Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Onderzoeksartikel

Identificatie van mitochondria-gerelateerde kandidaat-biomarkers van Ligustri Lucidi Fructus bij diabetische nefropathie

57 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71592

⸱

15 september 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Pharmaceutical and Food Engineering, Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Shanxi Key Laboratory of Integrative Systemic Regulation for Qi-Blood Homeostasis, 2College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Diabetische nefropathie (DN) gaat gepaard met mitochondriale dysfunctie. Met behulp van transcriptomics, netwerkfarmacologie en machine learning hebben we CAT, FABP1, MAOA en MAOB geïdentificeerd als kandidaat mitochondriaal-gerelateerde biomarkers voor Ligustri Lucidi Fructus. In db/db-muizen reguleerde LLF CAT en MAOA op, wat verdere mechanistische onderzoeken ondersteunt.

Samenvatting

Mitochondriële dysfunctie en overmatige oxidatieve stress binnen de mitochondriën zijn cruciale pathologische factoren die bijdragen aan renale tubulaire beschadiging bij diabetische nefropathie (DN). Hoewel Ligustri Lucidi Fructus (LLF) traditioneel wordt gebruikt voor de behandeling van DN, blijven de betrokken mechanismen, in het bijzonder die met betrekking tot mitochondriën-geassocieerde genen en signaalpaden, onvoldoende begrepen. In deze studie werd differentiële expressieanalyse van de GSE142025-dataset gebruikt om differentieel tot expressie gebrachte genen (DEGs) gerelateerd aan DN te identificeren. Kenmerkende genen werden geselecteerd door de output van vier machine learning-modellen te kruisverwijzen. Genen die een significante differentiële expressie en consistente expressiepatronen in beide datasets vertoonden, werden verder geëvalueerd via receiver operating characteristic (ROC)-curve-analyse. Genen met een area under the curve (AUC) > 0,7 in beide datasets werden gedefinieerd als kandidaat-biomarkers. Analyses voor functionele verrijking, immuuninfiltratie, netwerkconstructie en moleculaire docking werden uitgevoerd. Een DN-muismodel werd gebruikt om de bloedglucose, urinaire microalbuminurie, histopathologie en de RT-qPCR-expressie van de kandidaat-biomarkers te beoordelen. CAT en MAOA waren significant upgereguleerd in vivo. De kandidaat-biomarkers waren verrijkt in pathways gerelateerd aan ribosoomfunctie, degradatie van valine, leucine en isoleucine, cytokine-cytokine receptor-interacties en peroxisomen. Ze waren negatief gecorreleerd met CD8+ T-cellen en geactiveerde mestcellen en positief gecorreleerd met geactiveerde NK-cellen en naïeve B-cellen. Taxifoline, beta-sitosterol en eriodictyol vertoonden bindingsenergieën onder -5 kcal/mol met de kandidaat-biomarkers. CAT en MAOA zijn veelbelovende kandidaten die verdere mechanistische onderzoeken rechtvaardigen.

Inleiding

Diabetische nefropathie (DN), de belangrijkste oorzaak van nierfalen in het eindstadium wereldwijd, is een van de meest voorkomende complicaties van diabetes mellitus. Pathologisch wordt het gekenmerkt door overmatige accumulatie van de extracellulaire matrix in zowel de glomerulaire als de tubulaire compartimenten, samen met verdikking en sclerose van de intrarenale bloedvaten2. DN wordt gewoonlijk geassocieerd met proteïnurie en hypertensie3. De ontwikkeling ervan is nauw verbonden met schade aan de vasculaire endotheelcellen, een versterkte ontstekingsreactie en verhoogde oxidatieve stress als gevolg van langdurige hyperglykemie4. De incidentie van DN stijgt wereldwijd, vooral bij diabetici van middelbare leeftijd en ouderen. Naarmate de ziekte vordert, kan dit leiden tot nierfalen in het eindstadium en zelfs tot cardiovasculaire complicaties, wat de kwaliteit van leven en de prognose van patiënten aanzienlijk verslechtert5. Ondanks vorderingen in diagnostische en therapeutische benaderingen voor DN, blijven vroege en nauwkeurige kandidaat-biomarkers voor diagnose ongrijpbaar, en effectieve behandelstrategieën om de pathologische processen om te keren ontbreken nog steeds. Daarom is er een dringende behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe, gerichte anti-DN-geneesmiddelen.

Mitochondriën zijn essentieel voor de cellulaire bioenergetica, de synthese van metabole precursoren, calciumhomeostase, de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), immuunsignalering en apoptose, die allen noodzakelijk zijn voor het behoud van de cellulaire en organismische stabiliteit6. Als de energiercentrales van de cel spelen mitochondriën een spilrol in fundamentele processen zoals glycolyse, de tricarboxylaatzuurcyclus en oxidatieve fosforylering7. Obesitas verstoort de Krebs-cyclus en de mitochondriale ademhalingsketen, wat leidt tot mitochondriale dysfunctie en een verhoogde ROS-productie. Verhoogde ROS-niveaus in de mitochondriale ademhalingsketen kunnen oxidatieve stress induceren, wat de ontstekingsreactie geassocieerd met obesitas verergert en apoptose bevordert8. Recent onderzoek heeft de significante rol van mitochondriale dysfunctie bij de pathogenese en progressie van DN benadrukt, inclusief verstoringen in het energiemetabolisme, excessieve ROS-generatie en versterkte apoptose-signalering9. Chronische mitochondriale dysfunctie versnelt de progressie van nierziekten10. Daarom zou het verbeteren van de mitochondriale functie een cruciale beschermende strategie tegen DN kunnen vormen.

Ligustri Lucidi Fructus (LLF) is een gedroogde, rijpe vrucht uit de Luteaceae-familie die bekend staat om zijn lever- en nierversterkende eigenschappen, evenals het vermogen om haar te donkeren en het gezichtsvermogen te verbeteren. Er is een natuurlijk voorkomend heteropolysacharide uit LLF geëxtraheerd, waarbij is aangetoond dat dit potentieel bezit de nieren tegen fibrose te beschermen11. In recente jaren is er toenemende aandacht voor het gebruik van LLF bij de behandeling van diabetische nefropathie (DN), waarbij opmerkelijke renoprotectieve effecten zijn aangetoond11,12,13. Bovendien is de complexe relatie tussen LLF en mitochondriën uitgebreid onderzocht en gevalideerd. In het bijzonder heeft een studie aangetoond dat LLF zijn gunstige effecten uitoefent door de mitochondriale functie te moduleren via activering van de AMPK-signaleringsroute14. Dit mechanisme beschermt mitochondriën effectief tegen schade veroorzaakt door oxidatieve stress. Deze bevindingen benadrukken verder de cruciale rol van LLF bij het behouden van het cellulaire energiemetabolisme en het verbeteren van de veerkracht van cellen tegen oxidatieve stress. Het precieze therapeutische mechanisme, met name met betrekking tot het herstel van de mitochondriale functie, is echter nog onvoldoende begrepen.

Het doel van deze studie was om de biologische mechanismen te ontrafelen die ten grondslag liggen aan het therapeutische effect van LLF op de mitochondriale functie bij DN. Openbare databases werden doorzocht met behulp van bio-informatica-instrumenten om kandidaat-biomarkers te identificeren die geassocieerd zijn met de renoprotectieve effecten van LLF, waarbij transcriptomische gegevens en informatie over actieve bestanddelen werden geïntegreerd. Verdere analyses, waaronder immuuninfiltratie, associatie met klinische kenmerken, m6A RNA-modificatie, functionele verrijking, constructie van regulatoire netwerken en moleculaire docking, suggereerden dat deze kandidaat-biomarkers een cruciale rol spelen bij het reguleren van de mitochondriale functie tijdens de behandeling van DN. In vivo validatie bevestigde verder hun significantie. Deze uitgebreide analyse verdiept ons begrip van de mechanismen waarmee LLF DN behandelt en biedt een solide basis voor de ontwikkeling van nieuwe therapeutische doelwitten op basis van mitochondriale dysfunctie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Gegevensverzameling
De genexpressiematrix en de bijbehorende klinische gegevens voor de datasets GSE142025 en GSE96804, welke gerelateerd zijn aan DN, werden opgehaald uit de Gene Expression Omnibus (GEO) database (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)15. De trainingsset (GSE142025) bevatte niertestmonsters van 27 patiënten met DN en negen controles, die werden gesequenced met het GPL20301 platform. De validatieset (GSE96804) bestond uit sequencinggegevens van 41 DN-patiënten en 20 controles, verwerkt met het GPL17586 platform. Beide datasets richten zich op nierweefsel; de GSE96804 dataset onderzoekt specifiek de glomerulus, de primaire filtratie-eenheid van de nier (Figuur 1). De GSE142025 dataset (trainingsset) bestaat uit monsters van volledig nierweefsel en biedt een uitgebreid overzicht van het transcriptomische landschap van DN. De GSE96804 dataset (validatieset) richt zich daarentegen specifiek op glomerulair weefsel, wat de primaire locatie is van glomerulaire filtratieschade. Aangezien deze twee datasets niet direct werden samengevoegd vanwege verschillen in platform en weefsel, is er geen batch-effectcorrectie toegepast. In plaats daarvan werd cross-dataset validatie onafhankelijk uitgevoerd. Genen met consistente directionele veranderingen en een area under the curve (AUC) groter dan 0,7 in beide datasets werden geselecteerd als robuuste kandidaten, wat de generaliseerbaarheid over verschillende niervakken ondersteunt.

In totaal werden 1.136 mitochondrië-gerelateerde genen (MRG's) geëxtraheerd uit de MitoCarta3.0-database (https://www.broadinstitute.org/mitocarta). De actieve ingrediënten van LLF werden voorspeld met behulp van de Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP)-database (http://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php), op basis van een drempelwaarde voor orale biobeschikbaarheid (OB) van ≥30% en een drempelwaarde voor drug-likeness (DL) van ≥0,18. Vervolgens werden potentiële doelwitgenen voor de actieve bestanddelen voorspeld met behulp van de Swiss Target Prediction-database (http://www.swisstargetprediction.ch/).

Analyse van differentiële expressie
De analyse van differentiële expressie van GSE142025 (DN vs. controle) werd uitgevoerd met het limma-pakket (v3.54.1), waarbij de significantiecriteria werden gesteld op P.adj < 0.05 en |log2FoldChange| > 0.516. Volcano-plots en heatmaps werden respectievelijk gevisualiseerd met de pakketten ggplot2 (v 3.3.6) en ComplexHeatmap (v 2.14.0)17,18. DEGs, MRGs en potentiële targetgenen van de actieve ingrediënten werden geintersecteerd, en de overlappende genen werden gedefinieerd als kandidaatgenen. Het netwerk dat de actieve ingrediënten en kandidaatgenen verbindt, werd geconstrueerd met behulp van Cytoscape-software (v 3.9.0)19.

