Magnetisch nano-actuatieplatform voor op afstand regelbare mechanostimulatie van Schwann-cellen met real-time confocale beeldvorming

Yang Wang; Ting Liu; Mingxi Yang; Chong Qi; Bin Liu

doi:10.3791/71685

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Magnetisch nano-actuatieplatform voor op afstand regelbare mechanostimulatie van Schwann-cellen met real-time confocale beeldvorming

83 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71685

⸱

8 september 2026

Yang Wang¹^,² , Ting Liu³ , Mingxi Yang¹^,² , Chong Qi⁴ , Bin Liu¹^,²

¹Department of Hand Surgery, Orthopedic Center, The First Hospital of Jilin University, ²Key Laboratory of Tissue Repair, Reconstruction and Regeneration of Jilin Province, ³International Medical Department, Geriatric Medical Center, The First Hospital of Jilin University, ⁴Institute of Translational Medicine, The First Hospital of Jilin University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een microscoopcompatibel magnetisch nano-actuatieplatform dat fluorescerende superparamagnetische nanodeeltjes, een gekalibreerde elektromagneet en real-time confocale beeldvorming integreert om Schwann-cellen op afstand en gecontroleerd te stimuleren en hun mechanosensorische responsen dynamisch te monitoren.

Samenvatting

Mechanische krachten reguleren het cellulaire gedrag op cruciale wijze, maar veel bestaande methoden voor mechanische stimulatie zijn afhankelijk van direct fysiek contact of kunstmatig ontworpen extracellulaire omgevingen, waardoor hun flexibiliteit in dynamische live-cell studies beperkt is. Hier presenteren wij een magnetisch nano-actuatieplatform voor remote, contactloze en controleerbare mechanostimulatie van Schwanncellen in vitro. Deze geïntegreerde opstelling maakt remote magnetische stimulatie en gesynchroniseerde live-cell imaging in dezelfde experimentsessie mogelijk. Dit manuscript beschrijft de preparatie van fluorescerende superparamagnetische nanodeeltjes (SPIONs), optioneel actine-targetende gefunctionaliseerde SPIONs (f-SPIONs), de constructie en kalibratie van een microscoopcompatibel elektromagnetisch stimulatieapparaat, de schatting van magnetische krachten op het niveau van individuele deeltjes en individuele cellen, en de integratie van magnetische actuatie met real-time confocale imaging. Schwanncellen zijn zeer mechanosensitieve gliacellen die essentiële rollen spelen bij de ontwikkeling, het onderhoud en het herstel van perifere zenuwen. Real-time monitoring van hun reacties op mechanische stimulatie is cruciaal voor het begrijpen van hoe mechanische krachten de organisatie van het cytoskelet en het cellulaire gedrag beïnvloeden. Dit platform biedt een reproduceerbare workflow voor het bestuderen van de mechanobiologie van Schwanncellen en kan worden aangepast aan andere mechanisch responsieve celtypen en multicellular systemen.

Inleiding

Mechanische prikkels reguleren een breed scala aan cellulaire processen, waaronder adhesie, migratie, proliferatie, differentiatie en fenotypische plasticiteit¹^,²^,³. Studies in de mechanobiologie hebben aangetoond dat zowel neuronen als gliale cellen een uitgesproken mechanogevoeligheid en responsiviteit vertonen gedurende de ontwikkeling⁴^,⁵^,⁶^,⁷. Om te onderzoeken hoe cellen krachten waarnemen en daarop reageren, zijn meerdere experimentele benaderingen ontwikkeld, waaronder atomic force microscopy (AFM), micropipet-aspiratie, optische pincetten, kweeksystemen op basis van rek en microfluïdische platforms⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^,¹². Deze technieken hebben de studie van mechanotransductie sterk vooruitgeholpen. Veel van deze methoden vereisen echter direct fysiek contact met cellen of zijn afhankelijk van vooraf gedefinieerde kunstmatige mechanische omgevingen, waardoor ze minder geschikt zijn voor stimulatie op afstand die dynamisch regelbaar en compatibel is met imaging.

Krachtoverbrenging via magnetische nanodeeltjes biedt een alternatieve strategie voor mechanostimulatie op afstand¹³^,¹⁴^,¹⁵^,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸. Omdat de meeste biologische weefsels een lage magnetische susceptibiliteit vertonen, kunnen extern aangelegde magnetische velden biologische monsters penetreren zonder direct contact en selectief inwerken op magnetisch responsieve deeltjes die in cellen of weefsels zijn gebracht. In de aanwezigheid van een magnetische veldgradiënt ondervinden deze deeltjes directionele krachten die kunnen worden gebruikt om mechanische perturbaties op subcellulair, cellulair of weefselniveau op te leggen⁸^,⁹. Deze aanpak is aantrekkelijk omdat deze contactloos is, instelbaar is, compatibel is met live-imaging en potentieel kan worden uitgebreid naar complexere biologische systemen.

