen kleinere maskers niet worden afgewezen alleen omdat ze niet alle distale processen kunnen vastleggen, aangezien het iteratieve maskergeneratie-algoritme opzettelijk lokale drempelparameters aanpast op basis van maskergrootte en regionale pixelintensiteit.

Deze methodologie is zeer aanpasbaar en kan worden aangepast om aan specifieke experimentele eisen te voldoen. Omdat MMPS open source is, kan het platform worden uitgebreid om individuele Z-stack frames te analyseren of geautomatiseerde celdetectie-algoritmen te integreren om een volledig geautomatiseerde morfologie-analysepijplijn te genereren. Daarnaast blijven gegenereerde maskers en soma outlines compatibel met ImageJ-gebaseerde workflows voor fractale, hull-, skelet- en Sholl-analyses. Omdat MMPS is ontwikkeld in Python 3.11, kunnen aanvullende analyses ook direct in de software worden opgenomen met gebruik van algemeen beschikbare wetenschappelijke Python-pakketten zonder dat externe softwareplatforms nodig zijn.

Ondanks deze voordelen moeten er verschillende beperkingen worden overwogen. MMPS werd gevalideerd met behulp van een neuroontstekingsmodel in een specifiek hersengebied van mannelijke Sprague-Dawley-ratten, en verschillende hersengebieden, ziektemodellen, soorten of biologisch geslacht kunnen morfologische uitkomsten beïnvloeden. De toepasbaarheid van MMPS op alternatieve experimentele paradigma's moet daarom worden gevalideerd via pilotstudies of ondersteund door eerdere literatuurvergelijkingen. Daarnaast legt IF-gebaseerde beeldvorming driedimensionale vertakkende structuren onvolledig vast, omdat processen die direct boven of onder het brandpuntsvlak reiken, mogelijk niet worden gedetecteerd in maximale projectiebeelden. Het verhogen van het aantal geanalyseerde cellen kan helpen deze beperking te beperken. MMPS blijft ook afhankelijk van beeldverwervingskwaliteit en vereist daarom optimalisatie voor individuele beeldvormingssystemen, kleuringsprotocollen en antistofpreparaten. Afbeeldingen met lage resolutie kunnen de maskergrootte kunstmatig vergroten vanwege vage grenzen rondom somas en dicht opeengepakte takken. Om deze reden bevat het huidige protocol vrij-floating IF-methoden en meerdere beeldverwerkingsopties om de beeldkwaliteit te maximaliseren.

MMPS behoudt bovendien enige potentie voor gebruikersafhankelijke variabiliteit omdat gebruikers handmatig cellen selecteren en soma's omlijnen. Het gebruik van DAPI- en Iba1-colocalisatie vermindert echter aanzienlijk ambiguïteit tijdens celselectie. Bovendien toonde geblindeerde inter-user analyse minimale variabiliteit aan tussen voorheen ongetrainde gebruikers, wat de reproduceerbaarheid van de analytische workflow ondersteunde.

In tegenstelling tot verschillende eerder gepubliceerde microgliale morfologieplatforms is MMPS niet volledig geautomatiseerd. Dit ontwerp werd echter gekozen met prioriteit aan segmentatienauwkeurigheid en kwaliteitsborging van maskers. Geautomatiseerde workflows konden worden geïntegreerd door aanpassing van de Python-broncode om geautomatiseerde DAPI/Iba1-colokalisatiedetectie, contourgebaseerde soma-omlijning en machine-learning-gebaseerde mask-acceptatie of -afwijzing mogelijk te maken. Daarnaast vereist MMPS aanzienlijke schijfopslagcapaciteit omdat gegenereerde maskers en soma outlines automatisch als .tiff bestanden worden opgeslagen voor downstream analyses en kwaliteitsborging. De opslagvereisten konden worden verminderd door de software aan te passen zodat maskers sequentieel per cel werden gegenereerd, gevolgd door directe kwaliteitsbeoordeling en parameterextractie.

Samenvattend breidt MMPS de toegang tot kwantitatieve analyse van microgliale morfologie uit door een gestandaardiseerd, open-source platform te bieden dat geen codeerexpertise of in vivo beeldvormingsmogelijkheden vereist. Het platform faciliteert reproduceerbare analyse van IF-gebaseerde microgliale morfologie, terwijl compatibiliteit behouden blijft met geavanceerde downstream analytische benaderingen.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
12-well plate	Fisher Scientific	07-200-82	Plaat gebruikt voor incubatie en wassen van weefselsecties.
Aluminiumfolie	Fisher Scientific	01-213-101	Gebruikt om fluorescerende monsters te beschermen tegen lichtblootstelling.
Antigen Retrieval Buffer (10×)	ThermoFisher Scientific	00-4955-58	Gebruikt om de toegankelijkheid van antigenen tijdens immunofluorescentiekleuring te verbeteren.
Anti-Iba1 primaire antistof	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	019-19741	Primaire antistof gebruikt voor immunofluorescente markering van microglia.
Cryostat	Fisher Scientific	95-710-0L	Instrument gebruikt om bevroren hersenweefsel in bepaalde diktes te snijden.
Donkey anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 555	ThermoFisher Scientific	A-21428	Fluorescente secundaire antistof gebruikt voor visualisatie van konijn primaire antistoffen.
Donkey Serum	Fisher Scientific	50-413-115	Blokkeerd reagens gebruikt om niet-specifieke antilichaambinding te verminderen.
EVOS FL Auto 2 Imaging System	ThermoFisher Scientific	AMAFD2000	Fluorescentiemicroscoop gebruikt voor beeldacquisitie.
Fiji (ImageJ) 2.16.0	NIH	fiji.sc	Beeldverwerkingsplatform gebruikt voor downstream morfologieanalyses en plug-ins.
Fluoromount-G	ThermoFisher Scientific	00-4959-52	Monteermedium gebruikt om fluorescentie te behouden en dekglasjes vast te zetten.
Isofluraan	EntirelyPets Pharmacy	MWI502017	Inhalatieanestheticum gebruikt tijdens dierproeven.
Lipopolysacharide	Millipore Sigma	L2630	Gebruikt om systemische neuro-inflammatie en microglia-activering bij knaagdieren te induceren.
Matplotlib	https://pypi.org/project/matplotlib/		Python-plotbibliotheek gebruikt voor gegevensvisualisatie en figuurgeneratie.
MMPS (Mapping Microglial Parameters Software) v1.00	This work	https://github.com/NeurodegenerativePharmaceuticalLab/Mapping-Microglia-Parameters-Software/releases/tag/v1.00	Open-source softwareplatform ontwikkeld voor microgliale morfologieanalyse.
Net wells	Millipore Sigma	CLS3477	Inzetstukken gebruikt om vrij zwevende weefselsecties tijdens kleurprocedures vast te houden.
Numpy	https://pypi.org/project/numpy/		Python-bibliotheek gebruikt voor numerieke berekeningen binnen MMPS.
Objectieflens (4×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4922	Objectief met lage vergroting gebruikt voor anatomische oriëntatie en identificatie van regio's.
Objectieflens (40×)	ThermoFisher Scientific	AMEP4625	Objectief met hoge vergroting gebruikt voor beeldvorming van microgliale morfologie.
opencv-python	https://pypi.org/project/opencv-python/		Computervisiebibliotheek gebruikt voor beeldverwerkingsfuncties binnen MMPS.
Paraformaldehyde	ThermoFisher Scientific	169650025	Fixeermiddel gebruikt voor weefselperfusie en conservering vóór het snijden.
Permount	Fisher Scientific	SP15-100	Permanent monteermedium gebruikt voor het behoud van dia's.
Fosfaatgebufferde zoutoplossing	Fisher Scientific	BP3991	Bufferoplossing gebruikt voor weefselwassing en reagensvoorbereiding.
Pillow	https://pypi.org/project/Pillow/		Python-beeldverwerkingsbibliotheek gebruikt voor beeldverwerkingsbewerkingen.
PyQt5	https://pypi.org/project/PyQt5/		Python GUI-framework gebruikt om de grafische gebruikersinterface van MMPS te genereren.
Python 3.11	Python Software Foundation	python.org	Programmeertaalomgeving gebruikt voor het ontwikkelen en uitvoeren van MMPS.
R 4.3.2	R Foundation for Statistical Computing	r-project.org	Statistisch softwarepakket gebruikt voor gegevensanalyse en het genereren van grafieken.
Scikit-image	https://pypi.org/project/scikit-image/		Python-beeldanalysebibliotheek gebruikt voor beeldverwerking en segmentatie.
Scipy	https://pypi.org/project/scipy/		Python wetenschappelijk computerpakket gebruikt voor filtering en beeldverwerkingsbewerkingen.
Sprague-Dawley-ratten	Evingo	002	Experimentele dieren gebruikt voor validatie van het neuro-inflammatiemodel.
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3	Cryoprotector gebruikt voor het bevriezen van hersenweefsel.
Tifffile	https://pypi.org/project/tifffile/		Python-pakket gebruikt voor het lezen en schrijven van TIFF-beeldbestanden.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura Finetek	4583	Inbeddingsmedium gebruikt voor cryosectie van bevroren weefselmonsters.
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-100	Detergens gebruikt voor membraanpermeabilisatie tijdens immunofluorescentie.