Methodenartikel

Een cardio-oncologisch muismodel van anthracycline-geïnduceerde cardiotoxiciteit in immuuncompetente muizen met borsttumoren

6 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71633

⸱

1 oktober 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1INSERM UMR-S 942 MASCOT, Cardiovascular Biomarkers, Pathophysiology, and Therapeutic Strategies - CIRCUS, Paris Cité University, 2Medical and Surgical Intensive Care Unit, University Hospital Avicenne, AP-HP

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Klinisch relevante muismodellen voor anthracycline-geïnduceerde cardiotoxiciteit zijn schaars. Hier wordt een model voorgesteld met gebruik van immuuncompetente muizen met een tumor die een antikankerbehandeling krijgen, wat de klinische protocollen van kankerpatiënten nabootst.

Samenvatting

De recente update van de European Society of Cardiology over preklinische modellen van hartdisfunctie gerelateerd aan kankertherapie benadrukt de kritieke behoefte aan meer representatieve en translationele in vivo modellen. Er wordt gewezen op de noodzaak om modellen te ontwikkelen die gebruikmaken van immuuncompetente, tumordragende dieren, waarbij meerdere stammen en beide geslachten worden betrokken, om de heterogeniteit die in klinische populaties wordt waargenomen nauwkeuriger te reproduceren. Daarom is een klinisch relevant model van anthracycline-geïnduceerde cardiotoxiciteit (AIC) in dieren met borsttumoren opgezet. Afhankelijk van de genetische achtergrond van de muizen werden respectievelijk 4T1Luc-cellen (200k cellen) of PY8119-cellen (200k cellen) subcutaan in de onderste melkklier van mannelijke en vrouwelijke Balb/c-muizen of C57Bl/6J-muizen geïnjecteerd. De tumorgroei werd gecontroleerd met bioluminescentie en palpatie. Zodra de tumormassa via palpatie detecteerbaar was, 2 weken na de injectie van de tumorcellen, kregen de dieren een antikankerbehandeling met Doxorubicine. De tolerantie van de muizen voor Doxorubicine was stamspecifiek. De hartfunctie werd geëvalueerd vóór de start van het protocol (baseline) en vervolgens wekelijks via een echocardiografie bij met ketamine geanestheseerde muizen. Cardiotoxiciteit werd gedefinieerd als een afname van de fractionele verkorting van de linker ventrikel van ten minste 10% ten opzichte van de baseline, een absolute waarde <50%, en een hartslag >300 BPM. Het protocol was reproduceerbaar met een succespercentage van 99% voor tumorontwikkeling en een overlevingspercentage van de muizen van >80%. Cardiotoxiciteit werd waargenomen bij >90% van de behandelde muizen met een tumor en Doxorubicine.

Inleiding

Cardio-oncologie is erop gericht de cardiovasculaire uitkomsten bij kankerpatiënten te verbeteren vóór, tijdens en na chemotherapie. Preklinische modellen hebben een grote rol gespeeld bij het beter begrijpen van de wisselwerking tussen deze twee ziekten. Onlangs observeerde een paradigmashift-studie dat muizen die inherent gevoelig zijn voor spontane darmpoliepen, meer van deze tumoren ontwikkelden na een myocardinfarct en een periode van hartfalen (HF), wat de directe impact van een cardiovasculair event op tumorgroei aantoont1. Sindsdien hebben talrijke studies consistente bevindingen gerapporteerd bij diverse tumortypen en muizenstammen, waarbij vaak specifieke moleculaire pathways of eiwitten in het gilde werden betrokken, wat het concept versterkt dat kankerprogressie wordt versneld door cardiovasculaire aandoeningen (CVD's)2,3,4,5.

Omgekeerd wordt de impact van kanker op het risico op de ontwikkeling van hart- en vaatziekten (HVAZ) al decennia bestudeerd. Epidemiologische gegevens tonen aan dat kankeroverlevers vaker lijden aan HVAZ, zowel door de gedeelde risicofactoren van deze twee ziekten als door de bekende diverse toxiciteiten van anti-kanker behandelingen6,7,8,9,10. In preklinische studies zijn vaak door kanker geïnduceerde cachexiemodellen gebruikt om specifieke targets te identificeren die bij mensen gemoduleerd zouden kunnen worden om de langetermijnresultaten op cardiovasculair gebied te verbeteren11,12,13,14. Men zou echter kunnen aanvoeren dat deze modellen nauwelijks een gangbare klinische situatie weerspiegelen, aangezien patiënten vaak worden behandeld voordat zij dit gevorderde kankersyndroom bereiken, maar er wordt nog steeds vermoed dat gegeneraliseerde cachexie grotendeels bijdraagt aan de algemene kankersterfte15.

In de eerste cardio-oncologische richtlijnen van de European Society of Cardiology (ESC) is geconcludeerd dat verder onderzoek nodig is om de relatie tussen kanker en hart- en vaatziekten (CVD's) beter te begrijpen16. Specifiek werd in een recente update van de ESC-werkgroep cardio-oncologie gesteld dat preklinisch onderzoek van het grootste belang is om dit kennishiaat te dichten, in het bijzonder met modellen waarin gebruik wordt gemaakt van tumordragende dieren17. Bovendien is een betere correlatie tussen preklinische en klinische studies nodig, aangezien de meeste huidige klinische studies worden uitgevoerd op antikankertherapieën die in preklinische settings onvoldoende zijn bestudeerd18.

Anthracyclines (AC's), zoals doxorubicine (Dox), worden veelvuldig gebruikt bij chemotherapie voor een groot aantal solide tumoren en bloedtumoren. Hoewel er tegenwoordig modernere therapieën beschikbaar zijn, zullen hun lage kosten, goed gedocumenteerde bijwerkingen en evidente effectiviteit ertoe leiden dat deze geneesmiddelen nog vele jaren worden gebruikt19,20. Een grote hoeveelheid bewijs suggereert dat AC's leiden tot dosisafhankelijke cardiotoxiciteit, voornamelijk zichtbaar als een linkerventrikeldysfunctie, wat een van de belangrijkste beperkende factoren is voor het huidige klinische gebruik en vaak een zorgelijke factor is voor de cardio-oncoloog21,22. Deze literatuur is hoofdzakelijk afkomstig uit studies naar borstkanker vanwege de hoge incidentie bij mensen, maar klinische studies naar lymfomen, longkanker en leukemieën leveren soortgelijke observaties op23. Daarom is er al decennia preklinisch onderzoek verricht om de onderliggende pathofysiologische mechanismen van door AC geïnduceerde cardiotoxiciteit (AIC) te begrijpen, waarbij is aangetoond dat oxidatieve stress, directe en indirecte DNA-schade, ferroptose en mitochondriale schade gewoonlijk betrokken zijn23,24.

Desondanks is er eigenlijk beperkt bewijs over hoe AIC kan worden voorkomen of behandeld. Veelgebruikte HF-medicatie is getest in klinische studies met wisselende resultaten, en het moment van gebruik van de weinige potentiële kandidaten bleek moeilijk te bepalen21,23,25,26,27,28. Dexrazoxane, een ijzer-modulerend geneesmiddel, heeft veelbelovende resultaten getoond bij het voorkomen van AIC, maar wordt tegenwoordig niet systematisch gebruikt21. Het toedienen van AC's in andere vormen dan vrij in het bloed, bijvoorbeeld ingekapseld in liposomen, heeft ook veelbelovende resultaten laten zien, maar heeft nog steeds moeite om conventionele AC's te vervangen, mede vanwege de kosten21.

Eén verklaring voor deze situatie is het gebrek aan klinisch relevante diermodellen voor het bestuderen van AIC17. Bij mensen wordt Dox gedurende een bepaalde periode toegediend via herhaalde injecties, en het grootste deel van de AIC wordt waargenomen tijdens het eerste jaar na de behandeling. Er is echter een grote variatie in dierprotocollen waarneembaar in de literatuur, zoals aangetoond in een onlangs gepubliceerde review29. Een klassiek voorbeeld van een acuut cardiotoxiciteitsmodel bestaat uit tumorvrije muizen die een enkele injectie van 20 mg/kg Dox ontvangen30. In een typisch model voor chronische cardiotoxiciteit beschrijven veel studies tumorvrije muizen die één injectie per week van 5 mg/kg Doxorubicine ontvangen voor een totale cumulatieve dosis van 20 mg/kg29,31. Dit model voor chronische cardiotoxiciteit kan ook worden waargenomen bij tumordragende dieren bij dezelfde Dox-dosis; dit komt echter zeer zelden voor in de literatuur29,32.

