Methodenartikel

Hybridisatiekettingreactie FISH in de zich ontwikkelende Drosophila optische lob

DOI:

10.3791/71681

⸱

17 juli 2026

 ,  ,  , 
1Department of Biology, New York University, 2Department of Biological Sciences, Columbia University, 3Department of Biology, The City College of New York

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de stappen die nodig zijn om hybridisatiekettingreactie fluorescerende in situ hybridisatie (HCR-FISH) uit te voeren in oogtische lobben van Drosophila melanogaster-larven . Procedures voor probe-ontwerp, hybridisatie, amplificatie en weefselmontage worden gedetailleerd om de visualisatie van de zich ontwikkelende optische kwab te vergemakkelijken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het begrijpen van neurale ontwikkeling vereist nauwkeurige karakterisering van wanneer en waar genen tot expressie komen. Technieken zoals in situ hybridisatie maken al lange tijd visualisatie van genexpressie in zich ontwikkelende weefsels mogelijk. Hoewel in situ hybridisatie veel wordt gebruikt in Drosophila melanogaster-embryo's , is de toepassing ervan voor de ontwikkeling van visuele systemen beperkt door verschillende technische uitdagingen. Zo dringen lange probes vaak slecht door in de optische kwab, en protocollen die vertrouwen op diffunderbare katalytische reporters, zoals mierikswortelperoxidase, leveren vaak lage signaal-ruisverhoudingen op in hele mount-preparaten. Hybridisatiekettingreactie fluorescerende in situ hybridisatie (HCR-FISH) overwint veel van deze beperkingen en maakt robuustere signaaldetectie mogelijk. Net als bij conventionele FISH hybridiseren DNA-probemonomeren met RNA-sequenties binnen weefsels. In HCR-FISH vormen fluorescentie-geconjugeerde versterkerprobes echter stabiele haarspeldstructuren die polymerisatie van extra monomeren veroorzaken, waardoor de signaalintensiteit wordt versterkt. Het gebruik van gemultiplexeerde probesets maakt ook het gebruik van kortere oligonucleotiden mogelijk (~45 nt, vergeleken met tot 1.000 nt in conventionele FISH), wat de penetratie van de probe verbetert en een meer uniforme kleuring in hele montagemonsters oplevert. Dit artikel beschrijft een HCR-FISH-protocol dat is geoptimaliseerd voor de optische kwab van Drosophila-larven . Het protocol past bestaande HCR-FISH-benaderingen aan door fixatiecondities te optimaliseren en de concentraties van sonde en haarspelden te verhogen om de signaalintensiteit en weefselpenetratie te verbeteren. Reagentialijsten en stapsgewijze procedures worden verstrekt. Potentiële toepassingen in de ontwikkelingsneurobiologie worden ook gepresenteerd, waaronder visualisatie van pasgeboren neuronen en karakterisering van genexpressiepatronen in gevallen waarin conventionele methoden, zoals endogeen getagde eiwitten of antistofkleuring, onvoldoende informatie bieden.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te begrijpen hoe de hersenen zijn samengesteld, moet je zowel de diversiteit van aanwezige celtypen als de genenrepertoires binnen elke cel type1 identificeren. Recente vooruitgang in single-cell RNA-sequencing heeft onderzoekers in staat gesteld deze vragen op hoge resolutiete beantwoorden. Veel single-cell benaderingen behouden echter geen ruimtelijke informatie, waardoor extra experimenten nodig zijn om transcriptiecelclusters in kaart te brengen naar hun locaties binnen de zich ontwikkelende hersenen.

Binaire genexpressiesystemen zoals GAL4-UAS kunnen positionele informatie leveren, maar zijn niet kwantitatief3. Daarnaast kunnen vertragingen tussen genexpressie en detectie door de reporter fysiologisch relevante expressiepatronen tijdens vroege ontwikkelingsstadia verhullen. Immunokleuring is een andere veelgebruikte methode om weefselspecifieke expressiepatronen te bepalen4. Echter, afgescheiden eiwitten zijn vaak diffuus en moeilijk nauwkeurig te lokaliseren.