Schwanncellen zijn zeer mechanogevoelige gliale cellen¹⁹^,²⁰ die een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling, het onderhoud en het herstel van perifere zenuwen²¹^,²².Dynamische observatie van de reacties van Schwanncellen op fysieke stimulatie is essentieel om te begrijpen hoe kracht de organisatie van het cytoskelet en het celgedrag reguleert. Veel conventionele systemen voor krachtoverdracht zijn echter niet gemakkelijk compatibel met real-time microscopie met een hoge resolutie. Om deze beperking aan te pakken, hebben we een magnetisch nano-actuatieplatform ontwikkeld dat fluorescerende magnetische superdeeltjes (f-SPIONs), die zich richten op het actine-cytoskelet, combineert met een op maat gemaakt elektromagnetisch apparaat dat compatibel is met de tafel van een confocale microscoop, en een kwantitatief kader voor krachtschatting. Deze geïntegreerde opstelling maakt remote magnetische stimulatie en gesynchroniseerde live-cell imaging mogelijk in dezelfde experimentele sessie.

De hier beschreven workflow omvat de preparatie van fluorescerende magnetische superdeeltjes (SPIONs), optionele phalloidine-gebaseerde actin-target functionalisatie om f-SPIONs te genereren, karakterisering van nanodeeltjes, constructie van het elektromagnetische apparaat en veldkalibratie, schatting van de magnetische kracht, en gecombineerde magnetische stimulatie met real-time confocale imaging. Hoewel hier geoptimaliseerd voor Schwann-cellen, kan het platform een praktisch kader bieden voor gerelateerde studies in andere mechanisch responsieve levende systemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De experimenten beschreven in dit protocol maakten gebruik van een gevestigde ratten-Schwanncellijn (RSC96) en hielden geen menselijke deelnemers of levende dieren in. Deze studie werd uitgevoerd als onderdeel van een breder onderzoeksproject met dierproeven, dat is goedgekeurd door de Commissie voor Dierenwelzijn en Ethiek van het First Hospital of Jilin University (Goedkeuringsnummer 2022-0045).

1. Bereiding van fluorescente magnetische superdeeltjes

Synthetiseer met oliezuur gecoate Fe₃O₄-nanodeeltjes.
OPMERKING: Met oliezuur gecoate Fe₃O₄-nanodeeltjes werden gesynthetiseerd door thermische decompositie zoals eerder beschreven²⁰^,²³.
1. Voeg 2 mmol Fe(acac)₃, 6 mmol oliezuur, 6 mmol oleylamine en 5 mmol 1,2-hexadecaandiol toe aan 20 mL benzyléther in een reactiekolf.
2. Roer het mengsel 15 min onder een stikstofatmosfeer tot een homogene precursor-oplossing is verkregen.
3. Verwarm het mengsel tot 200 °C met een snelheid van 20 °C/min.
4. Houd de reactie 30 min op 200 °C.
5. Verhoog de temperatuur naar 265 °C en laat het mengsel 30 min refluxeren.
6. Laat het reactiemengsel op natuurlijke wijze afkoelen tot kamertemperatuur.
7. Verzamel de Fe₃O₄-nanodeeltjes door magnetische scheiding.
8. Was de nanodeeltjes 3 keer met ethanol.
9. Redispergeer de gezuiverde nanodeeltjes in tolueen.
Assembleer Fe₃O₄·Cy3.5 superdeeltjes.
OPMERKING: Fe₃O₄·Cy3.5 superdeeltjes werden bereid zoals eerder beschreven²⁰^,²⁴^,²⁵.
1. Dispergeer 28 mg met oliezuur gecoate Fe₃O₄-nanodeeltjes in 4 mL tolueen in een driehalsronde bodemkolf van 50 mL.
2. Bereid een waterige fase bestaande uit 12,5 mg natriumdodecylsulfaat en 3 mg Cyanine 3.5 (Cy 3.5) in 12,5 mL water.
3. Combineer de Fe₃O₄-nanodeeltjessuspensie in tolueen (28 mg in 4 mL; 7 mg/mL) met de waterige surfactant-/kleurstofoplossing om een olie-in-water-microemulsie te vormen.
4. Meng grondig tot een stabiele emulsie is verkregen.
5. Verwarm de driehalsronde bodemkolf tot 60 °C en roer continu bij 300 rpm gedurende 6 u.
  OPMERKING: Er is geen procedure voor vacuümevaporatie of rotatieverdamping vereist.
6. Verdampt het tolueen onder de bovenstaande condities om aggregatie van de Fe₃O₄-nanodeeltjes te induceren. Breng met een wegwerptransferpipet een kleine aliquot van de oplossing over in een reageerbuis en laat deze staan. De afwezigheid van fasescheiding geeft aan dat het tolueen volledig is verwijderd.
7. Breng de Fe₃O₄·Cy3.5 superdeeltjessuspensie over in centrifugebuizen van 15 mL. Centrifugeer 5 min bij 2.370 × g bij kamertemperatuur om de superdeeltjes te verzamelen, en verwijder voorzichtig het supernatant zonder de pellet te verstoren.
8. Redispergeer de pellet in ultrapuur gedeïoniseerd water en centrifugeer opnieuw bij 2.370 × g gedurende 5 min bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant en herhaal de wasprocedure drie keer om resterende vrije Cy3.5-kleurstof en natriumdodecylsulfaat te verwijderen.
Coat de superdeeltjes met polydopamine (PDA).
OPMERKING: Met polydopamine gecoate superdeeltjes werden bereid zoals eerder beschreven²⁰^,²⁶.
1. Centrifugeer de Fe₃O₄·Cy3.5 superdeeltjessuspensie 5 min bij 2.370 × g bij kamertemperatuur en verwijder het supernatant.
2. Redispergeer de pellet in 10 mM Tris-buffer (pH 8,5).
3. Voeg 26 mg dopamine-monomeer toe aan de suspensie.
4. Roer het mengsel 3 u bij kamertemperatuur onder alkalische condities.
5. Centrifugeer de suspensie 5 min bij 2.370 × g bij kamertemperatuur.
6. Verwijder het supernatant en redispergeer de pellet in ultrapuur water om Fe₃O₄·Cy3.5@PDA-deeltjes (SPIONs) te verkrijgen.
Functionaliseer de deeltjes optioneel met phalloidine-Alexa Fluor 350.
OPMERKING: De superdeeltjes werden oppervlaktefunctionaliseerd met commercieel verkrijgbare phalloidine-Alexa Fluor 350²⁰.
1. Bereid 5 mL waterige oplossing bestaande uit 100 units phalloidine-Alexa Fluor 350.
2. Voeg 200 µL Fe₃O₄·Cy3.5@PDA-suspensie met 2 mg deeltjes toe aan de oplossing.
3. Roer het mengsel voorzichtig 24 u bij kamertemperatuur.
4. Centrifugeer het mengsel 5 min bij 2.370 × g bij kamertemperatuur.
5. Verwijder het supernatant en redispergeer de pellet in gedeïoniseerd water.
6. Bewaar de uiteindelijke Fe₃O₄·Cy3.5@PDA@phalloidine (f-SPIONs) formulering beschermd tegen licht tot gebruik.

