Gestandaardiseerde immunofluorescentiebeeldvorming van tunnelende nanobuizen en mitochondriale overdracht tussen astrocyten en neuronen

Samenvatting

Dit protocol standaardiseert fixatie-, kleur- en confocale beeldvormingsmethoden voor het visualiseren van tunneling van nanobuisjes en mitochondriale overdracht tussen astrocyten en neuronen in vitro.

Samenvatting

Mitochondriën zijn essentiële organellen die de energieproductie, cellulaire signalering en metabole homeostase in neurale cellen reguleren. Tunneling-nanobuisjes (TNT's) zijn dunne membraanstructuren die intercellulaire communicatie over lange afstand bevorderen en de overdracht van cellulaire componenten, waaronder mitochondriën, tussen verbonden cellen faciliteren. Betrouwbare visualisatie van TNT's en mitochondriale overdracht vereist zorgvuldige monsterbehandeling omdat deze structuren zeer fragiel zijn en gevoelig voor fixatie-, was- en beeldvormingsomstandigheden. Dit protocol beschrijft gestandaardiseerde procedures voor de fixatie, kleuring en confocale beeldvorming van TNT's in astrocyten en astrocyt–neuron cocultuursystemen. De workflow omvat membraan- en cytoskeletkleuring voor TNT-visualisatie, mitochondriale labeling voor het volgen van mitochondriale lokalisatie, en immunofluorescentiekleuring voor Miro1-colocalisatieanalyse. Kritieke stappen voor het behoud van TNT-morfologie, waaronder voorzichtig wassen en lichtbeschermd hanteren, worden gedurende de hele procedure benadrukt. Het protocol beschrijft ook beeldvormingsmethoden voor de karakterisering van TNT's en mitochondriën in fixed-cell preparaten. Deze methoden bieden een reproduceerbaar experimenteel kader voor het bestuderen van TNT-vorming en mitochondriale overdracht tussen neurale cellen in vitro.

Inleiding

Mitochondriën fungeren als energiefabrieken van de cel, leveren de energie die nodig is voor cellulaire activiteiten door de productie van adenosinetrifosfaat, terwijl ze ook een belangrijke rol spelen in de transductie van cellulaire signalen en de redoxbalans¹. In het zenuwstelsel kunnen mitochondriale metabolieten de complexiteit en prikkelbaarheid van neuronale processen vergroten, waardoor de groei en ontwikkeling van neuronen worden ondersteund². Mitochondriën zijn geen statische organellen; Ze veranderen voortdurend hun morfologie, locatie en verspreiding om zich aan te passen aan diverse intracellulaire en extracellulaire stressen en metabole^behoeften. Intercellulaire mitochondriale overdracht draagt bij aan het behoud van weefselhomeostase en bevordert de ontwikkeling onder fysiologische omstandigheden, terwijl het onder pathologische omstandigheden deelneemt aan schadeherstel, immuunregulatie en ziekteprogressie ^4,5.

Intercellulaire communicatie van materialen en energie is essentieel voor verschillende biologische processen, waaronder cellulaire homeostase, weefselherstel en regulatie van neurale netwerken. Huidige studies hebben meerdere vormen van intercellulaire communicatie aan het licht gebracht, waaronder tunneling nanotubes (TNT's) een van de meest uitgebreid bestudeerde mechanismen vormen die geassocieerd zijn met intercellulaire mitochondriale overdracht⁶. TNT's zijn F-actine-gebaseerde, brugachtige membraanstructuren met een buisvormige morfologie, variërend van 50 tot 200 nm in diameter en tot meerdere celdiameters in lengte⁷. Onderzoek heeft aangetoond dat TNT's kunnen dienen als fysieke verbindingen tussen neurale cellen en nauw samenhangen met het ontstaan en de progressie van neurodegeneratieve ziekten, hersenkanker en andere aandoeningen. Zo is gerapporteerd dat mitochondriale overdracht van microglia naar neuronen via TNT's neuronale cellen^{redt 8,9}.

Huidig onderzoek naar TNT's staat vaak voor verschillende uitdagingen, waaronder de structurele kwetsbaarheid van TNT's, waardoor ze gevoelig zijn voor breuk en daardoor experimentele uitkomsten kunnen beïnvloeden; moeilijkheid om TNT's te onderscheiden van filopodien of andere membraanuitsteeksels; en uitdagingen die gepaard gaan met het nauwkeurig kwantificeren van intercellulaire TNT's. Om de reproduceerbaarheid en consistentie van TNT-gerelateerde studies te verbeteren, zijn gestandaardiseerde methoden nodig voor het wassen, fixeren, kleuren en beelden van TNT's om een nauwkeurige beoordeling van hun structuur en verspreiding mogelijk te maken, terwijl experimentele variabiliteit wordt geminimaliseerd. Factoren zoals celdichtheid vóór fixatie, bescherming tegen licht, wasintensiteit, fixatieduur en de kleuring na fixatie kunnen allemaal de structuur en stabiliteit van TNT's beïnvloeden. In deze studie beschrijven we procedures voor de voorbehandeling, kleuring en confocale beeldvorming van TNT's en mitochondriën-geassocieerde TNT-structuren in astrocyten- en astrocytneuroncultuursystemen.

