Methodenartikel

Bereiding van gedecellulariseerde humane perifere zenuvgrafts met behulp van natriumhydroxide en natriumdeoxycholaat

22 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71578

⸱

1 september 2026

 ,  ,  , 
1R&D Center, L&C BIO Co., Ltd.

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde, alkalisch-ondersteunde decellularisatiemethode die een behandeling met natriumhydroxide combineert met een door een peristaltische pomp aangedreven oplossingsuitwisselingssysteem om gedecellulariseerde menselijke perifere zenuwgrafs te produceren met een effectieve verwijdering van cellen en behoud van de architectuur van de natuurlijke extracellulaire matrix.

Samenvatting

Letsels aan perifere zenuwen vereisen vaak graftmaterialen die structurele begeleiding bieden voor axonale regeneratie. Hoewel autologe zenuwgrafts de klinische gouden standaard blijven, is het gebruik ervan beperkt door morbiditeit op de donorplaats en beperkte beschikbaarheid van weefsel. Deze beperkingen hebben geleid tot een toenemende belangstelling voor gedecellulariseerde menselijke perifere zenuwgrafts als alternatief biomateriaal voor zenuwregeneratie. Veelgebruikte decellularisatieprotocollen op basis van detergentia kunnen echter de architectuur van de extracellulaire matrix (ECM) verstoren en cytotoxische residuen achterlaten die de kwaliteit van de graft kunnen beïnvloeden. In dit artikel wordt een gestandaardiseerd protocol beschreven voor het bereiden van gedecellulariseerde menselijke perifere zenuwgrafts met behulp van een alkalisch-ondersteunde decellularisatieaanpak. De procedure begint met een behandeling met natriumhydroxide (NaOH) om efficiënte cellulaire disruptie te bevorderen, gevolgd door een milde stap met natriumdeoxycholaat (SDC) die overgebleven cellulaire en immunogene componenten verwijdert terwijl de oorspronkelijke organisatie van de ECM behouden blijft. Deze strategie beperkt de blootstelling aan detergentia terwijl de preservering van de oorspronkelijke ECM-architectuur wordt ondersteund. De workflow omvat de voorbereiding van de donorzenuw, gecontroleerde NaOH-behandeling, daaropvolgende milde SDC-behandeling en uitgebreid wassen onder continue uitwisseling van de oplossing met behulp van een door een peristaltische pomp aangedreven systeem om de verwijdering van resterende bewerkingsmiddelen te vergemakkelijken. Verdere post-processing stappen worden geïmplementeerd om de structurele integriteit te behouden en de grafts voor te bereiden op de uiteindelijke verpakking en sterilisatie. De efficiëntie van de decellularisatie wordt beoordeeld via histologische analyse en kwantificering van residu-DNA, en de preservering van de ECM-structuur wordt onderzocht met behulp van scanning elektronenmicroscopie. De afwezigheid van residu-SDC en de biocompatibiliteit van de bewerkte grafts werden bevestigd via cytotoxiciteitstesten. Dit protocol biedt een praktische aanpak voor het produceren van gedecellulariseerde menselijke perifere zenuwgrafts voor onderzoek naar perifere zenuwregeneratie en translationele toepassingen.

Inleiding

Letsels aan perifere zenuwen kunnen leiden tot ernstige functionele beperkingen en blijven een aanzienlijke klinische uitdaging in de regeneratieve geneeskunde en reconstructieve chirurgie. De regeneratie van segmentale zenuwdefecten vereist graftmaterialen die niet alleen de kloof van het letsel overbruggen, maar ook structurele geleiding en biochemische signalen bieden om axonale regeneratie en reïnnervatie te ondersteunen. Autologe zenuwgrafts worden algemeen beschouwd als de klinische gouden standaard omdat ze de architectuur van de natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) behouden en een ondersteunende micro-omgeving bieden voor zenuwregeneratie1,2. Het klinische gebruik ervan is echter beperkt door de geringe beschikbaarheid van donortissue, de noodzaak van extra chirurgische ingrepen en morbiditeit op de donorplaats3,4. Deze beperkingen hebben geleid tot de ontwikkeling van alternatieve graftmaterialen, in het bijzonder gedecellulariseerde perifere zenuwgrafts, die de natuurlijke ECM-architectuur behouden terwijl immunogene cellulaire componenten worden geminimaliseerd5,6,7,8.

