Dit protocol demonstreert transvesicale Ho:YAG laserablatie om een reproduceerbaar rattenmodel van blaasnekfibrose te creëren voor het bestuderen van door thermisch letsel veroorzaakte fibrotische remodellering en therapeutische interventies.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Holmium: YAG laser-ondersteunde inductie van de contractuur van de blaasnek in een rattenmodel
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Blaasnekcontractuur (BNC) is een fibrotische vernauwing van de blaasuitgang en een uitdagende complicatie na transurethrale resectie van de prostaat (TURP). Bestaande diermodellen maken vaak gebruik van extravesicale ligatie of chemische cauterisatie, die de door thermische schade veroorzaakte fibrose die na endoscopische chirurgie ontstaat niet adequaat reproduceren en mogelijk beperkte reproduceerbaarheid vertonen. Hier beschrijven we een rattenmodel van blaashalsfibrose geïnduceerd door transvesicale Holmium:YAG-laser (Ho:YAG-laser) ablatie van de blaasnek. Na een kleine laparotomie en cystotomie op de onderliggende middenlijn wordt een 200 μm Ho:YAG laservezel in het blaaslumen gebracht onder directe visualisatie. Laserenergie wordt in contactmodus geleverd bij 1,0 J en 10 Hz gedurende 5 seconden per punt op de 3- en 9-uursposities van de blaashals, wat overeenkomt met 50 J per punt en 100 J per dier. Vier weken later ontwikkelen behandelde dieren grove blaasvergroting, vernauwing van de blaasnek, verdikking van de blaaswand en histologisch bewijs van fibrotische remodellering, waaronder verhoogde collageenafzetting en verhoogde collageenexpressie type I en III. Dit protocol biedt een praktisch model dat lokale door thermische schade veroorzaakte littekens bij de blaasuitlaat nabootst. Omdat vrouwelijke ratten worden gebruikt en functionele urodynamische tests niet zijn uitgevoerd in de huidige studie, is het model het beste geschikt voor het bestuderen van blaas-halsfibrose en structurele remodellering in plaats van volledig mannelijke BNC na prostaatchirurgie te reproduceren. Het model kan nuttig zijn voor het bestuderen van de fibrotische mechanismen van BNC en voor preklinische evaluatie van antifibrotische of reconstructieve interventies.
Inleiding
Blaashalscontractuur (BNC) is een fibrotische vernauwing van de blaasnek die vaak voorkomt na transurethrale procedures, met name TURP 1,2,3. De pathologische basis is overmatige littekenvorming en collageenafzetting na weefselletsel en abnormale wondgenezing 4,5,6. Omdat BNC kan leiden tot aanhoudende ontlastingsstoornissen, terugkerende interventies en aanzienlijke morbiditeit, is een reproduceerbaar experimenteel model nodig om de pathogenese en behandeling ervan te onderzoeken7.
Verschillende diermodellen zijn gebruikt om blaasuitlaatobstructie of periurethrale fibrose te bestuderen, waaronder extravesicale ligatie van de proximale urethra8 en andere open chirurgische benaderingen9. Hoewel deze modellen urinewegobstructie en detrusorhypertrofie kunnen veroorzaken, reproduceren ze niet specifiek de gelokaliseerde thermische schade waarvan wordt gedacht dat die postoperatieve BNC na endoscopische chirurgie initieert. Daarnaast zijn het anatomische doel en de mate van verwonding vaak moeilijk te standaardiseren, wat de variabiliteit tussen dieren kan vergroten.
Een ideaal BNC-gerelateerd model moet aan drie criteria voldoen: het moet zich richten op de anatomische blaasnek, gecontroleerde thermische schade reproduceren vergelijkbaar met die veroorzaakt door endoscopische energieapparatuur, en betrouwbaar fibrotische vernauwing genereren met acceptabele chirurgische complexiteit. Om aan deze behoeften te voldoen, hebben we een transvesicale Ho:YAG laser-gebaseerd protocol ontwikkeld bij vrouwelijke ratten. Vrouwelijke dieren werden geselecteerd om chirurgische blootstelling te vergemakkelijken en om blaas-nek-specifieke thermische schade en fibrotische remodellering te isoleren zonder interferentie door prostaatweefsel. Met directe intravesicale visualisatie maakt deze methode een nauwkeurige levering van laserenergie mogelijk aan het halsmucosa en submucosa van de blaas, en veroorzaakt reproduceerbare fibrotische vernauwing van de blaasuitgang.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens protocollen goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Ethical Committee voor Experimentele Dierenwelzijn van het Beijing Institute of Traditional Chinese Medicine (Goedkeuringsnummer BJTCM-R-2025-03-02). Dieren werden onder standaardomstandigheden gehuisvest met ad libitum toegang tot voedsel en water. In het huidige protocol werden in totaal 16 ratten gebruikt, waaronder 8 ratten in de controlegroep zonder chirurgie en 8 ratten in de met laser behandelde Ho:YAG-groep. Twee dieren uit de met laser behandelde Ho:YAG-groep stierven postoperatief. Geen extra dieren werden uitgesloten vanwege perforatie, hevige bloedingen of mislukte modelinductie.
1. Preoperatieve voorbereiding
- Bereid farmaceutische kwaliteit meloxicam voor perioperatieve analgesie (Figuur 1A), het inademingsanesthesiesysteem voor kleine dieren (Figuur 1B), het Ho:YAG lasersysteem met een 200 μm laservezel (Figuur 1C), steriele microchirurgische instrumenten (Figuur 1D), 8-0 absorbeerbare gevlochten hechtingen (gecoate polyglycolzuur, PGA) voor cystotomiesluiting, 4-0 absorberbare gevlochten polyglactine 910 hechtingen voor huidsluiting, steriele zoutoplossing, steriele gordijnen, steriele wattenstaafjes en steriel glijmiddel (Figuur 1E).
- Induceer anesthesie met 3%–4% isofluraan in zuurstof in een inductiekamer, en handhaaf de anesthesie met 1,5%–2,5% isofluraan via een neuskegel tijdens de operatie.
- Pas de concentratie aan volgens de ademhalingsfrequentie en het goedgekeurde institutionele dierprotocol. Controleer voldoende anesthesiediepte door het ontbreken van de teenknellingsreflex vóór de incisie en beoordeel de diepte van de anesthesiekwaliteit gedurende de procedure.
- Knip de vacht ver vanaf de onderbuik zodat de draperie eventuele resterende vacht bedekt en contact tussen instrumenten en los haar voorkomt.
- Desinfecteren van het chirurgische veld met afwisselend povidonjodium en 70% isopropylalcoholscrubs; voer drie toepassingen van elke oplossing uit voordat je wordt gedraperd.
- Plaats het dier in rugligging op een verwarmingskussen dat op 37 °C staat en handhaaf de steriele omstandigheden gedurende de hele procedure.
- Als blaasvulling of intraoperatieve identificatie van de blaashals nodig is, smeer dan een kleine steriele urethrale katheter of canule met steriele glijmiddel, breng deze voorzichtig via de urethrale gang in de blaas en breng langzaam steriele zoutoplossing in. Vermijd geforceerde invoeging of overvulling. Verwijder of sluit de katheter vast volgens de geplande chirurgische blootstelling.
2. Blootstelling van de blaas
- Maak een incisie in de onderste middenlijn van 3–4 cm onder steriele omstandigheden (Figuur 2A).
- Met fijne pincetten en microscissoren verdeel je het subcutane weefsel en open je de linea alba om de peritoneale holte binnen te gaan.
- Voorzichtig de urineblaas naar buiten brengen met een atraumatische tang (Figuur 2B).
- Identificeer de blaashals als de overgang tussen de blaasbasis en de proximale urethra.
- Plaats een stompe sonde onder de blaashals om zachte ondersteuning te bieden en het doelgebied te stabiliseren (Figuur 2C).
3. Transvesicale Ho:YAG laserablatie
- Verspreid de blaas met steriele zoutoplossing totdat de blaaswand matig gespannen wordt. Vermijd overdistensie, die de anatomische herkenningspunten kan verhullen of de spanning op de cystotomieplaats kan verhogen.
- Maak een longitudinale cystotomie van 0,5 cm bij de voorste blaaskoepel met fijne microschaar (Figuur 2D).
- Breng de voorbereide 200-μm Ho:YAG laservezel via de cystotomie in het blaaslumen.
- Beweeg de vezel direct naar de blaasnek.
- Breng de vezeltip voorzichtig in direct contact met het slijmvlies van de blaasnek. Behoud contactmodus zonder zichtbare indruk van het weefsel; Zorg ervoor dat de afstand tussen tip en weefsel ongeveer 0 mm is tijdens de energietoevoer.
- Geef laserenergie af bij 1,0 J en 10 Hz gedurende 5 seconden op de 9-uurspositie (Figuur 3A) en herhaal op de 3-uurspositie (Figuur 3B). Deze instelling levert 50 J per punt en 100 J per dier, met een vermogen vastgesteld op 10 W over de dieren.
OPMERKING: Een succesvolle ablatie wordt aangeduid door uniforme mucosale bleeking en de vorming van een ondiepe mucosale tot submucosale krater zonder carbonisatie. - Houd de vezel stabiel tijdens de 5 seconden aanbrengen en voorkom dat de vezel tegen de muur wordt geduwd. Vermijd diepe kratervorming of perforatie van volledige dikte. Richt de vezel niet naar de ureterale openingen of de distale urethra.
- Verwijder de vezels en spoel het blaaslumen met steriele zoutoplossing om vuil te verwijderen en de hemostase te bevestigen.
- Sluit de cystotomie af met 2–3 onderbroken 8-0 absorberbare gevlochten hechtingen (gecoate PGA) op een waterdichte manier.
- Vul de blaas opnieuw met 0,5–1,0 ml steriele zoutoplossing om te bevestigen dat er geen lekkage uit de sluitingslijn is (Figuur 3C).
- Sluit de buikwand en huid in lagen (Figuur 3D).
4. Postoperatieve zorg
- Houd de rat op een warmtekussen totdat hij volledig hersteld is van de narcose.
- Dien meloxicam toe met 1 mg/kg subcutaan voor postoperatieve pijn en ga daarna één keer per dag gedurende 1–3 dagen door, of volgens het goedgekeurde dierprotocol.
- Houd het dier dagelijks minstens 7 dagen in de gaten op tekenen van pijn, stress, hematurie, urineretentie, wonddehiscence of infectie.
- Geef tijdens de vroege herstelperiode ondersteuning van hydratatie en zacht voedsel indien nodig.
5. Evaluatie van blaasnekcontractuur
- Laat de dieren na de operatie 4 weken herstellen om fibrotische remodellering van de blaashals mogelijk te maken.
- Aan het experimentele eindpunt euthanasen de dieren met een overdosis natriumpentobarbital (150 mg/kg, intraperitoneaal) of een andere methode goedgekeurd door het institutionele dierenprotocol, en bevestig de dood vóór de weefseloogst. Haal de blaas, blaashals en proximale urethra en bloc op.
- Open het exemplaar in de lengte en fotografeer de blaashals om een grove vernauwing te documenteren.
- Fixeer het weefsel in 4% paraformaldehyde bij 4 °C gedurende 24 uur, dehydrateer via gegradueerd ethanol, maak het schoon in xyleen, voeg het in paraffine en verkrijg seriële 4-μm dwarsdoorsneden door het blaashalsgebied.
- Kleurdoorsneden met hematoxyline en eosine, Masson's trichrome en picrosirius red volgens standaard histologische protocollen of de instructies van de fabrikant om het lumenvernauwen, de verdikking van de halswand van de blaas en collageenafzetting te evalueren.
- Voor immunohistochemie deparaffiniseer secties, voer antigeenoptrekking uit, blokkeer endogene peroxidase en niet-specifieke binding, incubeer secties met antilichamen tegen collageen type I en collageen type III, breng het juiste secundaire antilichaam aan, ontwikkel met chromogeen en contrasteer met hematoxyline.
OPMERKING: De antilichamen worden verdund volgens de aanbevelingen van de fabrikant. - Kwantificeer het lumenoppervlak en het collageen-positieve gebied met behulp van ImageJ/Fiji of vergelijkbare beeldanalysesoftware.
- Kalibreer de pixel-naar-micrometer schaal met behulp van de microscoopschaalbalk, bepaal handmatig het blaas-nek-lumen en het weefselgebied van interesse, en meet het lumengebied.
- Voor Massons trichrome kleuring past u een consistente kleurdrempel toe om blauwe collageenpositieve pixels binnen het interessegebied te identificeren.
- Bereken het collageen-positieve area-aandeel als collageen-positief area, gedeeld door het totale weefselarea.
- Voer metingen uit op vergelijkbare secties en velden van elk dier, en analyseer beelden op een blinde manier.
OPMERKING: Succesvolle modelinductie wordt ondersteund door het vernauwen van de grote blaasuitgang, samen met histologisch bewijs van concentrische fibrose en verhoogde collageenafzetting op de laesieplaats. Het operationele succespercentage was 6/8 in de Ho:YAG laserbehandelde groep, gebaseerd op de ontwikkeling van het verwachte bruto en histologisch fenotype.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Vier weken na de operatie vertoonden ratten die met de Ho:YAG-laser werden behandeld reproduceerbare grove en histologische veranderingen die overeenkomen met fibrotische vernauwing van de blaashals. In deze studie bestond de controlegroep zonder chirurgie uit 8 ratten, en de met een laser behandelde Ho:YAG-groep uit 8 ratten. 6 van de 8 behandelde dieren ontwikkelden het verwachte fenotype; Uitval bestond uit 2 postoperatieve sterfgevallen in de Ho:YAG laserbehandelde groep, zonder extr...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie hebben we een rattenmodel ontwikkeld van blaashalsfibrotische vernauwing met behulp van transvesicale Ho:YAG laserablatie. De belangrijkste kracht van deze methode is dat het gecontroleerde thermische schade veroorzaakt aan de anatomische blaasnek, gevolgd door progressieve fibrotische remodellering. Dit verschilt van traditionele extravesicale ligatiemodellen, die voornamelijk obstructie veroorzaken door externe compressie in plaats van intrinsieke littekenvorming
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China (nr. 82474255 voor H.R.) en het Onderzoeksprogramma van de Hebei Provincie Administratie van TCM (B2025018 voor H.R.).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Absorbable braided suture (coated PGA), 8-0 | Shanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., Ltd., Shanghai, China | R831 | |
| Anti-collagen I antibody, mouse monoclonal | Proteintech Group, Inc., Wuhan, China | 66761-1-Ig | |
| Anti-collagen III antibody, mouse monoclonal | Proteintech Group, Inc., Wuhan, China | 68320-1-Ig | |
| Coated Vicryl Plus suture (polyglactin 910), 4-0 | Ethicon, Inc. (Johnson & Johnson) | VCP773D | SH 26 mm ½-circle taper needle; violet braided; absorbable; Lot: RLMCJX |
| Hematoxyline en eosine (HE) kleuringskit | Servicebio, Wuhan, China | 2310005 | |
| Holmium-YAG Laser Systeem (LITHO) | Quanta System S.p.A, Italië | https://www.quantasystem.com/laser/litho/ | 1 J, 10 Hz, 10 W, 200 μm vezel |
| HRP-geconjugeerd geit anti-muis IgG secundair antilichaam | Boster, Wuhan, China | BA1050 | |
| Isofluraan | RWD | 2025010601 | |
| Masson's trichrome kleuringskit | Zhuhai Baso Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai, Guangdong, China | BA4079B | |
| Meloxicam Injectie | Qilu Animal Health, Shandong, China | E135H003 | |
| Paraformaldehyde (4%) | Servicebio, Wuhan, China | 2510H0070148 | |
| Picrosirius rood kleuringskit | Nanjing Senbeijia Biological Technology Co., Ltd., Nanjing, Jiangsu, China | 20250228 | |
| Veilige intraveneuze katheter, 24 G | Guangdong Lily Medical Technology Co., Ltd., Foshan, Guangdong, China | AD4-240827 | |
| Kleindier inhalatieanesthesiesysteem | RWD Life Science, Shenzhen, China | https://www.rwdstco.com/inhalation-anesthesia-solutions/ | Induceren met 3%–4% isofluraan in zuurstof |
Referenties
- Wu Y, et al. Analysis of risk factors for bladder neck contracture after transurethral endoscopic surgery for benign prostatic hyperplasia. Aging Male. 2024;27(1):2429456.
- Rassweiler J, et al. Complications of transurethral resection of the prostate (TURP)--incidence, management, and prevention. Eur Urol. 2006;50(5):969-79; discussion 980.
- Simhan J, et al. Bladder neck contracture. Transl Androl Urol. 2014;3(2):214-20.
- Browne BM, Vanni AJ. Management of urethral stricture and bladder neck contracture following primary and salvage treatment of prostate cancer. Curr Urol Rep. 2017;18(10):76.
- Pakshir P, Hinz B. The big five in fibrosis: macrophages, myofibroblasts, matrix, mechanics, and miscommunication. Matrix Biol. 2018;68-69:81-93.
- Li L, Zhao Q, Kong W. Extracellular matrix remodeling and cardiac fibrosis. Matrix Biol. 2018;68-69:490-506.
- Ren Y, et al. Bladder neck contracture: incidence, mechanisms, and therapeutic advances. Ann Med Surg (Lond). 2025;87(11):7378-7389.
- Mattiasson A, Uvelius B. Changes in contractile properties in hypertrophic rat urinary bladder. J Urol. 1982;128(6):1340-2.
- Igawa Y, et al. A rat model for investigation of spinal mechanisms in detrusor instability associated with infravesical outflow obstruction. Urol Res. 1993;21(4):239-44.
- Varkarakis IM, et al. Comparison of erbium:yttrium-aluminum-garnet and holmium:yttrium-aluminum-garnet lasers for incision of urethra and bladder neck in an in vivo porcine model. Urology. 2005;65(1):191-5.
- Hu X, et al. Clinical comparison of TURP, PVP and HoLEP for small volume BPH. Sci Rep. 2025;15(1):34751.
- Kang D, et al. Morphological characterization of tissue destruction according to the distance between holmium:YAG laser tip and tissue surface. Int Neurourol J. 2024;28(3):196-206.
- Zhang SL, Wong AW. A novel technique for atraumatic transurethral catheterisation of male rats. Biol Open. 2024;13(9).
- Kendall RT, Feghali-Bostwick CA. Fibroblasts in fibrosis: novel roles and mediators. Front Pharmacol. 2014;5:123.
- Kitta T, et al. Benefits and limitations of animal models in partial bladder outlet obstruction for translational research. Int J Urol. 2018;25(1):36-44.
- Wang Y, et al. Urethral orifice hyaluronic acid injections: a novel animal model of bladder outlet obstruction. BMC Urol. 2015;15:8.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
