Single-cell massaspectrometriebeeldvorming met desorptie-elektrosprayionisatie gekoppeld aan orbitrap-massaspectrometers

Samenvatting

Dit protocol beschrijft enkelcel massaspectrometrie beeldvorming van OVCAR-8-cellen met behulp van desorptie-elektrosprayionisatie gekoppeld aan Orbitrap-massaspectrometers voor metabolomische analyse met hoge ruimtelijke resolutie.

Samenvatting

Desorptie-elektrospray-ionisatie–massaspectrometrie-imaging (DESI–MSI) maakt omgevings-, matrixvrije moleculaire beeldvorming mogelijk met minimale monstervoorbereiding. Dit protocol beschrijft een workflow voor single-cell MSI van OVCAR-8-cellen met behulp van DESI gekoppeld aan Orbitrap-massaspectrometers. Het systeem integreert een DESI-spuit, een aangepaste massaspectrometerinterface, een gemotoriseerde XYZ-trap en een optisch breadboard voor beeldvorming met hoge ruimtelijke resolutie. Cellen worden gekweekt op gerasterde glazen dekplanken, gewassen met een ammoniumformiaatoplossing om zoutinterferentie te verminderen, gedroogd en geanalyseerd onder omgevingsomstandigheden. Het oplosmiddel wordt continu toegediend met behulp van een nano-vloeistofchromatografiesysteem, en het nebuliserende stikstofgas wordt geregeld om de spraystabiliteit te behouden. Het protocol beschrijft ook rasterbeeldvorming, pixelcontrole en optisch-naar-massaspectrometrie beeldregistratie voor single-cell lokalisatie. Hoge massaresolutie en massanauwkeurigheid die door Orbitrap-detectie worden geboden, maken differentiatie van nauw verwante moleculaire soorten mogelijk en ondersteunen enkelcel-metabolomische analyse. Dit protocol biedt een aanpasbare strategie voor het implementeren van hoog-ruimtelijke resolutie single-cell MSI met behulp van meerdere Orbitrap-massaspectrometerplatforms.

Inleiding

Metabolomics streeft ernaar om kleine-molecuulmetabolieten die de functionele toestand van biologische systemen^{weerspiegelen} 1,2,3,4,5, volledig te karakteriseren. Omdat metabolieten directe producten zijn van enzymatische activiteit, leveren ze een dynamische weergave van cellulaire fenotype- en biochemische regulatie. Conventionele metabolomische workflows vertrouwen echter doorgaans op bulkextractiemethoden die signalen gemiddeld verspreiden over duizenden tot miljoenen cellen, waardoor cellulaire heterogeniteit ^6,7,8 wordt verdoezeld.

Single-cell metabolomics pakt deze beperking aan door moleculaire profilering op het niveau van individuele cellen mogelijk te maken, metabole diversiteit binnen complexe populaties aan het licht te brengen en het mechanistische begrip van ziekteprogressie, medicijnrespons en cellulaire differentiatie te verbeteren. Massaspectrometrie (MS) is een onmisbaar hulpmiddel voor moleculaire analyse van biologische monsters. Recente ontwikkelingen in MS-technieken, waaronder monstervoorbereiding, instrumentatie en data-analyse, maken het mogelijk MS-metabolomics-studies uit te voeren op single-celniveau ^9,10,11,12.

MS-beeldvorming (MSI), die ruimtelijk opgeloste moleculaire analyse van biologische monsters mogelijk maakt, integreert precieze monsterbeweging, geminimaliseerde bemonstering, efficiënte ionisatie en datavisualisatie door een volledig massaspectrum te verkrijgen bij elke gedefinieerde ruimtelijke coördinaat over een monsteroppervlak 12,13,14. MS-beelden worden gereconstrueerd door de intensiteit van geselecteerde massa-ladingsverhoudingswaarden (m/z) over x–y-coördinaten uit te zetten, waardoor chemische ruimtelijke informatie binnen complexe biologische systemen ^{behouden blijft.} Het bereiken van ruimtelijk opgeloste single-cel metabolomics vereist analytische platforms die in staat zijn moleculaire lokalisatie te behouden terwijl voldoende gevoeligheid en massaresolutie behouden zijn om soorten met lage abundantie ^te detecteren^.

Single-cell MSI brengt extra uitdagingen met zich mee omdat individuele cellen doorgaans variëren van 5 tot 20 μm in diameter ^8,21. Op deze ruimtelijke schaal is de abundantie van analyten per steekproefgebeurtenis uiterst beperkt. Daarom zijn meerdere factoren, waaronder nauwkeurige controle van monsterbeweging, geminimaliseerde bemonstering, hoge ionisatie-efficiëntie en efficiënte ionenoverdracht, even essentieel om interpreteerbare moleculaire informatie van individuele cellen te verkrijgen^14,22. Matrix-ondersteunde laserdesorptie/ionisatie (MALDI)–MSI, een vacuümgebaseerde techniek die routinematig wordt gebruikt voor hoog-ruimtelijke resolutie MSI-studies, vereist matrixdepositie en vacuümwerking; echter, matrixkristallisatie in MALDI kan analyte-delokalisatie en variabiliteit op single-cel schaal^introduceren 23,24,25,26,27. Daarentegen werken ambient MSI-benaderingen onder omgevingsomstandigheden, en monsters behouden bijna natuurlijke chemische toestanden omdat er weinig of geen monstervoorbereiding nodig is. Onder de omgevings-MSI-methoden zijn DESI²⁸, nano-DESI²¹, pneumatisch ondersteunde nano-DESI²⁹ en Single-probe ^{8,30,31,32,33,34,35} eerder gebruikt voor single-cell MSI-studies. Hoewel technieken gebaseerd op micro-vloeistofextractie, waaronder nano-DESI, pneumatisch ondersteunde nano-DESI en Single-probe, een hoge bemonsterings- en ionisatie-efficiëntie bieden, zijn ze afhankelijk van het behouden van een stabiele vloeistofbrug aan de punt van de bemonsteringsprobe, terwijl verstoring van de vloeistofbrug, zoals veranderingen in oppervlaktemorfologie of verstopping van de probe, de kwaliteit van MSI-experimenten ^5,8 kan beïnvloeden^, 21,30,35.

