$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Deze studie werd uitgevoerd met gevestigde menselijke acute myelodiese leukemie-cellijnen en hun doxorubicineresistente derivaten. Er waren geen menselijke deelnemers, dieren of primaire door patiënten afgeleide monsters betrokken. Daarom was goedkeuring van de institutionele beoordelingscommissie voor onderzoek door mensen en goedkeuring van dierethiek niet vereist. De cellijnen werden verkregen van het Instituut voor Hematologie, Chinese Academie voor Medische Wetenschappen, Tianjin, China, en onderhouden in het Fujian Instituut voor Hematologie, Fujian Medical University Union Hospital. Celidentiteit werd bevestigd door karyotype en morfologisch onderzoek voorafgaand aan de experimenten, en alle celculturen werden getest op mycoplasma-contaminatie. De chemicaliën, apparatuur en software die in het protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.
1. Celkweek en bevestiging van het resistente fenotype
Menselijke HL60- en K562-acute myeloïde leukemiecellen en hun doxorubicineresistente derivaten, HL60/A en K562/A, zijn verkregen van het Instituut voor Hematologie van de Chinese Academie van Medische Wetenschappen, Tianjin, China. Cellen werden gekweekt in Roswell Park Memorial Institute 1640 medium, aangevuld met 10% foetaal rundserum en 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C in een bevochtigde broedmachine met 5% kooldioxide.
HL60/A-cellen werden onderhouden in een volledig medium met 1 μg/mL doxorubicine, en K562/A-cellen werden gehouden in een volledig medium met 5 μg/mL doxorubicine om het resistente fenotype te behouden. Doxorubicine werd een maand voor experimentele tests uit het kweekmedium verwijderd om acute effecten van geneesmiddelselectie tijdens behandelingstests te vermijden.
Voor de experimenten werd het resistente fenotype opnieuw bevestigd door de doxorubicine half-maximale inhibitieconcentratiewaarden tussen ouderlijke en resistente cellen te vergelijken. De resistentiestabiliteit na 1 maand geneesmiddelvrije kweek werd beoordeeld door de doxorubicine-gevoeligheidstest te herhalen en basale P-glycoproteïne en multidrug resistentie-geassocieerde eiwit 1-expressie te onderzoeken. Culturen werden alleen voor experimenten gebruikt wanneer de resistente derivaten een hogere doxorubicine half-maximale inhibitieconcentratiewaarden en een hogere transporterexpressie behielden dan hun ouderlijke tegenhangers.
2. Geneesmiddelenvoorbereiding en behandelingsontwerp
FTY720, doxorubicine en SC79 werden als standaardoplossingen bereid volgens de instructies van de fabrikant. FTY720 en SC79 werden opgelost in dimethylsulfoxide, en doxorubicine werd bereid in het aanbevolen oplosmiddel en beschermd tegen licht tijdens het hanteren. Werkoplossingen werden vers verdund in volledig kweekmedium vóór behandeling. De uiteindelijke dimethylsulfoxideconcentratie bleef identiek tussen de behandelgroepen en overschreed niet 0,1%.
Voertuigcontrolegroepen ontvingen dezelfde uiteindelijke dimethylsulfoxideconcentratie als de overeenkomstige behandelgroepen. Voor combinatie-behandelingsexperimenten werd 5 μM FTY720 gebruikt als sensibilisatieconcentratie. Doxorubicine werd gebruikt bij 4 μM voor HL60/A-cellen en 8 μM voor K562/A-cellen bij apoptose- en intracellulaire doxorubicine-accumulatieassays, tenzij anders vermeld.
3. Cellevensvatbaarheidstest en berekening van de halfmaximale inhibitorische concentratie
Cellen werden in 96-wellplaten geplaatst bij 1 × 104 cellen per put in een volledig medium van 100 μL. Voor FTY720 enkelvoudige geneesmiddeltesten werden HL60, K562, HL60/A en K562/A cellen behandeld met 0, 3,125, 6,25, 12,5, 25, 50 en 100 μM FTY720 gedurende 48 uur. Voor doxorubicine-gevoeligheidstesten werden HL60/A- en K562/A-cellen behandeld met seriële concentraties doxorubicine in aanwezigheid of afwezigheid van 5 μM FTY720 gedurende 48 uur.