De prestaties van gedecellulariseerde zenuwgrafts zijn sterk afhankelijk van het decellularisatieproces. Conventionele methoden vertrouwen doorgaans op detergentgebaseerde reagentia zoals Triton X-100 en natriumdeoxycholaat (SDC), die cellulaire componenten verwijderen door lipide membranen te solubiliseren9,10,11. Echter, langdurige blootstelling aan deze detergentia kan de microstructuur van de ECM verstoren en cytotoxische resten achterlaten die de cellulaire levensvatbaarheid en regeneratieve resultaten negatief beïnvloeden12,13. Als gevolg hiervan worden alternatieve decellularisatiestrategieën die een efficiënte celverwijdering mogelijk maken terwijl de integriteit van de ECM behouden blijft, actief onderzocht14. Alkalische decellularisatie met natriumhydroxide (NaOH) is naar voren gekomen als een potentiële alternatieve benadering, omdat extreme pH-condities cellulaire componenten, nucleïnezuren en lipiden efficiënt kunnen afbreken15,16,17. Desalniettemin kan ongecontroleerde blootstelling aan sterke alkalische condities de integriteit van de ECM in gevaar brengen, wat het belang benadrukt van nauwkeurig gecontroleerde verwerkingscondities16,18.

Hier wordt een gestandaardiseerd, alkalisch-ondersteund decellularisatieprotocol voor menselijke perifere zenuwgraft presented, waarbij gebruik wordt gemaakt van een door een peristaltische pomp aangedreven systeem voor continue oplossingenuitwisseling. In vergelijking met conventionele statische immersiemethoden maakt dit dynamische proces een continue uitwisseling van oplossingen mogelijk, wat de verwijdering van celresten en resterende bewerkingsmiddelen vergemakkelijkt. Dit artikel biedt een stapsgewijze visuele demonstratie van de volledige workflow, inclusief de voorbereiding van de donornerve, gecontroleerde alkalisch-ondersteunde decellularisatie en continue oplossingenuitwisseling met behulp van een door een peristaltische pomp aangedreven systeem. De resulterende grafts werden geëvalueerd via histologische analyse, kwantificering van resident DNA en scanning elektronenmicroscopie (SEM) om efficiënte decellularisatie en het behoud van de ECM-ultrastructuur te bevestigen. Door een duidelijke visualisatie van kritische technische stappen mogelijk te maken, biedt dit artikel een duidelijk gedefinieerd kader voor het voorbereiden van gedecellulariseerde zenuwgrafts en voor toekomstige opschaling van het proces.

Protocol

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

  1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
  3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
    CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

  1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
  2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
  3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
  4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
    NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

  1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
  2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
  3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
    NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

  1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
  2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
  3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
  4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
    NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
  5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
  6. Drain the solution from the column.
  7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
  8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
  9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
    NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

  1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

  1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
  2. Drain the solution from the column.
  3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
  4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
    PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

  1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
  2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
  3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
    NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

Resultaten

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing is shown in Figure 2A. Trimming and segmenting of the nerve were illustrated in Figure 2B–D. After completion of the process, the peripheral nerve maintained its overall morphology without visible structural disruption (Figure 2E).

Histological evaluation of the decellularization is shown in Figure 3. Hematoxylin and eosin (H&E) staining of the native peripheral nerve revealed abundant nuclei, whereas nuclei were largely absent in the decellularized samples (Figure 3A). Quantification of residual DNA, expressed as ng DNA/mg of dry tissue, demonstrated a substantial reduction in DNA content following decellularization (Figure 3B).

Ultrastructural analysis using scanning electron microscopy (SEM) is presented in Figure 4. The fibrous organization of the extracellular matrix (ECM) remained clearly visible after decellularization, indicating preservation of the native ECM architecture (Figure 4).

Assessment of residual detergent and cytocompatibility is shown in Figure 5. Residual SDC levels were minimal following the washing steps (Figure 5A). Cytotoxicity testing showed no significant cytotoxic response in cultured cells exposed to the decellularized peripheral nerve grafts (Figure 5B).

figure-results-1
Figure 1: Schematic workflow for the preparation of decellularized human peripheral nerve grafts. Donated human peripheral nerve segments are first prepared by trimming and segmenting to remove surrounding connective tissue. The nerve segments then undergo delipidization using IPA-based solution exchange (Day 1). Sequential decellularization is performed using NaOH (Day 2) and SDC (Day 3) under continuous solution exchange in a peristaltic pump-driven system. The processed grafts are subsequently packaged and sterilized (Day 4) to obtain decellularized peripheral nerve grafts. Abbreviations: IPA = isopropanol; NaOH = sodium hydroxide; SDC = sodium deoxycholate. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-2
Figure 2: Representative images of the peripheral nerve processing workflow. (A) Peristaltic pump-driven solution exchange system used for delipidization, decellularization, and washing. (B) Donated human peripheral nerve before trimming. (C) Peripheral nerve during trimming. (D) Peripheral nerve after trimming and segmenting. (E) Peripheral nerve after completion of the entire decellularization process. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-3
Figure 3: Evaluation of decellularization efficiency. (A) Representative hematoxylin and eosin (H&E)-stained images of native and decellularized human peripheral nerve tissues showing reduced cellular components after decellularization. Scale bars = 100 µm. (B) Quantification of residual DNA content in native and decellularized nerve tissues, expressed as ng DNA/mg of dry tissue. Data are presented as mean ± SD (n = 3). *p < 0.05. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-4
Figure 4: Scanning electron microscopy (SEM) analysis of nerve microarchitecture. Representative SEM images of native (left) and decellularized (right) human peripheral nerve tissues showing preserved extracellular matrix architecture following the decellularization process. Scale bars = 2 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

figure-results-5
Figure 5: Evaluation of residual detergent and cytotoxicity. (A) Chromatograms of the SDC standard (left) and extracts from decellularized nerve grafts (right) used to assess residual detergent. The red box indicates the region corresponding to the SDC retention time (~3.2 min). (B) Cytotoxicity assessment of extracts from decellularized nerve grafts using L929 fibroblasts following ISO 10993-5 guidelines. Representative images after 48 h incubation show the reagent control, extract from decellularized nerve grafts, negative control, and positive control groups. Scale bars = 50 µm. Please click here to view a larger version of this figure.

Nerve segment length (cm)IPA treatment (h)NaOH treatment (h)SDC treatment (h)
2–31.566
>3–4288
>4–52.51010

Table 1: Length-specific processing durations for peripheral nerve segments within the range evaluated in this study.

Discussie

Deze studie presenteert een gestandaardiseerd, alkalisch-ondersteund decellularisatieprotocol voor het vervaardigen van gedecellulariseerde menselijke perifere zenuwgrafts voor perifere zenuwregeneratie. Het protocol integreert een voorbehandeling van de donortenuw, gecontroleerde chemische decellularisatie en een door een peristaltische pomp aangedreven systeem voor vloeistofuitwisseling in een duidelijk gedefinieerde workflow, waardoor een efficiënte verwijdering van cellulaire en immunogene componenten mogelijk is terwijl de architectuur van de natuurlijke ECM behouden blijft.

Een belangrijk kenmerk van deze methode is de integratie van een alkalische behandeling met een verminderde blootstelling aan detergentia. Conventionele detergent-gebaseerde protocollen, zoals Sondell (3% Triton X-100 en 4% SDC) en de Hudson-methode (sulfobetaine-10, sulfobetaine-16 en Triton X-200), vertrouwen op langdurige, meerstaps detergentbehandelingen om een effectieve decellularisatie te bereiken9,10. Hoewel deze benaderingen cellulaire componenten effectief verwijderen, kan langdurige blootstelling aan detergentia de integriteit van de ECM aantasten en bijdragen aan residuele detergent-gerelateerde cytotoxiciteit19,20,21. In tegenstelling hiermee incorporeert het huidige protocol NaOH om de cellulaire verwijdering te verbeteren terwijl de SDC-blootstelling wordt beperkt, waardoor de totale detergentbelasting wordt verminderd en het behoud van de native ECM-architectuur wordt ondersteund.

Een ander kritisch aspect van dit protocol is het door een peristaltische pomp aangedreven systeem voor oplossingstuitwisseling. In tegenstelling tot perfusiegebaseerde benaderingen, die interne druk op het weefsel kunnen uitoefenen en het risico op structurele verstoring met zich meebrengen21, maakt dit systeem een continue, gecontroleerde uitwisseling van oplossingen binnen een chromatografiekolom mogelijk. De effectiviteit van deze aanpak wordt ondersteund door meerdere analytische resultaten. Histologische analyse en kwantificering van residu-DNA bevestigden de efficiënte verwijdering van cellulaire componenten, terwijl SEM-analyse aantoonde dat de architectuur van de oorspronkelijke ECM behouden bleef. Daarnaast ondersteunden lage residuele SDC-waarden en gunstige cytocompatibiliteitsresultaten de biocompatibiliteit van het resulterende transplantaat. Gezamenlijk suggereren deze bevindingen dat het protocol een balans bereikt tussen effectieve decellularisatie en structurele bewaring.

Verschillende technische stappen zijn cruciaal voor het minimaliseren van procedurele variabiliteit en het handhaven van gecontroleerde verwerkingscondities. Ten eerste is een zorgvuldige behandeling van het zenuwsegment tijdens het trimmen, overbrengen en wassen essentieel. Perifeer zenuwweefsel is mechanisch fragiel, en overmatige compressie, vouwing of spanning kan de interne structuur verstoren en de preservering van de ECM in gevaar brengen19,20. Daarom moet het weefsel gedurende de gehele procedure vochtig worden gehouden en voorzichtig worden behandeld. Ten tweede is een uniforme uitwisseling van de oplossing binnen de kolom een bepalende factor voor de prestaties van het proces. Luchtbellen in de kolom moeten worden geminimaliseerd en het weefsel moet volledig ondergedompeld en gesuspendeerd blijven in de oplossing, in plaats van aan de kolomwand of het filter te kleven. Adhesie van het weefsel kan leiden tot een ongelijkmatige uitwisseling van de oplossing, waardoor de wassefficiëntie afneemt en er een inconsistente blootstelling aan de verwerkingsreagentia ontstaat21,22. Ten derde moet het door een peristaltische pomp aangestuurde systeem gedurende de hele procedure stabiel functioneren. Continue circulatie is vereist voor delipidatie, decellularisatie en wassing; daarom moeten alle slangkoppelingen stevig worden vastgezet om loskoppeling door pompenduceerde druk of vibratie te voorkomen. Tijdens het terugwinnen van het monster moet volledige drainage van de kolom worden vermeden. Het handhaven van een voldoende liquidumvolume helpt weefseladhesie te voorkomen en vergemakkelijkt een zorgvuldige behandeling tijdens de collectie.

Zenuwsegmenten van 2–3 cm werden respectievelijk 1,5, 6 en 6 u verwerkt met IPA, NaOH en SDC. Segmenten van >3–4 cm werden respectievelijk 2, 8 en 8 u verwerkt, terwijl segmenten van >4–5 cm respectievelijk 2,5, 10 en 10 u werden verwerkt. De behandelingsduur varieerde dus van 1,5 tot 2,5 u voor de IPA-delipidatie en van 6 tot 10 u voor elke decellularisatiestap. Alle overige verwerkingsparameters, inclusief reagensconcentraties, oplossingsvolumes en wasprocedures, werden consistent gehouden voor alle lengtegroepen. Afhankelijk van de configuratie van de slang was de stroomsnelheid ingesteld binnen het gespecificeerde bereik en bleef deze constant tijdens elke verwerkingsrun. De lengtespecifieke verwerkingscondities zijn samengevat in Tabel 1. Aanpassingen op basis van zenuwdiameter, dikte, fasciculaire structuur of cellulaire en matrixsamenstelling zijn niet systematisch geëvalueerd en vereisen verder onderzoek23,24. Voor scale-up toepassingen kan een multichannel peristaltisch pompsysteem de doorvoer verbeteren; consistente stroomcondities over de kanalen moeten echter zorgvuldig worden geverifieerd om een uniforme verwerking te garanderen.

Er blijven verschillende overwegingen voor verdere optimalisatie. Hoewel dit protocol de totale blootstelling aan detergentia aanzienlijk vermindert, is SDC nog steeds inbegrepen, en toekomstige verbeteringen kunnen zich richten op het minimaliseren of vervangen van het gebruik van detergentia, terwijl de decellularisatie-efficiëntie en het behoud van de ECM gewaarborgd blijven25,26. Daarnaast is perifeer zenuwweefsel inherent moeilijk te standaardiseren vanwege variaties in fasciculaire structuur, diameter, dikte en cellulaire en matrixsamenstelling23,24. Tijdens grootschalige productie kunnen deze verschillen, samen met variaties in weefselbelading en stroomcondities, bijdragen aan variabiliteit tussen batches. De reproduceerbaarheid tussen donoren en tussen batches is echter in de huidige studie niet systematisch geëvalueerd. Daarom zal verdere validatie met weefsels van meerdere donoren en onafhankelijke productiebatches noodzakelijk zijn om passende acceptatiecriteria voor weefsels vast te stellen, processen te standaardiseren en batch-reproduceerbaarheid te garanderen.

