Bereiding van gedecellulariseerde humane perifere zenuvgrafts met behulp van natriumhydroxide en natriumdeoxycholaat

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde, alkalisch-ondersteunde decellularisatiemethode die een behandeling met natriumhydroxide combineert met een door een peristaltische pomp aangedreven oplossingsuitwisselingssysteem om gedecellulariseerde menselijke perifere zenuwgrafs te produceren met een effectieve verwijdering van cellen en behoud van de architectuur van de natuurlijke extracellulaire matrix.

Samenvatting

Letsels aan perifere zenuwen vereisen vaak graftmaterialen die structurele begeleiding bieden voor axonale regeneratie. Hoewel autologe zenuwgrafts de klinische gouden standaard blijven, is het gebruik ervan beperkt door morbiditeit op de donorplaats en beperkte beschikbaarheid van weefsel. Deze beperkingen hebben geleid tot een toenemende belangstelling voor gedecellulariseerde menselijke perifere zenuwgrafts als alternatief biomateriaal voor zenuwregeneratie. Veelgebruikte decellularisatieprotocollen op basis van detergentia kunnen echter de architectuur van de extracellulaire matrix (ECM) verstoren en cytotoxische residuen achterlaten die de kwaliteit van de graft kunnen beïnvloeden. In dit artikel wordt een gestandaardiseerd protocol beschreven voor het bereiden van gedecellulariseerde menselijke perifere zenuwgrafts met behulp van een alkalisch-ondersteunde decellularisatieaanpak. De procedure begint met een behandeling met natriumhydroxide (NaOH) om efficiënte cellulaire disruptie te bevorderen, gevolgd door een milde stap met natriumdeoxycholaat (SDC) die overgebleven cellulaire en immunogene componenten verwijdert terwijl de oorspronkelijke organisatie van de ECM behouden blijft. Deze strategie beperkt de blootstelling aan detergentia terwijl de preservering van de oorspronkelijke ECM-architectuur wordt ondersteund. De workflow omvat de voorbereiding van de donorzenuw, gecontroleerde NaOH-behandeling, daaropvolgende milde SDC-behandeling en uitgebreid wassen onder continue uitwisseling van de oplossing met behulp van een door een peristaltische pomp aangedreven systeem om de verwijdering van resterende bewerkingsmiddelen te vergemakkelijken. Verdere post-processing stappen worden geïmplementeerd om de structurele integriteit te behouden en de grafts voor te bereiden op de uiteindelijke verpakking en sterilisatie. De efficiëntie van de decellularisatie wordt beoordeeld via histologische analyse en kwantificering van residu-DNA, en de preservering van de ECM-structuur wordt onderzocht met behulp van scanning elektronenmicroscopie. De afwezigheid van residu-SDC en de biocompatibiliteit van de bewerkte grafts werden bevestigd via cytotoxiciteitstesten. Dit protocol biedt een praktische aanpak voor het produceren van gedecellulariseerde menselijke perifere zenuwgrafts voor onderzoek naar perifere zenuwregeneratie en translationele toepassingen.

Inleiding

Letsels aan perifere zenuwen kunnen leiden tot ernstige functionele beperkingen en blijven een aanzienlijke klinische uitdaging in de regeneratieve geneeskunde en reconstructieve chirurgie. De regeneratie van segmentale zenuwdefecten vereist graftmaterialen die niet alleen de kloof van het letsel overbruggen, maar ook structurele geleiding en biochemische signalen bieden om axonale regeneratie en reïnnervatie te ondersteunen. Autologe zenuwgrafts worden algemeen beschouwd als de klinische gouden standaard omdat ze de architectuur van de natuurlijke extracellulaire matrix (ECM) behouden en een ondersteunende micro-omgeving bieden voor zenuwregeneratie^1,2. Het klinische gebruik ervan is echter beperkt door de geringe beschikbaarheid van donortissue, de noodzaak van extra chirurgische ingrepen en morbiditeit op de donorplaats^3,4. Deze beperkingen hebben geleid tot de ontwikkeling van alternatieve graftmaterialen, in het bijzonder gedecellulariseerde perifere zenuwgrafts, die de natuurlijke ECM-architectuur behouden terwijl immunogene cellulaire componenten worden geminimaliseerd^5,6,7,8.

De prestaties van gedecellulariseerde zenuwgrafts zijn sterk afhankelijk van het decellularisatieproces. Conventionele methoden vertrouwen doorgaans op detergentgebaseerde reagentia zoals Triton X-100 en natriumdeoxycholaat (SDC), die cellulaire componenten verwijderen door lipide membranen te solubiliseren^9,10,11. Echter, langdurige blootstelling aan deze detergentia kan de microstructuur van de ECM verstoren en cytotoxische resten achterlaten die de cellulaire levensvatbaarheid en regeneratieve resultaten negatief beïnvloeden^12,13. Als gevolg hiervan worden alternatieve decellularisatiestrategieën die een efficiënte celverwijdering mogelijk maken terwijl de integriteit van de ECM behouden blijft, actief onderzocht¹⁴. Alkalische decellularisatie met natriumhydroxide (NaOH) is naar voren gekomen als een potentiële alternatieve benadering, omdat extreme pH-condities cellulaire componenten, nucleïnezuren en lipiden efficiënt kunnen afbreken^15,16,17. Desalniettemin kan ongecontroleerde blootstelling aan sterke alkalische condities de integriteit van de ECM in gevaar brengen, wat het belang benadrukt van nauwkeurig gecontroleerde verwerkingscondities^16,18.

