Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Ervaringen delen over langetermijnoverleving in een niet-arterialiseerd ratlevertransplantatiemodel

115 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71650

⸱

22 mei 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Organ Transplantation Center, the Affiliated Hospital of Qingdao University, 2Institute of Organ Donation and Transplantation, Medical College of Qingdao University, 3Organ Transplant Center, Fujian Medical University Union Hospital

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Het doel van dit gepresenteerde protocol is om geoptimaliseerde chirurgische ervaring te delen voor het opzetten van een niet-arterialiseerd ratlevertransplantatiemodel, met specifieke focus op technische verfijningen die een langetermijnoverleving van dieren langer dan 100 dagen garanderen.

Samenvatting

Bij experimentele levertransplantatie is het rattenmodel de gouden standaard voor het onderzoeken van transplantatie-immunologie en metabole processen; Het reconstrueren van de uiterst fijne leverslagader (~0,5 mm) vormt echter een formidabele technische uitdaging. Om dit te omzeilen wordt het vereenvoudigde niet-arteriële ratlevertransplantatie (NArLT) model veel gebruikt. Helaas beperken ernstige galwegcomplicaties—zoals gallekkage en ischemische cholangitis—die ontstaan door arteriële deprivatie vaak de langetermijnoverleving van de ontvangers. Dit obstakel beperkt het onderzoek naar belangrijke onderwerpen, waaronder langdurige immunocompatibiliteit tussen gastheer en transplantatie en chronische afstoting. Hier presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor het NArLT-model dat kritieke technische verfijningen bevat om deze ischemische galwegletsels succesvol te overwinnen. Belangrijke verbeteringen zijn onder andere een aanzienlijk verkorte anhepatische fase, een "no-touch" galwegdissectietechniek, grondige spoeling van de galweginfectie en een geoptimaliseerde interne galwegstentmethode. Na de implementatie van deze verbeterde procedure overschreed de overlevingskans van de ontvanger 94% gedurende de 100-daagse observatieperiode. Uiteindelijk biedt dit geoptimaliseerde protocol een zeer reproduceerbaar en robuust platform om de mechanismen achter langdurige transplantatietolerantie te onderzoeken, waarmee de ontwikkeling van nieuwe therapeutische strategieën in transplantatiegeneeskunde wordt ondersteund.

Inleiding

Het model voor rattenlevertransplantatie dient als het meest gebruikte experimentele platform voor fundamenteel transplantatieonderzoek. De bredere toepassing wordt echter vaak belemmerd door een berucht steile leercurve, die de voortgang van latere experimentele studiesaanzienlijk kan belemmeren 1,2. Bovendien hebben conventionele modellen van rattenlevertransplantaties vaak last van suboptimaal chirurgisch succes en lage langetermijnoverlevingskansen. Door de chirurgische procedures kritisch te stroomlijnen, operatieve details zorgvuldig te verfijnen en vasculaire en galwegreconstructies uit te voeren onder directe visualisatie, kan de leercurve die bij dit complexe microchirurgische model hoort, aanzienlijk worden ingekorttot 3,4. Levertransplantatie blijft de enige genezende therapie voor leverziekte in een eindstadium, waardoor de oprichting van modellen voor rattenlevertransplantaties van grote betekenis is voor wetenschappelijk onderzoek 5,6.

Het niet-arteriële ratlevertransplantatie (NArLT) model biedt aanzienlijke voordelen in experimentele chirurgie: het omzeilt de formidabele uitdaging van microvasculaire arteriële anastomose, verkort de totale operatietijd en verkort de duur van de anesthesie voor de ratten. Ondanks het verlies van arteriële bloedtoevoer biedt de resulterende galwegrespons in dit model een uniek perspectief voor het onderzoeken van ischemische galwegletsels. Conventionele NArLT-modellen worden echter geassocieerd met een hoge postoperatieve galwegcomplicatie tot wel 30%, wat de langetermijnoverleving ernstig aantast. In het traditionele klassieke rattenlevertransplantatiemodel is de langetermijnoverlevingskans van de ontvanger minder dan 70%–85%8. Om dit aan te pakken, introduceert deze studie een geoptimaliseerd protocol met gebruik van een met heparine behandelde zachte galiaire stent. Door gebruik te maken van een "no-touch" galwegdissectietechniek om het behoud van het peribiliaire microvasculaire netwerk te maximaliseren, naast grondige galwegspoeling via koude perfusie, is deze aanpak gericht op het fundamenteel beperken van galwegcomplicaties door fysieke ondersteuning en ischemische bescherming9, waarmee uiteindelijk een robuust en stabiel platform wordt geboden voor langdurige immunologische monitoring.

Daarom zijn het maximaliseren van procedurele succespercentages en het verlengen van de overleving van ontvangers de primaire doelstellingen van elke technische innovatie in rattenlevertransplantatie. Het bereiken van deze doelen is een cruciale voorwaarde om de tijdige en ononderbroken voortgang van downstream experimenteel onderzoekte waarborgen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven en operaties in deze studie zijn goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Experimentele Dieren van de Qingdao Universiteit (nr. 20260301SD5020260401065). Doe er alles aan om het lijden van dieren te minimaliseren.