Om bij te dragen aan het verkleinen van deze kenniskloof is een pragmatisch en klinisch relevant model ontwikkeld van immuuncompetente muizen met borsttumoren om AIC te bestuderen, namelijk in Balb/c-muizen met 4T1-tumoren; de robuustheid hiervan werd bevestigd in C57Bl/6J-muizen met PY8119-tumoren, wat naar kennis van de auteurs de eerste keer is dat een cardio-oncologisch model wordt opgezet met een triple-negatief borstkankertype in een C57Bl/6J-stam. Er werd een nauwkeurige registratie van de tumorgroei bereikt via bioluminescentie-kwantificatie voorafgaand aan de behandeling van de dieren met Dox, wat cardiotoxiciteit vertoonde, en er werd een protocol voor orgaanoogst geïmplementeerd om de tumormicro-omgeving gelijktijdig met het cardio-oncologische experiment te bestuderen. Bovendien werden resultaten waargenomen die vergelijkbaar zijn met die in de literatuur beschreven met betrekking tot stam- en geslachtgevoeligheid. Van dit werk wordt verwacht dat het zal bijdragen aan de standaardisatie en verbetering van dierprotocollen in toekomstige cardio-oncologische studies, aangezien C57Bl/6J-muizen zeer waardevol zijn vanwege hun hoge overlevingskans in AIC-experimenten29.

Het voordeel van de voorgestelde methode is het gebruik van de C57Bl/6J-stam, die eenvoudig genetisch te modificeren is, een goed gekarakteriseerd genoom heeft, goedkoop aan te schaffen is en tolerant is voor hoge cumulatieve doses ACs29,33,34. Indien het uitschakelen van een gen nodig is voor een specifieke studie met ACs, is dit model zeer geschikt voor dit doel. Bovendien is het gebruik van een triple-negatieve borstkanker afgeleid van deze stam van translationeel belang, aangezien vrouwen met triple-negatieve borstkanker de patiënten zijn die zeer waarschijnlijk ACs ontvangen en die de slechtste prognose hebben35. Het gebruik van dit model zal waarschijnlijk de kennis over AIC specifiek voor deze patiënten verbeteren.

De kracht van dit model ligt er ook in dat de muizen zijn voorbehandeld met een tumor, wat een werkelijke impact kan hebben op cardiovasculaire remodellering36,37. Daarnaast bevindt dit model zich tussen acute en volledig chronische modellen van AIC, met de mogelijkheid om de monitoringduur van de dieren te verlengen vanwege hun hoge overlevingpercentage, wat van grote waarde kan zijn als andere AC-cycli worden overwogen.

Dit model is echter waarschijnlijk niet het meest geschikt voor een specifieke tumorcharacterisering aan het einde van het protocol, vanwege de pragmatische aanpak van de tumorinoculatie. Een aangepaste versie van de tumorinjectie moet worden uitgevoerd als dit centraal staat in de wetenschappelijke hypothese. Daarnaast is de injectie van 4T1-cellen in Balb/c-muizen een goed gevestigd model voor een meer oncologische benadering, bijvoorbeeld voor het bestuderen van metastase, wat hier niet wordt beschreven en in overweging moet worden genomen als metastase essentieel is voor de wetenschappelijke vraag38. Dit model wordt uitgevoerd bij volwassen muizen; indien het doel echter is om AIC in een pediatrische setting te bestuderen, moeten jongere muizen worden overwogen, voor welke de respons op het protocol hier niet is onderzocht.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de lokale ethische commissie voor dierproeven (Lariboisière-Villemin) en werden goedgekeurd door het Franse Ministerie van Hoger Onderwijs en Onderzoek (MESRI) onder protocolnummer APAFIS 46086. De 3V-principes zijn meegenomen bij het ontwerp van het protocol. Balb/c- en C57Bl/6J-muizen werden aangeschaft bij een dierleverancier zoals Janvier Labs of Envigo. Voor dit protocol waren de muizen bij inclusie tussen de 10 en 18 weken oud om te corresponderen met jonge volwassenen, vergelijkbaar met de vrouwen die lijden aan triple-negatief mammacarcinoom. De dieren werden gehuisvest in groepen van 2–5 individuen in een ruimte met licht-/donkercycli van 12 uur en een kamertemperatuur tussen 20 °C en 24 °Cen een luchtvochtigheid tussen 30% en 70%. Water en voeding werden verstrekt ad libitumTijdens het protocol werd er zorgvuldig gehandeld om de humane eindpunten te volgen die voorafgaand aan de start van het protocol waren vastgesteld, zoals beschreven in Aanvullende tabel 1Zorg ervoor dat een isofluraanfilter wordt gebruikt om afvalgas op te vangen voor de veiligheid van de gebruiker van isofluraan. Behandel de dieren met zorg en draag bij elke stap van dit protocol handschoenen en een veiligheidsbril. Alle gevaarlijke materialen moeten worden behandeld volgens de lokale institutionele regelgeving; in dit geval werden alle besmette monsters (bloed, naalden, vials met dox, etc.) afgevoerd in containers voor biologisch gevaarlijk medisch afval. Het overzicht van het protocol wordt getoond in Figuur 1ADe gebruikte reagentia en apparatuur staan vermeld in de Tabel met materialen.

1. Week 0: Celpreparatie en injectie in het dier

OPMERKING: De volgende stappen zijn beschreven voor 4T1Luc-cellen en waren identiek voor het gebruik van PY8119-cellen. Desalniettemin dient dit te worden aangepast voor elke cellijn, afhankelijk van de aanbevelingen van de fabrikant. Om het protocol te optimaliseren, kan één persoon de celpreparatie verzorgen, terwijl de ander de dierpreparatie uitvoert.

  1. Wanneer een confluente celkweekfles is verkregen (80%–90% confluentie), breng dan 3 mL trypsine aan gedurende 5 min bij 37 °C en 5% CO2.
  2. Tik voorzichtig tegen de fles om alle cellen los te maken, voorkom celklonters en resuspendeer in celkweekmedium.
  3. Tel de cellen met behulp van een Malassez-telkamer (of een andere techniek, afhankelijk van wat beschikbaar is).
  4. Centrifugeer de cellen bij 300 × g gedurende 5 min en resuspendeer ze vervolgens in een gelijk volume PBS om 200.000 cellen in 100 µL te injecteren.
    OPMERKING: Het aantal cellen is gekozen na een literatuuronderzoek (zie Aanvullende Tabel 2).
  5. Aspireer voorzichtig 500 µL van de celsuspensie met een 26 G spuit. Om te voorkomen dat de celsuspensie te lang in de spuit verblijft, wordt aanbevolen de spuit met een kleiner volume te vullen dan nodig is voor 5 dieren.
  6. Plaats gelijktijdig (indien mogelijk) de muizen in een isofluraankamer en induceer snel anesthesie met 3% isofluraan bij 1 L/min in omgevingslucht. Zodra het dier slaapt, wordt het dier in rugligging geplaatst met de snuit in een conus met 1% isofluraan.
  7. Breng met een wattenstaafje een milde onthaarkrèm aan op de thorax en de linker onderste buikwand van het dier gedurende 1 min. Verwijder het haar en de crème met water en droog de huid vervolgens af met een tissue.
  8. Controleer of de anesthesie voldoende is door middel van een knijptest bij de teen.
  9. Identificeer de linker tepel van de bovenbuik. Pak deze voorzichtig vast met een pincet en til deze omhoog (zie Figuur 1B).
  10. Breng de spuitnaald subcutaan in en voer deze in totdat de naald zich onder de melkklier bevindt.
  11. Injecteer 100 µL van de celsuspensie. Er moet een subcutane blaas ontstaan onder de tepel (zie Figuur 1C). Controledieren moeten PBS ontvangen. Randomisatie kan worden uitgevoerd met randomisatiesoftware (zoals RandoMice, een gratis online tool) of door de behandeling toe te wijzen aan muizen volgens een vooraf gedefinieerde 1-op-1 of 2-op-2 ratio (of hoger).
  12. Verwijder de naald voorzichtig en laat de tepel los die met de pincet werd vastgehouden.
  13. Weeg het dier om een basisgewicht voor het protocol vast te stellen.
  14. Laat het dier ontwaken in omgevingslucht voordat het terugkeert naar de kooi.

2. Week 1: Beheersing van tumorgroei met bioluminescentie

OPMERKING: Dit kan op elke dag na de injectie worden gedaan om de groei te controleren. Bovendien kan dit op meerdere tijdstippen worden uitgevoerd als de tumorsnelheid van belang is. Echter, na 10–14 dagen kan het signaal vervagen door natuurlijke selectie van tumorcellen tijdens de kankergroei. Ook zou hergroei van haar geen probleem moeten vormen voor een goede fotonenvangst als het protocol aan het begin correct is uitgevoerd. Zie Figuur 2A,B voor representatieve resultaten van bioluminescentie gekwantificeerd op dag 2, 5, 8 en 11 na tumorinjectie.