2. Karakterisering van de nanodeeltjes

Bepaal de morfologie en de grootte.
1. Bereid nanodeeltjesmonsters voor voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) of hoge-resolutie transmissie-elektronenmicroscopie (HRTEM) volgens de instrumentvereisten.
2. Verwerf beelden om de algemene partikelmorfologie, de kern-schilstructuur en de gemiddelde diameter te bepalen (Figuur 1).
3. Bereid waterige nanodeeltjessuspensies voor voor dynamische lichtverstrooiing (DLS).
4. Meet de hydrodynamische diameter en de polydispersiteitsindex (PDI).
5. Vergelijk de resultaten van elektronenmicroscopie en DLS om de uniformiteit van de formulering en het colloïdaal gedrag te beoordelen.
Bepaal de magnetische eigenschappen.
1. Bereid gedroogde of geconcentreerde nanodeeltjesmonsters voor die geschikt zijn voor analyse met een superconducting quantum interference device (SQUID).
2. Registreer magnetische hysteresiscurven bij 300 K.
3. Bepaal de verzadigingsmagnetisatie, remanentie en coerciviteit.
4. Bevestig dat de deeltjes superparamagnetisch gedrag vertonen met verwaarloosbare remanentie en coërcitiviteit.
Bepaal de fluorescentie-eigenschappen.
1. Bereid een f-SPION-suspensie in ultrapuur gedemineraliseerd water en breng de suspensie over naar een kwartscuvet.
2. Registreer fotoluminescentiespectra met behulp van een fluorescentiespectrofotometer.
3. Bevestig dat het fluorescentiesignaal detecteerbaar blijft na het wassen en resuspenderen.
Valideer de actin-geassocieerde lokalisatie bij gebruik van de gerichte formulering.
1. Verkrijg RSC96-cellen.
  OPMERKING: De in deze studie gebruikte RSC96-cellen, een spontaan getransformeerde rat-Schwanncellijn tot stand gekomen via langdurige kweek van primaire rat-Schwanncellen, zijn verkregen van de Cell Bank of the Chinese Academy of Sciences, Shanghai, China (CSTR: 19375.09.3101RATGNR6) en zijn negatief getest op mycoplasma- en schimmelcontaminatie. Cellen in passage 3–10 werden gebruikt.
2. Kweek de cellen in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline-streptomycine-oplossing (100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine).
3. Zaai RSC96-cellen uit bij een dichtheid van 1 × 10⁵ cellen per 35 mm celkweekmicroscopieschaal en kweek deze gedurende 24 u bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ om celadhesie mogelijk te maken.
4. Sluis het bestaande kweekmedium af, was de cellen tweemaal met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en voeg compleet kweekmedium toe dat bevat 15 µg/mL f-SPIONs. Incubeer de cellen gedurende 12 uur met f-SPIONs.
5. Aspireer het kweekmedium en was de cellen twee keer met ijskoud PBS met 1 mM deferoxamine om niet-geïnternaliseerde deeltjes grondig te verwijderen.
6. Maak confocale beelden om de intracellulaire distributie van de deeltjes te evalueren. Stel de beeldvormingsparameters in op een pinhole van 1 Airy-unit (AU) en een z-stap van 0.43 µm om optische doorsneden met een hoge resolutie van de intracellulaire structuren te verkrijgen.
7. Onderzoek of de partikels een verrijking vertonen in actinie-geassocieerde cellulaire regio's.

3. Constructie en kalibratie van het elektromagnetische stimulatieapparaat (Figuur 2)

Stel het elektromagnetische apparaat samen.
1. Construeer een compact elektromagnetisch spoelsysteem met een afmeting die past op de tafel van de confocale microscoop en in de live-cell chamber (Figuur 2A,B).
2. Verbind de spoel met een regelbare stroomvoorziening of externe stroombron.
3. Simuleer de omgeving van het gradiëntmagnetisch veld numeriek met COMSOL Multiphysics 4.3b (Figuur 2C,D).
4. Bevestig dat de elektromagneet het overeenkomstige gradiëntmagnetisch veld (GMF) genereert bij verschillende ingangsstromen (Figuur 2G).
Meet de magnetische fluxdichtheid en kalibreer het gradiëntmagnetisch veld.
1. Plaats de elektromagneet naast de kweekschaal, waarbij de pooltip naar het centrum van de schaal is gericht en zich op 1 mm van de buitenwand van de schaal bevindt (Figuur 2E,F).
2. Handhaaf deze relatieve geometrische configuratie tussen de elektromagneet en de kweekschaal tijdens alle daaropvolgende experimenten voor magnetische krachtstimulatie en imaging van levende cellen.
3. Gebruik een digitale Gaussmeter om de magnetische fluxdichtheid te meten op vooraf gedefinieerde posities binnen het stimulatiegebied, waarbij het positioneringsraster op de bodem van de kweekschaal als ruimtelijke referentie dient.
4. Bereken de lokale veldgradiënt op basis van de ruimtelijke verandering in de magnetische fluxdichtheid.
5. Kalibreer en valideer de numeriek gesimuleerde magnetische veldgradiënt met behulp van de experimenteel gemeten en berekende waarden van de magnetische veldgradiënt.

4. Schatting van de magnetische krachten geleverd door het platform.

Definieer het model voor krachtschatting.
1. Gebruik de krachtvergelijking voor magnetische nanodeeltjes in een niet-uniform magnetisch veld²⁷^,²⁸:
2. Vereenvoudig de vergelijking onder de aanname van superparamagnetische uitlijning met het aangelegde veld tot
  $Diagram van de magnetische krachtvergelijking voor het berekenen van SPION-dynamica, met weergave van $ F_{f-SPION} = m \frac{dB}{dr} $.$
  waarbij:
  F de nanomagnetische kracht is
  m het magnetisch dipoolmoment is
  de gradiënt van het magnetisch veld is
  dB/dr de gradiënt van het magnetisch veld (T/m) is die wordt gegenereerd door het bijbehorende apparaat voor magnetische veldgeneratie.
3. Gebruik de gemeten veldgradiënt van het gekalibreerde apparaat in alle berekeningen.
Schat de kracht in die op een enkel nanodeeltje werkt.
1. Bepaal de gemiddelde afmetingen van de deeltjes aan de hand van HRTEM-beelden.
2. Bereken het volume van de magnetische kern uitgaande van een bolvormige geometrie.
3. Schat het Fe₃O₄-specifieke magnetische volume in op basis van de magnetische fractie van de kern.
4. Bereken het magnetisch dipoolmoment volgens
  waarbij:
  M_m de massamagnetisatie van de f-SPIONs (16 A·m²/kg) vertegenwoordigt onder de gegeven veldintensiteit;
  ρ de dichtheid van Fe₃O₄ is (5,24 g/cm³).
  V het volume is van de Fe₃O₄ magnetische kern binnen elke f-SPION (5,89 × 10⁻¹⁷ cm³).
5. Vermenigvuldig het dipoolmoment met de gemeten veldgradiënt om de kracht te schatten die op een enkel nanodeeltje werkt ( $Statische wrijving SPIONs; formule $F_{f-SPION}$; concept in analyse van magnetische nanodeeltjeskrachten.$ ).
Schat de opname van nanodeeltjes per Schwann-cel in.
1. Zaai RSC96 Schwann-cellen uit tegen een dichtheid van 5 × 10⁵ cellen per well in 35 mm cellenkweek-microscopieschaaltjes.
2. Incubeer de cellen gedurende 24 u onder standaard kweekcondities.
3. Vervang het medium door vers medium dat 15 µg/mL f-SPIONs bevat.
4. Incubeer de cellen nogmaals gedurende 12 u.
5. Was de cellen tweemaal met ijskoud fosfaatgebufferde zoutoplossing die 1 mM deferoxamine bevat.
6. Verzamel en tel de cellen.
7. Meet het intracellulaire ijzergehalte met behulp van inductief gekoppelde plasma-atoememissiespectroscopie (ICP-AES).
8. Bereken het aantal geïnternaliseerde deeltjes per cel door de gemiddelde ijzermassa per cel te delen door de ijzermassa per deeltje .
Schat de kracht in die op een enkele Schwann-cel wordt uitgeoefend.
1. Bereken de kracht op celliveau volgens
  
