Trans-mitochondriale cybride generatie uit mtDNA-patiëntplaatjes: een efficiënt protocol dat kolonieselectie en functionele validatie optimaliseert

Samenvatting

We beschrijven een geoptimaliseerd trans-mitochondriaal cybrid-generatieprotocol uit mtDNA-patiëntplaatjes, met nadruk op groeiparameters en kolonie-isolatie. Deze benadering maakt het mogelijk om mitochondriale DNA-varianten te bestuderen bij variabele heteroplasmatische niveaus in een gemeenschappelijke nucleaire achtergrond om hun functionele betekenis voor elektronentransportketen, enzymatische activiteiten en geïntegreerde ademhalingscapaciteit te kwantificeren.

Samenvatting

Trans-mitochondriale cybridecellijnen vormen de gouden standaard methode om pathogeniciteit te bepalen door biochemische analyses mogelijk te maken van een specifieke mitochondriaal DNA (mtDNA) variant van belang bij hoge en lage percentages (heteroplasmatieniveaus) binnen een verder identieke mtDNA- en nucleaire genoomachtergrond. Historisch gezien was het proces van het genereren van cybrides tijdrovend en slecht efficiënt. Hier beschrijven we een zeer efficiënt en effectief protocol voor het genereren van trans-mitochondriale cybridcellijnen door menselijke bloedplaatjes te fuseren met een standaard osteosarcoom 143B-cellijn om een isogene nucleaire achtergrond te leveren zonder mtDNA (Rho 0-cellen). Celisolaten vangen een bepaald mtDNA-genoom van belang om stabiele cellijnen te vestigen met verschillende graden van heteroplasmatie, of om uiteenlopende effecten van verschillende mitochondriale haplogroepen te vergelijken. Omdat cybriden van mitochondriale patiënten moeilijker te identificeren kunnen zijn met standaardprotocollen, richt deze huidige methodologie zich op het isoleren van mtDNA-varianten waarbij de activiteit van de elektronentransportketen wordt beïnvloed. We tonen hier aan dat kolonieselectietechnieken de tijd verkorten en de opbrengst van het genereren van hoog-niveau heteroplasmatische mtDNA-mutante cybridlijnen verbeteren. Er wordt een casestudy gegeven van cybridegeneratie voor een variant van onbekende significantie in MT-ND1, m.3985G>A (p.E227K). We analyseren de efficiëntie van het cybridegeneratieproces met dit protocol en voeren functionele studies uit die worden uitgevoerd met hoogresolutie respirometrie. Hoog-niveau heteroplasmatie MT-ND1 m.3985G>A cybridmutanten die door dit protocol worden gegenereerd, hebben aangetoond een verminderde complexe I-afhankelijke mitochondriale ademhaling te hebben ten opzichte van wildtypecontrole, wat aantoont dat m.3985G>A waarschijnlijk pathogeen is.