Een aanvullende beperking heeft betrekking op de lengte van het transplantaat. De regeneratieve prestaties nemen af naarmate de lengte van het transplantaat toeneemt, en deze lengteafhankelijke beperking kan sterker uitgesproken zijn bij acellulaire zenuwallografts dan bij autografts3,27. Omdat acellulaire zenuwallografts geen aanwezige levensvatbare Schwann-cellen bevatten, zijn ze afhankelijk van de migratie en proliferatie van Schwann-cellen van de gastheer om axonale regeneratie te ondersteunen27. Saheb-Al-Zamani et al. rapporteerden dat beperkte regeneratie in lange acellulaire zenuwallografts geassocieerd was met verhoogde senescentie van Schwann-cellen27.

Niettemin toonde een eerdere in vivo studie aan dat op NaOH gebaseerde gedecellulariseerde menselijke zenuertransplantaten functioneel en structureel herstel ondersteunden dat vergelijkbaar was met dat van autotransplantaten bij een defect van 15 mm in de nervus ischiadicus van konijnen28. Contreras et al. demonstreerden ook axonale regeneratie en functioneel herstel met behulp van een gedecellulariseerd zenuwallotransplantaten over een defect van 70 mm in de nervus peroneus bij schapen29. Deze studies ondersteunen het regeneratieve potentieel van gedecellulariseerde zenuertransplantaten, hoewel verdere evaluatie van transplantaten die volgens het huidige protocol zijn bereid over klinisch relevante transplantaatlengten vereist is. Autotransplantaten zijn bovendien beperkt door de beschikbaarheid van donornerven en vereisen een extra oogstprocedure, wat resulteert in een tweede operatieplaats en morbiditeit op de donornutsite4. Acellulaire zenuwallotransplantaten kunnen daarom een klinisch relevant alternatief bieden wanneer voldoende autoloog weefsel niet beschikbaar is of wanneer het oogsten van donornerven onpraktisch is.

Samenvattend biedt dit protocol een praktisch en aanpasbaar kader voor het bereiden van gedecellulariseerde perifere zenuwgrafte. De nadruk op verminderde blootstelling aan detergentia, gecontroleerde uitwisseling van oplossingen en standaardisatie van het proces ondersteunt zowel onderzoekstoepassingen als potentieel translationeel gebruik bij perifere zenuwregeneratie. Toekomstige studies zouden zich moeten richten op verdere ontwikkeling van detergent-vrije benaderingen, de schaalbaarheid van het systeem en een uitgebreide in vivo evaluatie van de regeneratieve prestaties.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT), gefinancierd door de Koreaanse overheid (MOTIE) (P0011947, Korea-Czech bilaterale gezamenlijke financiering van O&O-projecten).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
BT100-1L Meerkanaals Peristaltische PompLangere pompBT100-1LWordt gebruikt om een continue circulatie en uitwisseling van de oplossing te waarborgen tijdens de delipidatie, decellularisatie en het wassen.
Econo-Column chromatografiekolom, 2,5 × 10 cmBio-Rad737-2512Wordt gebruikt om perifere zenuwsegmenten vast te houden tijdens continue uitwisseling van de oplossing.
Isopropanol (IPA)Daejeong Chemicals5035-4410Gebruikt voor delipidatie van perifeer zenuwweefsel.
Masterflex Tygon E-LFL pompslangenThermo Scientific06440-16Wordt gebruikt om de peristaltische pomp, de chromatografische kolom en de reservoirvloeistoffen met elkaar te verbinden voor een continue circulatie van de oplossing.
Natriumdeoxycholaat (SDC)Sigma-Aldrich30970-100GGebruikt als detergent voor de tweede decellularisatiestap om residuele cellulaire componenten te verwijderen.
Natriumhydroxide, NaOHDuksan1636Voor celdisruptie.

Referenties

  1. Kornfeld T, Vogt PM, Radtke C. Nerve grafting for peripheral nerve injuries with extended defect sizes. Wien Med Wochenschr. 2019;169(9):240-251.
  2. Siemionow M, Brzezicki G. Current techniques and concepts in peripheral nerve repair. Int Rev Neurobiol. 2009;87:141-172.
  3. Hoben GM, et al. Increasing nerve autograft length increases senescence and reduces regeneration. Plast Reconstr Surg. 2018;142(4):952-963.
  4. Gaudin R, et al. Approaches to peripheral nerve repair: Generations of biomaterial conduits yielding to replacing autologous nerve grafts in craniomaxillofacial surgery. Biomed Res Int. 2016;2016:3856262.
  5. Lans J, et al. A systematic review and meta-analysis of nerve gap repair: Comparative effectiveness of allografts, autografts, and conduits. Plast Reconstr Surg. 2023;151(5):814e-827e.
  6. Huang H, et al. A comparative study of acellular nerve xenografts and allografts in repairing rat facial nerve defects. Mol Med Rep. 2015;12(4):6330-6336.
  7. Rana D, et al. Development of decellularized scaffolds for stem cell-driven tissue engineering. J Tissue Eng Regen Med. 2017;11(4):942-965.
  8. Zhang Y, et al. A nerve graft constructed with xenogeneic acellular nerve matrix and autologous adipose-derived mesenchymal stem cells. Biomaterials. 2010;31(20):5312-5324.
  9. Sondell M, Lundborg G, Kanje M. Regeneration of the rat sciatic nerve into allografts made acellular through chemical extraction. Brain Res. 1998;795(1-2):44-54.
  10. Hudson TW, et al. Optimized acellular nerve graft is immunologically tolerated and supports regeneration. Tissue Eng. 2004;10(11-12):1641-1651.
  11. Rinker B, et al. Use of processed nerve allografts to repair nerve injuries greater than 25 mm in the hand. Ann Plast Surg. 2017;78(6 Suppl):S292-S295.
  12. Zvarova B, et al. Residual detergent detection method for nondestructive cytocompatibility evaluation of decellularized whole lung scaffolds. Tissue Eng Part C Methods. 2016;22(5):418-428.
  13. Fox DA, Epstein ML, Bass P. Surfactants selectively ablate enteric neurons of the rat jejunum. J Pharmacol Exp Ther. 1983;227(2):538-544.
  14. Singh G, et al. Impact of various detergent-based immersion and perfusion decellularization strategies on the novel caprine pancreas derived extracellular matrix scaffold. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1253804.
  15. Gilbert TW, Sellaro TL, Badylak SF. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials. 2006;27(19):3675-3683.
  16. Tsuchiya T, et al. Influence of pH on extracellular matrix preservation during lung decellularization. Tissue Eng Part C Methods. 2014;20(12):1028-1036.
  17. Sengyoku H, et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 2018;14(2):94-106.
  18. Jones EM, Cochrane CA, Percival SL. The effect of pH on the extracellular matrix and biofilms. Adv Wound Care (New Rochelle). 2015;4(7):431-439.
  19. Nieto-Nicolau N, et al. Effective decellularization of human nerve matrix for regenerative medicine with a novel protocol. Cell Tissue Res. 2021;384(1):167-177.
  20. Philips C, et al. Qualitative and quantitative evaluation of a novel detergent-based method for decellularization of peripheral nerves. Ann Biomed Eng. 2018;46(11):1921-1937.
  21. Wüthrich T, et al. Development of vascularized nerve scaffold using perfusion-decellularization and recellularization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2020;117:111311.
  22. Crapo PM, Gilbert TW, Badylak SF. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 2011;32(12):3233-3243.
  23. Hopf A, et al. Optimized decellularization protocol for large peripheral nerve segments: Towards personalized nerve bioengineering. Bioengineering (Basel). 2022;9(9):412.
  24. Penkert G. Anatomy of the peripheral nerve system. In: Focal Peripheral Neuropathies: Imaging, Neurological, and Neurosurgical Approaches. Springer; 2014:3-9.
  25. Vasudevan S, et al. Detergent-free decellularized nerve grafts for long-gap peripheral nerve reconstruction. Plast Reconstr Surg Glob Open. 2014;2(8):e201.
  26. García-García ÓD, et al. Comprehensive ex vivo and in vivo preclinical evaluation of novel chemoenzymatic decellularized peripheral nerve allografts. Front Bioeng Biotechnol. 2023;11:1162684.
  27. Saheb-Al-Zamani M, et al. Limited regeneration in long acellular nerve allografts is associated with increased Schwann cell senescence. Exp Neurol. 2013;247:165-177.
  28. Kim S, et al. Enhancing peripheral nerve regeneration through NaOH-based decellularization of human nerve tissue. Bioeng Transl Med. 2025;10(6):e70072.
  29. Contreras E, et al. Repair of long nerve defects with a new decellularized nerve graft in rats and in sheep. Cells. 2022;11(24):4074.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Gedecellulariseerde zenuwgraftsregeneratie van perifere zenuwennatriumhydroxidebehandelingextracellulaire matrixbereiding van zenuwgraftshistologische analyseDNA kwantificeringscanning elektronenmicroscopiecytotoxiciteitstesten
Video binnenkort beschikbaar
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.