Nucleotidelabeling-methoden, zoals in situ hybridisatie (ISH), zijn ook veelvuldig gebruikt om ruimtelijke informatie over genexpressie te verkrijgen5. In ISH binden gelabelde DNA-oligonucleotiden aan omgekeerd-complementaire RNA-sequenties van interesse. Vroege ISH-methoden gebruikten radiogelabelde DNA-probes6, terwijl latere protocollen veiligere labels zoals digoxigenine, fluoresceïne en rhodamine 7,8,9 bevatten. Wetenschappers pasten ISH snel aan voor gebruik in Drosophila melanogaster, waar het werd toegepast om de organisatie van polytene chromosoomen te karakteriseren en de expressiepatronen van gapgenen zoals bochelrug in whole-mount embryo'sin kaart te brengen.

Ondanks het brede nut belemmerden verschillende technische beperkingen de adoptie van ISH in dikkere hele mount-preparaten zoals de larvale optische lob. Veel in situ-protocollen vertrouwden op diffuse katalytische reporters, zoals mierikswortelperoxidase, wat vaak resulteerde in lage signaal-ruisverhoudingen12. Daarnaast gebruikten veel benaderingen lange probes gericht op losse sequenties om de specificiteit te verbeteren. Hoewel effectief in Drosophila-embryo's en polyteenchromosomen, dringen lange probes slecht door in de larvale hersenen en produceren vaak ongelijkmatige labeling 10,11,13.

De ontwikkeling van enkelmolecuul fluorescerend ISH (smFISH) en hybridisatie kettingreactie fluorescerende in situ hybridisatie (HCR-FISH) heeft veel van deze beperkingen aangepakt14,15. Door gebruik te maken van sets korte probes die over één gengebied worden betegeld, vermindert smFISH de gemiddelde probelengte van ongeveer 1.000 nt tot ongeveer 40 nt16. Dit verbetert de doordringing van de probe aanzienlijk terwijl de sterke signaalintensiteit behouden blijft. HCR-FISH verbetert de signaal-ruisverhoudingen verder door fluorescentie-geconjugeerde versterkerprobes te gebruiken die de positionele nauwkeurigheid verhogen en de signaaluitvoer versterken. Belangrijk is dat deze amplificatiestap lineair lijkt te schalen met de transcriptconcentratie, waardoor kwantitatieve meting van genexpressieniveaus17 mogelijk is.

HCR-FISH begint met initialatorprobes die complementair zijn aan de doelsequentie. Deze ongelabelde DNA-oligonucleotiden bevatten een enkelstrengige initiatorsequentie die bindt aan het invoerdomein van een fluorescentief-gelabelde H1-versterkerprobe. H1-versterkers nemen een haarspeldstructuur aan die de katalytische inactiviteit in stand houdt totdat ze binden aan de initiatorsequentie. Bij binding opent de H1-versterker en belicht een sequentie die bindt aan een partnerprobe, H2. Deze interactie opent de H2-haarspeld, waardoor deze een andere H1-probe kan binden (Figuur 1)15. Herhaalde cycli van H1/H2-binding genereren een stabiel polymeer dat het fluorescentiesignaal versterkt en achtergrondruis vermindert. Omdat elke initiatorsequentie specifiek is voor een overeenkomstig H1/H2-paar, kunnen meerdere probes met verschillende initiatorsequenties en fluoroforen gelijktijdig worden gebruikt om meerdere genen binnen hetzelfde monster te labelen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Grafische weergave van de HCR-FISH-workflow. DNA-probes met initiatorsequenties hybridiseren met een doel-RNA-transcript. Fluorescentief-gelabelde DNA-versterkerhaarspelden binden aan de initiatorsequentie en ondergaan sequentiële polymerisatie om stabiele dubbelstrengs versterkingsketens te vormen. Directe fluorofoorconjugatie verbetert de signaalversterking en de signaal-ruisverhouding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Recente verbeteringen aan HCR-FISH hebben het nut verder vergroot. Het ontwerp van split-initiator probe verbetert de specificiteit van versterkers, en secundaire antilichamen geconjugeerd aan HCR-initiators maken gelijktijdige immunohistochemie en HCR-FISH18 mogelijk. Daarnaast maken uitgebreide fluoroforopties nu multiplexing van maximaal 10 genen gelijktijdigmogelijk 19,20.