Inleiding

Het vaststellen van pathogeniciteit van mitochondriaal DNA (mtDNA) mutaties is uitdagend vanwege hun zeldzaamheid, heteroplasmatie met wisselende niveaus van gemuteerde en wildtype mtDNA-genomen in verschillende weefsels, diverse pathofysiologische mechanismen en complexe interacties met nucleaire genoomachtergronden 1,2,3,4 . Om deze redenen blijven trans-mitochondriale cybridcellijnen de gouden standaard methode om pathogeniciteit van mtDNA-varianten vast te stellen, waarbij "cybriden" de fusie van de kern van de ene cel met de mitochondriën van een andere cel vertegenwoordigen 5,6,7,8,9,10 (Figuur 1). Cybridcellijnen bevatten een isogene nucleaire achtergrond en mitochondriën met een gespecificeerd percentage heteroplasmatie voor de mtDNA-variant onder studie^11,12. Op deze manier kunnen functionele assays zoals respirometrie (via polarografie) of elektronentransportenzymactiviteit (door spectrofotometrie) worden uitgevoerd in cybridlijnen tussen 0% en 100% heteroplasmatieniveaus om de potentiële pathogene effecten van een bepaalde mtDNA-variant te bepalen, evenals de relatieve invloed van mitochondriale haplogroepen die kunnen verschillen tussen cybridlijnen¹. Andere celtypen kunnen worden gebruikt om pathogeniciteit te bestuderen en zijn het beste geschikt om cybridegeneratie en functionele analyse aan te vullen, aangezien elk celtype zijn eigen voor- en nadelen heeft. Fibroblasten van patiënten ontstaan direct van de patiënt, maar zijn beperkt in de erfelijke heteroplasmatie en missen een isogene nucleaire controle om nucleaire geneffecten te elimineren. mtDNA-bewerking wordt steeds populairder, maar heeft last van off-target bewerking en beperkte bewerkbare sites in mtDNA¹³. Geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) kunnen worden gedifferentieerd om het effect van een mutatie op verschillende celtypen, zoals neuronen en retinale ganglioncellen, te bestuderen, maar inductie van pluripotentie kan leiden tot verlies van de mtDNA-variant van belang of resulteren in extra de novo varianten¹⁴. De Cybrid-studie omvat de creatie van een kunstmatiger systeem dat gebaseerd is op een nucleaire achtergrond van een kankercellijn (klassiek 143B osteosarcoom), maar klassiek goed groeit, waardoor het geschikt is voor gebruik in high-throughput screeningsstudies van kandidaat-interventies. Beperkingen van cybridgeneratie op hoog heteroplasmatisch niveau omvatten bloedplaatjeskwaliteit, beginnende heteroplasmatie en de selectieve nadelen van de mutante mitochondriën, die uitvoerig worden besproken in dit protocol.

Hoewel cybridgeneratie de gouden standaard is voor functionele bepaling van mtDNA-variantpathogeniciteit, genereren weinig laboratoria cybriden voor de studie van mitochondriale ziekten 9,10,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25^{, 26,27}. In plaats daarvan worden er meer cybriden gegenereerd om kanker en leeftijd^{van 28,29} jaar te bestuderen. Hier gebruiken we een vermoedelijke mitochondriale ziekte-casestudy om optimalisatiestrategieën te demonstreren die zijn ontwikkeld om de generatie van cybride uit mtDNA-patiëntplaatjes te vergemakkelijken, inclusief selectieprocessen en celpreparaten die nodig zijn om cybridcellijnen met hoge versus lage heteroplasmatieniveaus voor de doel-mtDNA-variant vast te stellen. Specifiek demonstreren we de methodologie om cybridecellijnen te genereren voor een complex I (CI) subunit MT-ND1 variant m.3985G>A, waarbij we biochemische studies uitvoeren die de pathogene aard van deze variant aantonen. Figuur 2 toont de tijdlijn voor cybridgeneratie, waarbij belangrijke methodologische stappen fusie-, selectie- en isolatiemethoden omvatten om verschillende kolonies te vormen.

Protocol

Bloedplaatjes werden afgenomen volgens de IRB-studie 08-6177 van het Children's Hospital of Philadelphia (CHOP).