DESI is een omgevings-ionisatietechniek waarbij geladen oplosmiddeldruppels een oppervlak raken, analyten extraheren en secundaire druppels genereren die geïoniseerde stof³⁶ bevatten. DESI biedt contactvrije, verstopte bemonstering met compatibiliteit voor rastergebaseerde beeldworkflows, waardoor het zeer geschikt is voor hoogresolutie, multi-ion moleculaire mapping van optisch geïdentificeerde individuele cellen wanneer gekoppeld aan hoogresolutievermogen Orbitrap-platforms 20,37,38,39,40. DESI wordt veel gebruikt voor weefselbeeldvorming, maar is zelden toegepast op single-cell MSI, grotendeels vanwege technische uitdagingen^20,28. Recente studies uitgevoerd met een commerciële opstelling bestaande uit een Waters DESI XS gekoppeld aan een SELECT SERIES cyclische IMS-massaspectrometer toonden aan dat single-celresolutie kan worden bereikt voor meerdere cellijnen. Het bereiken van een hoge ruimtelijke resolutie in DESI–MSI vereist gecoördineerde controle van ionisatie-efficiëntie, ionentransmissie, acquisitiesnelheid en spuituitlijning 12,20,28. In het bijzonder hebben vooruitgang in het ontwerp van nieuwe generaties DESI-sproeiers, waaronder DESI XS en desorptie elektro-flow focussering (DEFFI), het bemonsteringsgebied aanzienlijk verkleind^{met 41,42}. Daarnaast kan het verminderen van oplosmiddeldebietsnelheden, zoals nanoliter-per-minuut debiet geleverd door nanovloeistofchromatografie (LC) pompen, de ruimtelijke inperking aanzienlijk verbeteren om single-cel moleculaire afbakening²⁸ te bereiken. Hoewel deze aanpak single-cell resolutie MSI bereikte, is het afhankelijk van instrumentatie van een specifieke leverancier (Waters). Een bredere implementatie van single-cell DESI–MSI vereist daarom strategieën die kunnen worden geïntegreerd met breed beschikbare hoge-resolutie massaspectrometers, zoals Orbitrap-systemen, om hoge gevoeligheid, massanauwkeurigheid en resolutievermogen te bieden. Het combineren van DESI met Orbitrap-massaspectrometers biedt nieuwe mogelijkheden in enkelcel-MSI-studies, waaronder differentiatie van dicht bij elkaar liggende en isobare soorten in complexe cellulaire extracten 20,43,44^.

Dit protocol beschrijft een modulaire strategie voor het integreren van een Waters DESI XS-spuit met Orbitrap-massaspectrometers voor single-cell MSI-studies. De workflow integreert gerasterde coverslips voor celbevestiging en optische correlatie, een gemotoriseerde XYZ-trap voor gecontroleerde rasterscanning, nanoschaal aflevering van oplosmiddelen voor stabiele sprayvorming en hoge resolutie Orbitrap-detectie. Hoewel een Thermo Orbitrap Tribrid Lumos massaspectrometer als platform is gekozen, kunnen veel andere Orbitrap-massaspectrometermodellen met compatibele bron-interfacegeometrieën mogelijk worden gekoppeld aan vergelijkbare aangepaste DESI XS-configuraties na passende mechanische aanpassing en optimalisatie.

Protocol

OVCAR-8-cellen werden verkregen uit de American Type Culture Collection (ATCC). Alle celkweekprocedures werden uitgevoerd volgens de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen. Cellen werden routinematig getest op mycoplasma-besmetting met behulp van een mycoplasma-detectiekit volgens de instructies van de fabrikant.

OPMERKING: Voer alle procedures uit in overeenstemming met de institutionele bioveiligheidsrichtlijnen. Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen. Hanteer organische oplosmiddelen in een chemische dampafzuigkap.

1. Kweek en bereid OVCAR-8-cellen voor op gerasterde dekstroken

1. Bereid het volledige medium voor door RPMI-1640 medium aan te vullen met 10% foetaal rundserum en 1% penicilline–streptomycine. Verwarm het medium tot 37°C.
2. Bewaar OVCAR-8-cellen in 10 cm celkweekschotels met 10 mL volledig medium. Incubeer de cellen bij 37°C in een bevochtigde couveuse met 5%_CO2.
3. Doorgang van de cellen wanneer ongeveer 80% van het kweekoppervlak visueel wordt ingenomen door hechtende cellen, meestal elke 2 dagen onder de beschreven kweekomstandigheden.
   1. Aspiraat het medium uit de 10 cm kweekschaal en spoel de cellen één keer af met 5 ml 1× fosfaatgeborreerde zoutoplossing.
   2. Voeg 2 ml 0,25% trypsine–ethyleendiaaminetetraazijnzuur toe aan het kweekschotel. Incubeer de cellen bij 37°C gedurende ongeveer 3 minuten, of totdat de meeste cellen zichtbaar loskomen van het kweekoppervlak wanneer ze onder een microscoop worden onderzocht.
   3. Voeg 8 ml voorverwarmd volledig medium toe aan het gerecht om de trypsine te neutraliseren. Met een 10 mL serologische pipet, pipetteer je de celsuspensie voorzichtig ongeveer 15–20 keer omhoog en omlaag om de cellen te verspreiden.
   4. Overbreng 1 ml van de vering naar 9 ml verse complete medium.
   5. Tel de cellen met een geautomatiseerde celteller. Laad 10 μL van de hersuspendeerde celsuspensie direct in de telschuif zonder extra verdunning en voer celtelling uit volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: Cellevensvatbaarheidskleurstoffen zoals trypanblauw werden in dit protocol niet gebruikt. Beoordeel de celconditie visueel door celmorfologie en hechting te monitoren vóór trypsinisatie.
4. Zaai de cellen op de dekmantels.
   1. Verdun de cellen tot een eindconcentratie van ~1 × 10⁶ cellen/mL met een volledig medium. Bereken het vereiste volume celsuspensie met behulp van C₁V₁ = C₂V₂, waarbij C₁ de getelde celconcentratie is, V₁ het benodigde volume celsuspensie, C₂ de streefconcentratie en V₂ het gewenste eindvolume.
   2. Plaats individuele 28 mm geroosterde glazen dekplaten met een roosterafstand van 50 μm in putten van een 6-well plaat.
      OPMERKING: Autoclave-de glazen afdekfolies vóór gebruik voor celkweek. Plaats de gridzijde naar beneden om interferentie met celgroei te minimaliseren.
   3. Voeg 2 mL volledig medium en 200 μL celsuspensie (~2 × 10⁵ cellen per put) toe aan elke put. Beweeg de 6-well plaat zachtjes in een "X"-patroon om de cellen gelijkmatig over het dekkingoppervlak te verdelen.
   4. Incubeer de cellen ongeveer 15–20 uur om celhechting mogelijk te maken.
      OPMERKING: Monitor de celmorfologie routinematig met een microscoop om een normale celgroei te waarborgen. Onderzoek mogelijke mycoplasma-besmetting met een mycoplasmadetectiekit als de cellen slecht groeien.

