Een herhaalde gewichtsverliesprocedure voor het opstellen van een muismodel van chronisch traumatisch hersenletsel

Samenvatting

Er wordt een protocol gepresenteerd voor het opzetten van een repetitief muizenmodel met een licht traumatisch hersenletsel met gesloten hoofd voor het bestuderen van de mechanismen achter chronisch depressief gedrag in afwezigheid van grove structurele hersenlaesies.

Samenvatting

Traumatisch hersenletsel (TBI) kan leiden tot aanhoudende neuropathologische veranderingen en langdurige neuropsychiatrische gevolgen. Tijdens het herstel ontwikkelt een aanzienlijk deel van de patiënten affectieve stoornissen, waaronder depressieve symptomen en slaapgerelateerde klachten, zelfs wanneer routinematige computertomografie of magnetische resonantiebeeldvorming geen duidelijke structurele afwijkingen laat zien. Experimentele modellen die deze kenmerken reproduceren, zijn nodig om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan chronische posttraumatische neuropsychiatrische symptomen. Hier presenteren we een protocol om een repetitief musmodel voor licht traumatisch hersenletsel met gesloten hoofd op te zetten voor het bestuderen van de mechanismen achter chronisch depressief gedrag, zonder duidelijke grove structurele hersenlaesies die kunnen worden waargenomen door macroscopisch onderzoek en T2-gewogen MRI. Bij deze methode wordt de intacte schedel blootgesteld en herhaaldelijk blootgesteld aan inslagen met behulp van gedefinieerde gewichtsverliesparameters gedurende vijf opeenvolgende dagen. Onder de hier beschreven omstandigheden veroorzaakt de procedure een gesloten hoofdletsel zonder een grove schedelbreuk of macroscopische focale kneuzing. Na een periode na het letsel vertonen muizen depressief gedrag, terwijl ze geen duidelijke focale structurele afwijkingen vertonen bij grove onderzoeken of T2-gewogen magnetische resonantiebeeldvorming onder de gebruikte omstandigheden. Dit protocol biedt een experimentele benadering voor het bestuderen van chronisch depressief gedrag na herhaald licht traumatisch hersenletsel en voor het evalueren van mogelijke therapeutische interventies.

Inleiding

Omdat het huidige paradigma echter voornamelijk lineaire impact levert op een muis met een hoofdvast, moet het worden geïnterpreteerd als een gesloten-hoofd rmTBI-model dat geoptimaliseerd is voor het bestuderen van chronische affectieve uitkomsten, in plaats van als een directe biomechanische imitatie van sportgerelateerde hersenschuddingen of lichte verkeersongevallen." Traumatisch hersenletsel (TBI) is momenteel een van de belangrijkste oorzaken van trauma-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit, en legt een aanzienlijke medische en economische last op gezinnen en de samenleving ^1,2. Opmerkelijk is dat schade aan het centrale zenuwstelsel na TBI niet voorbijgaand is; Het ontwikkelt zich meestal chronisch en progressief. Een studie naar TBI toonde aan dat zelfs 18 jaar na het letsel microgliale activatie aanhoudt, en langdurige chronische neuro-ontsteking ernstige neurale achteruitgang blijft veroorzaken³. Epidemiologische gegevens geven aan dat tot 28%–32% van de patiënten ernstige affectieve stoornissen ontwikkelen tijdens de^verlengde herstelfase 4. In dit artikel verwijst rmTBI naar het paradigma van repetitieve milde traumatische hersenletselinductie, terwijl de daaropvolgende chronische post-letsel fase, gekenmerkt door aanhoudende gedragsveranderingen, hier wordt aangeduid als chronisch traumatisch hersenletsel (c-TBI). De term c-TBI wordt hier gebruikt om de chronische post-letsel toestand te beschrijven die wordt gekenmerkt door aanhoudende gedragsveranderingen na rmTBI, in plaats van een duidelijk blessureparadigma. Dit gebruik is conceptueel consistent met ons eerdere werk dat aantoont dat experimentele TBI kan evolueren als een progressief chronisch proces dat geassocieerd is met langdurige histopathologische en gedragsafwijkingen.

Deze chronische neuropsychiatrische gevolgen schaden ernstig de kwaliteit van leven en functionele uitkomsten^{van patiënten 5}. De exacte pathogenese achter deze secundaire affectieve stoornissen blijft echter onduidelijk, en de klinische behandelingsopties zijn sterk beperkt. Daarom is het onderzoeken van de mechanismen van c-TBI-geïnduceerd depressief gedrag en het identificeren van precieze therapeutische doelen van dringende klinische noodzaak en van groot praktisch belang.

Om de pathologische mechanismen van TBI te verduidelijken, hebben onderzoekers verschillende diermodellen ontwikkeld, waarvan het controlled cortical impact (CCI)-model momenteel een van de meest gebruikte ^6,7 is. CCI maakt de precieze controle van impactparameters mogelijk om zeer reproduceerbare focale laesies te genereren. Zowel CCI- als traditionele fluid-percussie-letsel (FPI)-modellen vereisen echter doorgaans een craniotomie. Deze benaderingen zijn vooral nuttig voor het bestuderen van focale kneuzingen, weefselverlies en ernstige laesie-gerelateerde neuro-inflammatoire reacties, maar ze simuleren doorgaans ernstige open TBI, wat aanzienlijk verschilt van de meest voorkomende klinische presentaties van milde gesloten hoofdletsels, zoals sportgerelateerde hersenschuddingen ^8,9. Cruciaal is dat hersenweefselnecrose, gliale littekens en late cavitatie veroorzaakt door craniotomie en impact twee grote beperkingen met zich meebrengen. Ten eerste veroorzaken ernstige structurele tekorten vaak motorische disfunctie, wat direct de nauwkeurige beoordeling van gedragsuitkomsten verstoort. Ten tweede snijdt het fysieke verlies van weefsel langeafstandsneurale projecties door. Zoals aangetoond in eerdere studies met het CCI-geïnduceerde TBI-model, vertoonden muizen significante focale hersenkneuzingen⁴. Deze structurele verstoring belemmert ernstig de toepassing van geavanceerde neuroanatomische technieken, zoals virale tracering, waardoor het grotendeels onhaalbaar is om psychiatrische symptomen en hun bijbehorende neurale circuits te onderzoeken. Daarom blijven deze modellen waardevol voor studies van ernstige of focale TBI, maar zijn ze mogelijk minder geschikt wanneer het doel is om chronische affectieve afwijkingen te onderzoeken na herhaald licht gesloten hoofdletsel, vooral wanneer het behoud van structurele integriteit belangrijk is voor gedrags- en circuitanalyses.

Om de beperkingen van de eerder genoemde modellen voor ernstige open TBI te overwinnen, beschrijft deze studie een protocol voor het vaststellen van een muismodel voor repetitief licht traumatisch hersenletsel (rmTBI) met behulp van een gewichtsdropmethode op de blootgestelde, intacte schedel zonder craniotomie. Dit protocol gebruikt nauwkeurig gedefinieerde impactparameters: een valhoogte van 25 cm en een gewicht van 20 g. De inslagplaats werd gericht op 2 mm links van de sagittale hechting en 2 mm achter de coronale hechting, waarbij een gebogen metalen impactpunt met een diameter van 4 mm werd gebruikt om de nauwkeurigheid en uniformiteit van de impactkracht te waarborgen. Bovendien zorgt de specifieke frequentie van herhaalde effecten over vijf opeenvolgende dagen voor de stabiliteit van chronische pathologische veranderingen. Uitgebreide evaluaties met MRI, histopathologie en gedragstests tonen aan dat dit muismodel significant depressief gedrag vertoont, terwijl het de structurele integriteit van de hersenen behoudt, zonder duidelijke focale kneuzingen of motorische tekorten. Dit fenotypische profiel legt geselecteerde gedragskenmerken vast van herhaald licht hoofdletsel, inclusief neuropsychiatrische veranderingen ondanks dat er geen duidelijke structurele afwijkingen zijn op routinematige neuroimaging 10,11,12,13. Omdat het huidige paradigma echter voornamelijk lineaire impact levert op een muis met een hoofd, moet het worden geïnterpreteerd als een gesloten-hoofd rmTBI-model dat geoptimaliseerd is voor het bestuderen van chronische affectieve uitkomsten, in plaats van als een directe biomechanische imitatie van sportgerelateerde hersenschuddingen of lichte verkeersongevallen.