1. Preoperatieve voorbereiding

  1. Proefdieren
    1. Gebruik volwassen mannelijke Sprague–Dawley (SD) ratten, van 8–10 weken oud en met een gewicht van 220–250 g, als donoren. Zorg ervoor dat het gewicht van de ontvanger iets groter is dan dat van de donor, met een verschil binnen 50 g.
    2. Huisratten onder specifieke ziektevrije omstandigheden bij een gecontroleerde temperatuur van 22°C ± 2°C en een relatieve luchtvochtigheid van 50% ± 10%.
    3. Houd een licht/donker-cyclus van 12 uur aan met een kooidichtheid van 2–3 ratten per kooi.
    4. Geef een standaard laboratoriumdieet voor knaagdieren. Laat ratten minstens een week wennen aan de laboratoriumomgeving voorafgaand aan de chirurgische ingreep.
    5. Hecht dieren 12 uur voor de operatie. Sta ad libitum toegang tot water toe.
      OPMERKING: Vasten vóór de operatie helpt het risico op aspiratie tijdens de narcose te minimaliseren en voorkomt maagverwijding die de ademhalingsfunctie kan aantasten en de chirurgische blootstelling kan belemmeren.
  2. Chirurgische instrumenten en materialen
    1. Gebruik de instrumenten die nodig zijn voor transplantatiechirurgie zoals weergegeven in Figuur 1. Vermeld de details van de verbruiksartikelen die in de operatie zijn gebruikt in de Materiaaloverzicht.
    2. Selecteer 5F en 6F epidurale katheterscheden door de buitendiameter van de katheters af te stemmen op de fysiologische interne diameters van de doelvaten bij mannelijke SD-ratten van 220–250 g.
    3. Gebruik een 5F-mantel (ongeveer 1,67 mm) voor de portaalader (PV). Gebruik een 6F-omhulsel (ongeveer 2,00 mm) voor de infrahepatische inferior vena cava (IHIVC).
      OPMERKING: Kies de kathetergrootte op basis van een combinatie van anatomische standaarden en intraoperatieve visuele schatting onder een chirurgische microscoop. Voer realtime vergelijkingen uit tussen de buitendiameter van de katheter en het interne lumen van het doelvat. Een passende match wordt bereikt wanneer de katheter ongeveer 70%–80% van het vatenlumen inneemt, waardoor een soepele invoeging mogelijk is zonder de vatwand te overbelasten of overmatige speling achter te laten. Voor SD-ratten binnen het gespecificeerde gewichtsbereik kunnen vooraf gedefinieerde anatomische vatdiameters worden gebruikt voor de initiële groottekeuze, die intraoperatief moet worden aangepast op basis van individuele variatie. Operators moeten deze afstemming tussen vat en katheter vaststellen door middel van eerdere microchirurgische training.
    4. Voor SD-ratten van 8–10 weken oud kiezen 5F en 6F epidurale katheterhoeden als manchetten voor respectievelijk de PV en IHIVC (Figuur 2A).
    5. Bereid manchetten voor met een totale functionele lengte (buisvormige lichaam) van 2,0–2,5 mm. Houd een verlengingslengte van 3,0–4,0 mm aan voor het hanteren met de pincett.
    6. Klem de manchetwand vast met de kaken van de muggenpincet om een omtrekgroef te creëren, ongeveer 0,5–1,0 mm van de proximale rand van de manchet (zie Figuur 2A voor details). Houd een groefdiepte van ongeveer 0,1–0,2 mm om het stevig knopleggen en de daaropvolgende fixatie te vergemakkelijken.
    7. Zorg ervoor dat de groef voorkomt dat de 7-0 bevestigingsligatuur van het stijve katheteroppervlak glijdt.
    8. Knip een 22G intraveneuze katheter om een galstent te creëren met schuine of afgeschuinde uiteinden. Zorg voor een lengte van 5–7 mm.
    9. Ik geef de voorkeur aan een stentlengte van 7 mm. Pas de lengte aan op basis van anatomische variatie met het horizontale niveau van de rechter maagader als herkenningspunt. Schat de afstand van dit herkenningspunt tot het hepatische hilum om de keuze van de stentlengte te begeleiden.
    10. Verkort de stent (tot ongeveer 5–6 mm) als de geschatte afstand beperkt is of als er weerstand wordt ervaren tijdens het plaatsen. Zorg ervoor dat ongeveer 2–3 mm van de stent in de galgang kan worden ingebracht zonder te buigen, knikken of uitsteken.
    11. Week de stent in hepariniseerde zoutoplossing (100 IU/mL) bij kamertemperatuur (23°C ± 2°C). Houd de stent minimaal 30 minuten ondergedompeld vóór gebruik om intraluminale galstolling bij het plaatsen in het gallumen van de donor te voorkomen (Figuur 2A).
      OPMERKING: Bereid de manchet voor vóór de operatie en gebruik muggentangen om groeven in de manchetwand te maken, zodat knopen en fixatie na succesvolle cannulatie mogelijk worden. Zorg ervoor dat de uiteinden van de afgetrimde galwegstent niet te scherp zijn om perforatie van de galwegen te voorkomen. Controleer onder een chirurgische microscoop (10×–16× vergroting of de snijrand schoon is en vrij van scherpe plastic bramen; Als de punt er naaldachtig uitziet, bot hem dan iets met een microschaar. Gebruik tijdens de manipulatie alleen fijne, niet-getande micro-tangen om de stent te hanteren. Vermijd het toepassen van buitensporige externe kracht, zoals blijkt uit eventuele afvlakking, ovalisatie of knikken van het stentlumen; Verwijder en vervang eventuele vervormde stent, omdat luminale vernauwing het risico op postoperatieve galwegcomplicaties verhoogt.

figure-protocol-1
Figuur 1. Chirurgische instrumenten die worden gebruikt bij de transplantatieprocedure. (A) Roestvrijstalen nierbassin. (B) Micronaaldhouders. (C) Micro-schaar. (D) Micro-pincet (recht en gebogen). (E) Microvasculaire clips en kleine muggen-achtige bulldogklemmen. (F) Standaard naaldhouder. (G) Rechte hemostatische pincet (muggenpincet). (H) Vaatklem. (I) Standaard chirurgische schaar. (J) Elastiek (gemaakt van de manchet van een steriele chirurgische handschoen). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-2
Figuur 2. Op maat gemaakte chirurgische manchetten, galwegstent en geplande buikincisies. (A) Voorbereiding van vaatmanchetten en de galstent naast een millimeterliniaal. Van links naar rechts: een 6F epidurale kathetermantel gebruikt voor de infrahepatische inferior vena cava (IHIVC) manchet, een 5F mantel voor de portaalvene (PV) manchet, en een 5–7 mm galstent die is afgeknipt van een 22G intraveneuze katheter. (B) Een kruisvormige incisie op de buik van de donorrat om de chirurgische blootstelling te maximaliseren. (C) Een standaard midline laparotomie-incisie op de ontvangerrat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Donateuroperatie

  1. Eerste stappen
    1. Verdoof de donorrat met 5% isofluraan bij een luchtstroom van 1 L/min in de inductiekamer. Beoordeel de diepte van de anesthesie door te bevestigen dat er geen spontane beweging van ledematen en terugtrekkingsreflex zijn.
      OPMERKING: De diepte van de anesthesie wordt beoordeeld door het ontbreken van spontane ledemaatbewegingen, het ontbreken van een terugtrekkingsreflex en de ademhalingsfrequentie te observeren. Om een soepele en veilige voortgang van de operatie te waarborgen, worden deze parameters gedurende de hele procedure streng om de 20 minuten herzien.
    2. Geef 1% pentobarbital (40–45 mg/kg) via intraperitoneale injectie aan de rechter onderbuik, ongeveer 1–2 cm lateraal van de middenlijn (linea alba) en 1–2 cm schedelband aan het rechter liesligament. Controleer voldoende verdoving door de achterpoot te knellen en te zorgen dat er geen terugtrekkingsreflex is.
    3. Plaats de donorrat in rugligging op een verwarmingskussen van 37°C om de lichaamstemperatuur intraoperatief te behouden.
    4. Scheer het operatiegebied van de buik. Desinfecteer het gebied drie keer met povidonjodium.
  2. Procedures vóór leverperfusie
    1. Maak een kruisvormige incisie die zich uitstrekt tot aan het uitsteeksel xiphoïd, tot aan de symfyse pubica en lateraal tot de middellijn van de axillaire om de blootstelling van het operatieveld te maximaliseren (Figuur 2B).
      OPMERKING: Voer de laparotomie uit in twee lagen. Snijd eerst de huid en het onderhuidse weefsel in. Zet vervolgens de linea alba in een tent met een tang en maak een kleine incisie om lucht binnen te laten, waardoor de ingewanden losvallen. Verleng de incisie met een schaar terwijl het onderste mes parallel blijft aan de buikwand om orgaanschade te voorkomen.
    2. Wikkel de darmen in met zoutwaterdoordrenkt gaas. Plaats ze op het steriele operatieveld aan de linkerkant van de buik om het operatiegebied bloot te leggen.
      OPMERKING: Het is essentieel om gedurende de hele procedure continu vocht te houden in de geëscereerde darmen om ischemische uitdroging en onderkoeling te voorkomen. Hydrateer het bedekkende gaas periodiek door ongeveer elke 10–15 minuten druppels warme (37°C) normale zoutoplossing toe te brengen, of direct wanneer het gaas onder chirurgische verlichting begint te drogen.
    3. Deel het falciforme ligament. Klem en trek het xiphoïde proces kraniaal terug om de suprahepatische IVC (SHIVC) en de linker inferior frenicusader bloot te leggen.
    4. Deel het linker driehoekligament. Ligateer de linker frenicusader dicht bij de SHIVC met een 7-0 of 8-0 hechting (Figuur 3A).
      OPMERKING: Bij het ligeren van de linker inferieure frenicusader plaats je de ligaties dicht bij de SHIVC. Wees je ervan bewust dat de hechtnaald gemakkelijk het middenrif kan doorboren en pneumothorax kan veroorzaken; hecht dicht bij het bloedvat.
    5. Elektrocauterisatie wordt aanbevolen voor de verdeling van vaten om snelle hemostase te bereiken en de operatietijd te verkorten, waardoor de procedurele consistentie en reproduceerbaarheid verbeteren.
      OPMERKING: Elektrocauterisatie standaardiseert hemmostase, vermindert de operationele tijd en verbetert de reproduceerbaarheid tussen de operatoren.
    6. Mobiliseer de caudaat- en papillaire lobben (Figuur 3B).
    7. Gebruik microscopische pincetten om vet en bindweefsel van het oppervlak van de IHIVC te verwijderen.
      OPMERKING: Verwijder bindweefsel totdat de vatwand glad en doorschijnend lijkt. Voldoende blootstelling wordt bereikt wanneer vaatklemmen zonder interferentie kunnen worden aangebracht en er geen restweefsel achterblijft dat het aanbrengen of hechten zou kunnen belemmeren.
    8. Ligaer de rechterbijnier vlak met de IHIVC. Isoleer de rechter nierader en verbind deze vlak met de IHIVC.
    9. Blijf de IHIVC caudaal disseceren tot een niveau net boven de linker niervena (Figuur 3C).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de IHIVC grondig wordt geskeletteerd (bloedvaten zo volledig mogelijk scheiden van vetweefsel) tijdens de dissectie. Dit vergemakkelijkt latere levertransplantatie en de bevestiging van de manchet.
    10. Tilt de lever voorzichtig op met een wattenstaafje. Ontleed de ligamenteuze aanhechtingen tussen de rechter inferieure leverkwab en het retroperitoneum.
      OPMERKING: Identificeer de SHIVC als een kort, bred, dunwandig blauwachtig vat bij de bovenste leverpool. Stop de dissectie zodra het voorste oppervlak is vrijgemaakt en de aangrenzende diafragmatische vezels zichtbaar worden.
    11. Stop de dissectie bij aankomst bij het SHIVC.
      OPMERKING: Behandel de lever met uiterste zorg om parenchymale schade te voorkomen. Wees voorzichtig om de IVC te beschermen tijdens de craniale retroperitoneale dissectie.
    12. Ontleed het bindweefsel tussen de PV en de juiste HA. Isoleer de PV.
    13. Ligaer de rechter maagvena (piloriusvenader) vlak met de PV. Ga verder met dissectie tot aan de wortel van de miltven.
    14. Ontbloot de porta hepatis. Identificeer het navelstrengachtige, vette bindweefsel links van de PV, dat de gemeenschappelijke galgang (CBD) en de HA omsluit.
    15. Maak een "V"-vormige incisie op de voorwand van het CBD, 3–5 mm distaal van de bifurcatie van het leverkanaal.
    16. Gebruik micropincetten om de galstent vast te houden. Plaats de stent ongeveer 3 mm in de galweg terwijl je parallel uitlijnt blijft met het kanaal.
      OPMERKING: Schuif de stent soepel naar voren zonder weerstand. Zorg ervoor dat er geen laterale uitpuiling, hoek of tenten in de buiswand is. Als er weerstand of vervorming optreedt, trek je het terug en richt je opnieuw uit voordat je het opnieuw inzet.
    17. Bevestig de stent met een circumferentiële 7-0 zijden strik. Ligateer de HA op het niveau van de incisie en transecteer deze proximaal (Figuur 3D).
      OPMERKING: Vermijd strikt overmatige "skeletisering" bij het disseceren van de donor-CBD. Behoud van het peribiliaire bindweefsel, zenuwplexussen en microvasculaire netwerken om vroege collaterale circulatie en postoperatieve galwegherstel te bevorderen. Omdat het distale uiteinde van het donorkanaal het meest ischemische gebied is, houd de anastomotische plaats dicht bij het hepatische hilum om de ischemische belasting te minimaliseren.
  3. Leverperfusie
    1. Maak de abdominale aorta bloot. Steek een 23-gauge (23 G) hoofdadernaald (ongeveer 1 cm) in die is verbonden met een 20 mL spuit gevuld met een koude (4°C) oplossing van de University of Wisconsin (UW).
      OPMERKING: Steek de naald in de buikaorta onder een ondiepe hoek (15°–20°). Bevestig de ingang door arteriële bloedflashback te observeren, schuif dan iets naar voren en richt de naald parallel aan het vat om perforatie van de achterwand te voorkomen.
    2. Haal lucht uit de spuit voor de infuus. Klem en corrigeer de abdominale aorta en naald met een vasculaire klem.
      OPMERKING: Verwijder alle lucht uit de spuit door te tikken om belletjes los te maken en vloeistof af te stoten totdat er een continue druppel zichtbaar is bij de naaldpunt. Controleer de afwezigheid van lucht in de naaldnaaf vóór de cannulatie.
    3. Start de perfusie langzaam door de spuit handmatig in te drukken met een constante snelheid van 3–3,5 mL/min (Figuur 3E).
      OPMERKING: Controleer de correcte plaatsing van de intravasculaire buis door de bloedterugvoer in de buis te observeren.
    4. Incère het middenrif. Leg de thoracale IVC en thoracale aorta volledig bloot.
    5. Klem de thoracale IVC bij de verbinding met het rechteratrium, samen met de thoracale aorta, met vasculaire klemmen.
    6. Transecteer de thoracale IVC direct onder de klem om een efflux van het perfusaat mogelijk te maken.
      OPMERKING: Zet de klem zo kraniaal mogelijk aan en doorsnijd eronder om de lengte van het vat te behouden. Begin onmiddellijk met perfusie om stolling te voorkomen en de kwaliteit van de graft te behouden.
    7. Blijf perfusie voeren met een constante snelheid (3–3,5 mL/min) tot een totaalvolume van ongeveer 40 mL.
    8. Stop de perfusie zodra het leverparenchym volledig bleek is (geelbruin) (Figuur 3F).
      OPMERKING: Voldoende perfusie wordt bevestigd wanneer de lever uniform bleek (geelbruin) wordt en het effluent van het doorgesneden IHIVC helder is, zonder restbloed.
    9. Transecteer de IHIVC vlak met de linker nierader. Snijd de PV door op het niveau van de miltven.
      OPMERKING: Vermijd snelle of krachtige injectie van perfusaat om endotheel- en parenchymale schade te voorkomen.
    10. Vergroot de diafragmatische incisie. Oogst de levertransplantatie en bloc met het aangesloten middenrif.
    11. Plaats het graf in een steriele petrischaal met koude UW-conserveringsoplossing.
    12. Houd de transplantatie in een koude UW-oplossing op 4°C. Voltooi de transplantatie binnen 2 uur na aanschaf.

figure-protocol-3
Figuur 3. Belangrijke chirurgische stappen tijdens de mobilisatie van donorlevers en in situ perfusie. (A) Blootstelling en ligatie van de linker inferior frenicusader. (B) Isolatie en deling van de hepato-oesofageale verbindende takken. (C) Dissectie van de IHIVC, waarbij ligasie van de rechterbijnier en rechter niervenen wordt aangetoond. (D) Inbrengen van de op maat gemaakte galstent in de gemeenschappelijke galgang (CBD) met behulp van de "no-touch"-techniek om peribiliair bindweefsel te behouden. (E) Canulatie van de abdominale aorta om koude in situ perfusie te initiëren. (F) Volledig doorbloede donorlever met een uniform bleke uitstraling, wat wijst op geslaagde bloedspoeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Ex vivo graftvoorbereiding

OPMERKING: Voer alle ex vivo graftvoorbereiding op ijs uit (Figuur 4A). Houd de transplantatie in UW-oplossing op 4°C ± 2°C en monitor de temperatuur periodiek om voldoende koude conservering te garanderen.

figure-protocol-4
Figuur 4. Ex vivo voorbereiding van de donorlevertransplantatie. (A) De geoogste levertransplantatie geplaatst in een steriele petrischaal met koude UW-conserveringsoplossing, geplaatst op gecrushed ice om onderkoeling te behouden. (B) Boeien van de donor PV door eversie over een op maat gemaakte manchet en fixatie met een omtrekligatuur. (C) Cuffvoorbereiding voor PV en IHIVC voltooid, met de galwegstent geplaatst. (D) Voorbereiding van de suprahepatische IVC (SHIVC) met stay-hechtingen geplaatst aan beide zijhoeken om de daaropvolgende anastomose te vergemakkelijken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. PV-manchetvoorbereiding
    1. Pak de staart van de PV-manchet vast met een muggentang en maak deze zo vast dat het uiteinde naar beneden gericht is, loodrecht op de onderkant van de petrischaal.
    2. Steek micropincetten door het lumen van de manchet. Trek de PV door de manchet.
    3. Stel de voorwand van de PV bij. Plaats ongeveer 3 mm van de schipwand over het uitlopende uiteinde van de manchet.
    4. Bevestig het uitgetrokken vat aan de buitenwand van de manchet met een circumferentiële 7-0 zijden strik (Figuur 4B).
      OPMERKING: Zorg ervoor dat het vat en de manchet uitgelijnd zijn zonder torsie of hoek. Na fixatie spoel je de PV-manchet met ongeveer 1 ml UW-oplossing en controleer je de openheid door efflux van de SHIVC te observeren.
  2. IHIVC-manchetvoorbereiding
    1. De voorbereiding en het opzetten van de IHIVC worden uitgevoerd met exact dezelfde stappen als beschreven voor de PV in Stap 3.1. Kort gezegd omvat dit vatmobilisatie, trimmen en cufffixatie volgens hetzelfde gestandaardiseerde protocol om experimentele consistentie en reproduceerbaarheid te waarborgen. (Figuur 4C).
      OPMERKING: Bevestig de openheid van de IHIVC-manchet door na het doorspoelen ongehinderde efflux van de SHIVC te observeren.
  3. Spoeling van de galweg
    1. Spoel de galweg voorzichtig door de galstent met een 1 mL spuit met 0,5 mL UW-oplossing.
    2. Zorg ervoor dat er tijdens het spoelen geen vloeistoflekkage optreedt.
      OPMERKING: Het ontbreken van vloeistoflekkage bevestigt de integriteit van de galweg.
  4. SHIVC-voorbereiding
    1. Trim de SHIVC van het levertransplantaat door het rest-diafragma te verwijderen.
    2. Zorg ervoor dat de SHIVC volledig geskeletteerd is, zoals gedefinieerd in Stap 2.2.7.
  5. Plaatsing van de stikdraad
    1. Gebruik 7-0 of 8-0 hechtingen gebaseerd op de voorkeur van de operator.
      OPMERKING: Wat betreft chirurgische uitkomsten (inclusief anastomotische patency en overleving van de ontvanger) zijn beide hechtingsgroottes functioneel gelijkwaardig in dit model. De keuze tussen de twee kan volledig gebaseerd zijn op de persoonlijke voorkeur van de operator of de beschikbaarheid van het laboratorium, zonder de reproduceerbaarheid van de procedure te beïnvloeden.
    2. Plat de SHIVC-stomp voorzichtig plat. Plaats hechtingen aan de linker- en rechterzijhoeken door de naald van binnen naar buiten te laten gaan, ongeveer 1 mm van de rand (Figuur 4D).

4. Ontvangeroperatie

  1. Eerste stappen
    1. Verdoof de ontvangende rat met hetzelfde protocol als beschreven voor de donor (stap 2.1.1).
    2. Plaats de ontvangerrat op een thermostatisch geregeld verwarmingskussen dat op 37°C wordt gehouden.
    3. OPMERKING: Weeg de ontvangerrat voordat je onder narcose gaat. Zorg ervoor dat het lichaamsgewicht van de donor ongeveer 50 g overtreft.
  2. Mobilisatie van de ontvangende lever
    1. Voer een midline laparotomie uit.
    2. Trek de buikwand zijwaarts in met behulp van vier elastische retractoren. Plaats de twee superieure retractors lateraal van de bilaterale costale marges en de twee inferieure retractors lateraal van de bilaterale liesgebieden om optimale blootstelling te bereiken.
      OPMERKING: Pas voldoende retractie toe om het operatieveld bloot te leggen, terwijl overmatige spanning wordt voorkomen die weefselblanchering kan veroorzaken of de ademhaling kan belemmeren.
    3. Ligateer de linker inferior frenicusvena (LIPV) op dezelfde manier als beschreven voor de donorprocedure (zie Stap 2.2.1).
    4. Ontleed de ligamenten tussen de linker leverkwab en het retroperitoneum. Mobiliseer de caudaat- en papillaire lobben.
    5. Verdeel de ligamenten en verbindende takken tussen de slokdarm en de linker leverkwab met behulp van elektrocauterisatie.
      OPMERKING: Elektrocauterisatie wordt aanbevolen om snelle hemostase te garanderen, de operatietijd te verkorten en de procedurele reproduceerbaarheid te verbeteren.
    6. Dissecteer de IHIVC botweg tot op het niveau van de rechter nierven.
    7. Isoleer en ligaer zorgvuldig de linker bijnierader ongeveer 2 mm van de samenvloeiing met de IHIVC.
    8. Beheer de rechter onderste leverkwab op dezelfde manier als beschreven voor de donorprocedure (zie Stap 2.2.4).
    9. Haal een elastiek (gemaakt van de manchet van een steriele chirurgische handschoen, ongeveer 10 cm lang) dwars achter de SHIVC door.
      OPMERKING: Pas zachte grip toe om de SHIVC bloot te leggen zonder de ademhalingsbeweging te beperken.
    10. Laat het elastiekje zitten voor gebruik tijdens de volgende doorsnijding van de SHIVC.
    11. Ontleed en isoleer de PV van het hepatische hilum tot aan het niveau van de tak van de pylorusader.
      OPMERKING: Beperk de dissectie van de PV tot het anastomotische gebied. Behoud omliggende zijrivieren om chirurgisch trauma te verminderen.
    12. Isoleer de HA bij het hepatische hilum.
    13. Ligaer de HA vlak met het hilum en transecteer deze proximaal.
    14. Identificeer de samenvloeiing van de linker- en rechterleverkanalen die de CBD vormen onder het hepatische hilum. Ligaer de CBD op deze plek met een 7-0 Prolene-hechting en snijd deze door (Figuur 5A).
      OPMERKING: Minimaliseer chirurgisch trauma in dit gebied. Behoud de maximaal mogelijke lengte van de HA samen met het peribiliaire bindweefsel, zenuwplexussen en microvasculair netwerk om een vroege vestiging van collaterale circulatie te bevorderen.
  3. Ontvanger hepatectomie
    1. Plaats microvasculaire klemmen om de IHIVC onmiddellijk te versluiten met cephalad op de rechter nierader.
    2. Breng een microvasculaire klem aan om de PV net boven de verbinding met de pylorusvena te blokkeren.
    3. Bevestig succesvolle vasculaire occlusie door zichtbare verdonkering van het leverparenchym te observeren.
      OPMERKING: Bevestig vasculaire occlusie door uniforme verdonkering (cyanose) van de lever, verlies van parenchymale turgor en instorting van de PV.
    4. Steek een 23G hoofdvenennaald in de PV die aan een 5 mL spuit is bevestigd.
    5. Infuseer 2 ml 5% glucoseoplossing gedurende ongeveer 30 seconden om intrahepatisch bloed door de systemische circulatie te spoelen.
      OPMERKING: Injecteer langzaam via de PV nabij het hepatische hilum om intrahepatisch bloed door te spoelen in de systemische circulatie.
    6. Breng naar beneden grip toe op het elastiekje om de SHIVC bloot te leggen.
    7. Klem de SHIVC kruis met een vasculaire klem (Figuur 5B).
    8. Transecteer de IHIVC, PV en SHIVC vlak met het leverparenchym.
    9. Verwijder de natuurlijke lever volledig uit de buikholte.
      OPMERKING: Houd de anhepatische fase binnen 26 minuten (niet langer dan 30 minuten). Transect vaten gelijk met de lever om voldoende lengte te behouden en de vaatstompjes glad te maken.
  4. Implantatie van de levertransplantatie
    1. SHIVC-reconstructie
      1. Plaats de levertransplantatie in zijn orthotopische anatomische oriëntatie.
      2. Gebruik de vooraf geplaatste 7-0 hechting in de linkerhoek om het continue hechten van de achterwand richting de rechterhoek te beginnen.
      3. Bevestig de hechting aan de stay-hechting in de rechterhoek.
      4. Zet de lopende hechting langs de voorwand voort om de anastomose te voltooien (Figuur 6A–6C).
      5. Houd een naaldinlaatafstand van 0,5–1,0 mm vanaf de vatrand.
      6. Houd een hechtingshoek van 1,0–1,5 mm.
        OPMERKING: Houd de naaldafstand en hechtingshoek gelijk om een veilige en spanningsvrije anastomose te garanderen.
      7. Draai de hechting na elke steek strak aan om dode ruimte te elimineren en de juiste spanning te behouden.
        OPMERKING: Spoel de SHIVC met UW-oplossing voordat je het voorwandhechten voltooit met een inwelling needle om rest-lucht uit te voeren en luchtembolie te voorkomen.
    2. PV-reconstructie
      1. Plaats 7-0 stay-hechtingen aan de linker- en rechterhoek van de ontvangende PV-stump.
      2. Breng driepuntstractie toe om een driehoekige opening te creëren.
      3. Plaats de gecuffde donor-PV in het lumen.
      4. Bevestig met een 7-0 ligatuur die rond de omtrekgroef is vastgemaakt (Figuur 6D–6F).
    3. IHIVC-reconstructie
      1. Reconstrueer de IHIVC met dezelfde techniek als PV-reconstructie (zie Stap 4.4.2) (Figuur 6G–6I).
    4. Reperfusie
      1. Laat de vasculaire klemmen op de SHIVC, PV en IHIVC sequentieel los.
      2. Bevestig succesvolle reperfusie door uniforme kleurherstel van het transplantaat te observeren zonder verstopping, bloeding of lekkage (Figuur 7A).
        OPMERKING: Actieve galproductie uit de galgang duidt op herstel van leverperfusie en vroege graftfunctie.
    5. Galwegreconstructie
      1. Maak een kleine dwarsdoorsnijding (half de diameter van het kanaal) op de voorwand van de ontvangende CBD-stomp.
      2. Plaats de donorgaliaire stent ongeveer 3 mm in het CBD-lumen.
      3. Bevestig de stent met een 7-0 omtrekdraad (Figuur 7B).
        OPMERKING: Observeer actieve galuitvloeiing vanuit de distale punt van de donorstent voordat de reconstructie wordt voltooid. Dit bevestigt openheid en vroege graftfunctie.
  5. Heropwarming van ontvangers
    1. Spoel de peritoneale holte met 150 mL normale zoutoplossing bij 37°C voorafgaand aan het sluiten van de buik.
      OPMERKING: Deze stap verwijdert restbloed, herstelt de lichaamstemperatuur en maakt inspectie van hemostase mogelijk bij de SHIVC-, IHIVC- en PV-anastomosen.
  6. Abdominale sluiting en postoperatieve zorg
    1. Sluit de musculofasciale laag met een continu hechtende draad en 4-0 absorberbare draad, waarbij je 5 mm happen neemt met intervallen van 1 cm.
    2. Sluit de huid met een doorlopende hechting en 4-0 zijden draad.
    3. Dien buprenorfine (0,1 mg/kg) subcutaan toe elke 12 uur, in totaal 2 doses.
    4. Breng de ontvangerrat over naar een schone, temperatuurgecontroleerde kooi.
    5. Houd continu in de gaten tot volledig herstel van de narcose en hervatting van normale spontane beweging.

figure-protocol-5
Figuur 5. Belangrijke chirurgische stappen tijdens de levermobilisatie en hepatectomie van de ontvanger. (A) Identificatie en ligatie van de ontvanger CBD nabij de hilar-bifurcatie. (B) Blootstelling en kruisklem van de SHIVC. Achter de SHIVC wordt een elastiek geplaatst om grip te bieden en de visualisatie tijdens het klemmen te verbeteren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-6
Figuur 6. Belangrijke chirurgische stappen voor vasculaire reconstructie tijdens de implantatie van een levertransplantaat. Reconstructie van de SHIVC: (A) uitlijning met hoekstag-hechtingen, (B) continue naad van de achterwand, en (C) voltooiing van het naden van de voorste wand. PV-reconstructie met de manchettechniek: (D) driepuntstractie, (E) inbrengen van gecuffde donor-PV, en (F) ligatie om de manchet vast te zetten. IHIVC-reconstructie met dezelfde manchettechniek: (G) blootstelling, (H) inbrenging en (I) ligaturen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-protocol-7
Figuur 7. Verificatie van de transplantatiefunctie, galwegreconstructie en postoperatief herstel. (A) Beoordeling van vroege graftfunctie na reperfusie, met zichtbare galuitvloei van de donorgaliaire stent. PV- en IHIVC-reconstructies zijn zichtbaar. (B) Voltooide galwegreconstructie met het plaatsen en fixeren van de donorgaliaire stent in de ontvanger CBD. (C) Representatieve ontvangerrat die volledige postoperatieve herstel vertoont met normale houding en spontane activiteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om consistente chirurgische kwaliteit en reproduceerbaarheid te waarborgen over de NArLT-modellen, werden alle procedures uitgevoerd door dezelfde ervaren microchirurg. In totaal werden er gedurende de studieperiode 50 rattenlevertransplantaties uitgevoerd. De gemiddelde duur van de chirurgische ingrepen was als volgt: de donoroperatie bedroeg gemiddeld 25,3 ± 2,6 minuten, de ex-vivo graftvoorbereiding gemiddeld 13,1 ± 2,1 min, de ontvangeroperatie gemiddeld 43,0 ± 1,6 min, en de anhepat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het NArLT-model is een hoeksteen voor experimenteel transplantatieonderzoek vanwege het vermijden van complexe microvasculaire arteriële anastomose11. Conventionele NArLT-methoden worden echter historisch geplaagd door hoge percentages galwegcomplicaties—tot 30%—die de langetermijnoverleving ernstig beperken en chronische immunologische studies belemmeren2. Het belang van de voorgestelde methode ligt in het vermogen om deze ischemische galw...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs geven geen belangenconflicten aan.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 8237066), het Key R&D-programma van de provincie Shandong, China (nr. 2025KJHZ016) en het provinciale gezondheidstechnologieproject van Fujian (nr. 2023CXA014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
4-0 Absorbable SutureEthiconW9109HGebruikt voor het sluiten van de musculofasciale laag (linea alba)
4-0 Zijde SutureEthiconVCP304HGebruikt voor het sluiten van de huid
7-0 of 8-0 Suture / Zijde BindEthiconZ1711EGebruikt voor ligatie van bloedvaten (bijv. linker frenicusvene)
22G Intraveneuze CatheterB. Braun4252098BBijgesneden tot 5–7 mm met schuine uiteinden om de biliaire stent voor te bereiden
23G HoofdvlamnaaldShandong Qinkai Medical Industry Co., Ltd.MDLSSVSGebruikt voor inbrenging in de abdominale aorta voor leverperfusie
BuprenorfineTianjin Institute of Pharmaceutical Research Pharmaceutical Co., Ltd.H12020275Toegediend als subcutane analgesie na de operatie
Katoenen WattenstaafjeAoocn216-236Gebruikt om de lever voorzichtig op te tillen tijdens dissectie
Gekneusd IjsN/AN/AGebruikt om de temperatuur van het graft te handhaven tijdens ex vivo-voorbereiding
Elastieke retractorenN/AN/AGebruikt om de buikwand terug te trekken tijdens laparotomie
Epidural Catheter OmhullingenJiangsu Maichuang Medical Device Co., Ltd.20173084015Groottes 5F en 6F; gebruikt als manchetten voor PV en IHIVC
GaasCentral Medical Technology Co., Ltd.CH-1001In zoutoplossing gedrenkt; gebruikt om darmen te bedekken en te beschermen
Glucose Oplossing (5%)Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.H20044307Gebruikt om intrahepatisch bloed weg te spoelen tijdens leverhepatectomie van de ontvanger
HeparinezoutoplossingShenzhen Life Biotechnology Co., Ltd.H2012003100 IE/mL; gebruikt om de biliaire stent te weken
Intraveneuze NaaldB. Braun4254074BGebruikt om SHIVC weg te spoelen om lucht te verwijderen voordat de anastomose wordt voltooid
IsofluraanJinan Guangshengyuan Biotechnology Co., Ltd.1531070155% concentratie; gebruikt voor anesthesie-inductie 
Microvasculaire KlemmenShanghai Medical Devices Co., Ltd.JCZ200Gebruikt voor occlusie van bloedvaten tijdens de operatie
MuggentangShanghai Medical Devices Co., Ltd.J31010Gebruikt voor fijne manipulatie en manchetvoorbereiding
Normale Zoutoplossing (0,9%)Sichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.H20044304Gebruikt voor irrigatie en gaas weken (37°C)
Pentobarbital (1%)Shanghai Yuansi Technology Co., Ltd.P050000040–45 mg/kg; gebruikt voor chirurgische anesthesie
Perifere Venous Catheter (PIVC)Covidien8888145015Gebruikt om de PV met manchet te spoelen en de doorlaatbaarheid te bevestigen 
Povidon-jodiumShanxi Trinda Biotechnology Co., Ltd.41836054Gebruikt voor desinfectie van de chirurgische plaats
Gumband (uit chirurgische handschoen)AnsellN/AGebruikt voor SHIVC-tractie tijdens chirurgie van de ontvanger
Sprague–Dawley RattenHuafukang (Beijing) Biotechnology Co., Ltd.22001AVolwassen mannelijke ratten, 8–10 weken, 220–250 g
Steriele Petrischaal (10 cm)Shandong Enyou Biotechnology Co., Ltd.H905001Gebruikt om het graft in UW-oplossing te houden tijdens ex vivo-voorbereiding
Spuit (20 mL)Shandong Weigao Group Medical Polymer Products Co., Ltd.20163141593Gebruikt voor gecontroleerde leverperfusie (3–3,5 mL/min) 
UW-conserveerdoplossingBridge to LifeBTL-UW-1LBijgehouden op 4°C; gebruikt voor donorleverperfusie en graftbehoud

Referenties

  1. Hirata, M., et al. Stepwise approach for acquisition of microsurgical skills through rat orthotopic liver transplantation experiments. Eur Surg Res. , (2023).
  2. Zhao, H., et al. Revisiting orthotopic rat liver transplant. Exp Clin Transplant. , (2021).
  3. Wu, W., et al. Research progress on anatomy reconstruction of rat orthotopic liver transplantation. Transplant Rev (Orlando). , (2024).
  4. Shi, J. H., Line, P. D., Zhang, S. J., Guo, W. Z. Experimental liver surgery for liver research: update, choice and translation. J Inflamm Res. , (2025).
  5. Engel, B., et al. Molecular signatures discriminating different types of rejection in human liver transplants. J Hepatol. , (2025).
  6. Khatua, C. R., Anirvan, P., Panigrahi, M. K., Singh, S. P. Admission Albumin-Bilirubin Score Is Inferior to MELD, MELD-Na+ and Child-Turcotte-Pugh Score in Predicting Survival in Indian Patients with Alcohol-associated Liver Disease. J Transl Gastroenterol. , (2025).
  7. Yu, H., et al. Low hepatic artery blood flow mediates NET extravasation through the regulation of PIEZO1/SRC signaling to induce biliary complications after liver transplantation. Theranostics. , (2024).
  8. Yang, Z., et al. Prognosis analysis of rat liver transplantation under direct vision of single operator. Transplant Proc. , (2024).
  9. Wang, Z., et al. Liver cold storage and transplantation in the cold-adaptive Daurian ground squirrels. J Vis Exp. , (2025).
  10. Wang, X., MacParland, S. A., Perciani, C. T. Immunological determinants of liver transplant outcomes uncovered by the rat model. Transplantation. , (2021).
  11. Kamada, N., Calne, R. Y. Orthotopic liver transplantation in the rat: technique using cuff for portal vein anastomosis and biliary drainage. Transplantation. , (1979).
  12. Yuan, Z., et al. The effect of microcirculation disturbance of peribiliary vascular plexus on hepatic bile duct epithelial cells in rats undergoing liver transplantation and postoperative rejection reduction by nanocarrier mediation. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). , (2022).
  13. Zhao, D., et al. Regression of bile duct damage and bile duct proliferation in the non-rearterialized transplanted rat liver is associated with spontaneous graft rearterialization. Hepatology. , (1995).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Niet gearterialiseerd modelgalwegcomplicatiestransplantatie immunologiechronische afstotinggalwegstentinganhepatische fasegalwegdissectietransplantatietolerantie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.