2. Celreiniging met ammoniumformatiet (AF) oplossing

OPMERKING: Maak voor elk gebruik een verse AF-oplossing.

1. Maak direct voor gebruik een isotonische AF wasbuffer klaar. Weeg 0,45 g luchtstof en los het op in 50 mL LC/MS-water om een uiteindelijke luchtstroomconcentratie van 0,14 m (0,9% w/w) te verkrijgen. Pas de pH niet aan op ^5,45.
   OPMERKING: Gebruik de vers bereide AF-oplossing op dezelfde dag van de voorbereiding. Houd de oplossing ijskoud (0°C–4°C) tot gebruik.
2. Aspireer het kweekmedium uit elke put van de 6-putplaat. Voeg direct 2 ml cold AF-oplossing toe aan elke put.
3. Met steriele pincet tilt u voorzichtig elke deklaag met hechtende cellen uit de put terwijl het celbedekte oppervlak naar boven blijft wijzen. Plaats de coverslip kort voor 2–3 seconden in een aparte put die vooraf is gevuld met 2 mL koude 0,9% AF-oplossing.
4. Herhaal het spoelproces voor in totaal twee spoelingen met een verse AF-oplossing per spoeling. Na de laatste spoeling verwijder je de deklaag uit de AF-oplossing en laat deze ongeveer 20–30 minuten aan de lucht drogen in een chemische dampafzuigkap op kamertemperatuur voordat de DESI–MSI-analyse wordt uitgevoerd.
   OPMERKING: Spoel de cellen voorzichtig af om te voorkomen dat ze tijdens het wassen worden verstoord.

3. Fabricage van een aangepaste FAIMS-gebaseerde MS-interface

1. Haal de FAIMS Pro elektrode-ionenbronadapter uit elkaar om toegang te krijgen tot het interne elektrodegebied. Bevestig dat de adapter compatibel is met Thermo Orbitrap massaspectrometers uitgerust met de FAIMS Pro-interfaceconfiguratie.
2. Verwijder de FIMM-elektrodecomponenten, waaronder de interne draden, elektrodeassemblages, O-ringen en ondersteunende interne structuren. Behou de externe behuizingsbehuizing, montageflenzen en de interfacedetectiepen die nodig is voor massaspectrometerherkenning van de adapter.
3. Pas de ronde opening aan met standaard machinewerkplaatsbewerkingsprocedures. Vergroot de opening totdat er voldoende ruimte is rond de uitstekende Orbitrap-inlaat/ionentrechter.
4. Glad en braam de bewerkte rand na het snijden. Controleer of de aangepaste opening een onbelemmerde plaatsing van de behuizingsadapter op de massaspectrometer mogelijk maakt.
5. Pas de lengte van de twee poten van de behuizingsadapter aan met een zaag. Trim de poten tot een uiteindelijke lengte van ongeveer 6,5 cm om aansluiting met het optische breadboard mogelijk te maken.
   OPMERKING: Gebruik geschikte bewerkingsgereedschappen en voorkom schade aan de structurele integriteit van de overgebleven behuizing.
6. Maak een aluminium optisch breadboard klaar (10 inch × 12 in × 0,5 inch, 1/4"-20 getapte gaten). Plaats het breadboard horizontaal onder de aangepaste FINS-adapter.
7. Gebruik twee montagebeugels om de aangepaste FIMIS-adapter aan het optische breadboard te verbinden. Trim de beugels indien nodig om het gewicht te verminderen en een juiste positie van het breadboard ten opzichte van de Orbitrap-inlaat mogelijk te maken.
8. Bevestig de aangepaste FINS-interface op het optische breadboard met mechanisch compatibele montagehardware die is uitgelijnd met het 1/4"-20 tapgatpatroon van het breadboard. Zorg voor stabiele positionering tijdens beeldvormingsexperimenten.
   OPMERKING: Zorg ervoor dat de interface stijf is vastgezet om trillingen tijdens het bewegen van het podium en gegevensverzameling te minimaliseren.
9. Machineren of snijd een ondiepe groef in het optische breadboard direct onder het contactgebied van de FAIMS behuizing. Grootte en positie van de groef om voldoende ruimte te bieden voor stabiele zitplaatsen en uitlijning van de aangepaste FINS-behuizing ten opzichte van de Orbitrap-inlaat.
   OPMERKING: Pas de groef op zodat de basis van de FAIMS behuizingsadapter kan worden aangepast en de positionele reproduceerbaarheid verbetert.
10. Lijn de gemonteerde interface uit met de inlaat van de massaspectrometer. Controleer of de vastgehouden bevestigingsflenzen correct op het instrument zitten en dat het optische breadboard waterpas onder de interface blijft.
11. Controleer of de aangepaste ronde opening onbelemmerde ruimte biedt rond de Orbitrap-inlaat/ionentrechter voordat je de DESI-spuit installeert.

4. Assembleer de DESI-spuit en Orbitrap-interface

1. Bevestig de DESI-spuit op de geïntegreerde opstelling bestaande uit het aangepaste FIMIS-frame, een gemotoriseerde XYZ-trap, gasregelaar en optisch breadboard. Gebruik een gemotoriseerde trap die wordt aangestuurd door een CONEX-MFACC-controller.
2. Definieer de x-as als de rasterscanrichting van links naar rechts en definieer de y-as als de lijn-stap richting van boven naar beneden. Stel de z-as positie in vóór de acquisitie en houd deze vast tijdens het beelden.
3. Gebruik een stage-bewegingsbereik van ongeveer 1 mm in de x-richting en 1 mm in de y-richting. Pas geen z-as beweging toe tijdens de acquisitie.
4. Plaats de DESI-spuit onder een hoek van ongeveer 70° ten opzichte van het monsteroppervlak. Plaats het monster direct onder de spuit en plaats de spuittip zo dicht mogelijk bij de Orbitrap-inlaat zonder fysiek contact.
5. Verbind het DESI-aardingsmetaal met een aardbron onder de massaspectrometer. Beheer rasterbeweging met de stage-control software (Figuur 1).
   OPMERKING: De DESI-sproeier die in deze studie wordt gebruikt, is alleen beschikbaar voor gebruikers met DESI–MSI-instrumenten.
6. Gebruik een gemotoriseerde XYZ-stagecontroller voor de beweging en positionering van het podium. Verbind de spanningslijn, stikstofgasleiding, oplosmiddelleiding en aardingsleiding voordat je hem in gebruik neemt.
7. Installeer een op maat gemaakte roestvrijstalen ionentransportbuis (1/16 inch OD × 0,033 in ID) die is ontworpen om te passen bij de Orbitrap ionenbroninlaat. Plaats de ionentransportbuis zo dat deze direct uitgelijnd is met de Orbitrap-inlaat, terwijl hij voldoende naar buiten uitsteekt om ongehinderde toegang tot de DESI-pluim mogelijk te maken.
   OPMERKING: Pas de ionentransferbuis aan volgens de configuratie van de massaspectrometer. Fabriceer de ionentransferbuis met behulp van geschikte bewerkingsprocedures.
8. Gebruik een ionentransportbuis met een gebogen geometrie om de positionering van de DESI-spuit ten opzichte van het monsteroppervlak en de Orbitrap-inlaat te verbeteren.
9. Lijn de spuit uit onder een hoek van ongeveer 70° ten opzichte van het monsteroppervlak zodat de DESI-spuitpluim het Orbitrap-inlaatgebied snijdt zonder het monsteroppervlak te raken.
10. Definieer een stabiele spraypluim door de aanwezigheid van stabiele massaspectra en consistente genormaliseerde niveauwaarden (NL) tijdens de verwerving. Pas de positie van de sproeier aan totdat er een stabiel ionensignaal is waargenomen.
11. Stel de afstand tussen sprayer en oppervlak in op ongeveer 1,0–1,5 mm als startconditie. Stel de positie van de sproeier handmatig fijn af terwijl je de NL-waarden monitort om het hoogst stabiele ionensignaal te bereiken.

Figuur 1. Geïntegreerde desorptie-elektrospray-ionisatie (DESI)–massaspectrometriebeeldvorming (MSI) opstelling gekoppeld aan een Orbitrap-massaspectrometer. De DESI-sproeier is gemonteerd op een geïntegreerd platform bestaande uit een aangepaste hoogveld-asymmetrische golfvorm-ionenmobiliteitsspectrometrie (FAIMS) -adapter, een gemotoriseerde XYZ-trap, een gasregelaar en een optisch breadboard. Oplosmiddel wordt toegediend met een nano-vloeistofchromatografiesysteem, en stikstofgas wordt geleverd met ongeveer 12 psi voor spraystabilisatie. De figuur toont ook de ionisatiespanningsverbinding, oplosmiddellijn en positie van de spuit ten opzichte van de Orbitrap-inlaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Configureer de toedienings- en spuitcondities van oplosmiddelen

1. Bereid een verse spuitoplossing bestaande uit methanol/water/mierenzuur (98:2:0,1, v/v/v) voor de DESI–MSI-analyse.
   OPMERKING: Andere DESI-compatibele oplosmiddelsystemen, waaronder acetonitril-gebaseerde oplosmiddelen en verschillende methanol/waterverhoudingen, kunnen na optimalisatie worden gebruikt. Methanol/water/mierenzuur (98:2:0,1, v/v/v) werd als standaard uitgangsvoorwaarde in dit protocol gebruikt omdat het stabiele pluimvorming, verminderde de verspreiding van oplosmiddelen en reproduceerbare positieve-ionenmodus lipidesignalen bood tijdens enkelcel DESI–MSI-experimenten.
   VOORZICHTIG: Methanol is brandbaar en giftig. Mierenzuur is corrosief. Behandel de oplosmiddelen in een chemische afzuigkap.
2. Het oplosmiddel wordt geleverd met een Ultimate 3000 nano-LC-systeem dat werkt als een isocratische oplosmiddelpomp bij 750 nL/min voor de gerapporteerde experimenten. Verbind het nano-LC-stopcontact met de DESI-spuit met behulp van een PEEK-buis (1/16 inch buitendiameter × 0,005 inch binnendiameter).
3. Installeer een C18-kolom (bijv. nanoEase M/Z Peptide BEH; 130 Å, 1,7 μm, 300 μm × 150 mm) in lijn om voldoende tegendruk te bieden voor stabiele sprayvorming bij lage debietsnelheden.
4. Stel de massaspectrometermethode in op positieve ionenmodus met Orbitrap-detectie, een sprayspanning van 0,85 kV, Orbitrap-resolutie van 120.000 bij m/z 200 en een m/z-bereik van 150–1200.
5. Stel het genormaliseerde AGC-doel in op 100%, maximale injectietijd op 100 ms, RF-lens op 45%, en microscans op 1. Schakel quadrupoolisolatie en bronfragmentatie uit.
6. Voer stikstofmantelgas aan van een stikstofgenerator of vloeibare stikstofbron met ongeveer 12 psi om de DESI-spuitpluim te stabiliseren. Gebruik 12 psi als startwerkdruk en voer alleen kleine handmatige aanpassingen uit als dat nodig is om de NL-waarden te verbeteren en een stabiel massaspectrum te behouden.

6. Voer rasterbeeldvorming en pixelcontrole uit

1. Identificeer een interessegebied met optisch zichtbare losse cellen met behulp van de gerasterde coverslips als referentie. Selecteer geïsoleerde cellen met duidelijke visuele scheiding van naburige cellen, intacte adherente morfologie en geen duidelijke overlap met afval of celclusters.
2. Definieer het rastergebied met Fance Stage Controller^{software 46}. Stel de rasterstapgrootte in op 0,01 mm, de snelheid van het podium op 0,01 mm/s en de dwell-tijd op 20 seconden.
3. Gebruik rasterscanning van links naar rechts over elke lijn, gevolgd door een beweging naar de volgende lijn in de y-richting. Stel de orthogonale stapgrootte tussen rasterlijnen in op 10 μm.
4. Pas de trapsnelheid aan volgens de Orbitrap-acquisitiesnelheid om de gewenste scanrichting-pixeldimensie te bereiken (bijv. ongeveer 2,5–6,5 μm). Bereken de scanrichting pixeldimensie met de volgende relatie: scanrichting pixeldimensie = trapsnelheid × acquisitietijd per scan.
5. Met een trapsnelheid van 0,01 mm/s (10 μm/s) wordt 376 scans over 102 seconden verworven, wat een verworvingstijd van 0,271 s per scan en een overeenkomstige scanrichtingspixeldimensie van ongeveer 2,7 μm oplevert. Synchroniseer de stagebeweging en massaspectrale acquisitie door de Orbitrap-acquisitietiming iets korter in te stellen dan de gecombineerde stage-bewegings- en dwell-timingparameters.
   OPMERKING: De orthogonale pixeldimensie wordt bepaald door de geprogrammeerde stapgrootte en de fysieke en mechanische beperkingen van de trap, terwijl de scanrichtingsdimensie wordt bepaald door trapsnelheid en spectrale verwervingssnelheid.
6. Verkrijg beeldgegevens over het geselecteerde massabereik totdat het vooraf gedefinieerde rastergebied is voltooid. Voor een beeldgebied van 1 mm × 1 mm, verkregen met een lijnstap van 0,01 mm en een trapsnelheid van 0,01 mm/s, bedraagt de totale opnametijd ongeveer 4–5 uur.
7. Genereer RAW-gegevensbestanden tijdens de acquisitie en stop de acquisitie na voltooiing van de opgegeven x–y rastercoördinaten en de bijbehorende duur van de instrumentmethode. Onder de hier beschreven positieve-ionenmodus condities genereert elke rasterlijn doorgaans een RAW-bestand van ongeveer 50 MB, wat resulteert in ongeveer 5 GB totale data voor 101 rasterlijnen.

7. Optische naar MS beeldregistratie

1. Maak brightfield-beelden van de cellen in het geselecteerde rastergebied na het AF-wassen en drogen en vóór DESI-acquisitie met een brightfield-microscoop uitgerust met een 10× objectief.
2. Converteer RAW-bestanden naar mzML-bestanden met msConvert vanuit ProteoWizard⁴⁸. Converteer de mzML-bestanden naar imzML-formaat met imzML Converter⁴⁹.
3. Gebruik centroid-/profielconversie-instellingen die consistent zijn met het verworven dataformaat. Upload de imzML-bestanden direct naar METASPACE (https://metaspace2020.eu)⁵⁰ voor beeldvisualisatie.
4. Pas geen normalisatie, hotspotverwijdering of extra correcties voor beeldverwerking toe vóór visualisatie. Lijn de optische en MS-afbeeldingen handmatig uit met behulp van de rasterherkenningspunten als positiereferenties.
5. Schaal het optische beeld met behulp van de bekende beeldafmetingen en rasterafstand. Leg handmatig het MS-beeld over elkaar heen om de correspondentie tussen optisch zichtbare celposities en gelokaliseerde ionensignalen te beoordelen.
6. Bevestig de localisatie van enkele cellen door visuele overeenstemming tussen geïsoleerde cellen in het brightfield-beeld en de bijbehorende MS-ionverdelingen.

Resultaten

Succesvolle uitvoering van dit protocol levert DESI–MSI-datasets op waarin optisch geïdentificeerde individuele cellen ruimtelijk overeenkomen met gelokaliseerde moleculaire ionsignalen (Figuur 2). Brightfield-microscopiebeelden die vóór DESI–MSI-analyse zijn verkregen, maken visuele identificatie van individuele OVCAR-8-cellen mogelijk en vergemakkelijken de optisch-naar-MS beeldregistratie met behulp van de gerasterde coverslip als positionele referentie. Representatieve DESI–MSI-ionenbeelden tonen gelokaliseerde ionenverdelingen die ruimtelijk correleren met individuele cellen die in het bijbehorende brightfield-beeld zijn geïdentificeerd (Figuur 2A–2D).

Figuur 2. Vergelijking van brightfield-microscopie en MSI van OVCAR-8 cellen. (A) Brightfield-microscopiebeeld van OVCAR-8-cellen met 10× vergroting. (B–D) MS-beelden verkregen met DESI–MSI met een pixelgrootte van 5,5 μm × 10 μm. Representative ionenverdelingen worden getoond voor (B) m/z 317.111, (C) m/z 808.562 en (D) m/z 788.616. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Individuele cellen genereren volledige massaspectra die meerdere lipide-gerelateerde ionen en kleine moleculen bevatten. In plaats van te vertrouwen op één moleculaire marker, vertoont elke cel een multi-ion moleculair profiel dat fungeert als een chemische vingerafdruk. Representatieve ionenbeelden op m/z 317.111, m/z 808.562 en m/z 788.616 tonen heterogene moleculaire verdelingen over naburige cellen, wat wijst op meetbare metabole heterogeniteit op enkelcelniveau (Figuur 2B–2D). METASPACE-gebaseerde annotaties suggereerden dat ionen die werden gedetecteerd bij m/z 808.562 en m/z 788.616 voornamelijk geassocieerd waren met fosfatidylcholine en fosfatidylethanolamine lipiden, terwijl m/z 317.111 overeenkwam met verschillende kandidaat kleine moleculen en dipeptide-gerelateerde soorten. Deze resultaten tonen aan dat het platform het mogelijk maakt om ruimtelijk gelokaliseerde moleculaire kenmerken te detecteren van optisch geïdentificeerde individuele cellen onder omgevingsomstandigheden. Aanvullende resultaten, waaronder voorlopig geannoteerde soorten, MS/MS-geïdentificeerde soorten, representatieve MS-beelden en massaspectra, zijn beschikbaar in eerdere studies²⁰.

Het geïntegreerde DESI–MSI-platform bestaat uit een DESI-spuit, een aangepaste FIMS-adapter, een gemotoriseerde XYZ-trap en een optisch breadboard gemonteerd naast de Orbitrap-inlaat (Figuur 1). De opstelling maakt stabiele oplosmiddelafgifte, gecontroleerde trapbeweging en uitlijning van de DESI-spraypluim met de massaspectrometer-inlaat mogelijk voor omgevings-single-cel imaging-experimenten. De aangepaste ionentransportbuis die in Figuur 3 wordt getoond, maakt ionentransmissie mogelijk tussen het DESI-brongebied en de Orbitrap-inlaat. De gebogen capillaire geometrie vergemakkelijkt de positionering van de DESI-spuit ten opzichte van het monsteroppervlak en het inlaatgebied, terwijl de ionenoverdracht onbelemmerd blijft.

Figuur 3. Aangepaste ionentransferbuis voor Orbitrap MSI. Foto van de op maat gemaakte ionentransportbuis die werd gebruikt om de DESI-sproeier te koppelen aan de Orbitrap Fusion Lumos massaspectrometer. De figuur toont de geometrie van de capillaire van de gebogen transfer en de montage die wordt gebruikt voor ionentransmissie tijdens ambient single-cell MSI-experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4 toont de aangepaste FINS-adapter geïntegreerd met het optische breadboard en de gemotoriseerde XYZ-trap. Het bovenaanzicht (Figuur 4A) toont de positie van de monstertrap en de aangepaste adapter ten opzichte van de Orbitrap-inlaat, terwijl het onderste beeld (Figuur 4B) de montagebeugels en trapassemblage toont die het beeldplatform ondersteunen. Mechanische stabiliteit van de geïntegreerde assemblage is belangrijk voor het behouden van consistente rasterbeweging en het minimaliseren van positionele afwijking tijdens beeldverkrijgen.

Figuur 4. Aangepaste hoogveld asymmetrische golfvorm ionenmobiliteitsspectrometrie (FAIMS) adapter geïntegreerd met het optische breadboard en de gemotoriseerde XYZ-trap. (A) Bovenaanzicht van de aangepaste adapter naast de Orbitrap-inlaat en monstertrap. (B) Onderaanzicht met de aangepaste beugels, optisch breadboard en gemotoriseerde XYZ-trapassemblage die worden gebruikt om het beeldplatform te ondersteunen en uit te lijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De hoge massaresolutie die door Orbitrap-detectie wordt geleverd, maakt differentiatie mogelijk van dicht bij elkaar liggende en isobare lipidesoorten, waardoor de moleculaire specificiteit en beeldcontrast verbeteren ten opzichte van systemen met een lagere massa-resolutie. Kleine pixelafmetingen kunnen worden bereikt door synchronisatie van trapsnelheid en spectrale acquisitiesnelheid. Zo zijn pixelafmetingen van slechts 2,7 μm × 10 μm bereikt met snel-acquisitieve Orbitrap-platforms en geoptimaliseerde rasterparameters⁴². Beeldvorming met hoge ruimtelijke resolutie maakt moleculaire afbakening van nauw aangrenzende cellen mogelijk, terwijl signaaloverlap tussen aangrenzende cellulaire gebieden wordt geminimaliseerd.

Succesvolle DESI–MSI-experimenten worden gekenmerkt door stabiele spraycondities, consistente ionenintensiteit over rasterlijnen en ruimtelijke lokalisatie van moleculaire signalen die overeenkomen met individuele cellen in het optische beeld. Suboptimale experimenten kunnen diffuse ionenverdelingen, lage signaalintensiteit, inconsistente rasterpatronen of verlies van cellulaire lokalisatie veroorzaken door onstabiele sprayvorming, onjuiste uitlijning van de sproeier, overmatige verspreiding van oplosmiddelen of monsterbeweging tijdens de verwerving. Zorgvuldige optimalisatie van sprayuitlijning, solventstroomsnelheid, trapsnelheid en monsterpositionering verbetert de ruimtelijke nauwkeurigheid en de stabiliteit van ionensignalen tijdens single-cell imaging-experimenten.

Discussie

Dit protocol maakt omgevings-enkelcel DESI–MSI mogelijk met behulp van Orbitrap-massaspectrometers met hoge massa-resolutie door de integratie van precieze trapbesturing, nanoschaal oplosmiddelafgifte, optische targeting en massaanalyse met hoge ruimtelijke resolutie. De combinatie van deze elementen pakt meerdere technische barrières aan die historisch gezien de toepassing van DESI–MSI op single-cell niveau hebben beperkt. In het bijzonder maakt gecoördineerde controle van spraystabiliteit, ionenoverdracht en verwervingstiming het mogelijk om moleculaire signalen uit extreem kleine bemonsteringsvolumes die overeenkomen met individuele cellen te detecteren. Een centrale factor die de prestaties in deze workflow bepaalt, is de stabiliteit en opsluiting van de DESI-spuitpluim. Bij ruimtelijke resoluties op micrometerschaal kunnen kleine verstoringen in de oplosmiddelstroomsnelheid, gasdruk of de positie van de sproeier het effectieve bemonsteringsgebied aanzienlijk veranderen. Het gebruik van nanoschaal solventafgifte gecombineerd met geschikte tegendruk verbetert de spraystabiliteit en vermindert de verspreiding van oplosmiddel, waardoor de ruimtelijke nauwkeurigheid wordt verbeterd. Daarnaast is het behouden van een consistente afstand en hoek tussen sprayer en oppervlak cruciaal voor reproduceerbare ionisatie-efficiëntie. Zelfs kleine afwijkingen in geometrie kunnen leiden tot aanzienlijke variatie in signaalintensiteit, vooral bij het analyseren van heterogene cellulaire monsters. In de praktijk werd de optimalisatie van DESI-sproeicondities empirisch uitgevoerd door het monitoren van de totale ionenstroom, spectrale stabiliteit en NL-waarden (meestal rond 10⁵–10⁶) tijdens de acquisitie. Reproduceerbare signaalkwaliteit werd bereikt door iteratieve aanpassing van de positie van de sproeier, stabiliteit van de oplosmiddelstroom, gasdruk en uitlijning van de DESI-pluim ten opzichte van de Orbitrap-inlaat.

De efficiëntie van ionenoverdracht vormt een andere belangrijke beperking op single-celschaal, omdat de analytenconcentratie inherent laag is binnen individuele cellen. Op deze ruimtelijke schalen kan efficiënte ionenoverdracht in sommige implementaties een grotere praktische beperking zijn dan de ionisatie-efficiëntie, omdat slechts een zeer klein deel van de gedesorbeerde ionen uiteindelijk de inlaat van de massaspectrometer bereikt. Efficiënte overdracht van ionen van het bemonsteringsgebied naar de inlaat van de massaspectrometer is daarom essentieel. De aangepaste FIMIS-behuizingsadapter die in dit protocol wordt gebruikt, biedt een interface tussen de DESI-spuitbron en een thermo-massaspectrometer, waardoor compatibiliteit met meerdere instrumentmodellen mogelijk is, waaronder Orbitrap Tribrid, Exploris en Astral-serie platforms. De integratie van de aangepaste FAIMS behuizingsadapter met een optisch breadboard zorgt ook voor mechanische stabiliteit, waardoor misalignment tijdens uitgebreide beeldvormingsexperimenten wordt geminimaliseerd. Synchronisatie tussen stagebeweging en massaspectrale acquisitie is even cruciaal voor het bereiken van een hoge ruimtelijke resolutie. In DESI–MSI wordt de pixeldimensie in de scanrichting bepaald door de relatie tussen trapsnelheid en acquisitiesnelheid, terwijl de orthogonale dimensie wordt gedefinieerd door de geprogrammeerde stapgrootte. Nauwkeurige controle van deze parameters maakt nauwkeurige bemonstering mogelijk. Omdat veel zoogdiercellen doorgaans ongeveer 5–20 μm in diameter variëren, zijn pixelafmetingen van slechts enkele micrometers nodig om signaaloverlap tussen aangrenzende cellen te minimaliseren en de lokalisatie van moleculaire kenmerken naar individuele cellulaire gebieden te verbeteren. De nominale pixelgrootte komt echter niet noodzakelijk overeen met de werkelijke bemonsteringsvoetafdruk, omdat de interactie van de oplosmiddelpluim met het monsteroppervlak laterale spreiding en gedeeltelijke signaaloverlap tussen aangrenzende pixels kan veroorzaken. Gerapporteerde pixelafmetingen moeten daarom worden geïnterpreteerd in de context van effectieve ruimtelijke resolutie in plaats van strikt geometrische definities. De aangepaste ionentransportbuis die in deze studie werd gebruikt, was ontworpen volgens de geometrie van de standaard ionentransportbuis om de ionentransmissiekenmerken te behouden en integratie met de DESI-bronconfiguratie mogelijk te maken.

Een hoog massaresolutievermogen en massanauwkeurigheid van Orbitrap-massaspectrometers zijn essentieel voor het oplossen van de complexe mix van metabolieten en lipiden die in individuele cellen aanwezig zijn. Veel gedetecteerde moleculaire kenmerken werden voorlopig geannoteerd met nauwkeurige massametingen en METASPACE-analyse. Omdat meerdere kandidaat-toewijzingen kunnen overeenkomen met één gemeten m/z-waarde, kunnen aanvullende MS/MS-validatie en orthogonale moleculaire bevestigingsstrategieën de moleculaire identificatie in toekomstige studies verder versterken. In positieve ionenmodus worden DESI-spectra vaak gedomineerd door fosfolipide-soorten met dicht bij elkaar liggende of isobare m/z-waarden. Detectie van Orbitrap met hoge resolutie maakt differentiatie van deze soorten mogelijk, waardoor de moleculaire specificiteit verbetert en spectrale ambiguïteit wordt verminderd. Deze mogelijkheid is vooral belangrijk voor enkelcel-analyses, waarbij een afhankelijkheid van een beperkt aantal ionen kan leiden tot een verkeerde interpretatie van cellulaire heterogeniteit. Deze aanpassingsvermogen suggereert dat vergelijkbare strategieën toepasbaar kunnen zijn op andere massaspectrometrieplatforms met bijbehorende interfaces en passende aanpassingen. Ondanks deze voordelen moeten er verschillende beperkingen worden overwogen. Ten eerste is de DESI-bron die in het huidige werk wordt gebruikt alleen beschikbaar voor gebruikers met DESI–MSI-systemen, en de bouw van DESI-sprayer/Orbitrap-systemen kan daarom beperkt zijn door de beschikbaarheid van DESI-bronnen. Alternatieve DESI-apparaten, waaronder DEFFI, kunnen echter ook worden geïmplementeerd voor hoog-ruimtelijke resolutie MSI-studies ^42,47. Ten tweede vereist de implementatie van dit platform aanzienlijke aanpassing, waaronder het bewerken van instrumentinterfaces en het fabriceren van montagecomponenten. Deze eisen kunnen de toegankelijkheid beperken voor laboratoria zonder ervaring in instrumentontwikkeling of mechanische fabricage. In de huidige uitvoering diende de FAIMS interfacebehuizing als een handig mechanisch montageplatform om de DESI-sproeier te positioneren ten opzichte van de Orbitrap-inlaat. Daarom is de implementatie van de beschreven configuratie praktischer voor laboratoria met toegang tot FAIMS-compatibele Orbitrap-systemen en basisondersteuning voor bewerking. Het bredere concept van het mechanisch koppelen van DESI-bronnen aan Orbitrap-inlaten kan echter worden bereikt met alternatieve ontwerpen zonder de FIMIS-interfacehardware aan te passen. Ten derde, hoewel lage oplosmiddelstromen de ruimtelijke opsluiting verbeteren, kunnen ze ook de totale ionenopbrengst verminderen, waardoor zorgvuldige optimalisatie nodig is om gevoeligheid en ruimtelijke resolutie in balans te brengen.

Een andere belangrijke overweging is de mogelijkheid voor analytendelokalisatie tijdens het bemonsteren. Hoewel DESI werkt onder omgevingsomstandigheden en geen matrixtoepassing vereist, kan de interactie van druppels oplosmiddelen met het monsteroppervlak leiden tot herverdeling van analyten, vooral bij zeer oplosbare stoffen. Het minimaliseren van het oplosmiddelvolume en het optimaliseren van de sproeiomstandigheden zijn daarom cruciaal voor het behouden van ruimtelijke integriteit op enkelcelniveau. Evenzo kan de wasprocedure met isotonisch ammoniumformiat de zoutgeassocieerde ionensuppressie verminderen, terwijl celintegriteit behouden blijft en cellulaire stoffen behouden blijven, zoals eerder gerapporteerd in single-cell MS-workflows⁵.

Toekomstige ontwikkelingen kunnen de prestaties en toepasbaarheid van dit platform verder verbeteren. Zo zou integratie met snellere data-acquisitiesystemen kleinere effectieve pixelgroottes en hogere doorvoer-MSI-experimenten mogelijk kunnen maken. De implementatie van geautomatiseerde uitlijningssystemen of realtime feedbackcontrole kan variabiliteit verminderen en reproduceerbaarheid verbeteren. Daarnaast kan het combineren van deze aanpak met complementaire technieken, zoals fluorescentiebeeldvorming of gerichte labelingstrategieën, de identificatie van celtypen verbeteren en multimodale analyses mogelijk maken.

Naast technische overwegingen heeft dit platform brede implicaties voor biologisch en biomedisch onderzoek. Het vermogen om moleculaire profielen op het niveau van individuele cellen onder omgevingsomstandigheden te karakteriseren, biedt nieuwe mogelijkheden voor het bestuderen van cellulaire heterogeniteit in complexe systemen. DESI–MSI is al met succes toegepast op weefselniveau in studies naar tumormicroomgevingen, neurologische ziekten, gastheer-pathogeen interacties en geneesmiddelresistente cellulaire populaties 12,15,16,35. Het uitbreiden van DESI–MSI naar het enkelcelniveau kan het vermogen verder verbeteren om gelokaliseerde chemische heterogeniteit tussen naburige cellen te onderscheiden, zeldzame cellulaire subpopulaties te identificeren en moleculaire markers te ontdekken die anders mogelijk verborgen zijn bij bulkweefselmetingen. De huidige studie is echter uitgevoerd met een vereenvoudigd monolaag-celkweekmodel, en er zijn aanvullende studies nodig om compatibiliteit met andere complexe biologische systemen aan te tonen, waaronder verschillende celmodellen, weefsels, organoïden en 3D-culturen. De huidige workflow kan een basis vormen voor het uitbreiden van DESI-metingen met hoge ruimtelijke resolutie naar steeds heterogene biologische omgevingen na verdere validatie en optimalisatie. Omdat deze methode de ruimtelijke context behoudt en gedetailleerde moleculaire informatie biedt, kan het dienen als een brug tussen beeldvorming en omics-gebaseerde benaderingen. Samenvattend stelt dit protocol een flexibel en aanpasbaar kader vast voor het bereiken van single-cel-resolutie DESI–MSI op Orbitrap-massaspectrometers. Door belangrijke uitdagingen aan te pakken die verband houden met ionisatie-efficiëntie, ionentransmissie, ruimtelijke controle en massaresolutie, maakt deze aanpak gedetailleerde moleculaire karakterisering van individuele cellen mogelijk. Hoewel verdere optimalisatie en validatie nodig zijn, biedt de methodologie een basis voor het uitbreiden van het gebruik van omgevings-MSI in enkelcel- en ruimtelijke metabolomica-studies.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
−80 °C vrieskast	Eppendorf New Brunswick	U700	Opslag van biologische monsters voor bereiding.
6" verticale beugel voor breadboards, 1/4"-20 gaten (2 stuks)	Millipore Sigma	VB01A	Mechanische ondersteuning en stabilisatie van de aangepaste sprayer-mount montage
Acetonitril	Fisher Chemical	240744	Organische oplosmiddel voor DESI-compatibele oplosmiddelvoorbereiding en optimalisatie
Ammoniumformiaat	Thermo Fisher Scientific	401152500	Bereiding van isotone ammoniumformiaat wasbuffer voor celwassing vóór DESI–MSI
Brightfield microscoop	Fisher Scientific	12575252	Optische beeldvorming en visualisatie van adherende cellen vóór DESI–MSI acquisitie
C18 kolom	Waters	186009259	In-line terugdrukgeneratie voor stabiele nano-flow DESI spray vorming
Koperdraad	N/A	N/A	Elektrische verbinding en aarding tijdens fabricage van sprayer-montage
DESI XS sprayer	Waters	700014033	Ambiente DESI ionisatiebron voor single-cell DESI–MSI experimenten
Epoxyhars	Devcon	20945	Mechanische stabilisatie en fixatie van aangepaste sprayer-montage componenten
FAIMS Pro elektrode ionisatiebronbehuizing adapter	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Modificatie en fabricage van de aangepaste Orbitrap-compatibele DESI interface
Mierenzuur	Ward’s Science	470301-120	Zuur modificer voor DESI spray oplosmiddelvoorbereiding
Methanol	Fisher Chemical	A456-4 Optima	Organisch oplosmiddel voor DESI spray oplosmiddelvoorbereiding
Gasregelaar	Millipore Sigma	23831-U	Regulering van stikstofmantelgasdruk tijdens DESI werking
Geraseerd glazen dekglas	Ibidi	10817	Celcultuur substraat en positionele referentie voor optische-naar-MS beeldregistratie
Aardingsdraad	N/A	N/A	Elektrische aardingsverbinding voor DESI sprayer en interface montage
Incubator	HeraCell	51026282	Onderhoud van zoogdiercelculturen onder gecontroleerde temperatuur en CO2 omstandigheden
LC/MS-kwaliteit water	Thermo Fisher Scientific	W6500	Bereiding van ammoniumformiaat wasbuffer en DESI spray oplosmiddel
METASPACE platform	METASPACE	https://metaspace2020.eu	Cloud-gebaseerde MS beeldvisualisatie en ruimtelijke metabolomics data-analyse
Gemodificeerde FAIMS interface	Thermo Fisher Scientific	98100-20046	Aangepaste interface voor koppeling van de DESI sprayer met Orbitrap massaspectrometers
Gemotoriseerde XYZ stage	Newport Corporation	CONEX-MFACC	Gecontroleerde raster-stage beweging tijdens DESI–MSI acquisitie
MycoAlert PLUS mycoplasma detectiekit	Lonza	LT07-703	Routine monitoring van mycoplasma besmetting in gekweekte cellen
Nano-vloeistofchromatografie systeem	Thermo Fisher Scientific	5200.0355	Nano-flow oplosmiddelafleveringssysteem voor DESI spray generatie
Optische breadboard	Thorlabs	MB1012	Mechanische ondersteuningsplatform voor DESI sprayer en gemodificeerde interface montage
Orbitrap Fusion Lumos massaspectrometer	Thermo Fisher Scientific	UVPD	Hoge resolutie Orbitrap massaspectrometer voor DESI–MSI data acquisitie
PEEK buis	IDEX	1535	Oplosmiddel-lijnverbinding tussen nano-LC systeem en DESI sprayer
Penicilline-streptomycine	Gibco	15140-122	Antibioticum supplement voor zoogdiercelcultuurmedium
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)	VWR	0780-50L	Wasoplossing voor gekweekte cellen tijdens overplanting
RPMI-1640 medium	Gibco	11875093	Zoogdiercelcultuurmedium voor onderhoud van OVCAR-8 cellen
Stage-control software	Lasken Group	Versie 6	Software controle van raster scannen, stage beweging, en beeldacquisitie parameters
Roestvrij stalen buis	MicroGroup	316H16H	Op maat gemaakte ionenoverdrachtsbuis (1/16" OD, 0.033" ID) voor Orbitrap interface integratie
Spuit, 250 µL	Hamilton	1725LTN250UL	Oplosmiddel laden en nano-flow oplosmiddelaflevering
Synthetisch foetaal bovien serum (FBS)	HyClone	SH3006603	Serum supplement voor bereiding van compleet zoogdiercelcultuurmedium
TC20 Geautomatiseerde Celteller	Bio-Rad Laboratories	1450102EDU	Geautomatiseerd tellen van gekweekte cellen vóór zaaien op dekglasjes
Weefselkweekschaal, 100 mm	Fisher Scientific	FB012924	Expansie en onderhoud van adherente OVCAR-8 celculturen
Trypsine-EDTA	Thermo Fisher Scientific	25200-072	Enzymatische loslating van adherente cellen tijdens overplanting
UV-hardende hars	Prime Dental	6.03	Fabricage en stabilisatie van aangepaste DESI sprayer-montage componenten
Xcalibur software	Thermo Fisher Scientific	4.7	Instrument controle, Orbitrap methode setup, en massaspectrale data acquisitie