Dit onderzoeksprotocol kan over het algemeen worden toegepast op de meeste laboratoriumomgevingen. Validatie in primaire astrocyten en een muis hippocampale neuronale cellijn bevestigde dat het protocol geschikt is voor zowel primaire neurale cellen als geïmmortaliseerde cellenlijnen. Dit protocol kent echter nog steeds verschillende beperkingen. Confocale microscopie biedt een lagere ruimtelijke resolutie dan superresolutie-beeldvormingsmethoden voor TNT-visualisatie, en de op MitoTracker gebaseerde beoordeling van mitochondriale overdracht kan worden beïnvloed door kleurstoflekkage en niet-mitochondriale signaalinterferentie¹⁰.

Protocol

Deze studie betrof geen menselijke proefpersonen of levende gewervelde dieren; Er werden alleen commercieel verkregen of gevestigde cellijnen gebruikt, en er was geen ethische goedkeuring vereist.

1. Kleuring voor TNT's in astrocyten

1. Celzaaiing
   1. Zaad isoleerde primaire rat-astrocyten bij passage 3 (P3) in 35 mm glazen bodemkweekschalen met een dichtheid van 5 × 10^{4 cellen} per schaal. Voeg 2 mL Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) complete medium toe, aangevuld met 10% foetaal rundserum (FBS) en 1% drievoudig antibioticummengsel (penicilline G, streptomycine en amfotericine B). Kweek de cellen bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂.
   2. Incubeer de cellen ongeveer 24 uur totdat de hechting plaatsvindt.
2. Voorbehandeling en fixatie
   1. Breng de kweekschotels over naar een schone bank onder lichtbeschermde omstandigheden na celhechting.
      OPMERKING: Minimaliseer onnodige beweging en trillingen tijdens het hanteren om de integriteit van TNT te behouden.
   2. Verwijder het kweekmedium voorzichtig onder zwak licht.
      OPMERKING: Vermijd volledige drooglegging van het celoppervlak tijdens het verwijderen van het medium, omdat TNT's kunnen instorten en zich aan het kweeksubstraat kunnen hechten.
   3. Was de cellen voorzichtig één keer met 500 μL fosfaatgebuffte zoutoplossing (PBS) zonder calcium- en magnesiumionen (pH 7,3–7,5). Voeg het PBS langzaam toe en verwijder het langs de wand van de kweekschaal om intercellulaire TNT's tijdens het wassen te voorkomen.
   4. Verwijder de PBS voorzichtig.
   5. Fixeer de cellen met een commerciële 4% weefselcelfixatieve oplossing met paraformaldehyde (pH 7,2–7,4) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT; 20°C–25°C) onder zwakke lichtomstandigheden.
      VOORZICHTIG: Behandel fixatiemiddelen met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en voer alle procedures uit volgens de institutionele richtlijnen voor chemische veiligheid.
   6. Verwijder de fixatieoplossing.
   7. Was de cellen één keer met PBS.
3. Celpermeabilisatie en fluorescentiekleuring
   1. Permeabiliseer de cellen met 500 μL kant-en-klare Triton X-100 permeabilisatieoplossing gedurende 20 minuten bij RT.
      VOORZICHTIG: Triton X-100 kan kwetsbare TNT-structuren verstoren. Minimaliseer overmatige agitatie tijdens permeabilisatie.
   2. Verwijder de permeabilisatieoplossing.
   3. Was de cellen één keer met PBS.
   4. Bereid de kleuroplossing direct voor gebruik voor. Verdun de F-actine kleurstof in PBS tot een eindconcentratie van 1 μM en gebruik 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) als kant-en-klare nucleaire kleuring. Meng de twee kleurmiddelen grondig voordat je ze gebruikt.
      OPMERKING: Falloïdine-gebaseerde kleuringsreagentia kunnen worden gebruikt als alternatief voor F-actinevisualisatie.
   5. Meng de F-actine en nucleaire kleuringsoplossingen in een verhouding van 1:1 (gelijke volumes) onder lichtbeschermde omstandigheden.
   6. Voeg de voorbereide kleuroplossing toe aan de kweekschalen.
   7. Breng de cellen 30 minuten uit bij 37°C in het donker.
   8. Verwijder de vlekoplossing.
   9. Was de cellen drie keer met PBS en gebruik 500 μL per wasbeurt gedurende 1 minuut per was.
   10. Voeg 1 ml PBS toe om te voorkomen dat de cellen uitdrogen tijdens de beeldvormingsvoorbereiding.
4. Confocale beeldvorming
   1. Neem beelden met een Nikon omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een ×20-objectieflens. Gebruik 405 nm excitatie voor DAPI en 488 nm excitatie voor F-actine kleuring. Maakt beelden met een resolutie van 1024 × 1024 pixels onder lichtbeschermde omstandigheden bij RT.
   2. Voer kwalitatieve beoordeling en handmatige kwantificering uit met ten minste vijf willekeurig geselecteerde gezichtsvelden per steekproef. Kwantificeer het aantal TNT's en het aantal TNT-positieve cellen met één of meer TNT's in elk gezichtsveld (Figuur 1A en 1B).
      OPMERKING: Maak direct na het kleuren beelden om fluorescentieverlies en structurele verstoring van TNT's te minimaliseren.