1. Bereiding van bloedplaatjes

1. Dag 1: Bloed nemen in zuur-citrat-dextrose buisjes bij afname.
   OPMERKING: Bloed moet onmiddellijk op de rotator worden geplaatst. Bloedplaatjes worden idealiter maximaal 4 uur na bloedafname geoogst.
2. Noteer de hoeveelheid bloed. Een hoeveelheid van 5–6 ml bloed wordt aanbevolen.
3. Centrifugeer bloed op 200 × g gedurende 20 minuten bij 12 °C.
   OPMERKING: Centrifugatie bij 12 °C behoudt de integriteit van het monster en voorkomt activatie van bloedplaatjes.
4. Breng het supernatant (plasma) over naar een nieuwe centrifugebuis.
5. Noteer het volume van het plasma.
6. Centrifugeer het plasma op 1500 × g gedurende 20 minuten bij 12 °C.
7. Noteer het geschatte volume van de bloedplaatjepellets.
   OPMERKING: Te veel bloedplaatjes kunnen omslachtig zijn in dit protocol. Na fusie kan bij het plateren van de Rho 0-cellen en bloedplaatjes een overschot aan de onderkant van de kolf blijven plakken en zo de hechting van Rho^0-cellen voorkomen. Het wordt aanbevolen minder dan 50 μL van het pelletvolume van de bloedplaatjes te gebruiken voor de fusie. De overtollige bloedplaatjes kunnen worden ingevroren door de bloedplaatjes in de volgende stappen te splitsen.
8. Verwijder het supernatant.
   OPMERKING: Als de pellet groot is, kan het verwijderen van de pellet worden uitgevoerd door aspiratie. Het aantal bloedplaatjes van patiënten is soms drastisch verminderd en niet erg plakkerig. Als dit het geval is, gebruik dan een pipet om het plasma langzaam te verwijderen.
9. Als je doorgaat met verse bloedplaatjes, suspendeer de pellet dan opnieuw in 1 mL Spinner-modificatie van Minimum essential Eagle's medium (SMEM) en breng het over in een microcentrifugebuis.
10. Bij het invriezen wordt de pellet (bloedplaatjes) opnieuw opgehangen in 1,05 mL SMEM en 450 μL bloedplaatjesvriesoplossing (350 μL foetaal rundserum [FBS] + 100 μL dimethylsulfoxide [DMSO]).
    OPMERKING: Sommige bloedplaatjes van patiënten zijn niet stabiel tijdens de vriesprocedure, en een hoge mutant cybrid kan na het invriezen niet worden verkregen. Het wordt aanbevolen om verse bereiding te gebruiken.
11. Als de Rho^0-cellen niet op tijd klaar zijn, plaats je de bloedplaatjes op 37 °C met lichte trillingen bij 60 rpm.
    OPMERKING: Uiteindelijk is het het beste om de bloedplaatjes en Rho^0-cellen zo te timen dat ze tegelijkertijd klaar zijn. Het wordt niet aanbevolen langer dan 2 uur te wachten.

2. Bereiding van Rho 0-cellen

1. Gebruik ofwel vers ontdooide 143B osteosarcoom Rho^0-cellen of Rho^0-cellen die bijna samengroeiden.
   OPMERKING: Het wordt aanbevolen om Rho^0-cellen te gebruiken die in de broedmachine groeiden tot bijna samenvloeiing. Vers ontdooide Rho^0-cellen kunnen worden gebruikt, en het wordt aanbevolen een bevroren buisje met Rho^0-cellen met een hoge celdichtheid te gebruiken. Laat de cellen twee uur of langer hechten voordat ze fuseren.
2. Was de T75-fles met 5 ml PBS.
3. Voeg 1 ml Trypsine-EDTA 0,25% toe om de Rho 0-cellen te bedekken.
4. Incubeer 5 minuten op 37 °C.
5. Na het wiebelen van de kolf was je de bodem van de fles met 5 mL SMEM.
6. Verzamel Rho^0-cellen in een 15 mL conische buis.
7. Centrifugeer op 200 × g gedurende 5 minuten om te concentreren voor celtellingmeting.
8. Verwijder het supernatant en suspensie opnieuw in 1 ml SMEM.
9. Tel de cellen.
   OPMERKING: Idealiter zouden er 1,5 miljoen cellen per fusie moeten zijn; echter, succesvolle fusies zijn uitgevoerd met slechts 30.000 cellen.
10. Aliquot 1,5 miljoen cellen in 1,5 microcentrifugebuizen en het volume verhogen tot 1 mL.
    OPMERKING: Zorg dat je een extra "mock fusion" buis hebt. Deze buis bevat alleen Rho^0-cellen en wordt gebruikt om het selectieproces te begeleiden.
11. Centrifugeer de bloedplaatjes op 1700 × g gedurende 15 minuten op kamertemperatuur.
    OPMERKING: Rho^0-cellen zijn gevoelig voor koude temperaturen.
12. Verwijder het supernatant uit de bloedplaatjes.
13. Voeg 1 ml Rho 0-cellen toe bovenop de bloedplaatjepellet.
14. Centrifugeer de Rho^0-cellen en de bloedplaatjes op 200 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.