Protocol

Alle dierprocedures zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van het Institute of Artificial Intelligence, Hefei Comprehensive National Science Center (goedkeuringsnummer IAI2024071004). Alle procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met institutionele en nationale richtlijnen voor de verzorging en het gebruik van proefdieren. Een schematisch diagram van het experimentele protocol is weergegeven in Figuur 1. Vergelijkbare apparatuur van andere leveranciers kan worden gebruikt, mits de kritieke prestatiekenmerken worden gehandhaafd, zoals het impactgewicht van 20 g, 25 cm valhoogte, 4 mm impactpuntdiameter, betrouwbare isofluraneafgifte en MRI-instellingen vergelijkbaar met die hier. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.

1. Diervoorbereiding

1. Maak de dieren klaar.
   1. Gebruik mannelijke C57BL/6N-muizen van 8–10 weken oud en met een gewicht van 20–25 g.
   2. Houd de muizen in individueel geventileerde kooien (IVC's) in een specifieke ziekteverwekkervrije (SPF) dierenfaciliteit. Geef voedsel en water en gebruik en houd een 12 uur licht/12 uur donkercyclus aan onder gecontroleerde temperatuur en vochtigheid.
   3. Wennen de muizen aan de huisruimte vóór het experiment en routinematige gezondheidscontroles uitvoeren volgens de procedures voor de institutionele dierenverzorging.
2. Wijs de groepen toe.
   1. Wijs de muizen willekeurig toe aan de Naïeve groep, de Sham-groep en de c-TBI groep. Onderzoekers die verantwoordelijk waren voor MRI-interpretatie, grove pathologische beoordeling en gedragsscore/data-analyse waren blind voor groepstoewijzing.
   2. Noteer het dieridentificatienummer en de groepstoewijzing vóór de eerste blessuresessie.

2. Voorbereiding op operatie en anesthesie

1. Bereid de chirurgische instrumenten en het anesthesiesysteem voor.
   1. Bereid een steriel scalpel voor met een No. 11 mes, steriele wattenstaafjes, steriele fysiologische zoutoplossing, 10% povidon-jodiumoplossing, 5-0 niet-absorberbare polypropyleen monofilament hechting, plakband en chlortetracycline oogzalf.
   2. Steriliseer de chirurgische instrumenten vóór gebruik, plaats ze op een schoon operatieveld en houd de aseptische techniek aan gedurende de hele procedure. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, een labjas en oogbescherming.
   3. Maak een thermostatisch verwarmingskussen klaar en zet het op 37 °C ± 0,5 °C.
   4. Verbind de inductiekamer en neuskegel met het laboratoriumgasanesthesiesysteem voor dieren.
   5. Stel de zuurstofstroom in op 0,5–1,0 L/min en bereid de isoflurane-vaporizer voor op inductie en onderhoud. Voer anesthesie uit in een goed geventileerde ruimte of gebruik een goedgekeurd afvalgasopvangsysteem.
2. Maak de muis klaar voor de operatie.
   1. Dien buprenorfine HCl toe (0,1 mg/kg, intraperitoneaal) 30 minuten voor narcose en operatie volgens het goedgekeurde dierprotocol.
   2. Plaats de muis in de inductiekamer en induceer anesthesie met isoflurane. Stel de vaporizer in op 3%–5% voor inductie en monitor de muis continu totdat de rechtstaande reflex verdwijnt en de spontane beweging van de ledemaat stopt. Niet meer dan 5% isofluraan tijdens inductie.
   3. Breng de muis over naar een stereotaxisch frame in buikligging en houd de narcose door een neuskegel. Verlaag de instelling van de vaporizer naar 1%–2% voor onderhoud, terwijl de zuurstofstroom op 0,5–1,0 L/min blijft.
      1. Houd tijdens de procedure een stabiele ademhalingsfrequentie van ongeveer 60–100 ademhalingen per minuut aan. Als de ademhalingsfrequentie onder de 60 ademhalingen per minuut zakt of de ademhaling oppervlakkig of onregelmatig wordt, verlaag onmiddellijk de isofluranconcentratie, zorg voor ondersteunende verwarming en stel de impact uit tot de ademhaling stabiel is. Niet meer dan 2% isofluraan tijdens onderhoud.
   4. Bevestig voldoende anesthesie door het ontbreken van een pedaalterugtrekkingsreflex, bevestig het hoofd met de oorbeulen van het stereotacische frame zonder de trommelvliezen te beschadigen (Figuur 2A), en houd de muis in de buikliggend. Als voldoende anesthesie niet kan worden bereikt binnen de opgegeven inductie- en onderhoudsbereiken, of als er sprake is van overmatige ademhalingsdepressie, sluit het dier dan uit van die blessuresessie.
   5. Breng chlortetracycline oogzalf aan op beide ogen, scheer de hoofdhuid en desinfecteer de operatieplaats met een oplossing van 10% povidon-jodium.

3. Het vaststellen van het model van repetitief licht traumatisch hersenletsel

1. Ontbloot de schedel.
   1. Maak een longitudinale middenlijninsnijding, ongeveer 0,5 cm tot 1 cm lang, in de hoofdhuid met een steriel scalpel uitgerust met een No. 11 mes.
   2. Snijd het subcutane weefsel en het periost bot open met steriele pincetten of wattenstaafjes om de schedel volledig bloot te leggen zonder het botoppervlak te bekrassen.
   3. Veeg het schedeloppervlak af met een steriel wattenstaafje dat is bevochtigd met fysiologische zoutoplossing om de schedelmarkeringen te visualiseren, waaronder bregma en de coronale hechting.
2. Maak het impactapparaat klaar.
   1. Plaats een gebogen metalen slagpunt van 4 mm met diameter op het vrijvallende gewicht-drop-apparaat.
   2. Stel de drophoogte in op 25 cm en gebruik een impactgewicht van 20 g (Figuur 2B).
3. Geef de impact.
   1. Identificeer de inslagplaats op een punt 2 mm links van de sagittale hechting en 2 mm achter de coronale hechting op het schedeloppervlak (Figuur 2C).
   2. Lijn de impactortip verticaal uit over de doellocatie, laat hem voorzichtig zakken tot hij het schedeloppervlak raakt, en zorg ervoor dat de punt gecentreerd en loodrecht op de schedel blijft voordat het gewicht wordt losgelaten.
   3. Laat het gewicht van 20 g los vanaf een hoogte van 25 cm om één enkele impact te leveren.
   4. Voor de Naïeve groep moet geen anesthesie of operatie worden uitgevoerd. Voor de Sham-groep dient u anesthesie toe en maakt u een incisie op de hoofdhuid, maar zorgt er geen impact voor.
4. Naai de incisie en bied postoperatieve zorg.
   1. Verwijder direct na de impact de tip van de impactor en inspecteer de operatieplaats.
   2. Sluit de hoofdhuidincisie met een onderbroken 5-0 niet-absorberbare polypropyleen monofilamenthechting en desinfecteer de incisieplaats met een oplossing van 10% povidon-jodium.
   3. Plaats de muis op een thermostatisch verwarmingskussen op 37 °C ± 0,5 °C, monitor de ademhaling tot volledig hersteld en vrij lopen, en breng de muis daarna terug naar zijn thuiskooi.
      OPMERKING: Herstel wordt gedefinieerd door het terugkeren van regelmatige spontane ademhaling, het herstel van de rechtstaande reflex en spontane loopbeweging. Acute apneu en zichtbare bloeding moeten direct na elke impact en tijdens het vroege herstel worden gemonitord. Dieren die langdurige apneu vertonen, zichtbare bloedingen, niet binnen 10 minuten na het stoppen van isofluraan de recteringsreflex terugkrijgen, of niet spontaan bewegen, moeten worden uitgesloten van verdere procedures en worden behandeld volgens het goedgekeurde dierprotocol.
   4. Gooi gebruikte messen en naalden weg in een goedgekeurde container voor scherpe voorwerpen. Verwijder dierlijk afval en besmet materiaal in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsvoorschriften.
5. Herhaal de blessure.
   1. Herhaal stappen 3.1–3.4 elke 24 uur gedurende 5 opeenvolgende dagen om in totaal 5 effecten te bereiken.
   2. Houd het lichaamsgewicht en de activiteit continu in de gaten tijdens de postoperatieve herstelperiode. Sluit dieren uit van vervolganalyses als ze een schedelbreuk, zichtbare bloeding, epileptische aanval, aanhoudend cirkelen of het onvermogen om zelfstandig te eten of drinken ontwikkelen.

4. Het verkrijgen van magnetische resonantiebeelden

OPMERKING: In deze studie werd een MRI uitgevoerd op dag 7 na het laatste letsel. Muizen werden gescand onder isoflurane anesthesie en werden niet opgeofferd voor beeldvorming. Weefselverzameling werd uitgevoerd na beeldvorming volgens het experimentele schema.

1. Maak het dier klaar voor een MRI.
   1. Verdoof de muis met isoflurane en plaats hem op een MRI-compatibel dierenbed met een neuskegel.
   2. Controleer de ademhaling gedurende de hele scan en houd de lichaamstemperatuur op 37 °C ± 0,5 °C.
2. Verkrijg T2-gewogen beelden
   1. Maakt beelden op een 9,4 T supergeleidende magneet met een boring van 30 cm en een gradiëntsysteem met een maximale gradiëntsterkte van 1000 mT/m en een maximale slew rate van 10.000 T/m/s.
   2. Gebruik een 86 mm volumespoel voor radiofrequentietransmissie en een 15 mm vlakke spoel voor signaalreceptie.
   3. Verkrijg T2-gewogen hoogresolutie multi-slice snelle spin-echo beelden met de volgende parameters: herhalingstijd = 3000 ms, echotijd = 46,34 ms, echo-treinlengte = 13, ontvangerbandbreedte = 220 Hz/pixel, gezichtsveld = 20 × 20 mm², acquisitiematrix = 208 × 208, slicedikte = 0,5 mm, slice gap = 0 mm en aantal excitaties = 2.
   4. Neem 30 plakjes om het hele brein te bedekken. Gebruik een totale verwervingstijd van 1 minuut 33 seconden. In de huidige studie werd T2-gewogen MRI uitsluitend gebruikt voor kwalitatieve beoordeling. Er is geen kwantitatieve MRI-analyse uitgevoerd.
      OPMERKING: MRI-beelden werden kwalitatief beoordeeld door een onderzoeker die blind was voor groepsopdracht.

5. Beoordeling van de grove neuropathologie

1. Voer weefselverzameling uit.
   1. Doof de muis diep volgens het goedgekeurde dierprotocol.
   2. Open de thoracale holte, ontbloot het hart, steek een perfusienaald in de linker hartkamer en snijd het rechter atrium in.
   3. Perfusie met normale zoutoplossing, daarna met 4% paraformaldehyde (PFA). Voer de volledige perfusieprocedure uit in een gecertificeerde chemische dampkap en vermijd direct huid- of oogcontact met PFA. Verwijder weefsels en vloeibaar afval in overeenstemming met de voorschriften voor gevaarlijk afval en bio-veiligheid.
   4. Verzamel de schedel en het intacte brein en maak vieze beelden met een hoge-resolutie camera.
      OPMERKING: Een grove pathologische evaluatie werd uitgevoerd door een onderzoeker die blind was voor groepstoewijzing.

6. Monitor het lichaamsgewicht

1. Registreer het lichaamsgewicht.
   1. Weeg elke muis vóór de eerste blessuresessie en op dag 1, 3, 7, 14, 21 en 30 na het letsel, en registreer de waarden om de algemene gezondheidstoestand in de tijd te beoordelen.

7. Voer de beam-walk test uit

1. Maak het apparaat gereed.
   1. Gebruik een horizontale houten balk van 1 m lang en 1 cm breed en hang deze 30 cm boven de grond.
2. Test motorcoördinatie.
   1. Plaats de muis aan het beginpunt van de bundel, laat deze naar het eindpunt bewegen en registreer de tijd die nodig is om de bundel te kruisen.
   2. Voer de test uit vóór het letsel en op dag 1, 3, 7, 14, 21 en 30 na het letsel.
      OPMERKING: Gedragstests werden ingepland om de overlapeffecten tussen de tests te minimaliseren. Omdat de staartophangingstest (TST) en de gedwongen zwemtest (FST) stressverwekkender zijn dan de open veld test (OFT), werden ze eerst uitgevoerd, gevolgd door het OFT en Barnes doolhof op latere tijdstippen. Deze sequentie werd geselecteerd om mogelijke verstoring door eerdere habituatie of herhaalde exploratieve blootstelling tijdens latere gedragsbeoordelingen te verminderen.

8. Het uitvoeren van de staartophangingstest

1. Maak het apparaat gereed.
   1. Voer de test uit op dag 7 na de blessure en plaats een plexiglazen cilinder over de staart om te voorkomen dat de staart klimt. Gebruik een cilinder van 4 cm lang met een buitendiameter van 1,6 cm, een binnendiameter van 1,2 cm en een gewicht van 1,6 g.
2. Noteer het gedrag.
   1. Bevestig de staart aan de ophangdoos met lijmtape, zorg dat de muis niet de onderkant van de doos kan bereiken, en hang de muis 3 minuten op.
   2. Neem de hele sessie op met een hogeresolutiecamera en analyseer handmatig de mobiliteitstijd en immobiliteitstijd van de opgenomen video door een blinde toeschouwer.

9. Het uitvoeren van de verplichte zwemtest

1. Maak het apparaat gereed.
   1. Voer de test uit op dag 10 na het letsel en vul een transparante cilinder van 25 cm hoog en 15 cm in diameter met water dat op 23–25 °C wordt gehouden. Gebruik een waterdiepte die voorkomt dat de staart en achterpoten de bodem raken.
2. Noteer het gedrag.
   1. Plaats de muis 6 minuten in het water en neem de hele sessie vast met een camera met hoge resolutie.
   2. Analyseer de laatste 4 minuten van de opname handmatig door een blinde waarnemer en kwantificeer de mobiliteitstijd en immobilitetijd.
   3. Definieer immobiliteit als alleen de minimale bewegingen die nodig zijn om het hoofd boven water te houden.

10. Het uitvoeren van de open veld-test

1. Maak het apparaat gereed.
   1. Voer de test uit op dag 14 na het letsel in een stille kamer onder constante verlichting. Dit latere tijdstip werd gekozen om afstand te nemen van de voorgaande TST- en FST-sessies en zo de acute stressgerelateerde overdracht naar de OFT te verminderen.
   2. Gebruik een open veldkas van 40 cm × 40 cm × 40 cm.
2. Leg verkennend gedrag op en analyseer je.
   1. Plaats de muis in het midden van de arena en laat hem 6 minuten vrij verkennen.
   2. Volg het gedrag 6 minuten met behulp van gedragsvolg- en analysesoftware. Kalibreer de arenaafmetingen in de software zodat ze overeenkomen met het 40 cm × 40 cm toestellen en verdeel de arena virtueel in een 5 × 5 raster.
   3. Definieer de 16 buitenste vierkanten als de perifere zone en de 9 binnenste vierkanten als de middenzone. Stel de dierenkleur donkerder in dan de achtergrondkleur. Volg alleen het lichaam van het dier; Volg de kop of staart niet. Leg de achtergrond handmatig vast.
   4. Gebruik de software om de gemiddelde snelheid, de tijd die in de middenzone wordt doorgebracht, de tijd die in de perifere zone wordt doorgebracht en de totale afstand die gedurende de volledige testperiode wordt afgelegd, te meten.
   5. Maak het apparaat schoon en ontgeurt het apparaat voor en na elke proef om geursignalen te verwijderen.

11. Het uitvoeren van het Barnes-doolhof

1. Maak het apparaat gereed.
   1. Begin met de Barnes Maze-beoordeling op dag 30 na een blessure.
   2. Gebruik een rond roestvrijstalen platform van 1 m in diameter met 20 gelijkmatig verdeelde gaten.
   3. Plaats de ontsnappingsbox onder een aangewezen doelgat, plaats visuele aanwijzingen rond het doolhof en houd de locatie van het doelgat constant voor alle proeven.
2. Het uitvoeren van de trainingsfase
   1. Zet 90 dB witte ruis aan als aversieve prikkel tijdens de training.
   2. Plaats de muis onder een transparante cilinder in het midden van het platform gedurende 120 seconden.
   3. Verwijder de cilinder en laat de muis tot wel 180 seconden verkennen.
   4. Registreer een geslaagde proef wanneer alle vier de poten de ontsnappingsbox binnenkomen.
   5. Leid de muis naar de escapebox als deze het doel binnen 180 seconden niet kan lokaliseren en registreer de latentie als 180 seconden.
   6. Laat de muis 60 seconden in de escapebox blijven.
   7. Herhaal de trainingsproef één keer na een interval van 4–5 uur op elke trainingsdag en ga 4 dagen achter elkaar door met trainen.
3. Afnemen van de rustdag en testfase
   1. Onderbreek de training voor 1 dag na de trainingsfase.
   2. Plaats de muis in het midden van het platform op de testdag en laat tot 180 seconden verkennen.
   3. Stel de diameter van het doolhof in op 100 cm voor kalibratie van de schaal, en zorg ervoor dat de tracking arena in het videoframe is gecentreerd. Stel de dierenkleur donkerder in dan de achtergrond. Volg alleen het lichaam van het dier; Volg de kop of staart niet. Leg de achtergrond handmatig vast.
   4. Noteer de latency om de escape box binnen te gaan, de gemiddelde snelheid en de totale afstand die tijdens de 180 seconden testsessie wordt afgelegd met behulp van een gedragsvolg- en analysesoftware. Definieer de ontsnappingszone in de software op basis van de locatie van het aangewezen doelgat vóór de analyse.

12. Data-analyse

1. Bereid de dataset voor.
   1. Verzamel de gedrags-, beeldvormings- en lichaamsgewichtsgegevens in een statistische en grafische software.
   2. Druk de gegevens uit als het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM).
2. Voer statistische analyses uit.
   1. Analyseer longitudinale lichaamsgewicht- en straalloopgegevens in deze studie met een lineair mixed-effects model waarbij groep, tijd en hun interactie vaste effecten zijn en dier een willekeurig effect, gevolgd door post-hoc meervoudige vergelijkingstests indien van toepassing.
   2. Analyseer TST-, FST-, OFT- en Barnes-doolhofuitkomsten met gewone eenrichtings-ANOVA voor normaal verdeelde gegevens met homogene varianties, gevolgd door Tukey's post hoc-test wanneer de totale ANOVA significant was. Voor niet-parametrische data gebruik je de Kruskal-Wallis-test gevolgd door Dunns post hoc-test.
   3. Rapporteer exacte p.-waarden waar beschikbaar, samen met de teststatistiek, vrijheidsgraden en een effectgroottemaat (R² voor eenrichtings-ANOVA). Leid alle gerapporteerde p-waarden af uit de hierboven genoemde statistische tests en voer alle analyses uit in de statistische en grafische software.
   4. Stel statistische significantie in op p. < 0,05.

Resultaten

Beeldvorming en neuropathologische evaluatie van c-TBI-muizen

Om de algehele gezondheidstoestand en basale motorische functie van de dieren te beoordelen, werden lichaamsgewichten en balk-loopprestaties gemonitord volgens de tijdlijn in Figuur 1. Longitudinale groepsverschillen werden geanalyseerd met een lineair gemengd-effect model waarbij dier als willekeurig effect diende. Voor de modellering waren er geen sta...

Discussie

Deze studie beschrijft een gestandaardiseerd experimenteel protocol voor het opzetten van een muismodel voor herhaald licht traumatisch hersenletsel (rmTBI) met behulp van een herhaalde vrijvallende gewichtsverliesmethode. Door de schedel-blootgestelde muis vast te zetten in een stereotaxisch apparaat en herhaaldelijk inslagen toe te passen op gedefinieerde coördinaten met een gewicht van 20 g dat van een hoogte van 25 cm vijf opeenvolgende dagen werd gedropt, werd een gedragsfenotype ge...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
5-0 nonabsorbable polypropylene monofilament suture	Jinhuan Medical	I303	wondsluiting
Anesthesia machine	RWD Life Science	R550	constructie van diermodellen
ANY-maze gedragsvolgsoftware	Stoelting	Versie 7	gedragssoftware
Barnes-labyrint	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XB108	gedragssoftware
Biorender	BioRender	https://biorender.com	wetenschappelijk onderzoekstekeningsoftware
Buprenorfine	Sigma-Aldrich	Y0001108	postoperatieve pijnstilling
Elektrisch scheerapparaat	AUX	AUX-C5-1	voorbehandeling van haardverwijdering
Gedwongen zwemtest	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	gedragssoftware
GraphPad Prism 9.5	La Jolla	9.5	statistische software
Isofluraan	RWD Life Science	R510-22-10	constructie van diermodellen
Muizen	Charles river	C57/6N	experimenteel dier
Open veldtest	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XZ301	gedragssoftware
Oftalmische zalf	BEIJING TWINLUCK PHARMACEUTICAL	H11021342	voorkomen van hoornvliesuitdroging tijdens anesthesie
Paraformaldehyde (PFA), 4%	Biosharp	BL539A	perfusie en weefselfixatie
Fosfaat-gebufferd zout (PBS)	Biosharp	BL1425A	perfusie en weefselwassing
Povidon-jodiumoplossing, 10%	Beyotime	27883-25g	huiddesinfectie vóór operatie
Preklinisch magnetische resonantiebeeldvormingssysteem	United Imaging Life Science Instrument	uMR9.4T	beeldvormingssoftware
Schelpmesje nr. 11	Jinhuan Medical	K3-11	huidincisie tijdens operatie
Schelpmeshandvat	Jinhuan Medical	K6-10	gebruikt met schelpmesje nr. 11
Stereotaxis-instrument	RWD Life Science	68025	constructie van diermodellen
Steriele gaas	HYNAUT	BK05	bloedingscontrole en chirurgische reiniging
Staartophangingstest	Shanghai Xinruan Information Technology	XR-XQX201	gedragssoftware
Gewigtedrop-impactor	RWD Life Science	68093	constructie van diermodellen