Figuur 1: Fluorescentiekleuring van tunneling-nanobuisjes (TNT's) in astrocyten. (A) Representatieve confocale microscopiebeelden die nucleaire en F-actinekleuring tonen in astrocyten gekweekt in glasbodemcultuurschalen. (B) Vergrote weergave van het ombakte gebied in paneel A. Witte pijlen geven TNT-achtige structuren tussen aangrenzende cellen aan. (C) Representatieve beelden die TNT-achtige structuren tonen die zijn verstoord na onjuiste monsterbehandeling. (D) Vergroot beeld van het omhulde gebied in paneel C. Gele pijlen geven verstoorde TNT-achtige structuren aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Kleuring voor mitochondriale overdracht van astrocyten naar neuronen via TNT's

1. Astrocytenzaaiing en mitochondriale etikettering
   1. Zaad isoleerde primaire ratastrocyten bij passage 3 (P3) in 35 mm glazen bodemkweekschalen met een dichtheid van 3 × 10^{4 cellen} per schaal. Voeg 2 ml DMEM/F-12 complete medium toe, aangevuld met 10% FBS en 1% drievoudig antibioticummengsel (penicilline G, streptomycine en amphotericine B). Kweek de cellen bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂.
   2. Incubeer de cellen ongeveer 24 uur totdat de hechting plaatsvindt.
   3. Breng de kweekschotels na celhechting over naar een schone bank onder zwak licht.
      OPMERKING: Minimaliseer onnodige beweging en trillingen tijdens het hanteren om de integriteit van TNT te behouden.
   4. Verwijder het kweekmedium voorzichtig onder lichtbeschermde omstandigheden. Vermijd het verstoren van TNT's tijdens het verwijderen van het middel.
      OPMERKING: Vermijd volledige drooglegging van het celoppervlak tijdens het verwijderen van het medium, omdat TNT's kunnen instorten en zich aan het kweeksubstraat kunnen hechten.
   5. Reconstrueren 50 μg gelyofilieerde MitoTracker-kleurstof in dimethylsulfoxide (DMSO) om een 1 mM voorraadoplossing te bereiden en de voorraadoplossing op te slaan bij −20°C. Verdun de voorraadoplossing vóór gebruik met 400 μL volledig DMEM/F-12 medium, aangevuld met 10% FBS en 1% drievoudig antibioticummengsel om een uiteindelijke MitoTracker-concentratie van 50 μM te verkrijgen.
      VOORZICHTIG: Bescherm fluorescerende kleurstoffen tegen directe lichtblootstelling tijdens de voorbereiding en incubatieprocedures.
   6. Voeg de mitochondriale kleuringsoplossing toe aan de kweekschalen.
   7. Incubeer de cellen bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂ gedurende 30 minuten onder lichtbeschermde omstandigheden.
   8. Verwijder de mitochondriale kleuringsoplossing onder lichtbeschermde omstandigheden.
   9. Was de cellen voorzichtig één keer met 500 μL PBS zonder calcium- en magnesiumionen (pH 7,3–7,5). Voeg het PBS langzaam toe en verwijder het langs de wand van de kweekschaal om intercellulaire TNT's tijdens het wassen te voorkomen.
   10. Verwijder de PBS voorzichtig.
2. Astrocyt-neuron cocultuur
   1. Zaad vereeuwigde muis hippocampale neuronale cellen bij passage 3 (P3) in de astrocytenhoudende kweekschotels met een dichtheid van 3 × 10^{4 cellen} per schaal. Voeg cellen toe in een totaalvolume van 2 mL, bestaande uit een 1:1 mengsel van DMEM en DMEM/F-12 complete medium, aangevuld met 10% FBS en 1% drievoudig antibioticummengsel. Vestig de cocultuur met een direct-contactmethode zonder Transwell-insert. Kweek de cellen bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂.
      OPMERKING: Voeg voorzichtig neuronale cellen toe om de verstoring van bestaande TNT-structuren te minimaliseren.
   2. Houd de cocultuur 24 uur in stand onder standaard incubatoromstandigheden, terwijl monsters beschermd worden tegen onnodige lichtblootstelling tijdens de behandeling.
3. Fixatie en permeabilisatie
   1. Verwijder het kweekmedium onder lichtbeschermde omstandigheden.
   2. Was de cellen één keer met PBS.
   3. Fixeer de cellen met 4% weefselcelfixatieve oplossing met paraformaldehyde gedurende 30 minuten bij RT onder zwakke lichtomstandigheden.
      VOORZICHTIG: Behandel fixatiemiddelen met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en voer alle procedures uit volgens de institutionele richtlijnen voor chemische veiligheid.
   4. Verwijder de fixatieoplossing.
   5. Was de cellen één keer met PBS.
   6. Permeabiliseer de cellen met 500 μL kant-en-klare Triton X-100 permeabilisatieoplossing gedurende 20 minuten bij RT onder zwakke lichtomstandigheden.
      VOORZICHTIG: Triton X-100 kan kwetsbare TNT-structuren verstoren. Minimaliseer overmatige agitatie tijdens permeabilisatie.
   7. Verwijder de permeabilisatieoplossing.
   8. Was de cellen één keer met PBS.
4. Fluorescentiekleuring en beeldvorming
   1. Bereid de kleuroplossing direct voor gebruik voor. Verdun de F-actine kleurstof in PBS tot een eindconcentratie van 1 μM en gebruik DAPI als kant-en-klare nucleaire kleuring. Meng de kleurmiddelen grondig voor gebruik.
      OPMERKING: Falloïdine-gebaseerde kleuringsreagentia kunnen worden gebruikt als alternatief voor F-actinevisualisatie.
   2. Meng de F-actine- en kernkleuringsoplossingen in een verhouding van 1:1 (gelijke volumes) onder lichtbeschermde omstandigheden direct voor gebruik.
   3. Voeg de voorbereide kleuroplossing toe aan de kweekschalen.
   4. Breng de cellen 30 minuten uit bij 37°C in het donker.
   5. Verwijder de vlekoplossing.
   6. Was de cellen drie keer met PBS en gebruik 500 μL per wasbeurt gedurende 1 minuut per was.
   7. Voeg 1 ml PBS toe om te voorkomen dat de cellen uitdrogen tijdens de beeldvormingsvoorbereiding.
   8. Neem beelden met een Nikon omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een ×20-objectieflens. Gebruik 405 nm excitatie voor DAPI, 488 nm excitatie voor F-actine kleuring en 665 nm excitatie voor MitoTracker kleuring. Maakt beelden met een resolutie van 1024 × 1024 pixels onder lichtbeschermde omstandigheden bij RT.
   9. Voer kwalitatieve beoordeling uit met ten minste vijf willekeurig geselecteerde gezichtsvelden per steekproef. Evalueer de aanwezigheid van TNT-achtige structuren en mitochondriën-geassocieerde fluorescentiesignalen binnen intercellulaire membraanverbindingen (Figuur 2A en 2B).
      OPMERKING: Maak direct na het kleuren beelden om fluorescentieverlies en structurele verstoring van TNT's te minimaliseren.

Figuur 2: Fluorescentiekleuring van mitochondriën en TNT's in een astrocyt-neuron cocultuursysteem. (A) Representatieve confocale microscopiebeelden die nucleaire, mitochondriale en F-actine kleuring tonen in astrocyten en neuronen gekweekt in glasbodemkweekschalen. Astrocyten vertoonden onregelmatige stervormige of polygonale morfologieën met uitgebreide cellulaire processen, terwijl neuronale cellen rond of ovaal leken met slanke, neurietachtige extensieën. (B) Vergrote weergave van het ombakte gebied in paneel A. Witte pijlen geven mitochondriën-geassocieerde TNT-achtige structuren tussen cellen aan. De twee celpopulaties werden voornamelijk onderscheiden op basis van hun karakteristieke cellulaire morfologie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Immunofluorescentie colokalisatiekleuring voor mitochondriën en Miro1 in TNT's

1. Astrocytenzaaiing en mitochondriale etikettering
   1. Zaad isoleerde primaire ratastrocyten bij passage 3 (P3) in 35 mm glazen bodemkweekschalen met een dichtheid van 3 × 10^{4 cellen} per schaal. Voeg 2 ml DMEM/F-12 complete medium toe, aangevuld met 10% FBS en 1% drievoudig antibioticummengsel (penicilline G, streptomycine en amphotericine B). Kweek de cellen bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂.
   2. Incubeer de cellen ongeveer 24 uur totdat de hechting plaatsvindt.
   3. Breng de kweekschotels na celhechting over naar een schone bank onder zwak licht.
      OPMERKING: Minimaliseer onnodige beweging en trillingen tijdens het hanteren om de integriteit van TNT te behouden.
   4. Verwijder het kweekmedium voorzichtig onder lichtbeschermde omstandigheden. Vermijd het verstoren van TNT's tijdens het verwijderen van het middel.
      OPMERKING: Vermijd volledige drooglegging van het celoppervlak tijdens het verwijderen van het medium, omdat TNT's kunnen instorten en zich aan het kweeksubstraat kunnen hechten.
   5. Reconstrueren 50 μg gevriesde MitoTracker-kleurstof in DMSO om een 1 mM voorraadoplossing te bereiden en de voorraadoplossing op te slaan bij −20°C. Verdun de voorraadoplossing vóór gebruik met 400 μL volledig DMEM/F-12 medium, aangevuld met 10% FBS en 1% drievoudig antibioticummengsel om een uiteindelijke MitoTracker-concentratie van 50 μM te verkrijgen.
      VOORZICHTIG: Bescherm fluorescerende kleurstoffen tegen directe lichtblootstelling tijdens de voorbereiding en incubatieprocedures.
   6. Voeg de mitochondriale kleuringsoplossing toe aan de kweekschalen.
   7. Incubeer de cellen bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂ gedurende 30 minuten onder lichtbeschermde omstandigheden.
   8. Verwijder de mitochondriale kleuringsoplossing onder lichtbeschermde omstandigheden.
   9. Was de cellen voorzichtig één keer met 500 μL PBS zonder calcium- en magnesiumionen (pH 7,3–7,5). Voeg het PBS langzaam toe en verwijder het langs de wand van de kweekschaal om intercellulaire TNT's tijdens het wassen te voorkomen.
   10. Verwijder de PBS voorzichtig.
2. Astrocyt-neuron cocultuur
   1. Zaad vereeuwigde muis hippocampale neuronale cellen bij passage 3 (P3) in de astrocytenhoudende kweekschotels met een dichtheid van 3 × 10^{4 cellen} per schaal. Voeg cellen toe in een totaalvolume van 2 mL, bestaande uit een 1:1 mengsel van DMEM en DMEM/F-12 complete medium, aangevuld met 10% FBS en 1% drievoudig antibioticummengsel. Vestig de cocultuur met een direct-contactmethode zonder Transwell-insert. Kweek de cellen bij 37°C in een bevochtigde broedmachine met 5% CO₂.
      OPMERKING: Voeg voorzichtig neuronale cellen toe om de verstoring van bestaande TNT-structuren te minimaliseren.
   2. Houd de cocultuur 24 uur in stand onder standaard incubatoromstandigheden, terwijl monsters beschermd worden tegen onnodige lichtblootstelling tijdens de behandeling.
3. Fixatie en permeabilisatie
   1. Verwijder het kweekmedium onder lichtbeschermde omstandigheden.
   2. Was de cellen één keer met PBS.
   3. Fixeer de cellen met een commerciële 4% weefselcelfixatieve oplossing met paraformaldehyde (pH 7,2–7,4) gedurende 30 minuten bij RT onder zwakke lichtomstandigheden.
      VOORZICHTIG: Behandel fixatiemiddelen met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen en voer alle procedures uit volgens de institutionele richtlijnen voor chemische veiligheid.
   4. Verwijder de fixatieoplossing.
   5. Was de cellen één keer met PBS.
   6. Permeabiliseer de cellen met 500 μL kant-en-klare Triton X-100 permeabilisatieoplossing gedurende 20 minuten bij RT onder zwakke lichtomstandigheden.
      VOORZICHTIG: Triton X-100 kan kwetsbare TNT-structuren verstoren. Minimaliseer overmatige agitatie tijdens permeabilisatie.
   7. Verwijder de permeabilisatieoplossing.
   8. Was de cellen één keer met PBS.
4. Blokkering en immunofluorescentiekleuring
   1. Blokkeer de cellen met 5% geitenserum voor 1 uur bij RT onder zwak licht. Bereid de blokkeringsoplossing voor door geitenserum 1:20 te verdunnen in PBS.
   2. Verwijder de blokkeringsoplossing.
   3. Verdun het monoklonale anti-Miro1-antilichaam van konijn in PBS met een verdunningsverhouding van 1:100. Voeg de verdunde primaire antistofoplossing toe aan de kweekschalen en laat deze een nacht (12–16 uur) incuberen bij 4°C.
      OPMERKING: Bescherm fluorescerend gelabelde monsters tegen directe lichtblootstelling tijdens de kleuring.
   4. Verwijder de primaire antistofoplossing.
   5. Was de cellen drie keer met PBS en gebruik 500 μL per wasbeurt gedurende 1 minuut per was.
   6. Verdun het fluorescerende geitenanti-konijn IgG secundaire antilichaam in PBS met een verdunningsverhouding van 1:100. Voeg 500 μL verdunde secundaire antistofoplossing toe aan elke kweekschotel en incubeer gedurende 1 uur onder lichtbeschermde omstandigheden.
      OPMERKING: Een controle zonder primaire antistoffen was niet opgenomen in de huidige studie. Toekomstige experimenten moeten passende immunofluorescentiecontroles bevatten om de kleuringsspecificiteit verder te valideren.
   7. Verwijder de fluorescerende secundaire antistofoplossing.
5. Fluorescerende tegenkleuring en beeldvorming
   1. Bereid de kleuroplossing direct voor gebruik voor. Verdun de F-actine kleurstof in PBS tot een eindconcentratie van 1 μM en gebruik DAPI als kant-en-klare nucleaire kleuring. Meng de kleurmiddelen grondig voor gebruik.
      OPMERKING: Falloïdine-gebaseerde kleuringsreagentia kunnen worden gebruikt als alternatief voor F-actinevisualisatie.
   2. Voeg het vlekmiddel toe aan de cultuurschalen.
   3. Breng de cellen 30 minuten uit bij 37°C in het donker.
   4. Verwijder de vlekoplossing.
   5. Was de cellen drie keer met PBS en gebruik 500 μL per wasbeurt gedurende 1 minuut per was.
   6. Voeg 1 ml PBS toe om te voorkomen dat de cellen uitdrogen tijdens de beeldvormingsvoorbereiding.
   7. Neem beelden met een Nikon omgekeerde confocale microscoop uitgerust met een ×20-objectieflens. Verzamel Z-stack beelden met een stapgrootte van 5 μm over een totaal beeldbereik van 40 μm (8 optische secties). Gebruik 405 nm excitatie voor DAPI, 488 nm excitatie voor F-actine kleuring, 594 nm excitatie voor Miro1 immunokleuring en 665 nm excitatie voor MitoTracker kleuring. Maakt beelden met een resolutie van 1024 × 1024 pixels onder lichtbeschermde omstandigheden bij RT.
   8. Voer kwalitatieve beoordeling uit met ten minste vijf willekeurig geselecteerde gezichtsvelden per steekproef. Evalueer TNT-achtige structuren, mitochondriën-geassocieerde fluorescentiesignalen en schijnbare colokalisatie tussen Miro1- en mitochondriën-geassocieerde kleuring binnen intercellulaire membraanverbindingen (Figuur 3A–3C).
      OPMERKING: Maak direct na het kleuren beelden om fluorescentieverlies en structurele verstoring van TNT's te minimaliseren.

Figuur 3: Colocalisatiekleuring van mitochondriën en Miro1 in TNT's in een astrocyt-neuron cocultuursysteem. (A) Representatieve confocale microscopiebeelden die nucleaire, mitochondriale, Miro1- en F-actinekleuring tonen in astrocyten en neuronen gekweekt in glasbodemkweekschalen. Witte pijlen geven gebieden aan van schijnbare colokalisatie tussen mitochondriën-geassocieerde signalen en Miro1 binnen TNT-achtige structuren. (B) Driedimensionale gereconstrueerde Z-stack afbeelding met TNT-achtige structuren gevormd tussen aangrenzende cellen. (C) Zijaanzicht reconstructie van dezelfde Z-stack afbeelding die TNT-achtige structuren toont die zich uitstrekken tussen aangrenzende cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

In astrocyt-monocultuurpreparaten werden dunne membraanuitstulpingen waargenomen die aangrenzende cellen verbinden na F-actine en nucleaire kleuring (Figuur 1A en 1B). Meerdere TNT-achtige structuren werden gedetecteerd die zich uitstrekten tussen naburige astrocyten, en individuele astrocyten vormden vaak verbindingen met verschillende omliggende cellen. Succesvol behoud van TNT-achtige structuren ging gepaard met voorzichtige behandeling tijdens het wassen en fixeren. Overmatige mechanische verstoring tijdens het verwijderen of wassen van het medium resulteerde in verminderde detecteerbaarheid en structurele verstoring van deze membraanverbindingen, zoals te zien is in verstoorde TNT-achtige structuren na onjuiste monsterbehandeling (Figuur 1C en 1D).

In astrocyt-neuron cocultuurpreparaten werden mitochondriën-geassocieerde fluorescentiesignalen waargenomen binnen TNT-achtige structuren die aangrenzende cellen verbinden na MitoTracker-kleuring en confocale beeldvorming (Figuur 2A en 2B). Deze structuren werden samen met F-actine en nucleaire kleuring gevisualiseerd ter ondersteuning van morfologische beoordeling van TNT-achtige verbindingen. Goede lichtbescherming en geminimaliseerde wasintensiteit verbeterden het behoud van het fluorescentiesignaal en de TNT-morfologie tijdens de beeldvormingsvoorbereiding.

In immunofluorescentie-colocalisatie-experimenten werden overlappende fluorescentiesignalen die overeenkomen met mitochondriën-geassocieerde kleuring en Miro1-immunokleuring waargenomen binnen TNT-achtige structuren in astrocyt-neuron cocultuurpreparaten (Figuur 3A). Deze waarnemingen suggereren een mogelijke associatie tussen Miro1 en mitochondriën die gelokaliseerd zijn binnen TNT-achtige structuren. Driedimensionale gereconstrueerde Z-stack beeldvorming ondersteunde verder de aanwezigheid van TNT-achtige structuren tussen aangrenzende cellen (Figuur 3B en 3C). TNT-behoud, fluorescentiesignaalintensiteit en beeldkwaliteit werden beïnvloed door fixatie-, permeabilisatie- en beeldvormingscondities.

Discussie

De eerste cruciale stap in het hierboven beschreven experimentele protocol is de lichtbeschermde voorbehandeling vóór fixatie. TNT-achtige structuren zijn zeer fragiel, en het behouden van lichtbeschermde omstandigheden na verwijdering uit de broedmachine is belangrijk om de fluorescentiesignaalintensiteit en structurele integriteit tijdens de monstervoorbereiding te behouden. De tweede cruciale stap is het uitvoeren van PBS-wasbetuiging met voorzichtige manipulatie om verstoring van TNT-achtige structuren veroorzaakt door vloeistofstroming te minimaliseren. Het naleven van deze belangrijke behandelingsprocedures helpt de morfologie en stabiliteit van TNT-achtige structuren te behouden en verbetert de consistentie van latere beeldvormingsresultaten. Overmatige aspiratie, langdurige wasbeurt of sterke vloeistofbeweging kan leiden tot instorting of fragmentatie van TNT-achtige structuren tijdens de monsterverwerking. Door hun zeer dynamische aard zijn TNT's gevoelig voor licht. Fototoxiciteit veroorzaakt door lichtblootstelling kan TNT-verstoring veroorzaken, waardoor deze structuren moeilijk te visualiseren^zijn. Daarom moeten lichtbeschermde omstandigheden worden gehandhaafd tijdens TNT-gerelateerde experimenten.

Intracellulaire mitochondriale beweging draagt bij aan de energiedistributie van cellulaire stoffen, vooral in neuronen. Studies hebben aangetoond dat mitochondriën zich kunnen bewegen langs actinefilamenten en microtubuli¹². Recente studies hebben ook aangetoond dat TNT's kunnen functioneren als intercellulaire communicatiestructuren op lange afstand die geassocieerd zijn met mitochondriale overdracht tussen neurale cellen¹³. De methodologische benadering die in deze studie wordt beschreven, maakt het mogelijk om TNT-achtige structuren en mitochondriën-geassocieerde fluorescentiesignalen in neurale celkweeksystemen te visualiseren. Eerdere studies hebben aangetoond dat intercellulaire mitochondriale overdracht tussen neurale cellen kan bijdragen aan weefselherstel en neuroprotectieve processen bij neurologische aandoeningen zoals de ziekte van Parkinson en cerebraal ischemisch letsel^14,15. Met behulp van de in deze studie beschreven methoden werden TNT-achtige structuren waargenomen tussen astrocyten en tussen astrocyten en neuronen, samen met mitochondriën-geassocieerde fluorescentiesignalen die binnen deze structuren gelokaliseerd waren.

Zoals opgemerkt in eerdere studies¹⁰, is MitoTracker-kleuring onderhevig aan kleurstoflekkage en niet-mitochondriale signaaloverdracht, wat de betrouwbaarheid van gegevens kan verminderen. Om deze beperking aan te pakken, zouden toekomstige onderzoeken robuustere methoden moeten gebruiken, zoals genetisch gecodeerde mitochondriale labeling, om meer overtuigende resultaten te verkrijgen. Onder de huidige experimentele omstandigheden werden de twee celtypen voornamelijk onderscheiden op basis van cellulaire morfologie, een benadering die de specificiteit van celtypeidentificatie kan verminderen. Toekomstige studies moeten celtype-specifieke fluorescerende labeling bevatten om de nauwkeurigheid van cocultuuranalyses te verbeteren. Miro1 is een adaptoreiwit dat gelokaliseerd is aan het buitenste mitochondriale membraan en is betrokken bij mitochondriale transportprocessen in neuronen^16,17. Met behulp van het immunofluorescentiecolocalisatieprotocol zoals beschreven in deze studie, werden overlappende fluorescentiesignalen die overeenkomen met mitochondriën-geassocieerde kleuring en Miro1-immunokleuring waargenomen binnen TNT-achtige structuren. Deze waarnemingen suggereren een mogelijke associatie tussen Miro1 en mitochondriën die gelokaliseerd zijn binnen TNT-achtige structuren. De ruimtelijke resolutie van conventionele confocale microscopie kan echter de definitieve beoordeling van moleculaire colocalisatie binnen dunne membraanuitsteeksels beperken.

We voerden Z-stack beeldvorming uit om de aanwezigheid van TNT-achtige structuren tussen cellen te bevestigen, wat de structurele validatie van deze membraanverbindingen ondersteunde. Hoewel het huidige protocol geschikt is voor de meeste experimentele omgevingen, kan confocale beeldvorming van vaste cellen resulteren in verlies van fragiele TNT-achtige structuren tijdens monsterverwerking in vergelijking met live-cel beeldvorming, waardoor de nauwkeurige TNT-kwantificering¹⁸ wordt beperkt. Bovendien maakt beeldvorming van gefixeerde cellen geen ondubbelzinnige bepaling van de mitochondriale overdrachtsrichting mogelijk, wat verder onderzoek in toekomstige studies vereist. Dit protocol biedt een gestandaardiseerde experimentele workflow voor het kleuren van TNT-achtige structuren, mitochondriën-geassocieerde signalen en verwante eiwitten in neurale celkweeksystemen. In vergelijking met ongecontroleerde was- en fixatieprocedures legt het protocol de nadruk op voorzichtige behandeling van monsters en fluorescentiebehoud tijdens de beeldvormingsvoorbereiding. Deze methoden kunnen helpen om de experimentele consistentie en reproduceerbaarheid in TNT-gerelateerde beeldvormingsstudies te verbeteren.

Samenvattend biedt deze studie een praktisch en breed toepasbaar laboratoriumprotocol voor de kwalitatieve beoordeling van TNT's en het onderzoek van mitochondriale transporten via TNT-achtige structuren. Echter, monsterverwerkingsstappen zoals fixatie en wassen kunnen kwantificatievariabiliteit introduceren in vergelijking met live-cel beeldvormingsmethoden. Bovendien biedt confocale microscopie een lagere ruimtelijke resolutie dan superresolutiemicroscopie, wat de gedetailleerde structurele karakterisering van TNT's beperkt. Daarnaast wordt mitochondriale kleuring op basis van MitoTracker beïnvloed door kleurstoflekkage en niet-specifieke signaaloverdracht, wat in toekomstige studies moet worden aangepakt om de experimentele nauwkeurigheid te verbeteren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1% triple antibioticmixtuur	Biosharp	BL142A	Voorkomt bacteriële en schimmelbesmetting tijdens celcultuur
4% weefselcelfixeermiddel	Solarbio	P1110	Celfixeermiddel
Anti-Miro1 antilichaam	Abcam	AB319154	Primair antilichaam tegen Miro1
Astrocyten	Laboratorium-geïsoleerde primaire cellen	NA	Astrocyten werden geïsoleerd uit de cerebrale cortex van neonatale SD-rattensnacks van 1–3 dagen oud. De zuiverheid van de geïsoleerde cellen werd bevestigd op >95% door GFAP-kleuring, en passage 3 (P3) cellen werden gebruikt voor alle experimenten
Astrocytcellencultuurmedium (DMEM/F-12)	Gibco	6125011	DMEM en F-12 werden gemengd in een verhouding van 1:1 (v/v), aangevuld met 10% foetaal bovien serum (FBS) en 1% drievoudig antibioticum
Confocale microscoop	Nikon AX	ECLIPSE TI2-E	Beelden werden verkregen met behulp van een Nikon AX confocale microscoop (Nikon Corporation, Japan) gecontroleerd door NIS-Elements (versie 5.4)
DAPI	Servicebio	G1012-100ML	Kernkleuringskleurstof
DMSO	BioFroxx	1084ML100	Oplosmiddel dat wordt gebruikt voor de bereiding van fluorescinerende kleurstof stockoplossingen
F-actinekleuringskleurstof	Thermo Fisher Scientific	A57243	F-actinekleuringsreagens voor visualisatie van cytoskeletal structuren en tunneling nanobuizen
Foetaal bovien serum	ExCell Bio	FSD500	Biedt essentiële voedingsstoffen voor celcultuur
Fluorescerend secundair antilichaam (Geiten Anti-Konijn IgG)	ABclonal	AS039	Secundair antilichaam voor immunofluorescentiekleuring
Celcultuurschaal met glazen bodem	NEST	801001	Beeldvormingsschaal voor confocale microscopie
Geitenserum	Solarbio	210C051	Blockingreagens voor immunofluorescentiekleuring
MitoTracker Deep Red	Thermo Fisher Scientific	M22426	Mitochondriale kleuringskleurstof
Neuronen	Celbank van CAS	HT22-GNM47	Gedeeltelijk onsterfelijke muis hippocampische neuronale cellen werden onderhouden in DMEM compleet medium. Cellen op passage 3 (P3) werden verzameld en gebruikt voor daaropvolgende experimenten.
Neuroncellencultuurmedium (DMEM)	Servicebio	G4511-500ML	DMEM aangevuld met GlutaPlus en natriumpyruvaat, zonder HEPES, aangevuld met 10% foetaal bovien serum (FBS) en 1% drievoudig antibioticum
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)	Servicebio	G4203-500ML	Wasbuffer gebruikt tijdens fixatie en kleuring
Triton X-100	Solarbio	P1080	Celpermeabiliseringsreagens