Protocol voor gestandaardiseerde beoordeling van systemische microvasculaire functie in menselijke cutane microcirculatie met behulp van laserspeckle contrastbeeldvorming

Summary

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde, niet-invasieve methode voor het beoordelen van de systemische microvasculaire functie in menselijke cutane microcirculatie met behulp van laserspeckle contrast imaging gecombineerd met farmacologische iontoforese en fysiologische stimuli om microvasculaire reactiviteit in klinische onderzoeksomgevingen te evalueren.

Abstract

Laser speckle contrast imaging (LSCI) is een hoogresolutie, niet-invasieve optische techniek die realtime, full-field visualisatie van microvasculaire bloedperfusie mogelijk maakt. Dit protocol presenteert een gestandaardiseerde methodologie voor het evalueren van de systemische microvasculaire functie in menselijke cutane microcirculatie met behulp van LSCI. Omdat metingen die met deze techniek worden verkregen zeer gevoelig zijn voor omgevings- en fysiologische verstoringen, legt het protocol de nadruk op strikte standaardisatieprocedures om reproduceerbaarheid en experimentele betrouwbaarheid te verbeteren. Het protocol beschrijft essentiële omgevingsmaatregelen, waaronder stabilisatie van kamertemperatuur bij 23°C ± 1°C, positionering van deelnemers, acclimatisatieprocedures en het minimaliseren van externe interferentie tijdens beeldverkenning. De methodologie integreert LSCI met twee complementaire provocerende manoeuvres om cutane microvasculaire reactiviteit te evalueren. Post-occlusieve reactieve hyperemie wordt gebruikt om geïntegreerde microvasculaire reactiviteit te beoordelen, terwijl iontoforese-gedreven farmacologische uitdagingen worden ingezet om de endotheelfunctie te evalueren. Specifiek wordt acetylcholine toegediend om endotheelafhankelijke vasodilatatie te beoordelen, en natriumnitroprusside om endotheelonafhankelijke vasodilatatie te beoordelen. Dit stapsgewijze gevisualiseerde protocol is bedoeld om de adoptie van gestandaardiseerde LSCI-methodologieën in klinische en translationele onderzoeksomgevingen te vergemakkelijken. De aanpak is met succes toegepast om microvasculaire aandoeningen te identificeren bij verschillende klinische aandoeningen, waaronder resistente hypertensie, diabetes en coronaire hartziekte. Door reproduceerbare en niet-invasieve beoordeling van microvasculaire reactiviteit mogelijk te maken, biedt deze methodologie een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van systemische vasculaire gezondheid, het monitoren van de ziekteprogressie en het evalueren van de effectiviteit van interventies gericht op de microvasculatuur.

Introduction

Het primaire doel van dit protocol is het bieden van een gestandaardiseerde, reproduceerbare methodologie voor het beoordelen van systemische microvasculaire functie en reactiviteit met behulp van laser speckle contrast imaging (LSCI) in combinatie met fysiologische en farmacologische provocatieve manoeuvres. De microcirculatie, bestaande uit terminale bloedvaten—arteriolen, haarvaten en venulen—kleiner dan ongeveer 100 μm in diameter¹, is de primaire plaats van metabole uitwisseling en een cruciale factor van perifere vasculaire weerstand². Endotheeldisfunctie in deze kleine vaten gaat vaak vooraf aan macrovasculaire veranderingen en dient als een vroege biomarker voor hart- en vaatziekten, waaronder hypertensie, diabetes en coronaire hartziekte³. Belangrijk is dat microvasculaire aandoeningen weliswaar aanzienlijk bijdragen aan schade aan het eindorgaan, maar samenwerken met macrovasculaire atherosclerose en systemische chronische ontsteking binnen een multifactorieel ziekteproces. Daarom is niet-invasieve beoordeling van microvasculaire reactiviteit essentieel voor zowel vroege diagnose als monitoring van therapeutische effectiviteit in translationeel onderzoek⁴.

De reden om de cutane microcirculatie als surrogaat voor systemische vasculaire gezondheid te gebruiken ligt in de toegankelijkheid ervan en de rol als representatief venster naar de wereldwijde endotheelfunctie ^5,6. Traditioneel wordt laser Doppler flowmetrie (LDF) beschouwd als de gouden standaard voor niet-invasieve cutane beoordeling⁷. LDF wordt echter beperkt door een slechte ruimtelijke resolutie omdat het puntgewijze metingen levert die zeer gevoelig zijn voor de inherente heterogeniteit van huidperfusie⁸. Daarentegen biedt LSCI aanzienlijke voordelen door fullfield, realtime visualisatie van weefselperfusie te bieden met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie⁹. Door het interferentiepatroon dat door laserlichtverstrooiing wordt gegenereerd te analyseren, maakt LSCI gelijktijdige beoordeling van meerdere vaatgebieden mogelijk zonder fysiek contact of exogene kleurstoffen^10,11.

Binnen de bredere literatuur is de integratie van LSCI met door iontoforese gedreven farmacologische provocaties, zoals acetylcholine (ACh) en natriumnitroprusside (SNP), gevalideerd als een robuuste benadering voor het evalueren van endotheelafhankelijke en endotheelonafhankelijke vasodilaterende routes^12,13. Bovendien biedt post-occlusieve reactieve hyperemie (PORH) een geïntegreerde beoordeling van microvasculaire reactiviteit waarbij endotheelmediatoren, neurogene sensorische zenuwen en de functie van de vaatvormige gladde spieren^betrokken zijn. Ondanks de voordelen vereist de hoge gevoeligheid van LSCI voor omgevings- en fysiologische variabiliteit strikte standaardisatieprocedures. Dit protocol pakt deze uitdagingen aan door kritieke milieucontroles te beschrijven, waaronder stabilisatie van kamertemperatuur bij 23°C ± 1°C en gestandaardiseerde participatiepositionering, om de reproduceerbaarheid van intrasubject en intersubject^te verbeteren. Deze methodologie is geschikt voor klinische en translationele onderzoekers die een methodologisch onderbouwde, niet-invasieve benadering zoeken voor het onderzoeken van microvasculaire pathofysiologie bij diverse patiëntenpopulaties.

Protocol

Alle procedures waarbij menselijke deelnemers betrokken waren, werden uitgevoerd volgens de ethische normen van het Nationaal Instituut voor Cardiologie (Ministerie van Volksgezondheid, Brazilië), in overeenstemming met nationale regelgeving (Het Nationaal Ethisch Comité voor Onderzoek – INAEP – volgens Wet nr. 14.874, mei 2024) en de Verklaring van Helsinki (herzien 2024).

1. Voorbereiding van deelnemers en milieucontrole

1. Stabiliseer de examenomgeving
   1. Stabiliseer de temperatuur van de onderzoekskamer (RT; 23°C ± 1°C) met een speciale thermostaat om een stabiele thermische omgeving te behouden.
   2. Monitor de RT elke 10 minuten met een gekalibreerde digitale thermometer (nauwkeurigheid van ±0,1°C).
      OPMERKING: De cutane microvasculaire functie is zeer gevoelig voor temperatuurschommelingen.
2. Bereid de deelnemer voor op de beoordeling
   1. Instrueer deelnemers om 24 uur lang niet te roken, geen cafeïne of alcohol te drinken en intensieve oefeningen te doen vóór de beoordeling.
   2. Geef de deelnemers de instructie om minstens 2 uur te vasten vóór de beoordeling, terwijl je water toelaat.
      OPMERKING: Het onthouden van cafeïne en intensieve lichaamsbeweging minimaliseert externe interferentie met de huidige vaattonus. Cafeïne, als adenosinreceptorantagonist, en lichaamsbeweging kunnen, door effecten op sympathische drift en thermoregulatie, aanhoudende veranderingen in microvasculaire reactiviteit veroorzaken die enkele uren na blootstelling^{aanhouden 4,14}.
3. Positioneer de deelnemer voor beeldverwerving
   1. Plaats de niet-dominante arm van de deelnemer op hartniveau met lichaamskussens om de onderarm horizontaal en stabiel te houden.
   2. Gebruik het buikoppervlak van de onderarm als beoordelingsplaats.
      OPMERKING: De niet-dominante onderarm minimaliseert de invloed van lateraliseerde vasculaire remodellering die samenhangt met dagelijkse activiteiten. De ventrale onderarm biedt gunstige anatomische eigenschappen voor optische beeldvorming, waaronder een lagere haardichtheid en verminderde huiddikte, waardoor signaalartefacten worden geminimaliseerd en de reproduceerbaarheid van iontoforetische geneesmiddelafgifte verbetert.
4. Sta cardiovasculaire stabilisatie toe
   1. Houd de deelnemer minstens 20 minuten in rust voordat je begint met de microvasculaire opnames.
   2. Beperk de deelnemer tijdens de rustperiode van praten, het bewegen van het onderzochte ledemaat of het gebruik van elektronische apparaten.
      OPMERKING: De stabilisatieperiode minimaliseert autonome en cardiovasculaire fluctuaties vóór de basisverwerving.
5. Minimaliseer bewegingsartefacten
   1. Plaats de niet-dominante onderarm van de speler op een vacuümkussensysteem.
   2. Pas het kussen aan om het buikoppervlak van de onderarm tijdens het hele beeldverkrijgen stabiel horizontaal te houden.
6. Bereid het huidoppervlak voor
   1. Selecteer huidplekken zonder zichtbaar haar voor alle metingen.
   2. Verwijder haar 24 uur voor de beoordeling met een chirurgische tondeuse wanneer nodig.
      VOORZICHTIG: Gebruik geen scheermes voor haarverwijdering, omdat huidirritatie microvasculaire metingen kan verstoren.
7. Meet arteriële bloeddruk
   1. Kies de manchetmaat op basis van de armomtrek van de deelnemer.
   2. Voer drie opeenvolgende bloeddrukmetingen uit met een gekalibreerd geautomatiseerd oscillometrisch apparaat met een interval van 1 minuut tussen de metingen.
   3. Laat de eerste meting weg en bereken het gemiddelde van de laatste twee metingen om de gemiddelde arteriële druk (MAP) te bepalen, volgens ESC/ESH en AHA cardiovasculaire richtlijnen.

2. LSCI-systeemopstelling en softwareconfiguratie

1. Bereid het LSCI-systeem voor
   1. Schakel het LSCI-systeem minstens 10 minuten voor beeldopname in om stabilisatie van de laserbron mogelijk te maken.
   2. Controleer de laserstabilisatie met behulp van de software-statusindicator voordat je met de opname begint.
2. Positioneer de laserkop
   1. Plaats de laserkop direct boven de onderarm van de deelnemer.
   2. Stel de laserkop precies 15 cm van het huidoppervlak af met behulp van het door de fabrikant geleverde afstandsmeetinstrument (Figuur 1A)
      OPMERKING: Het handhaven van een vaste acquisitieafstand zorgt voor optimale beeldscherpstelling en een consistent gezichtsveld tussen de deelnemers.
3. Configureer de acquisitiesoftware
   1. Start de beeldverwervingssoftware en maak een nieuw onderzoeksbestand aan.
   2. Voer de demografische informatie van de deelnemer en de eerder berekende MAP in.
      OPMERKING: Voeg gedetailleerde gebruiksinstructies voor de software en representatieve screenshots toe als aanvullend materiaal indien van toepassing.
4. Configureer de acquisitieparameters
   1. Stel de bemonsteringsfrequentie van de verwerving in op 1 beeld/s (1 Hz).
   2. Stel de ruimtelijke resolutie aan op ongeveer 0,1 mm/pixel voor het doelacquisitiegebied.
      OPMERKING: Een bemonsteringsfrequentie van 1 Hz biedt een passende balans tussen temporele resolutie en signaal-ruisverhouding, terwijl de hyperemische en farmacologische responskinetiek adequaat wordt vastgelegd.
5. Minimaliseer omgevingslichtinterferentie
   1. Voer een achtergrondruiscontrole of dark-frame subtractie uit volgens de systeemvereisten vóór beeldverwerving.
   2. Dim het kamerlicht en blokkeer het buitenzonlicht met verduisteringsgordijnen tijdens alle opnames wanneer donkere beelden niet beschikbaar zijn.
      OPMERKING: Gestandaardiseerde omgevingsverlichting minimaliseert optische interferentie en verbetert de reproduceerbaarheid van het signaal.
6. Definieer de interessegebieden (ROI's)
   1. Maak minstens drie circulaire ROI's van ongeveer 80 mm² op het live previewscherm binnen de acquisitiesoftware.
   2. Plaats twee ROI's boven de plaatsen van de iontoforese-elektrode en één ROI boven de PORH-beoordelingslocatie.
   3. Plaats alle ROI's op de ventrale onderarm, ongeveer 5 cm distaal van de antecubitale fossa, terwijl zichtbare oppervlakkige venen worden vermeden.
      OPMERKING: Het standaardiseren van het ROI-gebied minimaliseert de invloed van ruimtelijke heterogeniteit in cutane perfusie en vermindert randartefacten die geassocieerd zijn met medicijnafgiftekamers.
7. Verkrijg de basislijn perfusieregistratie
   1. Registreer de rustende cutane bloedperfusie gedurende 5 minuten voor vasculaire stimulatie.
   2. Monitor het realtime perfusiesignaal en bevestig de afwezigheid van door beweging veroorzaakte pieken tijdens de basislijnverwerking.
   3. Definieer basisstabiliteit als een perfusiesignaalvariatie van <10% gedurende een continu interval van 2 minuten.
8. Schakel cutane vasculaire conductantie (CVC) analyse in
   1. Voer de MAP van de deelnemer in in de acquisitiesoftware.
   2. Schakel de automatische berekening van CVC in in de software-instellingen in.
9. Perfusie- en conductantiegegevens van het record
   1. Configureer de software om CVC automatisch te berekenen door realtime perfusiewaarden (APU) te delen door MAP.
   2. Noteer zowel ruwe perfusie-eenheden (PU) als berekende CVC-waarden gelijktijdig gedurende het hele protocol.
      
      OPMERKING: Het uitdrukken van microvasculaire perfusie als CVC minimaliseert de verstorende invloed van systemische bloeddrukfluctuaties en maakt betrouwbaardere vergelijkingen mogelijk tussen deelnemers met verschillende hemodynamische profielen.

Figuur 1. Experimentele opstelling voor de beoordeling van cutane microvasculaire perfusie met behulp van laser speckle contrast imaging (LSCI) gecombineerd met iontoforese. (A) Representatieve experimentele opstelling gebruikt voor cutane microvasculaire beoordeling met behulp van laserspecklecontrastbeeldvorming en iontoforese van vasodilatoragenten. (B) Vertegenwoordigende microvasculaire perfusierespons tijdens transdermale iontoforetische toediening van cumulatieve doses acetylcholine (ACh). (C) Representatief beeld van ACh-iontoforese. (D) Representatief beeld van een voertuig-bevattende besturingselektrode. Labels geven de volgende componenten aan: (1) beeldvormerkop; (2) iontoforese-geneesmiddelafgifte-elektroden; en (3) dispersieve elektrode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Iontoforese en farmacologische provocatie

1. Bereid de huid voor op iontoforese
   1. Maak de geselecteerde buikhuidplekken van de onderarm schoon met een alcoholvrije zoutoplossing of een milde huidreiniger.
   2. Dep de huid voorzichtig droog voordat je de elektrode plaatst.
      OPMERKING: Vermijd overmatige mechanische stimulatie tijdens de huidvoorbereiding, omdat mechanisch geïnduceerde vasodilatatie de basismetingen kan verstoren.
2. Plaats de medicijnafgifte-elektroden
   1. Bevestig twee medicijnafgifte-elektroden aan de voorbereide huidplaatsen met behulp van dubbelzijdige kleefschijfjes (Figuur 1A).
   2. Houd een afstand tussen de elektroden van ongeveer 5 cm om elektrische stroominterferentie te voorkomen.
3. Bereid de ACh-oplossing voor
   1. Vul de eerste elektrodekamer met 200 μL van een 2% ACh-oplossing, bereid in 0,9% zoutoplossing^14,15.
   2. Gebruik de ACh-elektrode om endotheelafhankelijke vasodilatie te evalueren.
      OPMERKING: De geselecteerde medicijnconcentratie is geoptimaliseerd om een robuuste, dosisafhankelijke microvasculaire respons te induceren, terwijl niet-specifieke irritatie en galvanische artefacten worden geminimaliseerd.
4. Bereid de SNP-oplossing voor
   1. Vul de tweede elektrodekamer met 200 μL van een 2% SNP-oplossing, bereid in 0,9% zoutoplossing.
   2. Gebruik de SNP-elektrode om endotheelonafhankelijke vasodilatie te evalueren.
      VOORZICHTIG: SNP is lichtgevoelig. Bescherm de oplossing tegen lichtblootstelling met aluminiumfolie en gebruik de oplossing binnen 4 uur na bereiding om farmacologische stabiliteit te behouden.
      OPMERKING: De geselecteerde SNP-concentratie bevordert stabiele plateau-vasodilatatie terwijl niet-specifieke elektrische effecten worden geminimaliseerd.
5. Verwijder opgesloten luchtbellen
   1. Controleer de elektrodekamers op gevangen luchtbellen voordat je de huid aanhecht.
   2. Verwijder zichtbare luchtbellen door zachtjes op de elektrodekamer te tikken of met een steriele plastic spuittip te gebruiken.
      OPMERKING: luchtbellen kunnen de stroomstroom belemmeren en zorgen voor niet-homogene medicijnafgifte.
6. Plaats de referentie-elektrode
   1. Bevestig de referentie (neutrale) elektrode ongeveer 15 cm proximaal van de medicijnafgifte-elektroden met geleidende gel of lijm (Figuur 1A).
   2. Bevestig een stabiel elektrodecontact voordat je de iontoforese start.
      OPMERKING: De ruimtelijke scheiding tussen farmacologische en PORH-beoordelingsgebieden minimaliseert verstorende interacties en voorkomt overlap van de door ACh geïnduceerde axonreflexflair met het PORH-meetgebied.
7. Verbind het iontoforesesysteem
   1. Verbind alle elektroden met de iontoforese-afgifte-eenheid voordat je ze daadwerkelijk aanbrengt.
   2. Bevestig de polariteit van de elektrode voordat je het protocol start (anodaal voor ACh; kathodaal voor SNP).
      VOORZICHTIG: Onjuiste elektrodepolariteit kan de efficiëntie van de geneesmiddelafgifte aantasten en de vasculaire responsen veranderen.
8. Dien het iontoforese-stroomprotocol toe
   1. Geef zes incrementele stroomdoses van 30, 60, 90, 120, 150 en 180 μA voor beide farmacologische middelen.
   2. Breng elke huidige dosis 10 seconden aan.
      OPMERKING: Het incrementele stroomprotocol maakt het mogelijk een dosis-responscurve op te bouwen en vergemakkelijkt de beoordeling van microvasculaire gevoeligheid en plateauresponsen¹¹. De combinatie van lage stroomamplitudes en korte stimulatieintervallen minimaliseert niet-specifieke galvanische vasodilatatie.
9. Houd het interval tussen stimulaties aan
   1. Houd een interval van 60 seconden aan tussen opeenvolgende stroomtoepassingen.
   2. Monitor het perfusiesignaal tijdens de stabilisatieperiode tussen de doses.
      OPMERKING: Het geselecteerde interval maakt stabilisatie van de microvasculaire respons mogelijk, terwijl lokale geneesmiddelafgifte wordt gehandhaafd zonder systemische effecten.
10. Registreer de microvasculaire respons
    1. Neem het microvasculaire perfusiesignaal continu op tijdens alle iontoforese-stimulaties.
    2. Ga minstens 10 minuten verder met opnemen na de laatste huidige toepassing om de maximale plateaurespons vast te leggen. Een representatieve dosisafhankelijke respons wordt weergegeven in Figuur 2A.

Figuur 2. Representative opnames van cutane microvasculaire perfusie tijdens iontoforese en post-occlusieve reactieve hyperemie (PORH). (A) Representatieve registratie van cutane microvasculaire bloedflux verkregen met LSCI tijdens iontoforese van 2% ACh, toegediend met toenemende anodale stromen van 30, 60, 90, 120, 150 en 180 μA met intervallen van 10 seconden, gescheiden door 1 minuut. (B) Representatieve opname verkregen tijdens PORH-beoordeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Post-occlusieve reactieve hyperemie (PORH)

1. Plaats de occlusiemanchet
   1. Plaats een standaard pneumatische manchet (breedte ongeveer 12 cm) op de bovenarm van hetzelfde ledemaat dat voor de LSCI-opname wordt gebruikt.
   2. Plaats de manchet proximaal bij de geselecteerde microvasculaire onderzoeksplaats.
2. Definieer de PORH-beoordelingsregio
   1. Creëer een derde ROI op de ventrale onderarm naast de plaatsen van de iontoforese-elektrode.
   2. Plaats het ROI binnen een behandelingsvrij huidgebied om farmacologische interferentie te voorkomen.
      OPMERKING: Houd ruimtelijke scheiding tussen farmacologische stimulatieplaatsen en het PORH-beoordelingsgebied om onafhankelijke vasculaire responsen te behouden.
3. Verkrijg de PORH-baseline-opname
   1. Registreer de rustende cutane perfusie continu gedurende 5 minuten vóór arteriële afsluiting.
   2. Monitor het basisperfusiesignaal om de stabiliteit van het signaal te bevestigen vóór het opblazen van de manchet.
4. Induceer arteriële occlusie
   1. Blaas de pneumatische manchet snel op binnen < 5 seconden met een automatische inflator of handmatige opblaaslamp.
   2. Verhoog de manchetdruk tot 50 mmHg boven de eerder gemeten systolische bloeddruk (SBP) van de deelnemer.
      VOORZICHTIG: Bevestig volledige arteriële occlusie voordat de occlusieperiode wordt gestart, omdat onvolledige occlusie de hyperemische respons kan verstoren.
5. Behoud de occlusieperiode
   1. Houd arteriële occlusie continu gedurende precies 3 minuten.
   2. Controleer volledige occlusie door te bevestigen dat het LSCI-signaal afneemt naar een biologisch nulplateau (< 10 APU).
      OPMERKING: Het biologische nulsignaal weerspiegelt de resterende beweging van bloedcellen onafhankelijk van gerichte bloedstroom, inclusief Brownse beweging.
6. Maak de occlusiemanchet los
   1. Laat de druk van de manchet direct los met behulp van het snel-uitlaatventiel.
   2. Laat onmiddellijke herstel van de bloedstroom mogelijk om de reactieve hyperemische respons te starten.
7. Noteer de hyperemische respons
   1. Ga minstens 5 minuten na het loslaten van de boei door met het opnemen van LSCI.
   2. Vang de piekperfusierespons en de daaropvolgende terugkeer naar de basisperfusieniveaus. Een representatieve PORH-respons is weergegeven in Figuur 2B.
8. Kwantificeer de PORH-respons
   1. Bereken de piek-CVC binnen de beeldacquisitiesoftware.
   2. Bereken het oppervlak onder de kromme (AUC) van het hyperemische responssignaal met behulp van de analysesoftware.

5. Data-extractie en statistische analyse

1. Open en verifieer de geregistreerde gegevens
   1. Open de opgenomen verwervingsbestanden met behulp van de beeldanalysesoftware.
   2. Controleer dat alle vooraf gedefinieerde ROI's correct gepositioneerd blijven boven de bijbehorende meetplaatsen.
      OPMERKING: Herpositionerings-ROI's alleen wanneer bewegingsartefacten of verwervingsdrift de oorspronkelijke plaatsing in gevaar brengen.
2. Definieer de analyse-intervallen
   1. Identificeer de specifieke analyse-intervallen op de perfusie- en CVC-trendgrafieken.
   2. Selecteer een continu 60 seconden basisinterval direct voorafgaand aan de eerste vasculaire prikkel.
   3. Selecteer de laatste 30 seconden van elk interval van 60 seconden na iontoforesestimulatie om de microvasculaire respons van het plateau vast te leggen.
      OPMERKING: Definieer basisstabiliteit als een variatiecoëfficiënt (CV) < 5% in het perfusiesignaal om de invloed van vasomotorische oscillaties en bewegingsartefacten vóór data-analyse te minimaliseren.
3. Identificeer PORH-responsvariabelen
   1. Identificeer het biologische nulsignaal tijdens de arteriële occlusiefase van het PORH-protocol.
   2. Identificeer direct na het loslaten van de manchet de piek CVC-waarde.
4. Bereken de intervalgemiddelde waarden
   1. Bereken de gemiddelde CVC-waarde voor elk vooraf gedefinieerd analyse-interval met behulp van de beeldanalysesoftware.
   2. Controleer de afwezigheid van bewegingsartefacten voordat je de definitieve berekende waarden bevestigt.
5. Organiseer de geëxtraheerde gegevens
   1. Exporteer of transcrieer handmatig de gemiddelde ruwe PU en gemiddelde CVC-waarden in een gestructureerd spreadsheet.
   2. Organiseer de dataset volgens studiegroepen en vasculaire prikkels, waaronder acetylcholine, natriumnitroprusside en PORH-reacties.
      OPMERKING: Houd consistente bestandsnamen en deelnemersidentificatiecodes aan gedurende de hele gegevensverwerking om transcriptiefouten te minimaliseren.
6. Bereken secundaire vasculaire uitkomsten
   1. Bereken de procentuele toename ten opzichte van de basisperfusie of CVC-waarden om de vasculaire reactiviteit te bepalen.
   2. Bereken de AUC wanneer nodig voor secundaire eindpuntanalyse.
7. Voer statistische analyses uit
   1. Analyseer de gegevens met behulp van statistische analysesoftware.
      OPMERKING: Voeg representatieve screenshots of workflow-instructies toe voor softwarematige analyses als aanvullend materiaal indien van toepassing.
   2. Beoordeel de gegevensverdeling
      1. Beoordeel de datanormaliteit met behulp van de Shapiro-Wilk-test.
      2. Druk normaal verdeelde gegevens uit als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).
      3. Druk niet-normaal verdeelde gegevens uit als mediaan en interkwartielbereik (IQR).
   3. Vergelijk microvasculaire responsen
      1. Vergelijk tweegroepsdatasets met een onafhankelijke t-test wanneer aan normaliteitsaannames wordt voldaan.
      2. Vergelijk meerdere groepen met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door Tukey's post-hoc test.
   4. Definieer statistische significantiecriteria
      1. Definieer statistische significantie als p < 0,05.
      2. Behandel ontbrekende gegevens veroorzaakt door bewegingsartefacten met behulp van paargewijze verwijdering of uitsluiting van de getroffen analyse.
         OPMERKING: Pas dezelfde strategie voor ontbrekende data consequent toe in alle studiegroepen om de analytische integriteit te behouden.

Results

Een succesvolle toepassing van dit protocol levert een stabiele basislijn op, gevolgd door duidelijke en onderscheidende microvasculaire responsen op elke vasculaire stimulus. In een technisch succesvol experiment toont de basisopname een stabiel perfusiesignaal aan met minimale fluctuaties, gedefinieerd als een SD van < 10% van het gemiddelde signaal. Tijdens iontoforese van ACh en SNP wordt een stapsgewijze toename van de APU verwacht, wat een dosisafhankelijke vasodilatatie weerspiegelt. Een succesvolle PORH-respons wordt gekenmerkt door een snelle afname van de perfusie tot een stabiel biologisch nulpunt tijdens arteriële occlusie, gevolgd door een scherpe hyperemische piek direct na het loslaten van de manchet, waarbij bij gezonde proefpersonen doorgaans waarden worden bereikt die meerdere keren boven het basisniveau liggen. Figuur 1A illustreert de experimentele opstelling die wordt gebruikt voor cutane microvasculaire beoordeling met LSCI en iontoforese. Figuur 1B–1D tonen representatieve iontoforese-responsen en elektrodepositionering. Figuur 2A toont een representatieve dosisafhankelijke microvasculaire respons tijdens ACh-iontoforese, terwijl Figuur 2B een representatieve PORH-respons toont.

Suboptimale of technisch onsuccesvolle opnames worden vaak gekenmerkt door signaalinstabiliteit of bewegingsgerelateerde artefacten. Hoogfrequente pieken of abrupte basislijnfluctuaties duiden doorgaans op beweging van deelnemers of onvoldoende stabilisatie van het vacuümkussenondersteuningssysteem. Een verminderde of afwezige vasodilaterende respons tijdens iontoforese bij een verder gezonde deelnemer duidt vaak op slecht contact tussen elektrode en huid of gevangen luchtbellen in de elektrodekamer, wat leidt tot een verminderde elektrische stroomafgifte. Figuur 3 toont een representatief voorbeeld van een onaanvaardbare opname die wordt gekenmerkt door bewegingsgerelateerde signaalinstabiliteit.

Figuur 3. Representatief voorbeeld van een onaanvaardbare microvasculaire perfusieregistratie tijdens iontoforese. Een representatieve registratie van cutane microvasculaire bloedstroom verkregen met LSCI tijdens ACh-iontoforese, wat signaalinstabiliteit en bewegingsgerelateerde artefacten aantoont die ongeschikt zijn voor kwantitatieve analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Het niet bereiken van een stabiel biologisch nulpunt tijdens de PORH-occlusiefase duidt op onvolledige arteriële occlusie, vaak veroorzaakt door verkeerde positie van de manchet of onvoldoende druk van de manchet. Onder deze omstandigheden wordt de daaropvolgende hyperemische respons afgezwakt en ongeschikt voor betrouwbare interpretatie.

Succesvol uitgevoerde protocollen genereren reproduceerbare perfusie- en CVC-curves. Het maximale CVC-plateau dat tijdens SNP-iontoforese wordt waargenomen, weerspiegelt de totale vasodilaterende capaciteit en de vaatstructurele integriteit, terwijl de ACh-gemedieerde respons voornamelijk de endotheliaal-afhankelijke microvasculaire functie weerspiegelt. Gestandaardiseerde vergelijking van deze vasculaire responsen maakt differentiatie mogelijk tussen patronen die consistent zijn met behouden en aangetaste microvasculaire functie. Representatieve kwantitatieve microvasculaire parameters verkregen van gezonde jonge proefpersonen en patiënten met resistente arteriële hypertensie worden weergegeven in Tabel 1.

Microvasculaire parameter	Eenheid	Gezonde jonge controles (n = 25)	Patiënten met resistente arteriële hypertensie (n = 50)	p-waarde
Baseline CVC	APU/mmHg	0,37 ± 0,13	0,29 ± 0,12	0.01
ACh-geïnduceerde piek-CVC	APU/mmHg	0,67 ± 0,23	0,51 ± 0,19	0.004
SNP-geïnduceerde piek-CVC	APU/mmHg	0,60 ± 0,21	0,41 ± 0,17	0.0003
PORH Peak CVC	APU/mmHg	0,87 ± 0,18	0,60 ± 0,16	< 0,0001

Tabel 1: Vertegenwoordigende microvasculaire reactiviteitsparameters bij gezonde jonge proefpersonen en patiënten met resistente arteriële hypertensie. Waarden worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). P-waarden werden berekend met een onafhankelijke T-test voor vergelijkingen tussen groepen. Afkortingen: ACh, acetylcholine; SNP, natriumnitroprusside; PORH, post-occlusieve reactieve hyperemie; CVC, cutane vasculaire geleiding; APU, willekeurige perfusie-eenheden. De gegevens zijn ongepubliceerde resultaten uit het laboratorium van de auteurs.

Discussion

LSCI biedt een gestandaardiseerde en niet-invasieve benadering voor het evalueren van systemische microvasculaire functies met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. In vergelijking met LDF, dat beperkt is tot enkelvoudige metingen en zeer gevoelig is voor de ruimtelijke heterogeniteit van huidperfusie, maakt LSCI volledige beeldvorming en gelijktijdige beoordeling van meerdere ROI's mogelijk. Deze eigenschap verbetert de reproduceerbaarheid van de metingen aanzienlijk en vermindert de variatiecoëfficiënt in klinische microvasculaire studies. Bovendien minimaliseert het contactvrije karakter van LSCI lokale drukartefacten die vaak worden geassocieerd met probe-gebaseerde technieken, waardoor de geschiktheid voor herhaalde beoordelingen in translationele en klinische onderzoeksomgevingen wordt vergroot.

Een cruciaal onderdeel van dit protocol is de normalisatie van perfusiegegevens naar MAP om CVC te berekenen. Omdat cutane bloedperfusie sterk wordt beïnvloed door systemische perfusiedruk, kan de interpretatie van alleen ruwe APU leiden tot aanzienlijke verwarring, vooral bij populaties met veranderde hemodynamische profielen zoals hypertensie of dyslipidemie. Om deze reden raadt het protocol aan om zowel ruwe PU als genormaliseerde CVC-waarden te rapporteren om de interpretatie van microvasculaire functie onder verschillende fysiologische en pathologische omstandigheden te verbeteren. Een ander cruciaal aspect van het protocol is strikte omgevings- en deelnemerstabilisatie, waaronder kamertemperatuurbeheersing, minimalisatie van bewegingsartefacten en gestandaardiseerde deelnemerpositionering, die allemaal essentieel zijn voor reproduceerbare opnames.

Verschillende beperkingen van LSCI moeten ook worden meegenomen. De techniek evalueert voornamelijk oppervlakkige cutane microcirculatie op een diepte van ongeveer 0,5–1 mm en vertegenwoordigt daarom mogelijk niet volledig diepere vasculaire bedden. Daarnaast kunnen huidpigmentatie en omgevingslichtinterferentie de signaal-ruisverhouding beïnvloeden, wat het belang van de in dit protocol beschreven omgevingsmaatregelen versterkt. Een andere beperking is het gebruik van een enkele basislijn MAP-meting voor CVC-berekening gedurende de hele procedure. Hoewel de systemische bloeddruk kan fluctueren tijdens de ongeveer 40 minuten durende opnameperiode, werd herhaalde manchetopblazing bewust vermeden omdat herhaalde bloeddrukmetingen sympathische activatie- en bewegingsartefacten kunnen veroorzaken die het laser-specklesignaal verstoren. Toekomstige studies die continue niet-invasieve hemodynamische monitoring integreren, kunnen de fysiologische interpretatie van microvasculaire geleidingsmetingen verder verbeteren.

Kritieke protocolstappen zijn onder andere omgevingsstabilisatie, bewegingscontrole, elektrodepositionering en volledige arteriële occlusie tijdens PORH. Onstabiele basisopnames worden vaak veroorzaakt door beweging van deelnemers of onvoldoende rustperiodes en kunnen worden geminimaliseerd door het vacuümkussensysteem te herstabiliseren en de acclimatisatieperiode te verlengen. Stompte iontoforetische responsen wijzen vaak op slecht elektrode-huidcontact of gevangen luchtbellen in de afgiftekamer; Zorgvuldig vullen van de kamer en het herpositioneren van elektroden lossen deze problemen meestal op. Het niet bereiken van biologische nul tijdens de PORH-occlusiefase weerspiegelt meestal een onvolledige arteriële occlusie veroorzaakt door onvoldoende cuff-opblazing of verkeerde cuffpositie. Onder deze omstandigheden wordt de resulterende hyperemische respons afgezwakt en ongeschikt voor betrouwbare interpretatie.

De integratie van fysiologische en farmacologische provocaties vormt een belangrijke kracht van dit protocol omdat deze benaderingen complementaire aspecten van microvasculaire regulatie beoordelen. PORH biedt een geïntegreerde fysiologische beoordeling van microvasculaire reactiviteit waarbij endotheel-, neurogene en vasculaire gladde spiermechanismen worden geactiveerd door tijdelijke ischemie en schuifspanning¹⁶. Daarentegen maakt iontoforese selectieve evaluatie mogelijk van endotheelafhankelijke en endotheliaal-onafhankelijke vasodilaterende routes¹⁵. ACh beoordeelt endotheelafhankelijke stikstofoxide-gemedieerde vasodilatie, terwijl SNP, een directe stikstofoxidedonor, de responsiviteit van de vasculaire gladde spieren onafhankelijk van endotheelsignaal^{beoordeelt 15}. Vergelijkende interpretatie van deze responsen maakt het mogelijk om te onderscheiden tussen functionele endotheelstoornissen en structurele microvasculaire remodellering. Dit onderscheid is vooral relevant bij veroudering, resistente hypertensie, diabetes en chronische metabole ziekten, waar verstoorde endotheelsignaaloverdracht en microvasculaire verdunning kunnen samengaan^14,17.

Samenvattend biedt dit gestandaardiseerde LSCI-protocol een reproduceerbare en translationeel relevante methode voor de niet-invasieve evaluatie van de menselijke microvasculaire gezondheid. De combinatie van farmacologische iontoforese met fysiologische ischemie-reperfusietesten maakt gedetailleerde karakterisering van endotheliale en structurele vasculaire functies mogelijk, terwijl experimentele variabiliteit wordt geminimaliseerd door rigoureuze omgevings- en hemodynamische standaardisatie. Gezien de gevoeligheid voor het opsporen van vroege microvasculaire disfunctie bij diverse cardiovasculaire en metabole aandoeningen, is deze aanpak een waardevol instrument voor klinisch onderzoek, longitudinale monitoring en therapeutische evaluatie in de translationele vasculaire geneeskunde.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Automated Oscillometric BP Monitor	Omron Healthcare	HEM-7120	Used for baseline mean arterial pressure (MAP) assessment (3 measurements)
Digital Calibrated Thermometer	Delta OHM	HD2301.0	Accuracy ± 0.1°C for room temperature monitoring
Dispersive (Reference) Electrode	Perimed AB	PF 384	Large surface-area neutral electrode
Drug Delivery Electrodes	Perimed AB	PF 383 / LI 611	Non-invasive iontophoresis chambers (approximately 80 mm²)
Iontophoresis Power Controller	Perimed AB	PeriIont Microvascular Diagnosis System	Dual-channel current controller (up to 200 µA)
Laser Speckle Contrast Imaging (LSCI) System	Perimed AB	PeriCam PSI NR	High-resolution blood perfusion imager
Medical-grade Vacuum Cushion	AB Germa	N/A	Used for stable forearm positioning at heart level
One Hand Operated Vacuum Pump	AB Germa	N/A	Used for evacuation of vacuum cushions
Rapid Cuff Inflator	D.E. Hokanson, Inc.	E20 Rapid Cuff Inflator	Used for standardized 3 min arterial occlusion
Reagents and Consumables
Acetylcholine Chloride (ACh)	Sigma-Aldrich	A6625	Endothelium-dependent vasodilator prepared at 2%
Alcohol Prep Pads	Becton Dickinson	326895	70% isopropyl alcohol pads for skin preparation
Deionized Water	Sigma-Aldrich	38796	Used for final rinsing of electrodes
Sodium Chloride (0.9% Saline)	Local Supplier	N/A	Solvent for drug preparation and skin cleaning
Sodium Nitroprusside (SNP)	Sigma-Aldrich	S0501	Endothelium-independent vasodilator prepared at 2%
Sterile Gauze	Local Supplier	N/A	Used for drying the skin surface after cleaning
Software
Perfusion Analysis Software	Perimed AB	PIMSoft	Software for LSCI data acquisition and ROI analysis
Statistical Analysis Software	GraphPad Software	Prism 10	Used for dose-response curve fitting and area under the curve (AUC) calculation