3. Fusie

1. Verwijder het supernatant uit de Rho^0-cellen en de bloedplaatjepellet.
2. Voeg 150 μL fusiebuffer toe (50% polyethyleenglycol [PEG]/10% DMSO) en tritureer 90 seconden om opnieuw te suspensieren.
   OPMERKING: Sommige pellets zijn vrij plakkerig en moeten handmatig worden geroerd en gebroken, naast het op en neer gepipetterd. Noteer of de pellet plakkerig was.
3. Voeg 12 mL Cybrid-media (DMEM) + 10% FBS + 50 μg/mL uridine toe aan een T75-kolf.
4. Voeg de 1 ml gefuseerde bloedplaatjes en Rho^0-cellen toe aan de kolf.
5. De cellen worden geïncubeerd bij 37 °C met 5%_CO2 bij hoge luchtvochtigheid.
   OPMERKING: Alle celgroeistappen vinden plaats onder deze omstandigheden.

4. Groei

1. Dag 2: Verwijder Cybrid media en voeg verse 12 mL Cybrid media toe + 10% FBS + 50 μg/mL uridine.
   OPMERKING: Rho^0-cellen doen er ongeveer een week over om het mtDNA op te nemen.
2. Dag 5: Verwijder Cybrid media en voeg verse 12 mL Cybrid media toe + 10% FBS + 50 μg/mL uridine.
   OPMERKING: Als de Rho^0-cellen op 80% confluence staan, splits je de cellen in twee kolven.

5. Selectie

1. Dag 8: Verwijder het medium en spoel de cellen met 5 mL PBS.
2. Verwijder PBS en voeg 1 ml trypsine toe.
3. Bedek de bodem van de kolf met trypsine en incubeer 5 minuten op 37 °C.
4. Voeg 5 mL Cybrid-media toe + 10% FBS + 50 μg/mL uridine.
5. Tel de cellen.
   OPMERKING: De selectie moet beginnen bij 10% confluentie, wat neerkomt op 125.000 cellen in een T75- of met weefselkweek behandelde petrischaal. Het wordt aanbevolen petrischaaltjes te gebruiken als de kolonie-plukmethode de voorkeur heeft. Gebruik een T75 als je de verdunningsmethode gebruikt.
6. Voeg 125.000 cellen toe aan de juiste container en voeg de rest van het volume toe tot 12 mL met Selection Media (DMEM).
   OPMERKING: Het selectiemedium is ontworpen om gefuseerde 143B-cellen met mitochondriën te scheiden van de Rho 0-cellen. Rho^0-cellen hebben pyruvaat en uridine nodig om te overleven. Gedialyseerde FBS bevat geen pyruvaat en uridine en mag alleen worden gebruikt voor selectie. Gebruik indien mogelijk twee verschillende selectiemedia. De ene moet 10% gedialyseerd FBS zijn, en de andere moet minder beperkend zijn in groei, zoals 20% gedialyseerde FBS + 50 μg/mL uridine. Een minder restrictief selectiemedium wordt parallel voorgesteld voor ernstige mutanten.
7. Bevries de resterende cellen in twee cryovialen, elk met 1 ml vriesoplossing.
   OPMERKING: Dit zijn preselectiecellen, en verschillende selecties kunnen later worden geprobeerd.
8. Vervang de media om de dag gedurende ongeveer een week.
   OPMERKING: De Rho^0-cellen zullen drijven als ze sterven en worden weggespoeld na het wisselen van het medium. Gebruik de "mock" fusiecellen om te bepalen wanneer de selectie voltooid is (geen cellen meer in de kolf). Deze fles zal volledig leeg zijn omdat alle Rho^0-cellen zijn weggespoeld. Het is een goed idee om nog een dag te wachten, zelfs als de nepkolf leeg is, omdat gefuseerde cellen de voedingsstoffen in het medium kunnen leveren om andere Rho 0-cellen in de fles te laten voortbestaan. Als de cellen tot meer dan 20% samenvloeiing groeien, splitsen en opnieuw platen. Meer groei zal de selectie maskeren.

6. Methode voor kolonieselectie

1. Laat de kolonies groeien totdat ze met het oog zichtbaar zijn met Cybrid media + 20% FBS + 50 μg/mL uridine.
   OPMERKING: Kantel de schaal en houd hem omhoog tegen het licht. De kolonies verschijnen als bewolkte cirkels. Onder de microscoop zouden er niet veel achtergrondcellen tussen de kolonies moeten zijn.
2. Cirkel onafhankelijke, niet-overlappende kolonies met een marker onderin de fles terwijl je ze tegen het licht houdt.
3. Gebruik een P20 om zowel (mechanisch verstoorde cellen die aan de onderkant van de kolf zijn bevestigd) als om tegelijkertijd 20 μL binnen de getekende cirkel te aspireren om cellen van de geselecteerde kolonie in de punt van de P20 te plaatsen.
   OPMERKING: Door handmatig te schrapen worden de cellen losgemaakt en het omhoog trekken van 20 μL verzamelt de cellen in de pipettip.
4. Plaats elke kolonie in een eigen put in een plaat met 96 putten.
   OPMERKING: Het voordeel van deze methode is dat 143B-cellen goed samen groeien, dus je zou geen probleem moeten hebben met groeien en je snellere resultaten behaalt. Het nadeel is dat men een gemengde bevolking kan hebben.

7. Verdunningsgroeimethode

1. Wanneer de cellen 75% samenvloeiing in Cybrid-media + 20% FBS + 50 μg/mL uridine bereiken, spoel je de cellen met 5 mL PBS.
2. Verwijder PBS en voeg 1 ml trypsine toe.
3. Bedek de bodem van de kolf met trypsine en incubeer 5 minuten op 37 °C.
4. Voeg 5 mL Cybrid-media toe + 20% FBS + 50 μg/mL uridine.
5. Tel de cellen.
6. Voeg 1 × 10⁵ cellen toe aan 20 mL Cybrid-media + 20% FBS + 50 μg/mL uridine aan 50 mL conische buis 1.
   OPMERKING: Dit is 5000 cellen/mL, wat 500 cellen in 100 μL is wanneer het wordt geplateerd in een 96-well-plaat.
7. Bereid een 50 mL conische buis voor met een 100-voudige verdunning (200 μL uit buis 1 in 20 mL Cybrid-medium + 20% FBS + 50 μg/mL uridine).
   OPMERKING: Dit zijn ongeveer 5 cellen per put.
8. Bereid een 50 mL conisch buisje 3 voor met een verdunning van 1:1 (10 mL uit buis 2 in 10 mL Cybrid-medium + 20% FBS + 50 μg/mL uridine).
   OPMERKING: Dit is ongeveer 2,5 cellen per put.
9. Bereid een 50 mL conisch buisje 4 voor met een verdunning van 1:1 (10 mL buis 3 in 10 mL Cybrid-medium + 20% FBS + 50 μg/mL uridine).
   OPMERKING: Dit is ongeveer 1 cel per put.
10. Plaatbuizen 2, 3 en 4 in 96-put platen met elk 100 μL.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat je de cellen mengt voordat je ze opdient. Het is moeilijk om op de dag zelf te controleren of er één cel in elke put zit, omdat de cellen naar de bodem moeten zakken en zich hechten. Het voordeel van deze methode is dat een enkele cel uitgroeit tot een kolonie, waardoor een gemengde achtergrond ontbreekt. Het nadeel is dat ernstige mutanten mogelijk niet overleven als ze geïsoleerd zijn.
11. De volgende dag streep je putten door die duidelijk meer dan één cel per put hebben.
12. Controleer na een paar dagen opnieuw de putten.
    OPMERKING: Er zouden kolonies moeten zijn, en het is duidelijker als er enkele cellen dicht bij de randen van de putten zijn. Als er meer dan één kolonie is, verwijder dan die putten. Als er geen cel is, verwijder dan de put.

8. Groei

1. Begin in de 96-put plaat en zet cellen stapsgewijs over naar grotere platen indien nodig.
   OPMERKING: Deze cellen groeien het beste met een hoge celdichtheid, en het niet overbrengen van genoeg cellen kan de dood veroorzaken. Houd altijd de vorige plaat met wat cellen erin en markeer welke put waar vandaan komt, zodat je altijd terug kunt als dat nodig is. Belangrijk is dat 143B-cellen sterven en loskomen als ze overconfluent zijn, dus controleer deze cellen elke dag.

9. Genetische bevestiging

1. Centrifugeer de gealiquoteerde cellen op 450 ×g gedurende 5 minuten.
2. Verwijder media.
3. Voeg 5 μL DNA Extractiebuffer toe (50 mM NaOH).
   OPMERKING: Dit aantal kan veranderen als er veel cellen zijn. Significante celpellets kunnen in 10 μL buffer zitten.
4. Breng 30 minuten uit bij 95 °C.
5. Voeg een gelijkwaardig volume DNA-stabilisatiebuffer (0,1 M Tris-HCl; pH 8) toe aan de extractiebuffer.
6. Voer polymerasekettingreactie (PCR) uit volgens de richtlijnen van het enzym.
   OPMERKING: Sommige puntmutanten kunnen restrictie-enzymen gebruiken om controle- en patiëntcellen te onderscheiden. Andere puntmutaties kunnen niet worden onderscheiden en vereisen sequencatie. In dit geval is het belangrijk om PCR-mixen zonder kleurstoffen te gebruiken voor hoogwaardige resultaten. Sanger-sequencing en next-generation sequencing kunnen worden gebruikt. 2,5 μL DNA is voldoende voor een reactie van 25 μL.
7. Gebruik PCR-amplicons die specifiek zijn voor deze mutatie voor Sanger-sequencing.
   OPMERKING: De PCR-amplicons werden opgestuurd voor Sanger's sequencing. Het niveau van mutatieheteroplasmatie werd bevestigd zowel na kloonexpansie als na functionele analyse.

10. Hoogresolutie respirometrie met behulp van hoogresolutie respirometrie

1. Voer luchtkalibratie uit volgens de richtlijnen van de respirometer (bijv. Oroboros Instruments).
2. Was cybrids in een T75-fles met PBS.
   OPMERKING: De cellen mogen niet overconfluent zijn; 70%–80% confluent is ideaal.
3. Voeg 1 ml trypsine toe en laat het 4 minuten incuberen.
4. Voeg 5 mL Cybrid media toe en tel cellen.
5. Voeg 500.000 cellen toe aan een buis om te centrifugeren op 450 × g gedurende 5 minuten.
   OPMERKING: Het celnummer en het volume van de respirometer zijn bij de 0,5 mL kamer.
6. Was cellen opnieuw met een resuspendering met PBS en centrifugeer opnieuw.
7. Suspendeer cellen opnieuw in 510 μL MiR05-buffer en voeg toe aan een lege kamer.
8. Voeg na stabilisatie 0,65 μL digitonine (50 mg/mL), 0,8 μL malaat (2,5 M) en 2 μL pyruvaat (2,5 M) toe.
   OPMERKING: Voor de toevoeging van digitonine wordt hier de basale ademhaling gemeten. Elke volgende stap moet na stabilisatie worden uitgevoerd.
9. Voeg 12 μL adenosinedifosfaat (ADP) toe (0,25 M).
10. Voeg 4 μL glutamaat (2,5 M) toe.
11. Voeg 12 μL succinaat (1,25 M) toe.
12. Voeg 1 μL oligomycine toe (1 mg/mL).
13. Voeg 1 μL carbonylcyanide-p-trifluoromethoxyfenylhydrazon [FCCP] toe (0,2 mM).
    OPMERKING: Titreren met meerdere toevoegingen totdat er geen verdere toename wordt waargenomen (meestal 3–5).
14. Voeg 1 μL rotenon (2 mM) toe.
15. Voeg 1 μL antimycine A (1 mg/mL) toe.
16. Voeg 0,5 μL ascorbaat (0,8 M) en 0,5 μL tetramethylfenyleendiamine [TMPD] (0,2 M) toe.
17. Open de kamer met een afstandhouder voor 20 minuten.
18. Sluit de kamer en stabiliseer 5 minuten.
19. Voeg 22,5 μL azide (4 M) toe.
20. Verzamel cellen voor eiwitkwantificatie met een bicinchonininezuur (BCA) assaykit.
21. Voer berekeningen uit na stabilisatie van het zuurstofverbruik en normaliseer per eiwit. Basale Ademhaling is het gestabiliseerde zuurstofverbruik na het toevoegen van cellen aan de kamer.
    OPMERKING: Alle andere metingen worden genomen na het vermelde substraat of de inhibitor.
22. Bereken OXPHOS_BI: (Glutamaat-Antimycine A)/(FCCP-Antimycine A).
23. Bereken OXPHOS_CI+CII: (Succinaat-Antimycine A)/(FCCP-Antimycine A).
24. Bereken ETS_CI+CII: (FCCP-Antimycine A).
25. Bereken ETS_CII: (Rotenon-Antimycine A)/(FCCP-Antimycine A).
26. Bereken LEAK_CI+CII: (Oligomycine-Antimycine A)/(FCCP-Antimycine A).
27. Bereken OXPHOS_CIV: (TMPD/ASC-Azide)/(FCCP-Antimycine A).
28. Gebruik minstens 4–6 biologische replicaten voor respirometriemetingen.

Resultaten

Om methodologische verschillen en het pad naar protocoloptimalisatie aan te tonen, presenteren we de resultaten van cybridegeneratie van een patiënt met vermoedelijke mitochondriale ziekte die een variant van onbekende significantie (VUS) in MT-ND1 van complex I (CI) in de elektronentransportketen bezit. Na klinische mtDNA-genoomsequencing van next-generation in meerdere weefsels in twee verschillende CLIA-goedgekeurde klinische diagnostische laboratoria, was de enige variant di...

Discussie

Hier presenteren we een zeer efficiënt protocol voor de generatie van trans-mitochondriale cybridcellijnen uit mtDNA-patiëntplaatjes. We tonen de toepasbaarheid aan met een casestudy van een MT-ND1-variant van onzekere significantie, het belang van zorgvuldig overwegen van groei- en selectieparameters. Zodra deze grote problemen zijn geoptimaliseerd, wordt de succesvolle selectie van cybriden met mtDNA-varianten die de ademhalingsketenfunctie kunnen aantasten, succesvol geselect...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ADP	Sigma Aldrich	A5285-1G
Antimycin A	Sigma Aldrich	A8674-25MG
Ascorbaat	Sigma Aldrich	11140-250G
Azid	Sigma Aldrich	S2002-100G
Gedialyseerd FBS	Fisher Scientific	35071CV
Digitonine	Sigma Aldrich	D141-100MG
DMEM	Corning	10-013-CV	Cybrid media
DMEM	Corning	10-017-CM	Selectie media
FBS	Cytiva	SH30910.03
FCCP	Apex Bio	B5004
Glutamaat	Sigma Aldrich	G5889-100G
Graphpad Prism	Graphpad
Hybri-Max	Sigma Aldrich	P7306	fusie buffer
Malaat	Sigma Aldrich	M1000-100G
MiR05 buffer	Oroboros Instruments	60101-01
O2K respirometer	Oroboros Instruments	C-0050
Oligomycine	Sigma Aldrich	O4876-5MG
Pyrovaleaat	Sigma Aldrich	P2256-100G
Rotenon	Sigma Aldrich	R8875-1G
SMEM	Sigma	M8167
Succinaat	Sigma Aldrich	S2378-100G
TMPD	Sigma Aldrich	T3134-5G
Trypsine-EDTA 0,25%	Thermo Scientific	25200056
Uridine	Sigma Aldrich	U3750-25G