Hoewel de eerste proof-of-concept-experimenten voor HCR-FISH werden uitgevoerd bij zebravissen (Danio rerio), heeft de methode brede toepassing gekregen in veel systemen, vooral bij niet-modelorganismen waar antilichamen duur zijn of niet beschikbaarzijn. Probesynthese biedt ook een sneller alternatief voor de vorming van antistoffen, wat maanden ontwikkeling kan vergen. Daarom biedt HCR-FISH een snelle aanpak voor het valideren van kandidaatgenen die zijn geïdentificeerd via single-cell RNA sequencing datasets21. Zelfs in gevestigde genetische modelorganismen biedt HCR-FISH een waardevolle methode om pasgeboren neuronen ruimtelijk in kaart te brengen wanneer GAL4-reporters of immunohistochemie er niet in slagen specifieke celpopulaties adequaat te labelen.

Dit artikel beschrijft een HCR-FISH-protocol dat is geoptimaliseerd voor de optische kwab van de larve van het derde stadium van de Drosophila . Het protocol past methoden aan die eerder in andere organismen zijn gepubliceerd voor gebruik in het Drosophila visuele systeem22. Fixatiecondities die vaak worden gebruikt voor Drosophila-immunohistochemie waren geoptimaliseerd voor FISH-toepassingen. De concentraties van sonde en haarspelden werden verhoogd om de signaalintensiteit en weefselpenetratie te verbeteren. PCR-buizen werden gebruikt in plaats van spotplaten om het gebruik van reagens te verminderen en het hanteren van kleine weefselmonsters te vereenvoudigen. Daarnaast werden de was- en hybridisatietijden verkort om rekening te houden met de kleinere grootte van het Drosophila-brein ten opzichte van andere insectensystemen die vaak voor HCR-FISH worden gebruikt.

Representatieve toepassingen tonen aan hoe deze benadering positionele informatie kan leveren voor specifieke neuronale populaties tijdens de ontwikkeling. Deze experimenten geven aan dat bepaalde transcripten, zoals abrupt, eerder kunnen worden gedetecteerd met HCR-FISH dan met antistofkleuring of reporterlijnen. Potentiële uitdagingen, probleemoplossingsstrategieën en toepassingen van HCR-FISH voor het bestuderen van visuele systeemontwikkeling in Drosophila worden ook besproken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Drosophila melanogaster-experimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van City College of New York, Columbia University en New York University voor de verzorging en het gebruik van onderzoeksorganismen. De onderzoeksinstrumenten die in dit protocol worden gebruikt, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bereid buffers voor

OPMERKING: Bereid alle reagentia voor in nucleasevrije buizen met behulp van filtertips.
OPMERKING: Draag handschoenen tijdens de hele procedure. Maak werkoppervlakken schoon met een RNase-decontaminatieoplossing voordat je begint.

  1. Bereid nucleasevrije oplossingen voor
    1. Bereid 1x PBS-T voor door 20x PBS, Triton X-100 en glycine in nucleasevrij water te verdunnen tot de uiteindelijke concentraties van 1x PBS, 1% (v/v) Triton X-100 en 1 mM glycine.
    2. Bereid 5x SSCT door 20x SSC en Tween-20 te verdunnen in nucleasevrij water om 5x SSC te bereiden met 0,1% (v/v) Tween-20.
    3. Verdun 20x PBS in nucleasevrij water om 1x PBS te bereiden.