  1. Plaats de dieren in een isofluraankamer en induceer snel anesthesie met 3% isofluraan.
  2. Zodra de dieren in slaap zijn, injecteer dan 10 µL/g lichaamsgewicht luciferine intraperitoneaal (IP) met een 26-G spuit. Vermijd het injecteren van luciferine aan de linkerzijde vanwege de aanwezigheid van de tumor, die na enkele dagen soms al voelbaar kan zijn.
  3. Plaats de muizen in de fotonimager in rugligging om de fotoncapturering te optimaliseren, aangezien de tumor zich aan de abdominale zijde bevindt. Plaats de snuit in de neuskegel en verlaag de isofluraanconcentratie naar 1%.
    OPMERKING: Het correct plaatsen van 5 dieren in een fotoncapturer kost tijd; begin met het plaatsen ervan minimaal 2 min voordat de acquisitie moet starten.
  4. Start de acquisitie van de luminescentie-activiteit 10 min na de luciferine-injectie en laat deze 5 min lopen (Zie Figuur 2A). De acquisitiemodus voor het hier gebruikte apparaat was BLI bij 89 ms per frame, met een beeldformaat van 220 mm x 165 mm en een BVR Pixel-grootte van 153 µm.
  5. Wanneer de acquisitie is voltooid, laat het dier dan ontwaken in omgevingslucht voordat het terug in de kooi wordt geplaatst.
  6. Gebruik kwantificatiesoftware die is aangepast voor de fotonimager, volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

3. Week 2: Behandeling met doxorubicine

OPMERKING: De echocardiografische beoordeling moet worden uitgevoerd voordat met de Dox-injecties wordt gestart. Gebruik daarom de anesthesie die na de echocardiografie is toegediend om de injectie te geven terwijl het dier slaapt, om zo de stress van de eerste Dox-injectie te minimaliseren. Daarnaast moet de cumulatieve dosis worden aangepast aan elke muizenstam. Hier werden 16 mg/kg voor Balb/c-muizen en 24 mg/kg voor C57Bl/6J gebruikt, gebaseerd op eerdere interne gegevens en de literatuur29 (zie Figuur 3A–C).

  1. Resuspendeer en verdun het doxorubicinepoeder met een zoutoplossing. De verdunning moet zo worden bereid dat 4 mg/kg Dox overeenkomt met een volume van 240–360 µL. Een suggestie is daarom om een oplossing van 2 mg/mL te bereiden en deze vervolgens 6-voudig te verdunnen met zoutoplossing (finale concentratie 0,33 mg/mL).
  2. Controleer twee weken na de tumorinjectie of de tumor tastbaar is in het linkerondergedeelte van de buik, maar kleiner is dan 1 cm.
  3. Weeg het dier om het gewichtsverlies na de Dox-behandeling te controleren.
  4. Injecteer met een 26 G spuit het overeenkomstige volume om 4 mg/kg IP in het rechterondergedeelte van de buik te bereiken. Controle-dieren moeten zoutoplossing ontvangen. Randomisatie kan worden uitgevoerd zoals beschreven in stap 1.11.
  5. Herhaal deze procedure dagelijks gedurende 4 dagen om een cumulatieve dosis van 16 mg/kg te bereiken (voeg 2 dagen toe om 24 mg/kg te bereiken voor C57Bl/6J-muizen).

4. Week 2–5: Monitoring van cardiotoxiciteit

OPMERKING: Dit kan wekelijks worden uitgevoerd. Bij een frequentere beoordeling is voorzichtigheid geboden, aangezien de dieren vaak het meest kwetsbaar zijn tijdens week 3 en 4 van het protocol, en omdat sommige muizenstammen gevoelig zijn voor algemene anesthesie, wat kan leiden tot een verhoogde mortaliteit. Echocardiografie wordt uitgevoerd onder ketamine-anesthesie om de kansen op het vastleggen van cardiale dysfunctie te optimaliseren, aangezien isofluraan myocardiale depressie induceert; hierbij wordt 40 mg/kg gebruikt voor Balb/c-muizen en 80 mg/kg voor C57Bl/6J-muizen39. Het wordt aanbevolen om één echografie uit te voeren vóór de tumorinjectie om het potentiële effect van tumorgroei op de hartfunctie te kwantificeren voordat de chemotherapie wordt gestart.

  1. Weeg het dier. Indien er sprake is van significant gewichtsverlies, volg dan Aanvullende Tabel 1.
  2. Anestheseer de dieren via een IP-injectie met een 26 G spuit met ketamine bij 40 mg/kg (Balb/c muizen) of 80 mg/kg (C57Bl/6J muizen) om een lichte anesthesie te verkrijgen.
  3. Plaats het dier op een warmtemat om hypothermie te voorkomen.
  4. Zodra het dier slaapt, scheer het dier zoals beschreven in 1.7 om een haarvrije thoraxzone te verkrijgen.
  5. Voer tien minuten na de ketamine-injectie echocardiografie uit voor maximaal 5 min. Gebruik voorverwarmde echogel. Afhankelijk van het gebruikte apparaat, focus op M-mode en/of voer strain-kwantificatie uit.
  6. Indien M-mode wordt gebruikt, registreer mid-ventriculaire secties in parasternale long-axis view, kloppend gedurende minimaal 4 s, minimaal 3 keer om een representatief gemiddelde van de hartfunctie van de muis te verkrijgen (zie Figuur 4A,B). Hierbij was de framerate ingesteld op 100 frames/s, de transmissiefrequentie op 38,4 MHz bij 100% vermogen, de ontvangstfrequentie op 96 MHz, de geluidssnelheid op 1538 ms en de sweep-snelheid op 1200 Hz.
  7. Na ongeveer 5 min zal het dier te wakker zijn om echocardiografie toe te staan. Plaats het terug in de kooi na het verwijderen van de gebruikte echogel.
  8. Kwantificeer de hartfunctie blind39,40. Relevante dysfunctie in dit model wordt gedefinieerd als 10% onder de baseline-waarde en een absolute waarde <50% van de fractionele verkorting (FS) van de linker ventrikel, terwijl de hartslag >300 BPM blijft. Indien de FS-waarde vóór de behandeling te laag is, overweeg dan om het dier uit de analyse uit te sluiten.
    OPMERKING: Voor elke kwantificatie uit de fragmenten van 4 s zijn minimaal 3 hartcycli nodig, maar indien mogelijk kunnen meer cycli worden gebruikt. Gebruik indien mogelijk dezelfde experimentator voor alle echocardiografie en een andere persoon voor de kwantificatie om de analyse blind te houden. Aanbevelingen met betrekking tot kwaliteitscontrole van echocardiografie zijn elders gepubliceerd40.
  9. Voer een statistische analyse uit (zie stap 6). De aanbevolen toets voor het analyseren van twee groepen gedurende het gehele protocol is een two-way ANOVA, aangezien twee factoren worden vergeleken: tijd en behandeling.
  10. Voer dit wekelijks uit. De dysfunctie treedt al op na 1 week doxorubicine-behandeling.
    OPMERKING: Indien er op een bepaald tijdstip na de Dox bloedafname nodig is, bijvoorbeeld om cardiale biomarkers te meten, neem dan direct na de echocardiografie bloed af om een extra anesthesie-injectie te vermijden, stress bij het dier te minimaliseren en de tijd te optimaliseren.

5. Week 5: Opofferingsprocedure

OPMERKING: Idealiter dient dit protocol voor orgaanverzameling door twee personen te worden uitgevoerd.