Functionele verrijkingsanalyse en constructie van een eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk
Gene Ontology (GO) en Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) verrijkingsanalyses voor kandidaatgenen werden uitgevoerd met het clusterProfiler-pakket (v 4.6.2) om hun biologische functies en geassocieerde signaleringspaden te onderzoeken (P.adjust < 0,05). De kandidaatgenen werden vervolgens ingevoerd in de STRING-database (https://cn.string-db.org/) om PPI-relaties op te halen (betrouwbaarheidsniveau ≥ 0,4), gevolgd door de constructie van een PPI-netwerk met behulp van Cytoscape (v 3.9.0)20.

Machine learning
Vier machine-learning-algoritmen, waaronder random forest (RF), k-nearest neighbor (KNN), partial least squares (PLS) en support vector machine met een radial basis kernel (SVM), werden geïmplementeerd met het caret-pakket (v6.0-93) op basis van de GSE142025-dataset. De kandidaatgenen die in de voorafgaande analyse waren geïdentificeerd, werden gebruikt als voorspellende variabelen, en de ziektestatus (DN of controle) werd gebruikt als uitkomst. Voor het KNN-model werd 10-voudige kruisvalidatie uitgevoerd met de trainControl-functie, waarbij tuneLength = 10. Het RF-model werd gefit met 20 bomen (ntree = 20); de PLS- en SVM-modellen werden gefit met de instellingen die waren geïmplementeerd in de oorspronkelijke caret-workflow.

Modelresidudistributies werden geëvalueerd met het DALEX-pakket (v2.4.3). Vervolgens werd een permutatiegebaseerde variabelebeoordeling uitgevoerd met de DALEX variable_importance-functie, waarbij de root mean square error (RMSE) als verliesfunctie werd gespecificeerd. De resulterende dropout_loss representeert de RMSE die is verkregen na permutatie van de overeenkomstige variabele21,22. In de oorspronkelijke analytische workflow werden variabelen met een dropout loss < 0,281 over alle modellen behouden, en genen die in alle vier de modellen voorkwamen, werden gedefinieerd als consensus-featuregenen voor daaropvolgende validatie.

De vier machine-learningmodellen werden primair gebruikt voor feature-prioritering in plaats van voor het construeren van een definitieve klinische classifier. Bijgevolg werd de diagnostische discriminatie vervolgens op individueel genniveau geëvalueerd met behulp van ROC-analyse in zowel de discovery- als de validatiedatasets.

Identificatie van kandidaat-biomarkers
In GSE142025 en GSE96804 werden expressieverschillen in kenmerkgenen tussen DN- en controlemonsters geëvalueerd met de Wilcoxon-test. Alleen genen met een significante differentiële expressie (P < 0,05) en concordante expressietrends over de twee datasets werden geselecteerd voor analyse van de receiver operating characteristic (ROC)-curve. Het pROC-pakket (v1.18.0) werd gebruikt om ROC-curves te genereren en de area under the curve (AUC) te berekenen, waarbij genen met een AUC > 0,7 in beide datasets werden geclassificeerd als kandidaat-biomarkers23.

Gene set enrichment analysis (GSEA)
De biologische functies en signaleringspaden die geassocieerd zijn met de kandidaat-biomarkers werden verder onderzocht met behulp van GSEA op de GSE142025-dataset. Eerst werd een Spearman-correlatieanalyse van de kandidaat-biomarkers met alle overige genen uitgevoerd met het psych-pakket (v2.2.9)24. De correlatiecoëfficiënten werden berekend en gerangschikt (van hoog naar laag). De referentie-genenset was c2.cp.kegg.v2023.1.Hs.symbols.gmt uit de Molecular Signatures Database (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/). Vervolgens werd GSEA uitgevoerd om de verrijking van de gerangschikte genen in de achtergrond-genenset te evalueren met behulp van het clusterProfiler-pakket (v4.6.2). Correctie voor meervoudig testen werd toegepast via de FDR-methode, en aangepaste P-waarden (aangeduid als P.adjust) werden als significant beschouwd indien deze < 0,05 waren.

m6A-modificatieanalyse
Om RNA-methyleringsmodificaties van kandidaat-biomarkers te onderzoeken, is de SRAMP-database (http://www.cuilab.cn/sramp/) gebruikt om m6A-modificatieplaatsen op kandidaat-biomarkers te voorspellen, waarbij de focus lag op posities met een hoge betrouwbaarheid binnen hun secundaire structuren. Vervolgens is de ENCORI-database (https://starbase.sysu.edu.cn/) gebruikt om m6A-gemodificeerde eiwitten te identificeren die interageren met kandidaat-biomarkers, waarbij de parameter |HepG2 (shRNA)| > 1 is gebruikt om sleuteleiwitten te screenen. Daarna is de RPISeq-database (http://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/) gebruikt om de waarschijnlijkheid van interacties tussen sleuteleiwitten en kandidaat-biomarkers te voorspellen. De RNA-sequenties van beide zijn in platte tekst geüpload om RF- en SVM-classifier-voorspellingsscores te genereren. Een interactie werd als significant beschouwd wanneer de score boven de 0,5 uitkwam25. De SRAMP-analyse werd uitgevoerd met de 'High'-drempelwaarde voor m6A-plaatsvoorspelling, gebruikmakend van de 'Transcript'-modus en standaardparameters. Voor de ENCORI-analyse is de 'miRNA-mRNA'-interactiefunctie gebruikt met de parameter 'HepG2 (shRNA)' > 1. Voor de RPISeq-analyse is de RF-classifier met standaardparameters gebruikt; scores > 0,5 wezen op een positieve interactie. Dit zijn computationele voorspellingen en geen experimenteel bewijs van m6A-modificatie of RNA-eiwitinteracties in nierweefsel. Het HepG2-shRNA-criterium is afgeleid van de vooraf berekende datasets van ENCORI en weerspiegelt mogelijk geen nierspecifieke regulatie.

Analyse van immueninfiltratie
Het CIBERSORT-algoritme werd toegepast om de proporties van 22 immuunceltypen te schatten in zowel controle- als DN-monsters uit GSE142025, met visualisatie via een heatmap gegenereerd met het ggplot2-pakket (v3.3.6)26. CIBERSORT werd uitgevoerd met gebruik van de LM22-signatuurmatrix, met 1.000 permutaties en uitgeschakelde kwantielnormalisatie (zoals aanbevolen voor microarray-data). Monsters met een CIBERSORT p < 0,05 werden behouden voor verdere analyse. CIBERSORT schat immuuncelfracties op basis van bulkexpressie van nierweefsel, wat compartimentspecifieke infiltratie (bijv. glomerulair versus tubulo-interstitieel) niet kan oplossen en infiltrerende leukocyten niet kan onderscheiden van residente immuuncellen. De gerapporteerde correlaties bevinden zich dus op weefselniveau en dienen te worden gevalideerd met spatiale methoden. De Spearman-correlatieanalyse tussen immuuncellen met een differentieel abundantieniveau en kandidaat-biomarkers werd uitgevoerd met het psych-pakket.

Constructie van netwerken en moleculaire docking
Micro-RNA's (miRNA's) die interageren met kandidaat-biomarkers werden voorspeld met behulp van de miRNet-database (https://www.mirnet.ca). Vervolgens werden long noncoding RNA's (lncRNA's) die gericht zijn op de geïdentificeerde miRNA's voorspeld via de TarBase- (http://www.diana.pcbi.upenn.edu/tarbase) en starbase-databases (http://starbase.sysu.edu.cn/). lncRNA's die in beide databases voorkwamen, werden geselecteerd voor de netwerkconstructie. Vervolgens werd een lncRNA-miRNA-mRNA-regulatienetwerk gebouwd met behulp van Cytoscape-software. Potentiële actieve ingrediënten die gericht zijn op kandidaat-biomarkers werden gekozen om een netwerk van actieve ingrediënten en biomarkers te construeren. Daarnaast werden actieve ingrediënten, kandidaat-biomarkers en pathways die in GSEA waren geïdentificeerd, in Cytoscape geïntegreerd om een netwerk van actieve ingrediënten-biomarkers-pathways te creëren.

Er werd een moleculaire docking-analyse uitgevoerd om de bindingsaffiniteit tussen potentiële actieve bestanddelen en kandidaat-biomarkers te beoordelen. De 3D-structuren van de biomarker-eiwitten werden verkregen in PDB-bestandsformaat uit de Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB, https://www.rscb.org/pdb). De 2D-structuren van de potentiële actieve bestanddelen werden in SDF-formaat opgehaald uit de PubChem-database (http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). De moleculaire docking werd uitgevoerd met behulp van het CB-Dock-platform (http://clab.labshare.cn/cb-dock/php/blinddock.php). Een bindingsenergie van minder dan -5 kcal/mol duidde op een sterke bindingsaffiniteit27.

Bereiding en authenticatie van Ligustri Lucidi Fructus
Hier verwijst Ligustri Lucidi Fructus (LLF) naar de gedroogde rijpe vrucht van Ligustrum lucidum W. T. Aiton (Oleaceae). Het botanisch materiaal werd geauthenticeerd volgens de Chinese Farmacopee, en een bewijsexemplaar met nummer 20240506,20240911,20241103 werd gedeponeerd bij de Shanxi University of Traditional Chinese Medicine.

Voor de bereiding van het decoct werden 200 g gekwalificeerde LLF-plakjes gedurende 30 min bij kamertemperatuur geweekt in 1.000 mL gedestilleerd water. Het mengsel werd krachtig gekookt en vervolgens 60 min zachtjes laten sudderen. Het filtraat werd verzameld en het resterende kruidenmateriaal werd herhaaldelijk gedecocteerd met opnieuw 1.000 mL gedestilleerd water gedurende 60 min. De twee filtraten werden gecombineerd, gefilterd, gecentrifugeerd en onder vacuüm geconcentreerd om een uiteindelijke voorraadconcentratie van 1 g ruw drugmiddel/mL te verkrijgen (totaal volume van 100 mL). Het bereide decoct werd bewaard bij 4 °C voor kortstondig gebruik of bij −20 °C voor langdurige bewaring. De kwaliteit van LLF en het decoct werd strikt geïdentificeerd en geverifieerd volgens de normen van de Chinese Farmacopee om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van de experimenten te waarborgen.

Voor kwalitatieve identificatie werd dunne-laagchromatografie uitgevoerd. Kort samengevat werd een geschikt volume van het bereide decoct gecentrifugeerd en werd het supernatant geëxtraheerd met methanol. Na filtratie werden de monsteroplossing en de referentiestandaardoplossing van specnuezhenide op dezelfde silica gel G-plaat gespot. Na ontwikkeling, droging en inspectie onder ultraviolet licht vertoonde de vlek van de monsteroplossing een overeenstemmende kleur en positie met de referentieverbinding, waarmee het bestaan van de karakteristieke bioactieve component van LLF werd bevestigd.

Voor kwantitatieve kwaliteitscontrole werd detectie via hogedrukvloeistofchromatografie uitgevoerd. De analyse werd uitgevoerd met een C18-kolom en methanol-water als mobiele fase. De detectiegolflengte werd ingesteld op 224 nm. Het gehalte aan specnuezhenide in het decoct werd bepaald op basis van de standaardcurve. De resultaten toonden een stabiele en uniforme chemische samenstelling van het bereide decoct aan, waardoor een consistente drugskwaliteit tijdens het dierexperiment werd gewaarborgd.

Dierproeven
Twaalf mannelijke db/db-muizen van SPF-kwaliteit (8–9 weken oud) en zes leeftijd-gematched db/m-muizen werden gehouden in de SPF-dierfaciliteit van de Shanxi University of Traditional Chinese Medicine. Voorafgaand aan de experimenten werden de dieren 7 dagen geacclimatiseerd onder een cyclus van 12 u licht/12 u donker met ad libitum toegang tot voedsel en water. De studie werd goedgekeurd door de Ethiekcommissie van de Shanxi University of Traditional Chinese Medicine (Goedkeuringsnr. 2022DW167). Dieren met een gewichtsverlies van >20%, een moribunde toestand of onvermogen om toegang te krijgen tot voedsel of water werden humaan geëuthanaseerd vóór het geplande eindpunt van de studie. Aan het einde van de studie werden alle overgebleven muizen geëuthanaseerd via intraperitoneale injectie van pentobarbitalnatrium, gevolgd door cervicale dislocatie in overeenstemming met de institutionele protocollen.

Na de acclimatisatieperiode werd de vestiging van een DN-model in db/db-muizen bevestigd door een bloedglucosegehalte in de staartader van ≥ 16 mmol/L en microalbuminurie, aangetoond door een positieve urinestrip voor microalbumine. Na de succesvolle vestiging van het DN-model werden de db/db-muizen willekeurig verdeeld over twee groepen (n = 6 per groep): de DN-modelgroep (DN) en de LLF-behandelingsgroep (Treatment). Bovendien werden db/m-muizen (n = 6) gebruikt als controlegroep (Control). De dosering werd gekozen op basis van eerdere farmacodynamische studies van LLF bij diabetische ratten en werd omgerekend naar de menselijke equivalente dosis met behulp van normalisatie van het lichaamsoppervlak28. De Control- en DN-groepen kregen gedestilleerd water, terwijl de behandelingsgroep gedurende 8 weken 3,5 g/kg LLF ontving. Na 8 weken van toediening werden alle muizen geëuthanaseerd om serum, urine en nierweefsel te verzamelen voor vervolganalyses.

Bloed- en urine-indicatoren
Serumglucosewaarden werden geanalyseerd met een volledig automatische bloedbiochemie-analyser. De urinaire microalbumineconcentratie werd gemeten volgens de instructies van de kit (Aanvullend bestand 1).

Pathologische observatie van muisnierweefsels
Nierweefsels werden verwerkt voor histopathologisch onderzoek. Na fixatie in 4% paraformaldehyde werden de weefsels gewassen, gedehydrateerd, ingebed in paraffine en in coupes gesneden. Vervolgens werd hematoxyleen en eosine (HE) kleuring uitgevoerd, waarna de gekleurde coupes onder een optische microscoop werden onderzocht om pathologische veranderingen te evalueren.

Kwantitatieve reverse transcriptie polymerasekettingreactie (RT-qPCR)
RT-qPCR werd gebruikt om de expressie van de kandidaat-biomarkers in muisnierweefsel te bepalen. Totaal RNA werd geëxtraheerd volgens de instructies van de fabrikant, waarna de RNA-concentratie en -kwaliteit werden beoordeeld (Tabel 1). cDNA werd gesynthetiseerd uit het geëxtraheerde RNA met behulp van de cDNA Synthesis Kit. Amplificatie werd uitgevoerd met de primerparen vermeld in Tabel 1, waarbij GAPDH als referentiegen werd gebruikt. Relatieve expressieniveaus werden berekend met de 2−ΔΔCt methode13,26.

Statistische analyse
Alle statistische analyses zijn uitgevoerd met R-software (versie 4.2.2) in combinatie met de software die vereist was voor de overeenkomstige experimentele procedures. Tenzij anders aangegeven, waren alle statistische tests tweezijdig en werden verschillen als statistisch significant beschouwd bij P < 0,05. De transcriptomische analyse van differentiële expressie werd uitgevoerd met het limma-pakket. Genen met een aangepaste P < 0,05 en een absolute log2fold change groter dan 0,5 werden gedefinieerd als differentieel tot expressie gebracht.

Voor vergelijkingen van de expressie van kandidaatgenen tussen onafhankelijke DN- en controlesamples werden non-parametrische Wilcoxon rank-sum tests gebruikt, zoals aangegeven in de oorspronkelijke analytische workflow. Correlaties tussen kandidaatbiomarkers en immuuncelfracties werden beoordeeld met behulp van de rankcorrelatie van Spearman.

Experimentele gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD. Vergelijkingen tussen de drie onafhankelijke diergroepen werden uitgevoerd met behulp van een eenweg-variantieanalyse wanneer aan de aannames voor parametrische analyse werd voldaan. Voor post-hocvergelijkingen werd de test voor het kleinst significante verschil gebruikt wanneer de varianties homogeen waren, terwijl de T3-test van Dunnett werd gebruikt wanneer de varianties ongelijk waren. De baseline- en week-8-farmacodynamische metingen werden afzonderlijk geanalyseerd en gepresenteerd; er is geen conclusie getrokken met betrekking tot een interactie tussen groep en tijd. De R-scripts en brondata die zijn gebruikt voor de bio-informatica- en machine-learninganalyses zijn beschikbaar in Aanvullend bestand 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om systematisch potentiële mitochondria-gerelateerde kandidaat-biomarkers voor LLF bij de behandeling van DN te onderzoeken, hebben we een analytische workflow bestaande uit vier fasen ontworpen (Figuur 1). In Fase I hebben we transcriptomische gegevens uit de dataset GSE142025 (trainingsset, gehele nier, n=36) en GSE96804 (validatieset, glomerulus, n = 61) geïntegreerd met 1.136 mitochondria-gerelateerde genen uit de MitoCarta 3.0-database en 517 voorspelde targets van 9 actieve bestanddelen uit de TCMS...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

LLF is een veelgebruikt traditioneel Chinees geneesmiddel, dat primair wordt ingezet om de lever en nieren te voeden en om diabetes en de daarmee gepaard gaande complicaties te behandelen. Momenteel zijn er geen specifieke medicijnen of therapieën voor DN, en de behandeling ervan berust hoofdzakelijk op hypoglycemische, hypolipidemische en antihypertensieve behandelingen30,31,32. Deze behandelingen kunnen de progressie van nierb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te verklaren.

Dankbetuigingen

Wij willen onze oprechte dank uitspreken aan alle personen en organisaties die ons gedurende dit onderzoek hebben ondersteund en bijgestaan. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (No.81973486 en 82173974), de onderzoeksprojecten van de Traditional Chinese Medicine Administration van de provincie Shanxi (No.2024ZYYA021), het Discipline Project van de Shanxi University of Chinese Medicine (No.2026XK24) en het Scientific Research Fund project van de Shandong University of Chinese Medicine (No. KYZK2024Q13). Wij danken Qinqing Li, Associate Professor aan de Shanxi University of Chinese Medicine, die het botanisch materiaal heeft geauthenticeerd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4% paraformaldehyde-weefselfixeeroplossingSaiyin Biotechnology Co., Ltd.71033600
Absolute ethanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.10009218
BloedglucosemeterSinocare Inc.GA-3
Blood Urea Nitrogen (BUN) Assay KitNanjing Jianwei Bioengineering InstituteC03-2-1
C57BLKS/J db/db-muizenChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
C57BLKS/J db/m-muizenChangzhou Cavens Experimental Animal Co., Ltd.SCXK (Su) 2021-0013
CentrifugeerenHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.HI650
ChloraalhydraatShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.302-17-0
Cytoscape (v3.9.0)https://cytoscape.org
Database voor m6Een voorspelling van een modificatiehttp://www.cuilab.cn/sramp/
Database van actieve bestanddelen in traditionele Chinese geneeskundehttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
ENCORI / Starbasehttps://starbase.sysu.edu.cn/
Gene Expression Omnibus (GEO)https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/
Hematoxylin- en eosinekleurset (HE)Servicebio C0105S
SnelcentrifugeLabnet, USAC2500-R-230V
Instrument voor analyse van immuuninfiltratiehttps://cibersort.stanford.edu/
Ligustri Lucidi FructusSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20240506
Magnetische roerderJintan Zhongtian Instrument Factory, JiangsuT8-1
MicroscoopOlympusBX53
MicrotoomLeica, DuitslandRM 2016
Microvolume-spectrofotometerHangzhou Aosheng Instrument Co., Ltd.Nano-300
miRNethttps://www.mirnet.ca
MitoCarta 3.0https://www.broadinstitute.org/mitocarta
R-pakket voor modelinterpretatiehttps://cran.r-project.org/package=DALEX
Moleculair Dockingplatformhttp://clab.labshare.cn/cb-dock/
ELISA-kit voor microalbuminurie bij muizenFijne TestEM0632
Teststrip voor microalbuminurie bij muizenGuangzhou Huadu Gaoerbao Biotechnology Co., Ltd.20211203
ELISA-kit voor creatinine in muisserumAbmartAB5990A
MSigDBhttps://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/
PCR-thermocyclerRocheRoche LightCycler 480
R-software (v4.2.2) + R-pakkettenhttps://www.r-project.org / CRAN/Bioconductor
RCSB PDBhttps://www.rcsb.org
RNA-extractiekitBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF-036-01
RPISeqhttp://pridb.gdcb.iastate.edu/RPISeq/
RT-qPCR-kitBeijing Jumei Biotech Co., Ltd.MF949-T
SalidrosideSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20211009
Serum Creatinine Assay KitNanjing Jianwei Bioengineering InstituteC011-2-1
SPF-dierfaciliteitShanxi Universiteit voor Traditionele Chinese Geneeskunde
SRAMPSRAMP (Single-cell RNA-seq Analysis and Manipulation Pipeline) is een geïntegreerde tool voor de analyse van single-cell RNA-sequencing-data, die is ontworpen om onderzoekers te ondersteunen bij het efficiënt verwerken van complexe datasets. De pipeline biedt een gestroomlijnde workflow voor kwaliteitscontrole, normalisatie, clustering en celtype-identificatie, waardoor gebruikers in staat zijn biologische inzichten te verkrijgen uit single-cell transcriptoomprofielen. Met een focus op gebruiksvriendelijkheid en reproduceerbaarheid faciliteert SRAMP de overgang van ruwe sequencing-data naar betekenisvolle biologische conclusies.
U heeft geen brontekst opgegeven om te vertalen. Voeg alstublieft de Engelse tekst toe die u naar het Nederlands vertaald wilt hebben.https://cn.string-db.org/
SwissTargetPredictionhttp://www.swisstargetprediction.ch/
TCMSPhttp://sm.nwsuaf.edu.cn/lsp/tcmsp.php
Tezhi PiganSichuan Quanyirun Biotechnology Co., Ltd.20210602
WeefseldrijfbadWuhan JunjieJK-6

Referenties

  1. Thipsawat S. Early detection of diabetic nephropathy in patient with type 2 diabetes mellitus: a review of the literature. Diabetes Vasc Dis Res. 2021;18(6):14791641211058856.
  2. Kanwar YS, Sun L, Xie P, Liu FY, Chen S. A glimpse of various pathogenetic mechanisms of diabetic nephropathy. Annu Rev Pathol. 2011;6:395-423.
  3. Santulli G, et al. Prediabetes increases the risk of frailty in prefrail older adults with hypertension: beneficial effects of metformin. Hypertension. 2024;81(7):1637-43.
  4. Jin Q, et al. Oxidative stress and inflammation in diabetic nephropathy: role of polyphenols. Front Immunol. 2023;14:1185317.
  5. Alicic RZ, Rooney MT, Tuttle KR. Diabetic kidney disease: challenges, progress, and possibilities. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(12):2032-45.
  6. Harrington JS, et al. Mitochondria in health, disease, and aging. Physiol Rev. 2023;103(4):2349-422.
  7. Peña FJ, et al. An integrated overview on the regulation of sperm metabolism (glycolysis-Krebs cycle-oxidative phosphorylation). Anim Reprod Sci. 2022;246:106805.
  8. de Mello AH, Costa AB, Engel JDG, Rezin GT. Mitochondrial dysfunction in obesity. Life Sci. 2018;192:26-32.
  9. Shen Y, et al. Notoginsenoside Fc, a novel renoprotective agent, ameliorates glomerular endothelial cells pyroptosis and mitochondrial dysfunction in diabetic nephropathy through regulating HMGCS2 pathway. Phytomedicine. 2024;126:155445.
  10. Zhang PN, et al. Mitochondrial dysfunction and diabetic nephropathy: nontraditional therapeutic opportunities. J Diabetes Res. 2021;2021:1010268.
  11. Zhang JL, et al. Structural characterization and protective effect against renal fibrosis of polysaccharide from Ligustrum lucidum Ait. J Ethnopharmacol. 2023;302(Pt A):115898.
  12. Luan R, et al. The protective effect of ethyl acetate and n-butanol fractions of wine-steamed Ligustri Lucidi Fructus on diabetic nephropathy in rats. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:6512242.
  13. Luan R, et al. Pharmacodynamics, pharmacokinetics, and kidney distribution of raw and wine-steamed Ligustri Lucidi Fructus extracts in diabetic nephropathy rats. Molecules. 2023;28(2):791.
  14. Seo HL, et al. Liqustri lucidi Fructus inhibits hepatic injury and functions as an antioxidant by activation of AMP-activated protein kinase in vivo and in vitro. Chem Biol Interact. 2017;262:57-68.
  15. Yan M, et al. Identification of pyroptosis-related genes and potential drugs in diabetic nephropathy. J Transl Med. 2023;21(1):490.
  16. Ritchie ME, et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 2015;43(7):e47.
  17. Gustavsson EK, et al. ggtranscript: an R package for the visualization and interpretation of transcript isoforms using ggplot2. Bioinformatics. 2022;38(15):3844-6.
  18. Gu Z, Eils R, Schlesner M. Complex heatmaps reveal patterns and correlations in multidimensional genomic data. Bioinformatics. 2016;32(18):2847-9.
  19. Shannon P, et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 2003;13(11):2498-504.
  20. Wu T, et al. clusterProfiler 4.0: a universal enrichment tool for interpreting omics data. Innovation (Camb). 2021;2(3):100141.
  21. Dong H, et al. Identification through machine learning of potential immune-related gene biomarkers associated with immune cell infiltration in myocardial infarction. BMC Cardiovasc Disord. 2023;23(1):163.
  22. Pei B, et al. The development of prediction model for cuffed tracheal tube size from the middle finger in pediatrics: a concise and feasible approach. Transl Pediatr. 2023;12(12):2222-31.
  23. Robin X, et al. pROC: an open-source package for R and S+ to analyze and compare ROC curves. BMC Bioinformatics. 2011;12:77.
  24. Robles-Jimenez LE, et al. Worldwide traceability of antibiotic residues from livestock in wastewater and soil: a systematic review. Animals (Basel). 2021;12(1):60.
  25. Wang Y, et al. Bioinformatics analysis combined with clinical sample screening reveals that leptin may be a biomarker of preeclampsia. Front Physiol. 2022;13:1031950.
  26. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^−ΔΔCT method. Methods. 2001;25(4):402-8.
  27. Klejborowska G, et al. Synthesis, anticancer activity and molecular docking studies of N-deacetylthiocolchicine and 4-iodo-N-deacetylthiocolchicine derivatives. Bioorg Med Chem. 2021;32:116014.
  28. Reagan-Shaw S, Nihal M, Ahmad N. Dose translation from animal to human studies revisited. FASEB J. 2008;22(3):659-61.
  29. An Y, Duan H. The role of m6A RNA methylation in cancer metabolism. Mol Cancer. 2022;21(1):14.
  30. Mazzieri A, Porcellati F, Timio F, Reboldi G. Molecular targets of novel therapeutics for diabetic kidney disease: a new era of nephroprotection. Int J Mol Sci. 2024;25(7):3969.
  31. Breyer MD, Susztak K. The next generation of therapeutics for chronic kidney disease. Nat Rev Drug Discov. 2016;15(8):568-88.
  32. Leoncini G, et al. Blood pressure reduction and RAAS inhibition in diabetic kidney disease: therapeutic potentials and limitations. J Nephrol. 2020;33(5):949-63.
  33. Pofi R, et al. Diabetic nephropathy: focus on current and future therapeutic strategies. Curr Drug Metab. 2016;17(5):497-502.
  34. Arellano Buendía AS, et al. Immunomodulatory effects of the nutraceutical garlic derivative allicin in the progression of diabetic nephropathy. Int J Mol Sci. 2018;19(10):3107.
  35. Zhang X, Agborbesong E, Li X. The role of mitochondria in acute kidney injury and chronic kidney disease and its therapeutic potential. Int J Mol Sci. 2021;22(20):11253.
  36. Liu Y, et al. DsbA-L interacting with catalase in peroxisome improves tubular oxidative damage in diabetic nephropathy. Redox Biol. 2023;66:102855.
  37. Zhong Y, et al. Jujuboside A ameliorates high fat diet and streptozotocin induced diabetic nephropathy via suppressing oxidative stress, apoptosis, and enhancing autophagy. Food Chem Toxicol. 2022;159:112697.
  38. Zhong Y, et al. Dioscin relieves diabetic nephropathy via suppressing oxidative stress and apoptosis, and improving mitochondrial quality and quantity control. Food Funct. 2022;13(6):3660-73.
  39. Issac PK, et al. Protective effect of morin by targeting mitochondrial reactive oxygen species induced by hydrogen peroxide demonstrated at a molecular level in MDCK epithelial cells. Mol Biol Rep. 2022;49(6):4269-79.
  40. Abo El-Asrar M, Ismail EAR, Elnhrawy AM, Thabet RA. Fatty acid binding protein 1 (FABP1) and fatty acid binding protein 2 (FABP2) as a link between diabetic nephropathy and subclinical atherosclerosis in children and adolescents with type 1 diabetes. J Diabetes Complications. 2023;37(3):108414.
  41. Gholaminejad A, Fathalipour M, Roointan A. Comprehensive analysis of diabetic nephropathy expression profile based on weighted gene co-expression network analysis algorithm. BMC Nephrol. 2021;22(1):245.
  42. Tanaka M, et al. Urinary fatty acid-binding protein 4 is a promising biomarker for glomerular damage in patients with diabetes mellitus. J Diabetes Investig. 2025;16(4):670-9.
  43. Liu Y, et al. Gastric cancer adapts high lipid microenvironment via suppressing PPARG-FABP1 axis after arriving in the lymph node. Redox Biol. 2025;85:103759.
  44. Borús DL, et al. Fatty acid binding protein 1 (FABP1) depletion promotes an oxidative metabolic shift in Caco-2 colorectal cancer cells. Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 2025;1870(7):159661.
  45. Chu Y, et al. Glutathione peroxidase-1 overexpression reduces oxidative stress, and improves pathology and proteome remodeling in the kidneys of old mice. Aging Cell. 2020;19(6):e13154.
  46. Zhang F, et al. Mesenchymal stem cells alleviate rat diabetic nephropathy by suppressing CD103+ DCs-mediated CD8+ T cell responses. J Cell Mol Med. 2020;24(10):5817-31.
  47. Cao Q, et al. Renal F4/80+ CD11c+ mononuclear phagocytes display phenotypic and functional characteristics of macrophages in health and in adriamycin nephropathy. J Am Soc Nephrol. 2015;26(2):349-63.
  48. Zhou W, et al. The landscape of immune cell infiltration in the glomerulus of diabetic nephropathy: evidence based on bioinformatics. BMC Nephrol. 2022;23(1):303.
  49. Bloch K, Shichman E, Vorobeychik M, Bloch D, Vardi P. Catalase expression in pancreatic alpha cells of diabetic and non-diabetic mice. Histochem Cell Biol. 2007;127(2):227-32.
  50. Zhao Y, et al. Taxifolin attenuates diabetic nephropathy in streptozotocin-induced diabetic rats. Am J Transl Res. 2018;10(4):1205-10.
  51. Ding S, Wang W, Song X, Ma H. Based on network pharmacology and molecular docking to explore the underlying mechanism of Huangqi Gegen Decoction for treating diabetic nephropathy. Evid Based Complement Alternat Med. 2021;2021:9928282.
  52. Guo S, et al. Correction: Eriodictyol: a review of its pharmacological activities and molecular mechanisms related to ischemic stroke. Food Funct. 2023;14(10):4949.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Mitochondriële dysfunctiedifferentiële expressiemachine learning-modellenfunctionele verrijkingimmuuninfiltratiemoleculaire dockingribosoomfunctie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.