2. Ontwerpprobes

  1. Om probes commercieel te ontwerpen, selecteer je de isoform van interesse voor de soort van interesse en bestel je probes die worden afgestemd op de gewenste versterker via de webinterface van de leverancier.
    OPMERKING: Commerciële HCR-probechemieken en initiatorsequenties zijn eigendom en onder patent van Molecular Instruments.
    1. Pas het doelgebied in de webinterface aan als transcript-specifieke of pre-mRNA detectie gewenst is.
    2. Bestel ongeveer 20 probes voor sterk expressieve transcripties. Gebruik tot 40 sondes voor transcripties met lage abundantie in hele mount Drosophila-preparaten .
      OPMERKING: Bestel gespecialiseerde oligo's voor kortere transcripties die minder probe-bindingsplaatsen bevatten.
  2. Om probes handmatig te ontwerpen, download de FASTA-sequentie voor het doeltranscript. Bepaal of je één isoform of alle isoformen van het gen moet targeten.
    OPMERKING: Prioriteer constitutieve exonen of sterk expressieve isoformen die zijn geïdentificeerd uit RNA-sequencingdatasets om het signaal te verbeteren.
    1. Bij het ontwerpen van probes voor pre-mRNA-detectie, ontwerp dan probes die zich over intron-exonverbindingen uitspanen. Ontwerp probes die verbindingsverbindingen overspannen om volwassen transcripties te detecteren. Gebruik intronic-probes om beginnende transcripties binnen kernen te detecteren.
      OPMERKING: Intronic-probes colokaliseren mogelijk niet met volwassen cytoplasmatische transcripten en kunnen extra markers vereisen voor celidentificatie.
    2. Bepaal de grootte van de probeset. Gebruik minimaal ongeveer 5 probes voor korte transcripties wanneer grotere probesets niet kunnen worden ontworpen. Gebruik 20 probes voor standaardtoepassingen en ongeveer 40 probes voor optimale gevoeligheid in hele montagemonsters18,23.
    3. Als je je eigen probes ontwerpt, gebruik dan 25nt-sequenties gescheiden door een 2bp-spacer en voeg split initiator-sequenties toe aan het 5'-uiteinde van elke oligo.
      OPMERKING: Hoewel split-initiatorsequenties van de eerste generatie openbaar beschikbaar zijn, zijn next-generation commerciële initiatorsequenties propriëtair18.
    4. Als je je eigen probes ontwerpt, valideer dan de probesequenties. Zorg ervoor dat de probes binnen elke set vergelijkbare smelttemperaturen hebben. Bevestig 100% identiteit tussen de sondes.
      OPMERKING: Vermijd sterke G-rijke regio's en behoud een vergelijkbare GC-inhoud tussen desondes 24. Minimaliseer repetitieve sequenties en evalueer off-target binding met BLAST25.
    5. Gebruik openbaar beschikbare probe-design software wanneer dat gepastis 26,27.
      OPMERKING: Open-source ontwerptools kunnen mogelijk niet de geoptimaliseerde prestaties van commerciële probe-design pipelines reproduceren.