  1. Injecteer de dieren na de laatste echocardiografie in week 5 opnieuw met IP ketamine tegen 100 mg/kg. Breng lokale anesthesie aan met een druppel 1% Tetracaïne in het oog dat gebruikt zal worden voor de bloedafname.
  2. Voer met een heparinecapillair een retro-orbitale bloedafname uit om zoveel mogelijk bloed te verzamelen in een heparinebuis (of gebruik een EDTA-capillair voor een EDTA-buis).
  3. Wanneer er geen bloed meer kan worden verkregen, wordt cervicale dislocatie uitgevoerd in overeenstemming met de institutioneel goedgekeurde protocollen. Plaats het verzamelde bloed onmiddellijk op ijs tot aan verdere verwerking, terwijl het euthanasieprotocol wordt voortgezet zoals beschreven in stap 5.5.
  4. Centrifugeer het bloed bij 2000 x g gedurende 10 min bij 4 °C om de bloedcellen en het plasma te scheiden. Vries de plasmabuis snel in met vloeibare stikstof en bewaar deze bij -80 °C tot aan verdere analyse.
  5. Plaats het dier op een polystyreen schuimdeksel bedekt met absorptiepapier en zet de 4 poten vast met pinnen.
  6. De tumor moet een aanzienlijke omvang hebben (minstens 2 cm). Snijd met een ruime marge rondom de tumor om deze los te maken. Verdere dissectie kan worden uitgevoerd na de overige orgaanverzameling zoals beschreven in stap 5.15.
  7. Disseceer de tumor in een apart gebied voorzichtig met een klein, scherp schaartje terwijl u deze met een pincet vasthoudt. Om de spanning te verhogen zonder de tumor te beschadigen, kunt u de overtollige huid aan het deksel pinnen. Dit maakt de dissectie eenvoudiger.
  8. Zodra de tumor goed is gedisseceerd, wordt deze voorzichtig gereinigd met PBS om bloed, haar en ander niet-aanhechtend vuil te verwijderen. Weeg de tumor.
  9. Plaats een nylon gaas van 22 µm in een centrifugebuis van 5 mL, plaats de tumor er voorzichtig op en houd deze op ijs tot aan de centrifugatie.
  10. Centrifugeer de buis bij 100 x g gedurende 10 min bij 4 °C om interstitiële vloeistof te verzamelen (zie Figuur 5A). Het verkregen volume varieert van 1 tot 20 µL en is vaak roodachtig van kleur (Figuur 5B). Draag dit over naar een microcentrifugebuis van 200 µL en bewaar deze bij -80 °C tot aan verdere analyse.
    OPMERKING: Het restant van de tumor kan in kleinere stukjes worden gesneden, in bewaarbuisjes worden geplaatst, snel worden ingevroren in vloeibare stikstof en worden bewaard bij –80 °C tot aan verdere analyse.
  11. Om beenmerg te verzamelen, snijdt u het rechterbeen door met een schaar en disseceert u met een scalpel en pincet het femur en de tibia zodat al het spierweefsel, bindweefsel en vet zijn verwijderd. Snijd de epifyse aan beide zijden van beide botten door met een scalpel. Plaats de gereinigde botten in PBS in 12-wells kweekplaten terwijl de orgaanverzameling van de muizen wordt voltooid zoals beschreven in stap 5.15.
    OPMERKING: Uitgebreidere details over de isolatie van beenmerg zijn elders gepubliceerd41.
  12. Doorboor de bodem van 500 µL microcentrifugebuisjes met een 18 G naald, plaats de twee botten hierin en zet het buisje in een centrifugebuis van 1,5 mL gevuld met 400 µL PBS.
  13. Centrifugeer de buisjes bij 10.000 x g gedurende 1 min bij 4 °C. Er is een pellet van cellen zichtbaar op de bodem van de 1,5 mL buis; dit zijn allen beenmergcellen, terwijl het beenmergstroma is gemengd in de PBS. Aspireer al het supernatant (beenmergstroma) in een aparte bewaarbuis, vries het materiaal snel in met vloeibare stikstof en bewaar het bij -80 °C.
  14. Maak met een schaar een transversale incisie onder de thorax op het niveau van het diafragma en snijd het sternum langs de longitudinale as door om de longen en het hart bloot te leggen.
    OPMERKING: Indien nodig voor verdere analyse kan hier een verwijdering van het totaalbloed met zoutoplossing worden uitgevoerd.
  15. Verzamel alle organen die nodig zijn voor biomoleculaire en histologische analyse. Weeg ze en snijd ze in kleinere stukjes om toekomstige biomoleculaire analyse te vergemakkelijken. Vries alle buisjes onmiddellijk in vloeibare stikstof in zodra het orgaan in kleinere stukjes is gesneden, en bewaar ze vervolgens bij -80 °C.
  16. Scheid voor het hart de apex van het bovenste deel van het hart en plaats deze op plastic mallen gevuld met OCT. Plaats het orgaan na het aanbrengen van OCT in koud isopentaan voordat het snel wordt ingevroren met vloeibare stikstof en wordt bewaard bij -80 °C.

6. Statistische analyse

OPMERKING: Alle statistische analyses en grafieken zijn uitgevoerd met statistische en grafische software en volgen de aanbevelingen van de statistische gids42.

  1. De gepresenteerde gegevens zijn weergegeven als gemiddelde ± SEM.
  2. Gebruik dezelfde schaal voor alle grafieken van de fractionele verkorting.
  3. Toon elke individuele experimentele eenheid (muis) op elke grafiek.
  4. Voer de Shapiro-Wilk-test uit om de normaliteit van de distributies van elke experimentele groep te beoordelen, met een significantieniveau alpha ingesteld op p = 0,05.
  5. Gebruik voor vergelijkingen tussen twee groepen de tests van Welch of Mann-Whitney, afhankelijk van de normaliteit van de distributie (Welch-test voor normale distributies in beide groepen, Mann-Whitney-test als één of beide groepen een niet-normale distributie hebben). Kies de tweezijdige opties, met een betrouwbaarheidsniveau van 95%.
  6. Bepaal voor vergelijkingen tussen meer dan twee groepen op één specifiek tijdstip opnieuw of de distributies van de groepen normaal zijn, zoals in stap 6.4. Voer een eenwegvariantieanalyse (ANOVA) uit, gevolgd door de correctie van Holm-Sidak voor meervoudige vergelijkingen als de distributie normaal is.
    OPMERKING: Als de distributie niet normaal is, dient in plaats daarvan de Kruskal-Wallis-test met de correctie van Dunn voor meervoudige vergelijkingen te worden uitgevoerd. De family-wise alpha-drempelwaarde is ingesteld op 0,05 om de significantie te bepalen.
  7. Voor longitudinale gegevens is een tweeweg-ANOVA voor herhaalde metingen, gevolgd door de correctie van Sidak voor meervoudige vergelijkingen, gebruikt om groepsverschillen op een specifiek tijdstip te onderzoeken. De family-wise alpha-drempelwaarde is ingesteld op 0,05 om de significantie te bepalen.

Resultaten

Dit protocol, zoals weergegeven in Figuur 1A, is een protocol van 5 weken dat resulteert in de volgende experimentele groepen: tumorvrije dox-vrije muizen, tumorvrije dox-behandelde muizen, tumordragende dox-vrije muizen en tumordragende dox-behandelde muizen. Deze groepen kunnen worden verdubbeld afhankelijk van of beide geslachten worden gebruikt. De eerste 2 weken van tumorgroei, voorafgaand aan de start van de Dox-behandeling, zijn voldoende voor de groei van de tumor nadat 200.000 cellen zijn geïnjecteerd in de 4e linkermelkklier van de dieren (Figuur 1B). Bevestiging van de subcutane injectie moet worden verkregen door de verschijning van een blaasje onder de tepel bij het voorzichtig injecteren van de tumorcelсусpensie (Figuur 1C). Tabel 1 vat kort de belangrijkste parameters van het protocol voor elke muizenstam samen, samen met de belangrijkste resultaten die hieronder worden besproken.

Figuur 2A is een representatieve afbeelding van het bioluminescentiesignaal dat wordt verkregen wanneer één muis zonder tumor (links) en één muis met een tumor (rechts) worden geïnjecteerd met luciferine, waarna fotonen gedurende 5 min worden verzameld. Deze analyse vereist tumoren die het luciferasegen tot expressie brengen om fotonen te genereren na injectie van luciferine. In totaal werden 33 Balb/c-muizen met 4T1Luc-celinjecties gedurende 11 dagen gemonitord met bioluminescentie, terwijl 9 controles werden gebruikt. Figuur 2B bevestigt dat de tumor snel groeit, maar dat de signaalintensiteit na dag 8 begint af te vlakken; bovendien lijkt er aanvankelijk een snellere groei van de tumor te zijn bij vrouwelijke muizen in vergelijking met mannelijke Balb/c-muizen, zoals weergegeven in Figuur 2C. Slechts 1 van de 45 Balb/c-muizen had na 5 weken geen tumor, terwijl alle C57Bl/6J-muizen na 5 weken een tumor hadden (Figuur 2D).

Figuur 3A  en Figuur 3B tonen aan dat een cumulatieve dosisreductie van Dox leidt tot een verbeterde overleving 3 weken na de start van Dox: terwijl geen enkele tumordragende Balb/c-muis overleefde bij 24 mg/kg, overleefde 50% bij 16 mg/kg. Tumordragende C57Bl/6J-muizen zijn echter resistenter, zelfs bij 24 mg/kg Dox, aangezien >80% van hen 3 weken na de start van de chemotherapie overleeft (Figuur 3D). Geslacht had een belangrijke invloed op de uitkomst: vrouwtjes vertoonden een veel betere overleving dan mannetjes bij de Balb/c-muizen (16 van de 29 vrouwtjes overleefden vergeleken met 3 van de 16 mannetjes). Figuur 3C illustreert de geslachtsverschillen in Balb/c-muizen die 16 mg/kg Dox ontvingen (er is geen statistische toets uitgevoerd vanwege het lage aantal mannetjes). Bij C57Bl/6J-muizen waren er geen statistisch significante verschillen in overleving tussen de twee geslachten (zie Figuur 3E).

Een representatieve afbeelding van een gezonde hartfunctie bij muizen, geëvalueerd via echocardiografie vóór de Dox-behandeling, wordt getoond in Figuur 4Aen er wordt een afbeelding getoond van een muis met cardiale dysfunctie na toediening van Dox in Figuur 4BFS gekwantificeerd in M-mode bij 17 tumor dragende C57Bl/6J-muizen behandeld met 24 mg/kg Dox vertoont twee weken later een significante afname (59,3% vóór Dox tegenover 44,3% na Dox, p < 0.0001, Figuur 4C). Slechts 1 van de 12 overlevende muizen (8%) voldeed niet aan de vooraf gedefinieerde criteria voor cardiotoxiciteit. De hartslag daalt licht maar significant van 623 BPM vóór Dox naar 569 BPM na Dox (p < 0.05, Figuur 4D). Alle door M-mode gekwantificeerde parameters zijn te vinden in Aanvullende tabel 3.

Bevestiging van het cardiotoxische effect van doxorubicine wordt verkregen via macro- en microscopische analyse. Figuur 6A,B laat zien dat het absolute hartgewicht significant is afgenomen na doxorubicinebehandeling bij de weinige overlevende tumordragende vrouwelijke Balb/c-muizen, maar dat normalisatie van het hartgewicht ten opzichte van het totale lichaamsgewicht slechts een trend vertoont. In een experiment met niet-tumordragende C57Bl/6-muizen induceerde 24 mg/kg doxorubicine één week na de start van de behandeling de verwachte veranderingen in het cardiale mRNA van de volgende genen: Atrogin en Murf1 namen toe, wat wijst op atrofie, NQO1 nam toe in het voordeel van oxidatieve stress, en Bax nam toe in het voordeel van een pro-apoptotische situatie (Figuur 6C–F).

Figuur 5A is een schematische weergave van het protocol voor tumorinterstitieel vocht. Een representatief beeld van het verzamelde vocht wordt getoond in Figuur 5B: het verkregen volume is klein.

figure-results-1
Figuur 1: Representatieve illustraties van het experimentele protocol. (A) Schematisch overzicht van het experimentele protocol. Gemaakt met BioRender (licentienummer JE29USE7LU). (B) Schematische weergave van subcutane tumorinoculatie. Gemaakt met BioRender (licentienummer SO29JHW7R6). (C) Schematische weergave van een succesvolle subcutane tumorimplantatie. Gemaakt met BioRender (licentienummer SO29JHW7R6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Bioluminescentie-imaging en tumorimplantatiesnelheid. (A) Representatieve bioluminescentiebeelden van een controlemuis (links) en een tumor-dragende muis (rechts). (B) Bioluminescentiesignaal over de tijd (gemiddelde ± SEM; repeated-measures two-way analysis of variance [ANOVA]; *P < 0,05). (C) Vergelijking van bioluminescentiesignalen tussen mannelijke en vrouwelijke Balb/c-muizen (gemiddelde ± SEM). (D) Succespercentages van tumorimplantatie in beide muizenstammen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Overlevingsanalyse van tumor-dragende muizen. (A) Kaplan-Meier overlevingscurve van Balb/c muizen behandeld met 24 mg/kg doxorubicine (Dox). (B) Kaplan-Meier overlevingscurve van Balb/c muizen behandeld met 16 mg/kg Dox. (C) Kaplan-Meier overlevingscurve waarin mannelijke en vrouwelijke Balb/c muizen behandeld met 16 mg/kg Dox worden vergeleken. Er is geen statistische analyse uitgevoerd vanwege het beperkte aantal mannelijke muizen. (D) Kaplan-Meier overlevingscurve van C57BL/6J muizen behandeld met 24 mg/kg Dox. (E) Kaplan-Meier overlevingscurve waarin mannelijke en vrouwelijke C57BL/6J muizen behandeld met 24 mg/kg Dox worden vergeleken (log-rank test, P = 0.86). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Echocardiografische beoordeling van doxorubicine-geïnduceerde cardiotoxiciteit. (A) Representatief M-mode echocardiogram van een gezonde muis. (B) Representatief M-mode echocardiogram van een muis met doxorubicine-geïnduceerde cardiotoxiciteit. (C) Fractionele verkorting (FS) bij C57BL/6J-muizen vóór en 14 dagen na behandeling met doxorubicine. (D) Hartslag (HR) bij C57BL/6J-muizen vóór en 14 dagen na behandeling met doxorubicine. Gegevens zijn weergegeven voor n = 17 muizen. Statistische vergelijkingen zijn uitgevoerd met de Welch's t-test. *P < 0,05; ****P ≤ 0,0001. Afkortingen: FS, fractionele verkorting; HR, hartslag. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Protocol voor orgaanbemonstering. (A) Schematische weergave van het protocol voor het verzamelen van tumorinterstitieel vocht. Gemaakt met BioRender (licentienummer HV29USD91R). (B) Representatieve afbeelding die de collectie van tumorinterstitieel vocht tijdens de orgaanbemonstering laat zien. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Door doxorubicine geïnduceerde cardiotoxiciteit. (A>) Hartgewicht gemeten 3 weken na start van behandeling met 16 mg/kg doxorubicine bij tumor-dragende Balb/c-muizen. (B>) Hartgewicht genormaliseerd naar het totale lichaamsgewicht, gemeten 3 weken na start van behandeling met 16 mg/kg doxorubicine bij tumor-dragende Balb/c-muizen. (C>) Atrogin mRNA-expressie in het myocard van C57BL/6J-muizen 1 week na start van behandeling met 24 mg/kg doxorubicine. (D>) Murf1 mRNA-expressie in het myocard van C57BL/6J-muizen 1 week na start van behandeling met 24 mg/kg doxorubicine. (E>) NQO1 mRNA-expressie in het myocard van C57BL/6J-muizen 1 week na start van behandeling met 24 mg/kg doxorubicine. (F>) BAX mRNA-expressie in het myocard van C57BL/6J-muizen 1 week na start van behandeling met 24 mg/kg doxorubicine. Statistische analyses zijn uitgevoerd met de t-test van Welch of de Mann-Whitney U-test, afhankelijk van de datadistributie. ns, P > 0,05; *P < 0,05; **P < 0,01. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

MuisstamBalb/cC57Bl/6J
Gebruikte cellijn4T1LucPY8119
Aantal geïnjecteerde cellen200 000200 000
Gebruikt geslachtMannelijk en vrouwelijkMannelijk en vrouwelijk
Aantal injectiedagen46
Dagelijkse dosis4 mg/kg4 mg/kg
Cumulatieve Doxorubicine-dosis16 mg/kg24 mg/kg
Ketamine-dosis40 mg/kg80 mg/kg
Incidentie van cardiotoxiciteit>90%>90%
Overlevingspercentage19/4516/19

Tabel 1: Belangrijkste protocolparameters voor elke muizenstam. Vergelijking van de belangrijkste experimentele variabelen en reagentiaconcentraties die zijn gebruikt in de Balb/c- en C57BL/6J-muizenprotocollen.

Aanvullende tabel 1: Eindpunten voor dierenwelzijn.  Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Tabel 2: Literatuuroversicht van 4T1 experimentele protocollen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 3: Echocardiografische parameters gemeten via M-mode bij 17 tumordragende C57BL/6J-muizen behandeld met 24 mg/kg doxorubicine. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Hier is een model ontwikkeld van doxorubicine-geïnduceerde cardiotoxiciteit in muizen met borsttumoren, dat naar verwachting van grote klinische relevantie is voor toekomstige studies in de cardio-oncologie. Het doel was om de klinische situatie van het traject van een patiënt na te bootsen, vanaf de aankomst in het ziekenhuis met een gediagnosticeerde kanker tot aan de behandeling met een potentieel cardiotoxische chemotherapie. Het protocol volgt een pragmatisch ontwerp en maakt gebruik van immuuncompetente muizen die wereldwijd beschikbaar zijn, waardoor andere teams dit in andere laboratoria kunnen reproduceren. De hoge slagingskans bij tumorimplantatie maakt dit model een sterke kandidaat voor toekomstige cardio-oncologische toxiciteitsstudies.

Veelvoorkomende valkuilen in dit protocol zijn het uitvoeren van echocardiografie bij muizen met een lage hartslag, wat kan leiden tot een kunstmatig lage fractionele verkorting (FS). Het toestaan dat de muizen herstellen van de initiële negatieve chronotrope effecten van de anesthetica vóór de echocardiografische beoordeling helpt om nauwkeurige FS-metingen te garanderen. Bij Balb/c-muizen kan een verdere verlaging van de dosis anestheticum noodzakelijk zijn als de mortaliteit hoog blijft. Dezelfde experimentator moet alle echocardiografische beoordelingen gedurende de studie uitvoeren, omdat de inter-observervariabiliteit aanzienlijk kan zijn43. Bij tumorimplantatie kan het terugtrekken van de spuit tijdens de injectie resulteren in een lijnvormige tumor, die groter kan worden dan tumoren die door een correcte injectie zijn gegenereerd. Injectie in de juiste tepel van de melkklier is ook cruciaal, aangezien plaatsing in de bovenbuik tepel de echocardiografische beoordeling tijdens latere stadia van tumorontwikkeling kan belemmeren. Handmatig tellen van de cellen in de suspensie en grondig mengen vóór injectie worden aanbevolen om ervoor te zorgen dat elke muis een vergelijkbaar aantal cellen ontvangt, waardoor variatie in tumoromvang aan het einde van het protocol wordt geminimaliseerd. Wanneer wekelijkse bloedafname vereist is, moet het afgenomen volume zorgvuldig worden gecontroleerd, omdat muizen fragieler worden na behandeling met doxorubicine. Een maximaal totaal bloedvolume van 50 µL bij elk afnamepunt wordt aanbevolen, aangezien grotere volumes de mortaliteit tijdens het protocol kunnen verhogen. De frequentie en het volume van de bloedafname moeten bovendien voldoen aan de lokale ethische vereisten voor dieren en de richtlijnen van de institutionele dierfaciliteit. Het vervangen van het afgenomen bloedvolume door een equivalent volume fysiologisch zoutoplossing, subcutaan toegediend, kan helpen bij het compenseren van het vochtverlies na bloedafname.

Om deze dox-procedure te vergelijken, stelde een onlangs gepubliceerde review over diermodellen voor AIC vast dat de meeste preklinische modellen (88%) herhaalde injecties van Dox gebruikten en uitkomstmaten (vaak via echocardiografie) enkele weken later bepaalden29. In de meeste artikelen werd het gebruik van de C57Bl/6J-stam gerapporteerd (73,8%), waarschijnlijk vanwege de robuustheid en de lage kosten29. Helaas negeerde een aanzienlijk aantal studies de impact van een tumor op de biologie van het dier voordat AC's werden geïnjecteerd17,29. Slechts 46 van de 736 studies rapporteerden modellen met tumoren, waarvan er 12 de 4T1-cellijn (triple-negatieve borstkanker-achtig) in Balb/c-muizen gebruikten, en slechts één een model van borstkanker in C57Bl/6J-muizen was (specifieker EGFR2-positieve borstkanker-achtig)29. Een andere studie maakte gebruik van C57Bl/6J met een EGFR-2-positieve borstkanker-achtige tumor, maar liet geen tumorgroei toe vóór de start van de chemotherapie, wat het translationele aspect van dit model beperkt32.

Xenograftmodellen met gebruik van immuundeficiënte muizen maken het gebruik van menselijke tumorcellijnen mogelijk, maar missen een functioneel immuunsysteem. Dit beperkt de studie naar mechanismen van immuun-gemedieerde cardiotoxiciteit en vormt een belangrijke beperking gezien de groeiende relevantie van cardiotoxiciteit gerelateerd aan immuuncheckpointremmers. Grote diermodellen komen op in het veld van de cardio-oncologie, maar zullen altijd de nadelen hebben van hoge kosten en beperkte mogelijkheden voor genetische modificatie44. In vitro en 2D/3D menselijke celgebaseerde systemen (bijv. uit menselijke iPSC afgeleide cardiomyocyten, cardiale organoïden) maken high-throughput mechanistische en toxicologische screening mogelijk, maar kunnen de geïntegreerde fysiologie van het hele organisme (hemodynamiek, neurohormonale regulatie, immuun-interactie) die door in vivo modellen wordt gevangen, niet nabootsen. Vergeleken met deze benaderingen biedt dit syngene, immuuncompetente, tumordragende model een klinisch relevantere context om de interactie tussen tumorlast en door chemotherapie geïnduceerde cardiotoxiciteit te bestuderen, ten koste van een grotere biologische variabiliteit, een hogere mortaliteit bij sommige stammen en een lagere throughput dan eenvoudigere in vitro of niet-tumordragende in vivo modellen.

AC-cardiotoxiciteitsmodellen zonder tumor, die tot nu toe het meest zijn gebruikt, bieden een hoge reproduceerbaarheid, lage kosten en eenvoudigere echocardiografische en overlevingsbeoordelingen, maar vangen de systemische effecten van tumorlast, kankergeassocieerde ontsteking en cachexie op het hart niet op, welke in toenemende mate worden erkend als relevante confounders van cardiotoxiciteit bij patiënten17,45. Bovendien kunnen de metabole herprogrammering van het hart en bijgevolg de contractiele functie ervan worden beïnvloed door uitgescheiden oncometabolieten, zoals D-2-hydroxyglutaraat of succinaat14. Daarom is de aanwezigheid van de tumor vóór de chemotherapie essentieel indien een cardio-oncologisch model wordt gebouwd voor biochemische analyse van het hart met behulp van diverse omics (bijvoorbeeld proteomics en metabolomics). Er is ook enig bewijs dat de tumor op zichzelf duidelijke hartdisfunctie kan induceren, hoewel dit in de literatuur niet consistent is. Terwijl sommige modellen een nadelig effect van tumorinoculatie op de FS of elektrische conductieparameters aantoonden, hebben anderen gevonden dat de aanwezigheid van de tumor muizen beschermde tegen de remodellering geïnduceerd door een transversale aortaconstrictie11,13,46. Afhankelijk van de voorlopige hypothese zijn ook dieren zonder tumor nodig. Zij vormen de enige setting waarin het directe cardiotoxische effect van het chemotherapeuticum kan worden geïsoleerd van de storende invloed van de tumor zelf, een essentiële voorwaarde voor het vaststellen van causaliteit en het ontrafelen van drugspecifieke werkingsmechanismen. Deze dieren zullen dienen als controles voor het effect van de antikankertherapie en de interactie daarvan met de tumor op de cardiotoxiciteit. Zonder deze vergelijking zou het onmogelijk zijn om te ontrafelen welk component van het waargenomen hartfenotype attributable is aan het geneesmiddel, aan de tumor, of aan hun interactie. Dit onderscheid is cruciaal, niet alleen voor mechanistisch begrip, maar ook voor het rationele ontwerp van cardioprotectieve strategieën. Het is daarom belangrijk om te erkennen dat elk van deze modellen verschillende en complementaire wetenschappelijke vragen beantwoordt en dat geen enkel model alleen voldoende is om de complexiteit van de klinische cardio-oncologie volledig te recapituleren; een gecombineerd of sequentieel gebruik van beide is vaak vereist om robuuste mechanistische en translationele conclusies te trekken.

In dit protocol werd cardiotoxiciteit gedefinieerd volgens de 2022 ESC-richtlijnen voor cardio-oncologie, waarin matige asymptomatische hartdisfunctie gerelateerd aan kankertherapie wordt gedefinieerd als een afname van de linkerventrikelejectiefractie (LVEF) met >10% met een LVEF tussen 40% en 49%16. Echter is voor een nauwkeurige kwantificering van de LVEF een 3D-module op het echografieapparaat vereist39. Om een onjuiste beoordeling van de systolische hartfunctie te voorkomen en om een eenvoudig protocol te behouden dat kan worden geïmplementeerd in laboratoria die gebruikmaken van oudere echografieapparatuur, werd bij voorkeur FS gebruikt als marker voor hartdisfunctie. Deze is correct en eenvoudig te verkrijgen via M-mode analyse bij muizen, met dezelfde criteria als gesteld door de ESC. Met dit protocol voldoet 90% van de overlevende muizen aan de criteria voor cardiotoxiciteit, waardoor het een sterke kandidaat is voor toekomstige translationele studies. Het cardiotoxische effect van Dox werd bevestigd via macroscopische evaluatie (afname van het hartgewicht) in Balb/c-muizen. Er is hier geen tumor-only groep bij C57Bl/6-muizen opgenomen; daarom is er voor deze stam nog geen vergelijking beschikbaar. Bovendien induceerde de dosis Dox bij C57Bl/6-muizen zonder tumor veranderingen die consistent zijn met eerdere literatuur over de mechanismen van anthracycline-cardiotoxiciteit: verhoogde atrofie, oxidatieve stress en apoptose19,20.

Echter, modernere variabelen die bij patiënten worden gebruikt, zoals speckle-tracking global longitudinal strain (GLS), werden hier om technische redenen niet gekwantificeerd. Indien dit lokaal haalbaar is, zou het kwantificeren van GLS van toegevoegde waarde zijn, aangezien dit over het algemeen als gevoeliger wordt beschouwd voor het detecteren van vroege hartschade23. Circulerende cardiale biomarkers zoals troponine kunnen ook worden beoordeeld om de zekerheid van de detectie van cardiotoxiciteit te verhogen; echter kan de hoeveelheid plasma die traditioneel voor deze analyses bij muizen vereist is, een beperkende factor zijn vanwege het lage totale bloedvolume van deze dieren. Bovendien kan de fragiliteit van deze dieren na Dox-behandeling de mortaliteitspercentages tijdens of na bloedafname verhogen. Een laatste beperkende factor is de gevoeligheid van deze assays voor dergelijke biomarkers, wat de interpretatie vaak kan bemoeilijken.

Hoewel alle echografie-acquisities door dezelfde ervaren experimentator werden uitgevoerd, werd een hoge week-tot-week variatie bij dezelfde Balb/c-muizen waargenomen, zelfs zonder behandeling. Dit kan worden verklaard door de gevoeligheid van deze stam voor ketamine-anesthesie47. Inderdaad werden aanvankelijk hoge mortaliteitscijfers opgemerkt tijdens procedures met anesthesie, waardoor weinig dieren het einde van het protocol bereikten, wat leidde tot een verlaging van de gebruikte dosis ketamine van 80 mg/kg naar 40 mg/kg voor Balb/c-muizen. Wanneer men kijkt naar de overlevingsgrafieken van Balb/c met Dox, is te zien dat er enige mortaliteit optreedt op het moment van anesthesie (wekelijkse echocardiografie), maar de meeste sterfgevallen treden op in de dierfaciliteit zonder dat er een actieve procedure plaatsvindt, wat benadrukt dat Dox de belangrijkste factor is bij de mortaliteit bij deze muizen. Desondanks is het belangrijk om rekening te houden met anesthesiegerelateerde sterfte bij het interpreteren van overlevingsgrafieken voor dit model bij het vergelijken van twee of meer stammen. Om het risico op anesthesiegerelateerde sterfte te verminderen, zou echocardiografie ook bij bewuste muizen kunnen worden uitgevoerd, maar dit vereist training en acclimatisatie voordat de muizen in het protocol worden opgenomen. Wat betreft Dox, bereikte zelfs bij verlaagde doses bijna de helft van de Balb/c-muizen het einde van het protocol niet. De inductie van cardiotoxiciteit met nog lagere doses Dox zou kunnen worden geprobeerd, met het risico dat het aantal dieren dat aan de criteria voor cardiotoxiciteit voldoet, afneemt. Een andere strategie zou kunnen zijn om het dier meer tijd te geven om te herstellen na elke Dox-injectie; dit is hier niet gedaan, maar er is in de literatuur bewijs voor een verbeterde overleving29.

De waarnemingen die zijn gedaan tijdens het opzetten van dit model — dat Balb/c-muizen gevoeliger zijn voor Dox dan C57Bl/6J-muizen, en dat vrouwtjes resistenter zijn tegen Dox dan mannetjes — komen overeen met eerdere literatuur29. Bovendien bevestigen de vergelijkbare en reproduceerbare resultaten die in beide muizenstammen zijn behaald verder de robuustheid van dit voorgestelde model. Door middel van matig hoge dagelijkse doses over een korte periode werden hoge cumulatieve doses bereikt, wat resulteerde in hoge graden van cardiotoxiciteit met een hoge overleving. Het opzetten van een borstkankermodel (PY8119 is een triple-negatieve borstkanker-achtige lijn) in C57Bl/6J zal van groot nut zijn voor verdere studies, aangezien deze muizen een van de belangrijkste genetische achtergronden vertegenwoordigen voor transgene modellen34. Het hoge succespercentage van tumorinoculaties, wat de effectiviteit van de gekozen injectiemethode ondersteunt, is eveneens veelbelovend voor dit model. Daarnaast opent de hoge Dox-tolerantie van deze muizen de deur naar langere studies met Dox-herhaalprikkels om de frequente klinische situatie van secundaire kanker of metastase na te bootsen. Tot slot maakt het protocol voor orgaanafname de collectie mogelijk van alle solide organen, tumoren en hun interstitiële vloeistof, evenals het beenmerg en het stroma daarvan, wat een zeer grondige analyse van het model mogelijk maakt.

Dit model kent enkele beperkingen. Vanwege het pragmatische ontwerp en om invasieve chirurgie te vermijden, kan de precieze locatie van de tumor (d.w.z. de juiste melkklier in plaats van subcutaan vet) niet nauwkeurig worden gecontroleerd met een subcutane injectie, wat van groot belang kan zijn afhankelijk van de wetenschappelijke vraag die wordt onderzocht48. Als een nauwkeurige injectie op de plek van de kanker nodig is, kan uitgebreidere chirurgie geschikter zijn voor het uitvoeren van een orthotope injectie, hoewel dit vooral van belang lijkt te zijn als er een biochemische analyse van de tumor is gepland, aangezien volume, latentietijd en incidentie vergelijkbare resultaten geven ongeacht de injectiemethode48. Men zou ook kunnen aanvoeren dat het gebruik van alleen AC's niet perfect correleert met de klinische situatie, waarbij patiënten vaak combinatieregimes ontvangen, bijvoorbeeld cyclofosfamide of cisplatine. Dit zou inderdaad het volgende ontwerp voor dit protocol kunnen zijn; echter moet de dosisadaptatie voor elke gebruikte chemotherapie zorgvuldig worden uitgevoerd. Bovendien blijft een mortaliteit van meer dan 50% bij Balb/c-muizen 3 weken na de start van de Dox-behandeling zeer hoog; dosisreductie zou de overleving kunnen verbeteren, mogelijk ten koste van een minder uitgesproken cardiotoxiciteit. Ook moet met betrekking tot de in dit model gebruikte doses worden opgemerkt dat deze hoger zijn dan de doses die tegenwoordig gebruikelijk zijn bij mensen, wat het translationele potentieel van dit model kan beperken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen belangenverstrengeling is met betrekking tot het manuscript.

Dankbetuigingen

Hartelijke dank aan het team van de dierfaciliteit voor hun hulp bij de dagelijkse monitoring van het dierenwelzijn. Dank aan Léanne Borges, Elias Ait Assa en Clémence Chabaud voor de hulp bij het opstellen van het dierprotocol. Voor de schenking van de PY8119-cellen bedanken wij Dr Julie Helft van de INSERM Unit 932. Bijzondere dank gaat uit naar Dr Sylvain Provost en zijn student Mel Gavens voor hun hulp bij de bioluminescentie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4T1Luc-cellenATCCCRL-2539
DoxorubicinepoederKlinische wetenschap23214-92-8
EchocardiograafVisual SonicsVEVO LT-200
LuciferinePerkin Elmer E1605
NylongaasMerckNY2002500
PhotonImager OptimaBioSpace Lab
PY8119-cellenGift van Dr. Julie Helft

Referenties

  1. Meijers WC, et al. Heart failure stimulates tumor growth by circulating factors. Circulation. 2018;138(7):678-691.
  2. de Wit S, et al. Pressure overload-induced cardiac hypertrophy stimulates tumor growth in tumor-prone Apc(Min) mice. Circ Heart Fail. 2023;16(9):e010740.
  3. Avraham S, et al. Early cardiac remodeling promotes tumor growth and metastasis. Circulation. 2020;142(7):670-683.
  4. Langier Goncalves I, et al. Heart failure promotes cancer progression in an integrin β1-dependent manner. Int J Mol Sci. 2023;24(24):17367.
  5. Koelwyn GJ, et al. Myocardial infarction accelerates breast cancer via innate immune reprogramming. Nat Med. 2020;26(9):1452-1458.
  6. Wong J, Soh CH, Wang B, Marwick T. Long-term risk of heart failure in adult cancer survivors: a systematic review and meta-analysis. Heart. 2024;110(19):1188-1195.
  7. Kuiper JG, et al. Risk of heart failure among colon and rectal cancer survivors: a population-based case-control study. ESC Heart Fail. 2022;9(4):2139-2146.
  8. Mamidanna R, Nachiappan S, Bottle A, Aylin P, Faiz O. Defining the timing and causes of death amongst patients undergoing colorectal resection in England. Colorectal Dis. 2016;18(6):586-593.
  9. Armstrong GT, et al. Aging and risk of severe, disabling, life-threatening, and fatal events in the Childhood Cancer Survivor Study. J Clin Oncol. 2014;32(12):1218-1227.
  10. Herrmann J. Adverse cardiac effects of cancer therapies: cardiotoxicity and arrhythmia. Nat Rev Cardiol. 2020;17(8):474-502.
  11. Kelm NQ, Straughn AR, Kakar SS. Withaferin A attenuates ovarian cancer-induced cardiac cachexia. PLoS One. 2020;15(7):e0236680.
  12. Graca FA, et al. Progressive development of melanoma-induced cachexia differentially impacts organ systems in mice. Cell Rep. 2023;42(1):111934.
  13. Xiong S, et al. Development of an efficient mice model of cancer-associated cardiac cachexia. Anim Models Exp Med. 2025; 8(11):1960-1970.
  14. Karlstaedt A, Moslehi J, de Boer RA. Cardio-onco-metabolism: metabolic remodelling in cardiovascular disease and cancer. Nat Rev Cardiol. 2022;19(6):414-425.
  15. Murphy KT. The pathogenesis and treatment of cardiac atrophy in cancer cachexia. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2016;310(4):H466-H477.
  16. Lyon AR, et al. 2022 ESC Guidelines on cardio-oncology developed in collaboration with the European Hematology Association (EHA), the European Society for Therapeutic Radiology and Oncology (ESTRO) and the International Cardio-Oncology Society (IC-OS). Eur Heart J. 2022;43(41):4229-4361.
  17. Ghigo A, et al. Update on preclinical models of cancer therapy-related cardiac dysfunction: challenges and perspectives. A scientific statement of the Heart Failure Association (HFA) of the ESC, the ESC Council of Cardio-Oncology, and the European Association of Preventive Cardiology. Eur J Heart Fail. 2025;27(6):1028-1046.
  18. Cagnazzo R, et al. Mismatch between preclinical cardio-oncology and clinical oncology research. JACC CardioOncol. 2025;7(6):770-773.
  19. Mattioli R, et al. Doxorubicin and other anthracyclines in cancers: activity, chemoresistance and its overcoming. Mol Aspects Med. 2023;93:101205.
  20. Martins-Teixeira MB, Carvalho I. Antitumour anthracyclines: progress and perspectives. ChemMedChem. 2020;15(11):933-948.
  21. Fabiani I, Chianca M, Cipolla CM, Cardinale DM. Anthracycline-induced cardiomyopathy: risk prediction, prevention and treatment. Nat Rev Cardiol. 2025;22(8):551-563.
  22. Rivero-Santana B, et al. Anthracycline-induced cardiovascular toxicity: validation of the Heart Failure Association and International Cardio-Oncology Society risk score. Eur Heart J. 2025;46(3):273-284.
  23. Camilli M, Cipolla CM, Dent S, Minotti G, Cardinale DM. Anthracycline cardiotoxicity in adult cancer patients: JACC: CardioOncology state-of-the-art review. JACC CardioOncol. 2024;6(5):655-677.
  24. Díaz-Guerra A, et al. Anthracycline cardiotoxicity induces progressive changes in myocardial metabolism and mitochondrial quality control. JACC CardioOncol. 2024;6(2):217-232.
  25. Omland T, et al. Sacubitril-valsartan and prevention of cardiac dysfunction during adjuvant breast cancer therapy: the PRADA II randomized clinical trial. Circulation. 2025: 152(16):1136-1145.
  26. Henriksen PA, et al. Multicenter, prospective, randomized controlled trial of high-sensitivity cardiac troponin I-guided combination angiotensin receptor blockade and beta-blocker therapy to prevent anthracycline cardiotoxicity: the Cardiac CARE trial. Circulation. 2023;148(21):1680-1690.
  27. Sobiborowicz-Sadowska AM, Kamińska K, Cudnoch-Jędrzejewska A. Neprilysin inhibition in the prevention of anthracycline-induced cardiotoxicity. Cancers (Basel). 2023;15(1):312.
  28. Stansfeld A, et al. Pharmacological strategies to reduce anthracycline-associated cardiotoxicity in cancer patients. Expert Opin Pharmacother. 2022;23(14):1641-1650.
  29. Li M, et al. Optimizing dose selection for doxorubicin-induced cardiotoxicity in mice: a comprehensive analysis of single and multiple-dose regimens. Eur J Pharmacol. 2025;1003:177883.
  30. Gambardella J, et al. Infiltrating macrophages amplify doxorubicin-induced cardiac damage: role of catecholamines. Cell Mol Life Sci. 2023;80(11):323.
  31. Chen Y, et al. Cysteine imaging reveals early redox dysregulation and identifies gnetol as a ferroptosis-modulating agent in doxorubicin cardiotoxicity. Redox Biol. 2026;92:104131.
  32. Luo W, et al. Critical role of the cGAS-STING pathway in doxorubicin-induced cardiotoxicity. Circ Res. 2023;132(11):321587.
  33. Mouse Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 2002;420(6915):520-562.
  34. Mekada K, Yoshiki A. Substrains matter in phenotyping of C57BL/6 mice. Exp Anim. 2021;70(2):145-160.
  35. Yin L, Duan JJ, Bian XW, Yu SC. Triple-negative breast cancer molecular subtyping and treatment progress. Breast Cancer Res. 2020;22(1): doi.org/10.1186/s13058-020-01296-5.
  36. Akbay EA, et al. D-2-hydroxyglutarate produced by mutant IDH2 causes cardiomyopathy and neurodegeneration in mice. Genes Dev. 2014;28(5):479-490.
  37. Springer J, et al. Prevention of liver cancer cachexia-induced cardiac wasting and heart failure. Eur Heart J. 2014;35(14):932-941.
  38. Herndon ME, et al. The highly metastatic 4T1 breast carcinoma model possesses features of a hybrid epithelial/mesenchymal phenotype. Dis Model Mech. 2024;17(9):dmm050771.
  39. Lindsey ML, Kassiri Z, Virag JAI, De Castro Brás LE, Scherrer-Crosbie M. Guidelines for measuring cardiac physiology in mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2018;314(4):H733-H752.
  40. Zacchigna S, et al. Towards standardization of echocardiography for the evaluation of left ventricular function in adult rodents: a position paper of the ESC Working Group on Myocardial Function. Cardiovasc Res. 2021;117(1):43-59.
  41. Assad N, et al. Crosstalk between circulating DPP3 and immune cells in the context of cardio-systemic stress. iScience. 2026;29(3):115114.
  42. Motulsky HJ. GraphPad Statistics Guide. 2016. http://www.graphpad.com/guides/prism/10/statistics/index.htm.
  43. Garcia-Elcano L, et al. Accurate estimation of interobserver variability in echocardiography segmentation measured from 35 experts and impact on derived clinical metrics. Eur Heart J Cardiovasc Imaging. 2025;26(Suppl 1): jeae333.044.
  44. Medina-Hernandez D, et al. SGLT2i therapy prevents anthracycline-induced cardiotoxicity in a large animal model by preserving myocardial energetics. JACC CardioOncol. 2025;7(2):171-184.
  45. Asnani A, et al. Preclinical models of cancer therapy-associated cardiovascular toxicity: a scientific statement from the American Heart Association. Circ Res. 2021;129(1):e21–e34.
  46. Awwad L, Shofti R, Haas T, Aronheim A. Tumor growth ameliorates cardiac dysfunction. Cells. 2023;12(14):1853.
  47. Levin-Arama M, et al. Subcutaneous compared with intraperitoneal ketamine-xylazine for anesthesia of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2016;55(6):794-800.
  48. Fleming JM, Miller TC, Meyer MJ, Ginsburg E, Vonderhaar BK. Local regulation of human breast xenograft models. J Cell Physiol. 2010;224(3):795-806.

Herprints en machtigingen

Tags

Cardio-oncologiemodelanthracycline-cardiotoxiciteitborsttumormuizendoxorubicinebehandelingcardiale echografietumorbioluminescentielinkerventrikelfunctietumordragende muizenpreklinische cardiotoxiciteit

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.