  waarbij:
  $Statische wrijving SPIONs; formule $F_{f-SPION}$; concept in analyse van magnetische nanodeeltjeskrachten.$ de magnetische kracht is die op een enkele f-SPION wordt uitgeoefend.
  het aantal is van geïnternaliseerde f-SPIONs per cel.
  F_cell de magnetische kracht is die op een enkele cel wordt uitgeoefend.
2. Rapporteer de resulterende waarde als de geschatte magnetische kracht die op een enkele Schwann-cel wordt uitgeoefend (F_cell).
3. Vermeld duidelijk dat deze waarde een modelgebaseerde schatting is en geen directe intracellulaire krachtmeting.

5. Combineren van magnetische stimulatie met real-time confocale laserscanmicroscopie (CLSM) beeldvorming

Laad Schwann-cellen met magnetische nanodeeltjes.
1. Zaai Schwann-cellen uit in beeldvormingscompatibele ibidi-kweekschalen of microfluïdische kweekkamers.
2. Laat de cellen hechten en herstellen.
3. Vervang het bestaande medium door vers kweekmedium dat 15 µg/mL f-SPIONs bevat.
4. Incubeer de cellen gedurende 12 h om de f-SPION-belading mogelijk te maken.
5. Inspecteer de celmorfologie voordat u verdergaat.
Verwijder niet-geïnternaliseerde deeltjes.
1. Verwijder het medium dat de nanodeeltjes bevat.
2. Was de cellen twee keer met PBS dat 1 mM deferoxamine bevat.
3. Vervang de wasoplossing door beeldvormingscompatibel live-cell medium.
4. Bevestig dat er een lage extracellulaire deeltjesachtergrond is vóór de beeldvorming.
Integreer het elektromagneetapparaat met het CLSM-beeldvormingssysteem.
1. Assembleer de elektromagneet met de live-cell kweekkamer en positioneer de elektromagneet op de vooraf gekalibreerde locatie.
2. Plaats de geassembleerde live-cell kweekkamer op de tafel van de confocale microscoop (Figuur 3). Bevestig dat de kweekschaal zich binnen het effectieve stimulatiedomein bevindt (Figuur 3A).
3. Zet de elektromagneet onder spanning volgens de vooraf ingestelde parameters en bevestig de effectieve blootstelling aan het gradiënt magnetisch veld binnen het gebied van de kweekschaal (Figuur 3B).
4. Bevestig dat de objectieflens het brandvlak kan bereiken zonder interferentie.
5. Bevestig dat het apparaat de positionering van het objectief of de beweging van de tafel niet belemmert.
6. Houd rekening met de warmte die tijdens de werking van de elektromagneet wordt gegenereerd en pas de temperatuurinstellingen van de live-cell kamercomponenten aan volgens de vooraf bepaalde optimale kweekcondities om een interne omgeving van 37 °C en 5% CO₂ te garanderen (Figuur 3C).
7. Bevestig dat het gehele systeem normaal en stabiel functioneert.
Functionele Ca²⁺-beeldvorming in levende cellen.
1. Incubeer de cellen met Krebs–Ringer-oplossing (pH 7.4) die 3 µM Fluo-4 AM en 0.1% Pluronic F-127 bevat bij 37 °C gedurende 30 min.
2. Was de kweken na incubatie twee keer met PBS en breng ze over naar het live-cell beeldvormingsplatform van het CLSM-systeem voor beeldvorming (Figuur 4A).
3. Maak gebruik van het positioneringsraster op de bodem van de ibidi-kweekschaal om vijf vooraf gedefinieerde locaties in beeld te brengen.
4. Verdeel elk beeldveld gelijkmatig in 25 regio's en selecteer 0–3 cellen per regio voor fluorescentiekwantificering, afhankelijk van de werkelijke celdichtheid binnen die regio.
5. Definieer de volledige omtrek van een individuele cel als de region of interest (ROI) en monitor de magnetisch geïnduceerde calciumrespons door veranderingen in fluorescentie-intensiteit (ΔF) binnen de ROI te analyseren.
6. Bereken de verandering in fluorescentie-intensiteit als ΔF = (F_stim- F₀). Beschouw een verandering in fluorescentie-intensiteit vóór en na stimulatie (ΔF/F₀) van meer dan 10% als een calciumrespons-gebeurtenis.
  OPMERKING: F_unstim vertegenwoordigt de fluorescentie-intensiteit vóór magnetische krachtstimulatie, F₀ vertegenwoordigt de basislijn fluorescentie-intensiteit, en F_stim vertegenwoordigt de opgewekte fluorescentie-intensiteit na magnetische krachtstimulatie.
7. Trek voor achtergrondcorrectie de gemiddelde achtergrondfluorescentie-intensiteit, gemeten in een celvrije regio, af van de fluorescentie-intensiteitswaarde van elke ROI.
8. Voer drie onafhankelijke experimenten uit, waarbij in elk experiment één kweekschaal is opgenomen.
Voer time-lapse beeldvorming uit en pas magnetische stimulatie toe tijdens de beeldvorming.
1. Stel de time-lapse beeldvormingsparameters als volgt in: een acquisitie-interval van 2.1 s per frame, een totale acquisieduur van 650 s en standaard optische sectie-beeldvorming met hoge resolutie met behulp van 1 AU.
2. Neem tijdens de cellulaire beeldvorming gedurende 50 s continu beelden op zonder stroomtoevoer om de intracellulaire calciumfluorescentie-intensiteit in afwezigheid van magnetische krachtstimulatie vast te leggen (F_unstim) (Figuur 2H en Figuur 4B).
3. Normaliseer de fluorescentie-intensiteit die tijdens de eerste 50 s is vastgelegd en definieer dit als de basislijn fluorescentie-intensiteit (F₀).
4. Pas vervolgens een constante stroomtoevoer van 3.0 A toe op de elektromagneet, waardoor Schwann-cellen die geladen zijn met magnetische nanodeeltjes worden blootgesteld aan een gradiënt magnetisch veld van 3.25 T/m en hiermee worden onderworpen aan magnetische krachtstimulatie. Ga door met time-lapse beeldvorming gedurende 10 min om de intracellulaire calciumfluorescentie-intensiteit tijdens magnetische krachtstimulatie vast te leggen (F_stim) (Figuur 2H en Figuur 4C).
5. Bereken de verandering in fluorescentie-intensiteit kwantitatief als ΔF/F₀ (Figuur 4D,E).
Voer een statistische analyse uit en analyseer de Ca²⁺-fluorescentiegegevens.
1. Bereken voor elke cel de mediaan ΔF/F₀-waarde over de geanalyseerde tijdreeks en gebruik deze waarde als de Ca²⁺-responsmetriek op celniveau.
2. Voer voor elke experimentele conditie drie onafhankelijke experimenten uit, met per conditie één kweekschaal per experiment. Voeg de cellen die in de drie onafhankelijke experimenten zijn geanalyseerd samen voor beschrijvende presentatie, en rapporteer n als het totaal aantal geanalyseerde cellen per groep.
3. Beoordeel de normaliteit van de ΔF/F₀-gegevens op celniveau met de Kolmogorov-Smirnov-toets.
4. Omdat de Ca²⁺-fluorescentieresponsgegevens niet normaal verdeeld zijn, worden de gegevens gepresenteerd als de mediaan en het interkwartielbereik (IQR).
5. Analyseer verschillen tussen groepen met de non-parametrische Friedman-toets, gevolgd door Wilcoxon signed-rank tests voor paarsgewijze vergelijkingen, zoals eerder gerapporteerd.
6. Beschouw P < 0.05 als indicatie voor statistische significantie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Hoge-resolutie transmissie-elektronenmicroscopie (HRTEM) toonde aan dat de uiteindelijke nanodeeltjesformulering een geclusterde magnetische kern en een buitenste schil bezat na oppervlaktemodificatie (Figuur 1). De uiteindelijke f-SPIONs hadden een gemiddelde totale diameter van 63,36 ± 16,65 nm, met een Fe₃O₄-rijke magnetische kern van ongeveer 56,60 ± 6,19 nm en een buitenste schil bestaande uit polydopamine en phalloidine-Alexa Fluor 350 met een gemiddelde dikte van ongeveer 5,79 ± 1,36 ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

IJzeroxide-nanodeeltjes worden algemeen erkend als magnetische nanomaterialen met een gunstige biocompatibiliteit. Als veelgebruikte contrastmiddelen voor magnetische resonantiebeeldvorming zijn superparamagnetische Fe₃O₄-nanodeeltjes uitgebreid toegepast in de klinische beeldvormingsdiagnostiek²⁹^,³⁰. In een recente studie van onze groep²⁰ werd aangetoond dat f-SPIONs een extreem lage cytotoxiciteit en een uitstekende biosafety vertonen. H...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (subsidienummers 82571677 en 82001304 aan Y.W.), het Special Program for Medical and Health Care Talents in Jilin Province (subsidienummer JLSRCZX2025-134 aan Y.W.) en het Bethune Program Project van Jilin University (subsidienummer 2024B19 aan Y.W.). De auteurs danken de College of Chemistry, Jilin University (State Key Laboratory of Supramolecular Structure and Materials), en het Changchun Institute of Applied Chemistry, Chinese Academy of Sciences, voor hulp bij het ontwerp, de synthese en de karakterisering van nanomaterialen. De auteurs danken daarnaast het Institute of Translational Medicine at The First Hospital of Jilin University voor hulp bij CLSM-beeldvorming.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1,2-hexadecaandiol	Sigma-Aldrich	213748	Technische kwaliteit, 90%; gebruikt bij thermische decompositie-synthese
35 mm ibidi µ-schalen	ibidi	80156	Gebruikt voor Schwanncelkweek en imaging
benzylesther	Sigma-Aldrich	108014	98%; oplosmiddel voor Fe₃O₄ nanopartikelsynthese
Confocale laserscanningmicroscoop	Nikon	AXR (Ti2-E)	Gebruikt voor live-cell imaging en fluorescentie-imaging
Op maat gemaakte elektromagneet	Op maat gemaakt	Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan er geen vertaling worden gemaakt. Voeg alstublieft de Engelse tekst toe die u wilt laten vertalen naar het Nederlands.	Compact unipolaire elektromagneet voor in vitro generatie van gradiëntmagneetvelden
Cyanine3.5-carbonzuur	Duofluor Inc.	D10128	Fluorescente kleurstof gebruikt voor Fe₃O₄·Assemblage van Cy3.5-superdeeltjes; MG 593,20; bewaren bij -20 °C, beschermd tegen licht
Deferoxamine-mesylaatzout	Sigma-Aldrich	D9533	IJzerchelatiemiddel gebruikt voor het verwijderen van niet-geïnternaliseerd en membraangeassocieerd ijzer
Digitale Gaussmeter	WEITE MAGNETISCH	WT103	Wordt gebruikt om de magnetische fluxdichtheid te meten en het gradiëntmagnetisch veld dat door de op maat gemaakte elektromagneet wordt gegenereerd te kalibreren
Dopaminehydrochloride	Sigma-Aldrich	H8502	≥98% (TLC); gebruikt voor polydopamine-coating
Instrument voor dynamische lichtverstrooiing	Malvern Instruments	Zetasizer Nano-ZS	Gebruikt voor de meting van de hydrodynamische diameter en de PDI
Fluo-4 AM	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	F14201	Calciumindicator gebruikt voor live-cell Ca2+²⁺ beeldvorming
Fluorescentiespectrofotometer	Shimadzu	RF-6000	Gebruikt voor fotoluminescentiekarakterisering
Hoge-resolutie transmissie-elektronenmicroscoop	JEOL	JEM-F200	Gebruikt voor HRTEM-imaging van de morfologie en de kern van nanodeeltjes–schaalstructuur
Inductief gekoppeld plasma-atoomemissiespectrometer	PerkinElmer	Optima 3300 DV	Gebruikt voor intracellulaire ijzerkwantificering
IJzer(III)acetylacetonaat, Fe(acac)₃	Sigma-Aldrich	F300	97%; precursor voor Fe₃O₄ synthese van nanodeeltjes
Live-cell stage-top incubator	TOKAI HIT	TENP&CO₂	Gebruikt voor confocale live-cell imaging tijdens magnetische stimulatie
Koolzuur	Sigma-Aldrich	O1008	≥99% (GC); oppervlakteligand voor Fe₃O₄ nanodeeltjessynthese
Oleylamine	Sigma-Aldrich	O7805	Technische kwaliteit, 70%; ligand voor nanodeeltjessynthese
Falloidine–Alexa Fluor 350	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	A22281	Optioneel functionaliseringsreagens gericht op actine
Pluronic F-127	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	P3000MP	Gebruikt om de Fluo-4 AM-loading voor live-cell Ca2+ beeldvorming te vergemakkelijken²⁺ beeldvorming
Programmeerbare gereguleerde DC-stroomvoeding	Tongmen	eTM-L605SPL (60 V, 5 A)	Gebruikt voor de voeding van de aangepaste elektromagneet voor de in vitro generatie van gradiëntmagnetische velden
RSC96 Schwann-cellen	Cellbank van de Chinese Academie van Wetenschappen	Omdat er geen brontekst is verstrekt, kan er geen vertaling worden gemaakt. Voer aub de tekst in die u vertaald wilt hebben.	Ratten-afgeleide Schwann-cellijn
Natriumdodecylsulfaat (SDS)	Sigma-Aldrich	436143	ACS-reagens, ≥99,0%; surfactant voor olie-in-water microemulsie
SQUID-magnetometer	Quantum Design Inc.	MPMS-XL	Gebruikt voor magnetische hysteresismeting bij 300 K
Tolueen	Sigma-Aldrich	244511	Watervrij, 99,8%; oplosmiddel voor superparticle-assemblage
Transmissie-elektronenmicroscoop	FEI	EP 5018/40, Tecnai Spirit Biotwin	Gebruikt voor de observatie van de ultrastructuur van cellulaire en neurale weefsels

Referenties

Cheng B, et al. Mechanobiology across timescales. Nat Rev Phys. 2025;7:621-44.
Di X, et al. Cellular mechanotransduction in health and diseases: from molecular mechanism to therapeutic targets. Signal Transduct Target Ther. 2023;8:282.
Pillai EK, Franze K. Mechanics in the nervous system: from development to disease. Neuron. 2024;112(3):342-61.
Franze K. The mechanical control of nervous system development. Development. 2013;140(15):3069-77.
Franze K, Guck J. The biophysics of neuronal growth. Rep Prog Phys. 2010;73:094601.
Moore SW, Sheetz MP. Biophysics of substrate interaction: influence on neural motility, differentiation, and repair. Dev Neurobiol. 2011;71(11):1090-101.
Franze K, Janmey PA, Guck J. Mechanics in neuronal development and repair. Annu Rev Biomed Eng. 2013;15:227-51.
Sun W, et al. Biophysical approaches for applying and measuring biological forces. Adv Sci (Weinh). 2022;9(5):e2105254.
Mohammed D, et al. Innovative tools for mechanobiology: unraveling outside-in and inside-out mechanotransduction. Front Bioeng Biotechnol. 2019;7:162.
Constantinou I, Bastounis EE. Cell-stretching devices: advances and challenges in biomedical research and live-cell imaging. Trends Biotechnol. 2023;41:939-50.
Polacheck WJ, Li R, Uzel SGM, Kamm RD. Microfluidic platforms for mechanobiology. Lab Chip. 2013;13(12):2252-67.
Li Z, et al. Non-invasive acquisition of mechanical properties of cells via passive microfluidic mechanisms: a review. Biomicrofluidics. 2021;15(3):031501.
Xiao Y, Du J. Superparamagnetic nanoparticles for biomedical applications. J Mater Chem B. 2020;8(3):354-67.
Yang X, et al. Nanotechnology enables novel modalities for neuromodulation. Adv Mater. 2021;33(52):e2103208.
Semeano AT, et al. Effects of magnetite nanoparticles and static magnetic field on neural differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev Rep. 2022;18(4):1337-54.
Lee B, et al. Design of oxide nanoparticles for biomedical applications. Nat Rev Mater. 2025;10:252-67.
Kim YJ, et al. Magnetoelectric nanodiscs enable wireless transgene-free neuromodulation. Nat Nanotechnol. 2025;20:121-31.
Signorelli L, Hescham SA, Pralle A, Gregurec D. Magnetic nanomaterials for wireless thermal and mechanical neuromodulation. iScience. 2022;25(11):105401.
Liu T, Wang Y, Lu L, Liu Y. SPIONs-mediated magnetic actuation promotes nerve regeneration by inducing and maintaining repair-supportive phenotypes in Schwann cells. J Nanobiotechnology. 2022;20:159.
Liu T, et al. f-SPION-mediated magnetic stimulation induces reparative Schwann cell reprogramming via cytoskeletal dynamics-gated activation of Piezo1. J Nanobiotechnology. 2026;24:298.
Jessen KR, Mirsky R, Lloyd AC. Schwann cells: development and role in nerve repair. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;7(7):a020487.
Jessen KR, Mirsky R. The repair Schwann cell and its function in regenerating nerves. J Physiol. 2016;594(13):3521-31.
Sun S, Zeng H. Size-controlled synthesis of magnetite nanoparticles. J Am Chem Soc. 2002;124(28):8204-5.
Zhuang J, Wu H, Yang Y, Cao YC. Controlling colloidal superparticle growth through solvophobic interactions. Angew Chem Int Ed Engl. 2008;47(12):2208-12.
Bai F, et al. A versatile bottom-up assembly approach to colloidal spheres from nanocrystals. Angew Chem Int Ed Engl. 2007;46(35):6650-3.
Tang L, et al. Investigating the optimal size of anticancer nanomedicine. Proc Natl Acad Sci U S A. 2014;111(43):15344-9.
Tay A, Kunze A, Murray C, Di Carlo D. Induction of calcium influx in cortical neural networks by nanomagnetic forces. ACS Nano. 2016;10(2):2331-41.
Tay A, Di Carlo D. Magnetic nanoparticle-based mechanical stimulation for restoration of mechano-sensitive ion channel equilibrium in neural networks. Nano Lett. 2017;17(2):886-92.
Cheng FY, et al. Characterization of aqueous dispersions of Fe(3)O(4) nanoparticles and their biomedical applications. Biomaterials. 2005;26(7):729-38.
Lee N, et al. Iron oxide-based nanoparticles for multimodal imaging and magnetoresponsive therapy. Chem Rev. 2015;115(19):10637-89.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Superparamagnetische nanodeeltjes magnetische stimulatie live-cell imaging cytoskeletorganisatie elektromagnetische stimulatie mechanobiologie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Houd me op de hoogte: