Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Het induceren van circadiane faseverschuivingen overdag met behulp van chemogenetische en spectrale benaderingen

301 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71594

⸱

12 juni 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Section on Light and Circadian Rhythms, National Institute of Mental Health (NIMH), National Institutes of Health (NIH)

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie introduceert chemogenetische en op violet licht gebaseerde strategieën om betrouwbare circadiane fasenverschuiving overdag mogelijk te maken.

Samenvatting

Bij zoogdieren wordt circadiane faseverschuiving overdag beperkt door verminderde fototische responsiviteit van de suprachiasmatische kern (SCN), waardoor het experimenteel manipuleren van de circadiane klok tijdens deze fase wordt beperkt. Betrouwbare methoden om dagfaseverschuivingen te induceren zijn daarom essentieel voor het onderzoeken van mechanismen van circadiane plasticiteit en fototische intrekking. Complementaire genetische en spectrale strategieën worden beschreven om robuuste, tijdelijk precieze manipulatie van de circadiane klok overdag mogelijk te maken. De eerste benadering, momenteel beperkt tot muizen, maakt gebruik van een chemogenetische strategie waarbij Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADDs) intravitreal toegediend worden om intrinsiek fotosensitieve retinale ganglioncellen (ipRGC's) selectief te activeren. Deze aanpak maakt gecontroleerde activatie van het retinohypothalamische pad mogelijk en induceert reproduceerbare dagfaseverschuivingen onafhankelijk van de omgevingslichtomstandigheden. De tweede benadering maakt gebruik van golflengte-specifieke optische stimulatie als een niet-invasief alternatief. Blootstelling aan violet licht maakt gebruik van de spectrale gevoeligheid van ipRGC's om depolarisatieblokkades te verminderen en langdurige activatie te bevorderen, waardoor betrouwbare fasereset tijdens de subjectieve dag mogelijk is. Deze methode is breed toepasbaar op zoogdiersystemen en vereist geen genetische manipulatie of farmacologische interventie. Gedetailleerde protocollen worden verstrekt voor experimentele voorbereiding, stimulatietiming, validatie van faseverschuivingen met behulp van locomotorische activiteit en beoordeling van neuronale activatie via c-Fos immunohistochemie. Belangrijke overwegingen, waaronder circadiane timing, stimulusparameters en experimentele controles, worden uiteengezet om reproduceerbaarheid te bevorderen. Samen bieden deze benaderingen veelzijdige en experimenteel hanteerbare hulpmiddelen om dag-circadiane faseverschuivingen te induceren en maken ze directe onderzoeken mogelijk van mechanismen achter de dagelijkse circadiane respons.

Inleiding

De suprachiasmatische kern (SCN), de hoofdklok van de zoogdierhersenen, coördineert essentiële dagelijkse ritmes in fysiologie en gedrag, waaronder slaap-waakcycli en voedingspatronen. Om de uitlijning met de externe omgeving te behouden, ontvangt het SCN directe fototische input van intrinsiek lichtgevoelige retinale ganglioncellen (ipRGC's), die netvlieslichtinformatie doorgeven om interne circadiane ritmes te synchroniseren met de zonnedag 1,2.

Een bepalend kenmerk van circadiane systemen tussen organismen is fase-afhankelijke responsiviteit: dezelfde stimulus die op verschillende circadiane tijden wordt toegediend, kan duidelijk verschillende effecten veroorzaken. Bij zoogdieren induceert nachtlicht betrouwbaar faseverschuivingen van de SCN-klok, terwijl blootstelling tijdens de subjectieve dag weinig tot geen resetvan 3,4 veroorzaakt. Deze schijnbare ongevoeligheid overdag is consequent waargenomen in zowel in vivo als in vitro preparaten, waar pogingen om fototische input na te bootsen geen significante faseverschuivingen veroorzaken 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 .

Overdag is ongevoeligheid deels toegeschreven aan onvoldoende retinale aandrijving om fase-resetmechanismen te activeren, naast circadiane poortmechanismen binnen het SCN. In overeenstemming met dit idee zijn ipRGC's niet uniform responsief onder fotopische omstandigheden; Een subset komt in het depolarisatieblok, waarbij het aanhoudende actiepotentieel beperktwordt tot 17,18,19. Deze fysiologische beperking kan de effectiviteit van conventionele fototische stimulatie overdag verminderen. Het overwinnen van deze beperking zou directe ondervraging van de plasticiteit van dagklokken mogelijk maken, een fase die traditioneel als refractair wordt beschouwd voor fototische reset.

Twee complementaire methodologieën worden beschreven om robuuste faseverschuiving van de circadiane klok tijdens de subjectieve dag mogelijk te maken. De eerste benadering maakt gebruik van een chemogenetische strategie waarbij ipRGC's selectief worden geactiveerd, onafhankelijk van de omgevingslichtomstandigheden. Specifiek krijgen Opn4Cre/+ muizen intravitreale injecties van een adeno-geassocieerd virus (AAV) dat codeert voor de exciterende Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs (DREADD), hM3Dq, op een Cre-afhankelijke manier. Toediening van clozapine-N-oxide (CNO) op circadiane tijd 4 (CT4) induceert een burst-achtige afvuring van ipRGC's, wat zorgt voor een aanhoudende activatie van het retinohypothalamische pad19. Faseverschuivingen worden gekwantificeerd met behulp van opnames van de locomotorische activiteit, en moleculaire activatie binnen het SCN wordt beoordeeld met behulp van c-Fos immunohistochemie.

De tweede benadering gebruikt golflengte-specifieke optische stimulatie als een niet-invasieve strategie voor bredere toepasbaarheid. Wildtypemuizen worden blootgesteld aan violet licht (385 nm) op circadiaanse tijd 6 (CT6), midden op de subjectieve dag. Violet licht produceert een verminderd depolarisatieblok en ondersteunt aanhoudende ipRGC-activatie in vergelijking met blauw of wit licht19. Faseverschuivingen worden gekwantificeerd zoals hierboven beschreven.

Beide benaderingen zijn erop gericht de ipRGC-gestuurde signalering naar het SCN te verbeteren, waardoor de verminderde fototische responsiviteit die kenmerkend is voor de subjectieve dag wordt overwonnen. Samen bieden deze methodologieën robuuste, experimenteel hanteerbare strategieën om de circadiane klok te manipuleren tijdens een fase die traditioneel resistent is tegen fototische reset.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door en uitgevoerd volgens de richtlijnen van het National Institute of Mental Health (NIMH) Animal Care and Use Committee (ASP-SLCR-01). Alle inspanningen werden geleverd om pijn te minimaliseren en het aantal gebruikte dieren te verminderen. De gebruikte onderzoeksinstrumenten staan vermeld in de Materiaalkundige Tabelle.

1. Chemogenetische strategie

  1. Intravitreale injectie van adeno-geassocieerd virus in Opn4Cre/+ muizen
    1. Maak de stereotaxische fase en alle chirurgische instrumenten schoon en steriliseer met behulp van passende sterilisatieprocedures. Zet het injectieapparaat in en bevestig een glazen capillairinjectienaald.
    2. Doof de muis met isoflurane. Stel de zuurstofstroom in op ongeveer 1,5 L/min. Stel isofluraan aan op 3%–5% voor inductie en verlaag tot 1–3% voor onderhoud gedurende de procedure.
    3. Controleer voldoende verdoving met een knijp in de teen. Beschouw het dier volledig onder narcose wanneer er geen onttrekkings- of schrikreflex wordt waargenomen.
    4. Plaats de muis op een verwarmingskussen om de lichaamstemperatuur gedurende de hele procedure te behouden.
    5. Trek glazen capillairnaalden uit. Naalden werden gemarkeerd op ~1,5 mm vanaf de punt met een fijne marker onder een stereomicroscoop om een consistente penetratiediepte te garanderen.
    6. Oefen voorzichtig druk uit op het onderste ooglid met een stompe pincet om het oogbol iets uit te steken en de dorsale limbus bloot te leggen. Met een dorsale benadering steek je de naald tangentieel in het oogoppervlak en dringt je 0,5–1 mm achter de limbus in de sclera en doe je de vascularisatie van de limbus uit.
    7. Steek de naald in de glasvochtkamer tot de vooraf bepaalde diepte. Trek iets terug om de intraoculaire druk te verlichten en te voorkomen dat de naaldpunt door weefsel wordt verstopt.
    8. Injecteer een totaalvolume van 1,5 μL AAV-oplossing (bij 2,4 x 1013 GC/ml), toegediend als vijf opeenvolgende injecties van elk 300 nL (met een snelheid van 50 nl/s). Pauzeer 5 seconden tussen de injecties om diffusie mogelijk te maken en reflux te minimaliseren. Na de laatste injectie wacht je 30 seconden voordat je de naald langzaam terugtrekt. Herhaal dezelfde procedure in het contralaterale oog met identieke parameters, waarbij je erop let dat trauma en reflux worden geminimaliseerd.
    9. Dien ketoprofen toe (10 mg/kg, subcutaan) direct na de operatie.
    10. Laat muizen minstens 2 weken herstellen om een adequate virale expressie te waarborgen voordat ze worden overgebracht naar de gedragsvoorziening.
  2. Wielrijdende activiteit en CNO-administratie (Figuur 1A)
    1. Huismuizen individueel in kooien met loopwielen. Registreer de wielenrij-activiteiten met behulp van een geautomatiseerd dataverzamelingssysteem.
    2. Geleide muizen in een licht-donkercyclus van 12:12 uur gedurende 4–7 dagen. Bevestig stabiele inleiding en laat de dieren dan overgaan naar constante duisternis (DD).
    3. Bepaal het begin van de activiteit met behulp van analysesoftware. Definieer het begin van activiteit als CT12 bij nachtelijke knaagdieren. Bereken CT4 dienovereenkomstig.
    4. Op dag 8 in DD krijgen muizen intraperitoneale injecties van CNO (1 mg/kg) of zoutoplossing bij CT4 onder zwak rood licht.
    5. Zet dieren terug in hun kooien en houd ze onder constante duisternis. Registreer de bewegingsactiviteit continu gedurende 8 dagen.
    6. Bepaal het begin van activiteit en voer regressieanalyse uit tijdens de pre- en postinjectieperiodes. Bereken faseverschuivingen als het verschil tussen het begin van de geprojecteerde en waargenomen activiteit.
  3. SCN c-Fos immunohistochemie na chemogenetische activatie
    1. Muizen in een licht-donker cyclus van 12:12 uur en loslaten in constante duisternis. Op de tweede dag in DD dient u CNO toe bij CT6. Perfuseerde dieren 30 minuten na injectie.
      Opmerking: CT4 werd gebruikt in gedragsexperimenten om de kans te minimaliseren dat CNO-effecten zich voortzetten in de subjectieve nacht, aangezien CNO enkele uren actief kan blijven. Daarentegen werd CT6 gebruikt voor immunokleuringsexperimenten om de acute effecten van CNO op de circadiane klok te beoordelen, waarbij dieren 30 minuten na injectie werden geperfuseerd.
    2. Dissectie de hersenen en fix het 's nachts met 4% paraformaldehyde bij 4 °C. Cryoprotect in 30% sucrose totdat het weefsel zinkt. Snijdt coronal op 40 μm.
    3. Incubeer secties in blokkerende oplossing, gevolgd door primaire antistofincubatie 's nachts bij 4 °C. Was en incubeer met secundaire antilichamen gedurende 1 uur. Tegenbeits met DAPI en montagesecties.
    4. Neem beelden met consistente microscoopinstellingen. Verwerk beelden met analysesoftware. Identificeer AAV-geïnfecteerde gebieden met mCherry-positieve cellen.

2. Spectrale strategie

  1. Breng wildtype-muizen over naar de gedragsvoorziening en houd ze individueel in kooien met loopwielen, zoals hierboven beschreven. Houd dieren onder constante duisternis (DD) om de vrij lopende circadiane activiteit te monitoren.
  2. Op dag 8 in DD, op circadiane tijd 6 (CT6), haal je de kooi uit de lichtdichte kast en stel je de muis bloot aan een lichtpuls van 15 minuten.
  3. Blootstel muizen aan ofwel een blauwlichtpuls (λmax = 470 nm; 1,8 × 1014–2,2 × 1014 fotonen/cm2/s) of een violette lichtpuls (λmax = 385 nm; 1,45 × 1014–3,3 × 1014 fotonen/cm2/s), met intensiteit gemeten in het midden en alle vier de hoeken van de kooi op ooghoogte van het dier.
  4. Voor beide golflengtecondities houd je muizen in hun eigen kooien met de bovenkant van de kooi verwijderd. Plaats kooien direct onder een vaste lichtbron zodat het midden van de lichtbundel uitgelijnd is met het midden van de kooi om een uniforme verlichting te garanderen.
  5. Zet kooien onmiddellijk terug naar hun oorspronkelijke positie onder constante duisternis na lichtblootstelling. Blijf de wielloopactiviteiten ononderbroken registreren voor faseverschuivingsanalyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Opn4Cre/+ muizen die AAV-DREADD uitdrukten en zoutoplossing kregen bij CT4 vertoonden geen significante faseverschuiving in wielrijdende activiteit (n = 5; Figuur 1B). Daarentegen veroorzaakte de toediening van CNO bij CT4 een significante fasevertraging in het begin van activiteit (gemiddelde ± SEM: 5,03 ± 0,48 uur; n = 5; Figuur 1C, D), wat aantoont dat DREADD-activatie tijdens deze circadiane tijd ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De resultaten tonen aan dat activatie van ipRGC's tijdens de subjectieve dag circadiane faseverschuivingen bij muizen kan induceren, een tijd die typisch wordt gekenmerkt door verminderde gevoeligheid voor fototische stimulatie. Een chemogenetische benadering maakte selectieve activatie van ipRGC's mogelijk onafhankelijk van extern licht en veroorzaakte robuuste fasevertragingen in het wielgedrag. Deze activatie induceerde ook acute c-Fos-expressie in het SCN, waarmee de activering van d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de leden van de SLCR bij NIMH en het Johns Hopkins Biology Mouse Tri-Lab voor nuttige discussies. Financieringsbronnen: National Institute of Mental Health Grant  ZIAMH002964 (S.H.)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AAV2-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherryAddgene44361Cre-afhankelijke virale vector die codeert voor excitatoire DREADD (hM3Dq) gefuseerd met mCherry voor selectieve ipRGC-activatie
Anti-c-Fos antilichaam (konijn monoklonaal)Cell Signaling Technology2250SPrimair antilichaam gebruikt om c-Fos te detecteren als marker voor neuronale activatie
Anti-tdTomato antilichaam (geit)LSBioLS-C340696Primair antilichaam gebruikt om de expressie van mCherry/tdTomato reporter aan te tonen
Blue LED driverThorlabsLEDD1BVoeding voor het regelen van de intensiteit en output van blauwe LED
Blue LED lichtbronThorlabsM470L5LED-bron die blauw licht uitzendt (λmax ≈ 470 nm) voor fotische stimulatie
ClockLab softwareActimetricsVersie 6.0.53Software voor het verzamelen en analyseren van data over circadiane locomotorische activiteit
Clozapine-N-oxide (CNO)Sigma-AldrichC0832-5MGLigand gebruikt om hM3Dq DREADD-receptoren in vivo te activeren
DAPIInvitrogen62248Fluorescente nucleaire kleuring voor het labelen van celkernen
Donkey anti-goat Alexa Fluor 555InvitrogenA21432Fluorescente secundair antilichaam voor detectie van geiten primaire antilichamen
Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488InvitrogenA21206Fluorescente secundair antilichaam voor detectie van konijn primaire antilichamen
Fluoromount-GInvitrogen00-4958-02Montagemedium gebruikt om fluorescentie in weefselsecties te behouden
ImageJ (Fiji) softwareNIHVersie 2.16.0/1.54gOpen-source software voor beeldverwerking en kwantitatieve analyse
Opn4cre MuizenThe Jackson LaboratryRRID:IMSR_JAX:035925Muizen gebruikt voor chemogenetische activatie
Violet LED driverMightexSLA-1000-2Voeding voor het regelen van violette LED-uitvoer
Violet LED lichtbronMightexBLS-LCS-0385-04-22LED-bron die violet licht uitzendt (λmax ≈ 385 nm) voor golflengte-specifieke stimulatie
Wild-type muizenThe Jackson LaboratryJackson stam #101043Muizen gebruikt voor violet licht experiment

Referenties

  1. Hattar S, Liao HW, Takao M, Berson DM, Yau KW. Melanopsin-containing retinal ganglion cells: architecture, projections, and intrinsic photosensitivity. Science. 2002;295(5557):1065–70.
  2. Jones JR, Simon T, Lones L, Herzog ED. SCN VIP neurons are essential for normal light-mediated resetting of the circadian system. J Neurosci. 2018;38(37):7986–95.
  3. Coursey PJ. Daily light sensitivity rhythm in a rodent. Science. 1960;131:33–35.
  4. Kornhauser JM, Ginty DD, Greenberg ME, Mayo KE, Takahashi JS. Light entrainment and activation of signal transduction pathways in the SCN. Prog Brain Res. 1996;111:133–46.
  5. Ding JM, Weber ET, Faiman LE, Rea MA, Gillette MU. Resetting the biological clock: mediation of nocturnal circadian shifts by glutamate and NO. Science. 1994;266(5191):1713.
  6. Mintz EM, Gillespie CF, Price KM, Albers HE. Activation of NMDA receptors in the suprachiasmatic nucleus produces light-like phase shifts of the circadian clock in vivo. J Neurosci. 1999;19(12):5124–30.
  7. Shirakawa T, Moore RY. Glutamate shifts the phase of the circadian neuronal firing rhythm in the rat suprachiasmatic nucleus in vitro. Neurosci Lett. 1994;178(1):47–50.
  8. Shibata S, Watanabe A, Hamada T, Ono M, Watanabe S. N-methyl-D-aspartate induces phase shifts in circadian rhythm of neuronal activity of rat SCN in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1994;267(2):R360–R364.
  9. Asai M, Yamaguchi S, Isejima H, Jonouchi M, Moriya T, et al. Visualization of mPer1 transcription in vitro: NMDA induces a rapid phase shift of mPer1 gene in cultured SCN. Curr Biol. 2001;11(19):1524–27.
  10. Sladek M, Sumova A. Modulation of NMDA-mediated clock resetting in the suprachiasmatic nuclei of mPer2 (Luc) mouse by endocannabinoids. Front Physiol. 2019;10:361.
  11. Shibata S, Moore RY. Neuropeptide Y and optic chiasm stimulation affect suprachiasmatic nucleus circadian function in vitro. Brain Res. 1993;615(1):95–100.
  12. Jones JR, Tackenberg MC, McMahon DG. Manipulating circadian clock neuron firing rate resets molecular circadian rhythms and behavior. Nat Neurosci. 2015;18(3):373–75.
  13. Kim S, McMahon DG. Light sets the brain’s daily clock by regional quickening and slowing of the molecular clockworks at dawn and dusk. Elife. 2021;10:e70137.
  14. de Vries MJ, Treep JA, de Pauw ES, Meijer JH. The effects of electrical stimulation of the optic nerves and anterior optic chiasm on the circadian activity rhythm of the Syrian hamster: involvement of excitatory amino acids. Brain Res. 1994;642(1-2):206–12.
  15. Rusak B, Groos G. Suprachiasmatic stimulation phase shifts rodent circadian rhythms. Science. 1982;215(4538):1407–09.
  16. Duy PQ, Komal R, Richardson ME, Hahm KS, Fernandez DC, et al. Light has diverse spatiotemporal molecular changes in the mouse suprachiasmatic nucleus. J Biol Rhythms. 2020;35(6):576–87.
  17. Liu A, Milner ES, Peng YR, Blume HA, Brown MC, et al. Encoding of environmental illumination by primate melanopsin neurons. Science. 2023;379(6630):376–81.
  18. Milner ES, Do MTH. A population representation of absolute light intensity in the mammalian retina. Cell. 2017;171(4):865–876.e16.
  19. Komal R, Beier C, Nath A, et al. ipRGC properties prevent light from shifting the SCN clock during daytime. Nature. 2026;650(8103):942–50. .
  20. Jewett ME, Rimmer DW, Duffy JF, Klerman EB, Kronauer RE, et al. Human circadian pacemaker is sensitive to light throughout subjective day without evidence of transients. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 1997;273(5):R1800–R1809.
  21. Revell VL, Molina TA, Eastman CI. Human phase response curve to intermittent blue light using a commercially available device. J Physiol. 2012;590(19):4859–68.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Chemogenetische activatiespectrale stimulatieretinohypothalamische routeintrinsiek lichtgevoelige retinale ganglioncelDREADD-activatiestimulatie met violet lichtc-Fos immunohistochemielocomotore activiteitcircadiane plasticiteit
Het induceren van circadiane faseverschuivingen overdag met behulp van chemogenetische en spectrale benaderingen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.