Hier wordt een gestandaardiseerd, alkalisch-ondersteund decellularisatieprotocol voor menselijke perifere zenuwgraft presented, waarbij gebruik wordt gemaakt van een door een peristaltische pomp aangedreven systeem voor continue oplossingenuitwisseling. In vergelijking met conventionele statische immersiemethoden maakt dit dynamische proces een continue uitwisseling van oplossingen mogelijk, wat de verwijdering van celresten en resterende bewerkingsmiddelen vergemakkelijkt. Dit artikel biedt een stapsgewijze visuele demonstratie van de volledige workflow, inclusief de voorbereiding van de donornerve, gecontroleerde alkalisch-ondersteunde decellularisatie en continue oplossingenuitwisseling met behulp van een door een peristaltische pomp aangedreven systeem. De resulterende grafts werden geëvalueerd via histologische analyse, kwantificering van resident DNA en scanning elektronenmicroscopie (SEM) om efficiënte decellularisatie en het behoud van de ECM-ultrastructuur te bevestigen. Door een duidelijke visualisatie van kritische technische stappen mogelijk te maken, biedt dit artikel een duidelijk gedefinieerd kader voor het voorbereiden van gedecellulariseerde zenuwgrafts en voor toekomstige opschaling van het proces.

Protocol

Donated human peripheral nerves were obtained from a U.S. tissue bank under an exclusive agreement with L&C BIO and in compliance with the regulations of the American Association of Tissue Banks (AATB) and the U.S. Food and Drug Administration (FDA). Donor information, including age and sex, medical histories, and serological test results, was provided with the tissues and reviewed and approved by a certified medical director. Upon receipt, all tissues underwent incoming inspection, including verification of donor screening, serological testing, and testing for relevant pathogens; only tissues that met the predefined acceptance criteria were used in this study. All procedures involving human specimens were conducted in accordance with the principles of the Declaration of Helsinki. As no human subjects were directly recruited or involved in this study, a separate Institutional Review Board (IRB) approval number was not issued.

1. Prepare the solutions (Day 1)

1. Prepare 0.25 N sodium hydroxide (NaOH) solution by dissolving 10 g of NaOH in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
2. Prepare 4% sodium deoxycholate (SDC) solution by dissolving 40 g of SDC in 1 L of distilled water under magnetic stirring.
3. Transfer each prepared solution into sterile glass bottles.
   CAUTION: Handle sodium deoxycholate (SDC) inside a chemical fume hood. Wear appropriate personal protective equipment, including gloves, a laboratory coat, and eye protection, to prevent inhalation and skin contact.

2. Prepare the peripheral nerve segments for decellularization

1. Disinfect the outer surface of the packaged raw peripheral nerve and open the package aseptically.
2. Rinse the peripheral nerve several times with sterile distilled water.
3. Remove residual adipose tissue, connective tissue, unnecessary branches, and damaged nerve tissue using sterile scissors and forceps. Rinse the peripheral nerve again with sterile distilled water.
4. Cut the peripheral nerve into segments measuring 2–5 cm in length. Classify the prepared segments into three length groups: 2–3 cm, >3–4 cm, and >4–5 cm.
   NOTE: Process each length group separately because different IPA, NaOH, and SDC treatment durations are applied according to nerve segment length, as summarized in Table 1.

3. Set up the peristaltic pump system

1. Attach chemically resistant silicone tubing of sufficient length to both ends of the chromatography column.
2. Connect one end of the tubing to the peristaltic pump.
3. Connect the free ends of the tubing to a 1 L glass bottle containing isopropyl alcohol (IPA) using pump tubing to establish a closed-loop circulation system.
   NOTE: Secure all tubing connections firmly, as pressure and vibration from the peristaltic pump may cause the tubing to disconnect from the column or bottle.

4. Delipidize the peripheral nerve

NOTE: Unless otherwise indicated, perform all solution-exchange steps at room temperature (20–25 °C) using a peristaltic pump set to 90–186 mL/min, depending on the tubing configuration. Maintain the selected flow rate constant throughout each processing run.

1. Open one end of the chromatography column and partially fill the column with the IPA solution to ensure that the nerve tissue remains immersed immediately after insertion.
2. Using sterile forceps, gently grasp the outer tissue at one end of a single prepared peripheral nerve segment. Avoid directly compressing or grasping the main body of the nerve. Carefully lower the nerve segment into the solution within the column.
3. Using the forceps, gently straighten the nerve segment and position it longitudinally, parallel to the direction of fluid flow. Ensure that the segment is not folded, coiled, or pressed against the inner wall of the column or the outlet filter.
4. Close the column and position it at a slight upward incline toward the outlet, with the outlet placed slightly higher than the inlet. This orientation helps prevent the nerve segment from settling against either end filter, particularly the outlet filter.
   NOTE: Process one peripheral nerve segment per column per procedure. No additional physical fixation device is required. The natural buoyancy of the nerve tissue and the relatively gentle fluid flow help maintain the segment in a suspended and extended position. Inspect the tissue position during processing and gently reposition it with sterile forceps if it adheres to the column wall, filter, or itself.
5. Connect the IPA solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 1.5 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 2 h for segments measuring >3–4 cm, or 2.5 h for segments measuring >4–5 cm.
6. Drain the solution from the column.
7. Add 40 mL of sterile distilled water to the column. Gently invert or shake the column five times to wash the peripheral nerve.
8. Repeat steps 4.6 and 4.7 for a total of five washes.
9. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 5.1.
   NOTE: Minimize air bubbles inside the column to promote efficient solution exchange. Adjust the peripheral nerve segment as needed to keep it suspended in the solution and prevent it from adhering to the inner wall of the column or filter.

5. Perform the first decellularization (Day 2)

1. Connect the 0.25 N NaOH solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
2. Drain the solution from the column.
3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 6.1.

6. Perform the second decellularization (Day 3)

1. Connect the 4% (w/v) SDC solution to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column for 6 h for nerve segments measuring 2–3 cm, 8 h for segments measuring >3–4 cm, or 10 h for segments measuring >4–5 cm.
2. Drain the solution from the column.
3. Wash the peripheral nerve as described in steps 4.6–4.8.
4. Connect a reservoir containing 5 L of sterile distilled water to the peristaltic pump system. Perform continuous solution exchange through the column overnight.
   PAUSE POINT: After completing the overnight wash, the procedure may be paused. Stop the peristaltic pump and store the peripheral nerve fully submerged in sterile distilled water at 4 °C for up to 24 h before proceeding to step 7.1.

7. Sterilize the decellularized peripheral nerve (Day 4)

1. Remove a small volume of distilled water from the column. Carefully retrieve the decellularized peripheral nerve while keeping it suspended in the remaining liquid.
2. Package the peripheral nerve together with sterile distilled water.
3. Sterilize the packaged peripheral nerve by gamma irradiation at a dose of 25 kGy.
   NOTE: Do not completely drain the distilled water from the column. Keep the nerve segment suspended in a sufficient volume of the remaining liquid to prevent it from adhering to the inner wall of the column and to facilitate gentle handling without allowing the liquid to overflow.

Resultaten

An overview of the preparation process for decellularized human peripheral nerve grafts is shown in Figure 1. The workflow included trimming of the raw peripheral nerve, delipidization with IPA, sequential chemical decellularization with NaOH and SDC, followed by extensive washing and sterilization (Figure 1).

The peristaltic pump-driven solution-exchange system used for delipidization, decellularization, and washing ...

Discussie

Deze studie presenteert een gestandaardiseerd, alkalisch-ondersteund decellularisatieprotocol voor het vervaardigen van gedecellulariseerde menselijke perifere zenuwgrafts voor perifere zenuwregeneratie. Het protocol integreert een voorbehandeling van de donortenuw, gecontroleerde chemische decellularisatie en een door een peristaltische pomp aangedreven systeem voor vloeistofuitwisseling in een duidelijk gedefinieerde workflow, waardoor een efficiënte verwijdering van cellulaire en immunogene componenten mogelijk is ter...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
BT100-1L Meerkanaals Peristaltische Pomp	Langere pomp	BT100-1L	Wordt gebruikt om een continue circulatie en uitwisseling van de oplossing te waarborgen tijdens de delipidatie, decellularisatie en het wassen.
Econo-Column chromatografiekolom, 2,5 × 10 cm	Bio-Rad	737-2512	Wordt gebruikt om perifere zenuwsegmenten vast te houden tijdens continue uitwisseling van de oplossing.
Isopropanol (IPA)	Daejeong Chemicals	5035-4410	Gebruikt voor delipidatie van perifeer zenuwweefsel.
Masterflex Tygon E-LFL pompslangen	Thermo Scientific	06440-16	Wordt gebruikt om de peristaltische pomp, de chromatografische kolom en de reservoirvloeistoffen met elkaar te verbinden voor een continue circulatie van de oplossing.
Natriumdeoxycholaat (SDC)	Sigma-Aldrich	30970-100G	Gebruikt als detergent voor de tweede decellularisatiestap om residuele cellulaire componenten te verwijderen.
Natriumhydroxide, NaOH	Duksan	1636	Voor celdisruptie.