De levensvatbaarheid van cellen werd gemeten met behulp van de Cell Counting Kit-8 assay volgens de instructies van de fabrikant. Na behandeling werd Cell Counting Kit-8 reagens aan elke put toegevoegd en werd de plaat 2 uur geïncubeerd bij 37 °C. De absorptie werd gemeten op 450 nm met een microplaatlezer.
De relatieve cellevensvatbaarheid werd als volgt berekend: relatieve cellevensvatbaarheid = [(absorptie van behandelde putten - absorptie van leegputten) / (absorptie van voertuigcontroleputten - absorptie van leegputten)] × 100%
Half-maximale inhiberende concentratiewaarden werden berekend met behulp van niet-lineaire regressie met een logistisch dosis-responsmodel met vier parameters in GraphPad Prism, versie 9.5. Elk experiment bevatte drie onafhankelijke biologische replicata, met drie technische putten per behandelingsconditie.
4. Geneesmiddelencombinatieanalyse
De effecten van FTY720 op doxorubicine gevoeligheid werden geëvalueerd door doxorubicine-dosis-responsrelaties te vergelijken in aanwezigheid of afwezigheid van FTY720. HL60/A- en K562/A-cellen werden behandeld met seriële concentraties van alleen doxorubicine of doxorubicine gecombineerd met FTY720 gedurende 48 uur.
De cellevensvatbaarheid werd beoordeeld met behulp van de Cell Counting Kit-8 assay, en de halfmaximale inhiberende concentratiewaarden werden berekend met behulp van niet-lineaire regressie met een vierparameter logistisch dosis-respons model. Veranderingen in doxorubicinegevoeligheid werden geïnterpreteerd op basis van verschuivingen in dosis-responscurves en verschillen in half-maximale remmende concentratiewaarden tussen behandelgroepen.
Omdat de experimenten niet waren ontworpen als een volledige dosis-matrixstudie met vaste verhoudingen, werd er geen formele combinatie-indexanalyse uitgevoerd. Daarom werden de resultaten geïnterpreteerd als bewijs van veranderde doxorubicinegevoeligheid in plaats van definitieve farmacologische synergie.
5. Apoptose-analyse met Annexine V en propidiumjodide flowcytometrie
HL60/A- en K562/A-cellen werden gezaaid in 6-wellplaten met 4 × 105 cellen/mL en 48 uur behandeld met vehicle, FTY720 alleen, alleen doxorubicine of doxorubicine gecombineerd met FTY720. Voor combinatiebehandeling werd 5 μM FTY720 gecombineerd met 4 μM doxorubisine in HL60/A-cellen of 8 μM doxorubicine in K562/A-cellen.
Na behandeling werden cellen verzameld, waaronder cellen die in het kweekmedium waren gesuspendeerd, en tweemaal gewassen met koude, fosfaatgevulde zoutoplossing. Cellen werden opnieuw opgehangen in Annexin V bindingsbuffer bij de concentratie aanbevolen door de fabrikant van de apoptose-detectiekit. Elk monster werd gekleurd met 5 μL Annexin V-fluoresceïne isothiocyanaat of Annexine V-allofycocyanine en 5 μL propidiumjodide, gevolgd door 15 minuten incubatie bij kamertemperatuur in het donker.
Monsters werden onmiddellijk geanalyseerd met flowcytometrie. Ongekleurde controles, enkelgekleurde controles en fluorescentie-minus-één controles werden gebruikt om compensatie- en kwadrantpoorten in te stellen. Afval werd uitgesloten met behulp van voorwaartse verstrooiing en zijwaartse verstrooiing. Vroege apoptotische cellen werden gedefinieerd als Annexine V-positieve en propidiumjodide-negatieve cellen, en late apoptotische of dode cellen werden gedefinieerd als Annexine V-positieve en propidiumjodide-positieve cellen. Totale apoptose werd berekend als de som van vroege en late apoptotische celfracties. Voor elk monster werden minstens 10.000 levensvatbare single-cel gebeurtenissen verkregen.
6. Intracellulaire doxorubicine-accumulatietest
HL60/A- en K562/A-cellen werden in 6-wellplaten geplaatst bij 4 × 10cellen van 5 ml en 's nachts gekweekt. Cellen werden vervolgens behandeld met voertuigcontrole, alleen doxorubicine, of doxorubicine gecombineerd met 5 μM FTY720. HL60/A-cellen werden behandeld met 4 μM doxorubicine, en K562/A-cellen werden behandeld met 8 μM doxorubicine. Cellen werden 4 uur geïncubeerd bij 37 °C en beschermd tegen licht.
Na de behandeling werden cellen geoogst en tweemaal gewassen met koud fosfaatgepufferde zoutoplossing om extracellulaire doxorubicine te verwijderen. Cellen werden opnieuw gesuspendeerd in fosfaatgebuffte zoutoplossing en geanalyseerd met flowcytometrie met behulp van de intrinsieke fluorescentie van doxorubicine. Onbehandelde cellen werden gebruikt om achtergrondautofluorescentie te definiëren, en met doxorubicine behandelde cellen werden gebruikt als fluorescentie-positieve referentie. De intracellulaire doxorubicine-accumulatie werd gekwantificeerd als mediane fluorescentieintensiteit na uitsluiting van afval en aggregate. Mediane fluorescentieintensiteitswaarden werden genormaliseerd naar de doxorubicine-alleen groep binnen elk onafhankelijk experiment.
7. Flowcytometrische analyse van P-glycoproteïne en multidrug resistentie-geassocieerde eiwit 1-expressie
HL60/A- en K562/A-cellen werden in 6-wellplaten geplaatst bij 2 × 106-cellen /mL en behandeld met 5 μM FTY720 of voertuigcontrole gedurende 24 uur. Na behandeling werden de cellen twee keer gewassen met ijskoude fosfaatgebuffte zoutoplossing en opnieuw gesuspendeerd in een 100 μL celkleuringsbuffer.
Cellen werden gekleurd met fycoerythrin-geconjugeerd anti-P-glycoproteïne-antilichaam en Alexa Fluor 647-geconjugeerd anti-multidrug resistentie-geassocieerd eiwit 1-antilichaam bij de door de fabrikant aanbevolen verdunning. Bijpassende isotypecontroles, ongekleurde regelingen, enkelkleurige controles en fluorescentie-minus-één regelaars werden opgenomen voor gate-instelling en compensatie. Monsters werden 30 minuten geïncubeerd bij 4 °C in het donker, twee keer gewassen met een celkleuringsbuffer en opnieuw opgehangen in een 500 μL celkleuringsbuffer voordat ze werden verworven.
Flowcytometrie werd uitgevoerd met een BD FACScan flowcytometer. Voor elk monster werden minstens 10.000 levensvatbare single-cel gebeurtenissen verkregen. De expressieniveaus van p-glycoproteïne en multidrug resistentie geassocieerd eiwit 1 werden gekwantificeerd als mediane fluorescentieintensiteit na aftrekking van het overeenkomstige isotype-controlesignaal. De genormaliseerde waarden werden uitgedrukt ten opzichte van de voertuig-controlegroep binnen elk onafhankelijk experiment.
8. Westerse blotting en densitometrische kwantificatie
Na de aangegeven behandelingen werden de cellen verzameld en twee keer gewassen met koude, fosfaatgevulde zoutoplossing. Het totale eiwit werd geëxtraheerd met behulp van een radioimmunoprecipitatie-assaybuffer, aangevuld met protease- en fosfataseremmers. De eiwitconcentratie werd gemeten met behulp van een bicinchoninezuur-eiwittestset.
In totaal werd 30 μg eiwit per baan gescheiden door natriumdodecylsulfaat-polyacrylamide gelelektroforese en overgebracht op polyvinylide-difluoridemembranen. De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk of 5% runderserumalbumine in Tris-gepufferde zoutoplossing met Tween 20 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
Membranen werden 's nachts geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen totale eiwitkinase B, gefosforyleerde protetekinase B, totaal mechanistisch doelwit van rapamycine, gefosforyleerd mechanistisch doelwit van rapamycine, gespleten caspase-3, gesplitste poly(adenosine difosfaat-ribose) polymerase, P-glycoproteïne, multidrug resistentie-geassocieerd eiwit 1 en glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase. Na het wassen werden membranen 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met de juiste mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antistoffen. Eiwitbanden werden visualiseerd met verbeterde chemiluminescentiedetectie.
Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ-software, versie 1.53t. Gefosforyleerd eiwitkinase B werd genormaliseerd tot totale eiwitkinase B, en gefosforyleerd mechanistisch doelwit van rapamycine werd genormaliseerd tot totaal mechanistisch doelwit van rapamycine. P-glycoproteïne, multidrug resistentie-geassocieerd eiwit 1, gespleten caspase-3 en gespleten poly(adenosine difosfaat-ribose) polymerase werden genormaliseerd tot glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase. Genormaliseerde waarden werden uitgedrukt als vouwveranderingen ten opzichte van de voertuigcontrole- of doxorubicine-alleen-groep, afhankelijk van de vergelijking. Western blot-analyses werden uitgevoerd met drie onafhankelijke biologische replicaten. Onbekrompen Western blot-afbeeldingen werden in het openbare databestand geplaatst of als aanvullende bestanden geüpload.
9. SC79 reddingsexperiment
Om te onderzoeken of eiwitkinase B-signalering geassocieerd was met de waargenomen effecten van FTY720, werden HL60/A- en K562/A-cellen behandeld met FTY720 in aanwezigheid of afwezigheid van SC79, een eiwitkinase B-activator. Cellen werden voorbehandeld met 5 μM FTY720 gedurende 12 uur en vervolgens behandeld met 30 μM SC79 of voertuigcontrole voor nog eens 12 uur.
Na behandeling werden fosforylereiwitkinase B, gefosforyleerd mechanistisch doelwit van rapamycine, P-glycoproteïne en multidrug resistentie-geassocieerde eiwit 1-niveaus beoordeeld met Western blotting. Parallel werd apoptose beoordeeld met Annexine V en propidiumjodide kleuring na doxorubicine, FTY720 en SC79-behandelingen. Reddingseffecten werden geïnterpreteerd als padgeassocieerd bewijs. Omdat er geen genetische overexpressie of knockdown-experiment werd uitgevoerd, werden causale conclusies voorzichtig gesteld.
10. Statistische analyse en gegevensrapportage
Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism, versie 9.5, en IBM SPSS Statistics, versie 23.0. Biologische replicaten werden gedefinieerd als onafhankelijke experimenten die op verschillende dagen werden uitgevoerd met onafhankelijk gekweekte cellen. Technische replicaten werden gedefinieerd als herhaalde putten of herhaalde metingen binnen hetzelfde biologische experiment.
De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde, tenzij anders vermeld. Tweegroepsvergelijkingen werden geanalyseerd met behulp van een ongepaarde tweezijdige Student's t-test wanneer de gegevens ongeveer normaal verdeeld waren. Vergelijkingen tussen drie of meer groepen werden geanalyseerd met eenrichtingsvariantie, gevolgd door Tukey's post hoc-test. Experimenten met twee onafhankelijke factoren, zoals geneesmiddelconcentratie en behandelingsconditie, werden geanalyseerd met tweerichtingsanalyse van variantie gevolgd door een passende meervoudige vergelijkingscorrectie.
Wanneer normaliteitsaannames niet werden ondersteund, werden niet-parametrische tests gebruikt. Exacte p-waarden werden waar mogelijk gerapporteerd. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05 na correctie voor meervoudige vergelijkingen. Alle figuurlegenda's gaven het aantal biologische replica's, de gebruikte statistische test, de betekenis van foutbalken en de significantiedrempel aan. Individuele biologische replicatieve waarden werden weergegeven in verstrooiingsdiagrammen of overgelegd op staafdiagrammen waar mogelijk.