3. Hersenen ontleden, repareren en prehybridiseren

  1. Prewarm-probe hybridisatiebuffer tot 37 °C.
    VOORZICHTIG: Probe Hybridization Buffer bevat formamide. Hanteer onder een chemische dampkap terwijl je de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
  2. Verdun elke probe op een eindconcentratie van 1 μM met nucleasevrij gedestilleerd water.
  3. Aliquot ongeveer 250 μL nucleasevrije PBS op een dissectieschaal.
  4. Breng een zwervende larve van het derde stadium over in de PBS met een tang. Houd de buik vast met één paar tangen en grijp de mondhaken vast met een tweede paar. Trek de mondhaakjes van het lichaam af om de hersenen en ventrale zenuwstreng (VNC) te isoleren.
  5. Verwijder vetlichamen en speekselklieren terwijl je de VNC behoudt. Overbreng gedissecte hersenen naar een buis met 600 μL ijskoude nucleasevrije PBS.
    OPMERKING: Houd de ooglobben tijdens de dissectie ondergedompeld om uitdrogen van het weefsel te voorkomen.
  6. Herhaal dissectie totdat ongeveer zes ooglobben zijn verzameld. Voltooi de dissecties binnen 20 minuten om weefselafbraak te minimaliseren.
  7. Voeg 200 μL 16% paraformaldehyde (PFA) toe om een uiteindelijke concentratie van 4% PFA te bereiken. Draai de buis voorzichtig om te mengen en laat hem 15 minuten op kamertemperatuur incuberen.
    VOORZICHTIG: PFA is giftig en mutagene. Hanteer onder een chemische afzuigkap terwijl je handschoenen draagt.
  8. Verwijder het fixatiemiddel uit de monsters en stort het als aangewezen chemisch afval. Was monsters drie keer met 600 μL koude, nucleasevrije PBS, waarbij je een dissectieschotel gebruikt om de wasoplossingen op te vangen.
    OPMERKING: Inspecteer wasmiddelen op weefselverlies en haal eventuele verplaatste hersenen terug onder een dissectiemicroscoop.
  9. Breng hersenen over in een PCR-buis met 100 μL voorverwarmde Probe Hybridization Buffer.
    Meng voorzichtig door de tube te knippen en laat het 10 minuten op kamertemperatuur incuberen.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de hersenen ondergedompeld blijven en niet aan de buiswanden blijven kleven.

4. Hybridiseer probes

  1. Bereid een 4 nM probe-oplossing voor door 0,4 pmol toe te voegen van elke probe die is ingesteld op Probe Hybridization Buffer voor een eindvolume van 100 μL.
    OPMERKING: Verhoog de concentratie van de probe tot 16 nM als de signaalintensiteit laag is in de eerste kleuringen.
  2. Verwijder de prehybridisatiebuffer zonder het weefsel te verstoren. Voeg een verdunde probe-oplossing toe aan elk monster.
  3. Incubeer monsters bij 37 °C op een nutator gedurende 16–24 uur.

5. Versterk het sondesignaal

  1. Breng Amplification Buffer op kamertemperatuur. Bereid ongeveer 200 μL versterkingsbuffer per monster voor.
  2. Evenwichtige washbuffer. Warm Probe Wash Buffer tot 37 °C met een waterbad.
    VOORZICHTIG: Probe Wash Buffer bevat formamide. Hanteer onder een chemische afzuigkap.
  3. Verwijder de sondeoplossing en bewaar bij -20 °C voor hergebruik.
    OPMERKING: Hergebruik probe-oplossingen totdat de intensiteit van de kleuring afneemt.
  4. Was monsters vier keer gedurende 10 minuten elk in voorverwarmde Probe Wash Buffer op 37 °C. Was monsters twee keer gedurende 5 minuten elk in kamertemperatuur 5x SSCT.
  5. Voeg 100 μL Amplification Buffer toe zonder haarspelden. Incubeer 30 minuten op kamertemperatuur.
  6. Verwarm een thermocycler tot 95 °C. Voeg 2 μL van elke 3 μM haarspeldkolf toe aan aparte PCR-buizen. Bereid één buis voor voor elke haarspeldsoort.
    OPMERKING: Verhoog de versterkerconcentratie als kleuring spaarzame puncta of een lage signaal-ruisverhouding veroorzaakt.
  7. Bred haarspelden uit bij 95 °C gedurende 90 seconden. Bescherm buizen tegen licht en breng ze minstens 30 minuten uit bij kamertemperatuur.
  8. Bereid een versterkingsoplossing voor. Combineer haarspelden in de versterkingsbuffer tot een eindvolume van 100 μL per monster.
  9. Verwijder Amplification Buffer uit samples. Voeg een haarspeld-bevattende versterkingsbuffer toe.
    Breng een nacht uit op kamertemperatuur op een nutator die beschermd is tegen licht (omwikkeld met folie).
  10. Verwijder de versterkingsoplossing. Was monsters twee keer gedurende 5 minuten in 150 μL 5x SSCT. Was monsters drie keer gedurende 10 minuten in 150 μL 5x SSCT op een nutator. Voer twee korte wasbeurten uit in nucleasevrije PBS om wasmiddel te verwijderen.

6. Hersenen monteren voor beeldvorming

  1. Plak een beeldspacersticker op een glazen glaasje. Druk voorzichtig met het onderste uiteinde van een pincet om opgesloten luchtbellen te verwijderen.
  2. Snijd de hersenen door het ventrale zenuwwerg met een tang.
  3. Plaats de hersenen in het midden van de spacer-schacht. Oriënteer het weefsel lateraal met de oogkwab naar boven gericht.
  4. Voeg voldoende antifade montagemedium toe (ongeveer 25 μL) om de put te vullen zonder luchtbellen te introduceren. Verdeel het montagemedium gelijkmatig met behulp van de tang.
  5. Leg een deklap over het monster en sluit het af met nagellak.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voor wetenschappers die ontwikkelingsneurobiologie bestuderen, biedt HCR-FISH een robuuste methode om genexpressiepatronen te visualiseren en de ruimtelijke posities van zich ontwikkelende neuronen binnen de Drosophila-opticuskwab te bepalen.

In de optische kwab van Drosophila (Figuur 2A) ontstaan neuronen binnen de medulla neuropil uit neurale stamcellen (neuroblasten) afkomstig van een ruimtelijk gepatroneerd n...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft een aanpassing van HCR-FISH voor gebruik in de larvale optische kwab van Drosophila melanogaster . Conventionele in situ hybridisatiebenaderingen presteren vaak slecht in het hersenweefsel van de hele larvale vezels vanwege beperkte penetratie van de probe en lage signaalintensiteit. Het hier gepresenteerde protocol optimaliseert verschillende cruciale stappen om de kleurkwaliteit van de zich ontwikkelende oogkwab te verbeteren. Fixatiecondities d...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs bedanken Claude Desplan voor het bieden van toegang tot Molecular Instruments, HCR-FISH-sondes en de dpp-GAL4; UAS-Stinger vliegenlijn. De auteurs bedanken ook Aneesh Acharya en Harry Choi van Molecular Instruments voor technische feedback en discussies over de implementatie van HCR-FISH. Dit protocol is aangepast van eerder gepubliceerde en niet-gepubliceerde HCR-FISH-methodologieën ontwikkeld door Meg Younger22, Hunter Whitbeck, Bogdan Sieriebriennikov, Amanda Araujo Gomes Ferreira, Yen-Chung Chen en Yanqiqi Zeng. Bogdan Sieriebriennikov werd ondersteund door het Human Frontier Science Program (LT000010/2020-L). Jennifer Malin werd ondersteund door de R00-subsidie van de National Institutes of Health EY032269.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
10% Tween-20Bio-Rad Laboratories1662404NA
20x PBS, pH7.4Growcells.comMRGF-63962.74M NaCl, 53.7 mM KCl, 20.3 mM Na2HPO4, 29.4 mM KH2PO4 
20x SSCQuality Biological351-003-1313M NaCl, 0.3M Sodium Citrate
37 °C incubatorFisher Scientific (Isotemp)15-015-2633NA
37 °C water bathFisher ScientificFSGPD15DNA
Aluminum foilReynolds Wrap/Fisher Brand15-078-291NA
Antibody: Mouse-anti-AbruptDSHBAbrupt; RRID: AB_528344 Verdunning: 1:20
Antibody: Chicken anti-GFPMillipore SigmaCatalog# 06-896; RRID: AB-619712Verdunning: 1:500
Antibody: Rabbit anti-GFPLife Technologies#11122; RRID: AB_221569Verdunning: 1:500
Antibody: Rabbit anti-DllGenscript/Desplan lab-Verdunning: 1:200
Antibody: Rat anti-NCadherinDSHBDN-Ex #8, RRID: AB_528121Verdunning: 1:50
Antibody: Rabbit anti-SoxNGenscript/Desplan lab-Verdunning: 1:200
Antibody: Guinea Pig anti-Traffic jamGift from D. Godt-Verdunning: 1:2.000
Antibody: Donkey anti-Rat 405Jackson ImmunoResearchCode # 712-475-150; RRID: AB_2340680Verdunning: 1:100
Antibody: Donkey anti-Chicken 488Jackson ImmunoResearchCode #703-545-155; RRID: AB_2340375Verdunning: 1:200
Antibody: Donkey anti-Mouse 488Jackson ImmunoResearchCode #715-545-151; RRID: AB_2341099Verdunning: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit 488Jackson ImmunoResearchCode #711-545-152; RRID: AB_2313584Verdunning: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rabbit A555Thermo ScientificCatalog #A-31572; RRID: AB_162543Verdunning: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat Cy3Jackson ImmunoResearchCode #712-165-153; RRID: AB_2340667Verdunning: 1:200
Antibody: Donkey anti-Guinea Pig 647Jackson ImmunoResearchCode #706-605-148; RRID: AB_2340476Verdunning: 1:200
Antibody: Donkey anti-Rat 647Jackson ImmunoResearchCode #712-605-153; RRID: AB_2340694Verdunning: 1:200
Antifade mountantThermo Fisher ScientificS36940 (SlowFade Gold Antifade Mountant)Andere slowfades zullen ook werken, inclusief degenen met DAPI (S36936)
Confocal MicroscopeZeissLSM-880NA
Cover slips (22 x 30)VWR16004-332NA
Fly: D. melanogaster: ab-GFP-FLAGBDSC38626; RRID: BDSC_38626NA
Fly: D. melanogaster: Canton SBDSC64349; RRID: BDSC_64349NA
Fly: D. melanogaster: dpp-Gal4BDSC1553; RRID: BDSC_1553NA
Fly: D. melanogaster: ham-GFP.FPTBBDSC83660; RRID: BDSC_83660NA
Fly: D. melanogaster: yw; 10xUAS-myr-GFP;BDSC32198; RRID: BDSC_32198NA
Fly: D. melanogaster: UAS-StingerBDSC84277; RRID: BDSC_84277NA
Fly: D. melanogaster:  wit-KO-Gal4BDSC600136; RRID: BDSC_600136NA
ForcepsDumont#5 of #55sNA
Glass slidesVWR16005-106NA
GlycineMillipore SigmaG7126-10MGNA
HCR Amplification bufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR-Gold AmplifiersMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR HiFi ProbesMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitNA
HCR Probe Hybridization BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitBevat formamide
HCR Probe Wash BufferMolecular InstrumentsHCR Gold RNA-FISH KitBevat formamide
Nail polish (clear)Electron Microscopy Sciences72180NA
Nuclease-free water (not DEPC-treated)Thermo Fisher ScientificAM9937NA
Nutating mixerCorning/Fisher Scientific10-320-100NA
Paraformaldehyde, 16% (w/v)Electron Microscopy Sciences15710Toxisch
PCR Machine/Thermal CyclerBio-Rad1851148 (C1000 Touch Thermal Cycler)NA
PCR pull-apart tube strips with dome cap strips (0.2 mL) USA Scientific#1402-2400NA
Petri dishes (150 x 15 mm; for making dissecting dishes)Fisher ScientificFB0875714NA
RNase ZAPThermoFisher ScientificAM9780NA
Slide spacer stickersSUNJinIS016 (iSpacer stickers (0.2 mm deep))NA
Sylgard elastomer kit (for making dissecting dishes)Fisher ScientificNC9285739NA
Triton X-100Merck Millipore Sigma

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

NeurowetenschappenEditie 233Editie 233Lege waardeEditieHCR FISHVisueel systeemNeurale ontwikkelingGemultiplexeerde RNA detectieWhole mount kleuring
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen