Methodenartikel

Ontwikkeling van een STAT6-reporterassay voor het screenen van milieugifstoffen die allergische luchtweginflammatie beïnvloeden

108 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71694

⸱

25 augustus 2026

 ,  ,  ,  , 
1Chakri Naruebodindra Medical Institute, Faculty of Medicine Ramathibodi Hospital, Mahidol University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de generatie en validatie van een stabiele STAT6 luciferase reporterassay in menselijke epitheelcellen van de luchtwegen. De methode maakt een efficiënte screening mogelijk van milieutoxicanten en componenten van luchtvervuiling die de STAT6-activiteit moduleren onder gecontroleerde in vitro condities.

Samenvatting

Allergische luchtwegontsteking geassocieerd met luchtvervuiling is een groeiend probleem voor de volksgezondheid. Interleukine-4 (IL-4) en interleukine-13 (IL-13), die de Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6)-route activeren, een centrale mediator van allergische luchtwegontsteking, kunnen de respiratoire toxiciteit van vervuilende stoffen moduleren. De huidige studie beschrijft de generatie en validatie van een stabiele STAT6-luciferase-reporterassay in menselijke epitheelcellen van de luchtwegen voor het evalueren van milieutoxicanten die STAT6-signalering moduleren. Menselijke bronchiale epitheelcellen 16HBE14o− werden getransduceerd met een STAT6-responsieve luciferase-reporter met behulp van een lentivirale vector, gevolgd door optimalisatie van de puromycineselectie en de multiplicity of infection, en monoklonale isolatie door middel van limiterende verdunning. Er werd een stabiele kloon geselecteerd met een sterke en reproduceerbare inductie over opeenvolgende passages. De responsiviteit van de reporter werd gevalideerd door IL-4/IL-13-stimulatie, en de STAT6-afhankelijkheid werd bevestigd met behulp van selectieve STAT6-, STAT5- en STAT3-remmers. De assayprestaties werden gekwantificeerd via Z′-factoranalyse, wat wees op een reproduceerbare signaalscheiding. Bovendien werd de assay toegepast op individuele bestanddelen van luchtvervuiling, waarbij benzo[b]fluorantheen en fijnstof de STAT6-reporteractiviteit significant verhoogden. Deze methode biedt een schaalbare aanpak voor het meten van STAT6-activiteit in epitheelcellen van de luchtwegen en voor het prioriteren van milieutoxicanten die allergische luchtwegsignalering moduleren.

Inleiding

Luchtvervuiling vormt een van de meest urgente wereldwijde uitdagingen voor de volksgezondheid, met diepgaande gezondheidseffecten en sociaaleconomische gevolgen. Het wordt momenteel geclassificeerd als de tweede belangrijkste risicofactor voor mortaliteit, verantwoordelijk voor 8,1 miljoen sterfgevallen per jaar1,2,3. Onder de luchtvervuilende stoffen vormt fijnstof met een diameter van minder dan 2,5 micrometer (PM2,5) het grootste gezondheidsrisico vanwege het vermogen om diep in de luchtwegen door te dringen4,5. Een verhoogde blootstelling aan PM2,5 is consistent gekoppeld aan een verslechterde longfunctie en een toename van het aantal ziekenhuisopnames voor luchtwegaandoeningen6. De prevalentie van allergische ontstekingsziekten, waaronder astma, allergische rinitis en atopische dermatitis, neemt wereldwijd toe en is onevenredig hoog in sterk vervuilde megasteden4.

Allergische luchtwegaandoeningen, zoals atopisch astma, worden primair gemedieerd door een type 2-inflammatoire respons die wordt gekenmerkt door verhoogde spiegels van de cytokinen interleukine-4 (IL-4) en interleukine-13 (IL-13) en activatie van de Signal Transducer and Activator of Transcription 6 (STAT6)-signaleringsroute7. In luchtwwegepitheelcellen bevordert de door IL-4 en IL-13 gedreven fosforylering van STAT6 mucus-hypersecretie en verstoring van de epitheliale barrière, waardoor STAT6 wordt geïdentificeerd als een centrale mediator van allergische luchtwegpathologie en een relevant therapeutisch doelwit8,9. Experimenteel bewijs uit muismodellen geeft aan dat blootstelling aan PM2.5 en zwaveldioxide de STAT6-signalering versterkt en allergische luchtwegontsteking verergert10,11. Het is echter nog niet systematisch geëvalueerd of individuele componenten van luchtvervuiling de transcriptionele activiteit van STAT6 in menselijke luchtwwegepitheelcellen direct moduleren.

Luchtvervuiling bestaat uit een chemisch complex mengsel van bestanddelen, waaronder fijnstof, polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's), zware metalen en anorganische zouten, waarvan de individuele bijdragen aan de activering van STAT6 in de luchtwegen nog onvoldoende zijn gedefinieerd12,13. Huidige methodologieën voor het meten van STAT6-activiteit in epitheelcellen van de luchtwegen, zoals endpoint-fosforyleringsassays of reporter-systemen op basis van transiënte transfectie, lenen zich niet voor grootschalige chemische screening. Een stabiel, celgebaseerd STAT6-reporterplatform in menselijke epitheelcellen van de luchtwegen zou daarom een schaalbaar instrument bieden om door vervuiling afgeleide verbindingen te identificeren die allergische signalering in de luchtwegen moduleren. Dit protocol beschrijft de ontwikkeling en validatie van een stabiele STAT6-luciferase-reporterassay in 16HBE14o− epitheelcellen van de luchtwegen, wat kwantitatieve evaluatie van STAT6-activering mogelijk maakt voor systematische screening van milieu monsters en individuele chemische toxines.

Protocol

Ethische goedkeuring voor menselijke proefpersonen is niet van toepassing, omdat deze studie gebruikmaakte van de gevestigde 16HBE14o− humane bronchiale epithelcellijn.

1. Generatie van 16HBE14o− cellen die stabiel een STAT6-activiteitsreporter tot expressie brengen

OPMERKING: Figuur 1 geeft een overzicht van de workflow.

  1. Celkweek
    OPMERKING: Voer alle procedures uit met aseptische techniek in een Class II biologische veiligheidskabinet. Bevestig dat de cellen vrij zijn van mycoplasma-contaminatie vóór gebruik.
    1. Onderhoud van de 16HBE14o− cellen in minimum essential medium aangevuld met 10% foetaal runderserum en 1% penicilline-streptomycine. Incubeer de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO22en vervang het kweekmedium om de dag.
    2. Laat de cellen een confluentie van ongeveer 80% bereiken. Aspireer het kweekmedium en spoel de cellaanzet één keer met fosfaatgebufferde zoutoplossing.
    3. Voeg voldoende fosfaatgebufferde zoutoplossing toe om de cellaag te bedekken en incubeer de cellen gedurende 20 min bij 37 °CZuig de fosfaatgebufferde zoutoplossing volledig af.
      OPMERKING: Gebruik de incubatie van 20 minuten in fosfaatgebufferde zoutoplossing om de disruptie van de nauwe intercellulaire verbindingen die door deze cellijn worden gevormd te vergemakkelijken. Deze tijdsduur is een intern geoptimaliseerde aanpassing.
    4. Voeg voldoende 0,25% trypsine-ethylendiaminetetraazijnzuuroplossing toe om de cellaag te bedekken. Incubeer de cellen 10 min bij 37 °C.
      OPMERKING: Controleer de celdetachement met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop. Tik indien nodig voorzichtig tegen het kweekvat om de detachement te vergemakkelijken.
    5. Voeg ongeveer vijf volumes volledig kweekmedium toe ten opzichte van het volume van de trypsine-ethylenediaminetetra-azijnzuuroplossing om de enzymatische activiteit te stoppen. Pipetteer de suspensie voorzichtig om een enkelcel-suspensie te verkrijgen.
    6. Breng de cel-suspensie over naar een centrifugebuis van 15 mL. Centrifugeer de suspensie bij 300 × g gedurende 5 min bij 25 °C.
    7. Aspireer het supernatant voorzichtig en resuspendeer het celpellet in vers kweekmedium. Tritureer de suspensie voorzichtig en bevestig de aanwezigheid van een enkelcel-suspensie onder een inverted lichtmicroscoop.
    8. Tel de cellen met een hemocytometer en pas de celconcentratie aan naar de dichtheid die vereist is voor het volgende experiment. Gebruik een routinematige splitverhouding van 1:8.
      OPMERKING: Raadpleeg Aanvullende tabel 1 en Aanvullende tabel 2 voor de groeioppervlakken van de kweekvaten en de overeenkomstige volumes fosfaatgebufferde zoutoplossing en trypsine-ethylendiaminetetraazijnzuuroplossing.
  2. Bepaling van puromycine-geïnduceerde cytotoxiciteit
    OPMERKING: Selecteer het antibioticum op basis van het resistentiegen dat door het lentivirale construct wordt gecodeerd.
    1. Zaai de 16HBE14o-cellen uit− cellen bij 2 × 104 cellen per put in een 96-wells kweekplaat met 100 µL volledig culturedmedium per putje. Incubeer de cellen gedurende de nacht.
    2. Vervang het kweekmedium door vers medium dat puromycine bevat in uiteindelijke concentraties van 0,5, 1, 2 of 4 µg/mLBereid afzonderlijke plaatjes voor voor de tijdspunten van 24, 48 en 72 uur.
    3. Toevoegen 5 µL celtelreagens aan elke put. Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 °C.
      OPMERKING: Voorkom het introduceren van luchtbellen in de wells, aangezien deze de absorbantiemetingen kunnen beïnvloeden.
    4. Meet de absorptie bij 450 nm met 650 nm als referentiegolflengte. Schud de plaat 15 s vlak voordat de absorptie in endpoint-modus wordt geregistreerd.
    5. Bereken de cellevensvatbaarheid14 met gebruik van Vergelijking 1.
      Vergelijking voor cellevensvatbaarheid, OD450-650 voor monsters, controle, blanco; formule voor bioassay-analyse.
      waar:
      Absorbantievergelijking OD450-650, subtractiemethode, gebruikt in spectrofotometrie, formule.
      Optische dichtheidsformule (OD450-650) voor absorptieanalyse in spectroscopie-experimenten.
      Optische dichtheidsvergelijking, OD450-650blank=OD450blank-OD650blank, voor spectroscopische data-analyse.
      OPMERKING: Definieer de controle als onbehandelde cellen en de blanco als celvrij medium dat het assay-reagens bevat. Selecteer de laagste puromycineconcentratie die de niet-getransduceerde cellen binnen 48–72 uur volledig elimineert.
  3. Bepaling van de optimale multipliciteit van infectie
    WAARSCHUWING: Hanteer lentivirale partikels onder Biosafety Level 2-condities in een geregistreerde Biosafety Level 2-faciliteit en in overeenstemming met de institutionele biosafety-regelgeving. Voer alle virusmanipulaties uit in een klasse II biosafety cabinet. Bedek virusbesmette verbruiksartikelen en morsingen met 10% bleekmiddel gedurende minimaal 1 uur voordat deze als biologisch gevaarlijk afval worden afgevoerd.
    OPMERKING: Optimaliseer de multipliciteit van infectie, aangezien dit een directe invloed heeft op de transductie-efficiëntie.
    1. Bereken het benodigde volume lentivirale voorraad15 met behulp van vergelijking 2.
      Formule voor MOI-berekening, verhouding tussen viruspartikels en doelcellen, moleculair biologische vergelijking.
      waar:
      Formule voor functionele virustiter, T_virus = TU/ml, vergelijking voor data-analyse in virologisch onderzoek.
      Vergelijking voor virusvolume, V_virus=virusvolume in mL, formule, virologiestudie, berekeningsmethode
      Statisch evenwicht, vergelijking: N_cellen = aantal doelcellen, diagram voor educatief onderzoek.
      OPMERKING: De functionele titer van de STAT6 luciferase reporter lentivirale stock die in dit protocol is gebruikt, was 5 × 107 transducerende eenheden/mL. Voor 2 × 104 doelcellen, komt een MOI van 20 overeen met 8 µL lentivirale stock per well. Het virusvolume moet opnieuw worden berekend voor viruspreparaten met verschillende titers.
    2. Zaai de 16HBE14o-cellen uit− cellen bij 2 × 104 cellen per well in een witte 96-wells plaat met transparante bodem die bevat 100 µL volledig kweekmedium per put. Incubeer de cellen overnight totdat ze een confluentie van ongeveer 80% bereiken.
    3. Vervang het kweekmedium door vers medium dat ... bevat 5 µg/mL polybrene en STAT6 luciferase reporter lentivirus bij MOI's van 1, 5, 10 en 20. Voeg een niet-getransduceerde mock-controleput toe zonder lentivirus.
      OPMERKING: Bereken het benodigde lentivirale volume voor elke MOI op basis van de functionele titer van de voorraad.
    4. Incubeer de cellen gedurende 48 uur met de lentivirale deeltjes. Vervang het transductiemedium door vers kweekmedium en incubeer de cellen nog eens 24 uur.
    5. Vervang het kweekmedium door vers medium dat interleukine-4 en interleukine-13 bevat, beide in een concentratie van 10 ng/mL. Incubeer de cellen gedurende 24 u.
    6. Toevoegen 25 µL van luciferase-assayreagens in elke put16Bescherm de plaat tegen licht en incubeer deze gedurende 20 min bij kamertemperatuur.
    7. Schud de plaat 20 s lineair. Meet de luminescentie in endpoint-modus met een volledige plaatmeting en een gain-instelling van 120.
      WAARSCHUWING: Registreer de luminescentie binnen 1 uur na toevoeging van het luciferase-assayreagens om het maximale signaal vast te leggen. Volg de veiligheids- en hanteerinstructies van de fabrikant van het reagens.
      OPMERKING: Gebruik voor alle absorbentie- en luminescentiemetingen dezelfde multimode microplaatlezer en acquisitie-instellingen.
  4. Selectie van getransduceerde cellen
    1. Zaai de 16HBE14o-cellen uit− cellen bij 2 × 105 cellen/ml in een 24-wells kweekplaat. Incubeer de cellen gedurende de nacht.
    2. Vervang het kweekmedium door vers medium dat het STAT6-luciferase-reporter-lentivirus bevat bij een MOI van 20 en 5 µg/mL polybrene. Incubeer de cellen gedurende 48 u.
    3. Vervang het transductiemedium door vers kweekmedium. Incubeer de cellen nog eens 24 uur.
    4. Suige het kweekmedium af en voeg vers medium toe dat ... bevat 1 µg/mL puromycine. Incubeer de cellen gedurende 5 dagen en vervang het selectiemedium elke 2 dagen.
    5. Zet de puromycineselectie voort totdat alle cellen in de niet-getransduceerde mock-controleput zijn geëlimineerd.
      OPMERKING: Wacht na transductie ten minste 24 uur voordat u overgaat tot antibioticumselectie, om expressie van het resistentiegen mogelijk te maken.
  5. Isolatie van enkelcelclonen door middel van limiterende verdunning
    1. Detach en tel de met puromycine geselecteerde STAT6-reportercellen. Bereid een enkelcel-suspensie van 5 cellen/mL door middel van seriële verdunning.
      OPMERKING: Voorkom celklontering tijdens het verdunnen. Leid de suspensie indien nodig door een celzeef.
    2. Dispenseer 200 µL van de cel-suspensie in elke put van een 96-well cultuurplaat om een gemiddelde dichtheid van ongeveer één cel per put te verkrijgen.
    3. Inspecteer elke put binnen 24 uur met een geïnverteerde microscoop en identificeer de putten die één enkele cel bevatten. Sluit putten uit die meer dan één cel of meerdere ruimtelijk gescheiden celclusters bevatten.
    4. Houd de geselecteerde putjes gedurende de eerste week in de gaten om clonale groei te bevestigen. Vervang het kweekmedium elke 3 dagen.
    5. Breid elke kloon in de oorspronkelijke 96-wells plaat ongeveer 20 dagen uit of totdat de cellen confluentie bereiken. Transfer elke kloon sequentieel naar een 6-wells plaat en vervolgens naar een T-25 kweekflask.
      OPMERKING: Kweek de cellen gedurende ongeveer 6 dagen in de 6-wellplaat voordat u ze overbrengt naar de T-25 fles, of breng ze over zodra ze de juiste confluentie hebben bereikt.
      PAUZEPUNKT: Ga door met het uitbreiden van de klonen of cryopreserveer ze bij 1 × 106 cellen per vial in 1 mL cryobewaarmedium bestaande uit 90% foetaal runderserum en 10% dimethylsulfoxide.
    6. Zaai elke uitgebreide kloon uit bij 2 × 105 cellen/mL in een witte 96-wells plaat met transparante bodem. Incubeer de cellen gedurende de nacht.
    7. Vervang het kweekmedium door vers medium dat IL-4 en IL-13 bevat in een concentratie van elk 10 ng/mL. Incubeer de cellen gedurende 24 uur.
    8. Meet de luciferase-activiteit zoals beschreven in stappen 1.3.6–1.3.7. Vergelijk de geïnduceerde reporteractiviteit tussen de individuele klonen.
    9. Herhaal de luciferase-assay over toenemende celpassages. Selecteer klonen die een consistente cytokine-geïnduceerde reporteractiviteit behouden over de passages heen.
      OPMERKING: Kloon 3 werd geselecteerd vanwege de lage basale luminescentie en het vermogen om een consistent cytokine-geïnduceerd activatiesignaal te behouden over opeenvolgende passages.

2. Opzet en validatie van de STAT6-activiteitsreporterassay

OPMERKING: Figuur 2 geeft een overzicht van de workflow.

  1. Validatie van de STAT6-activiteitsreporterassay
    1. Zaai de STAT6-reportercellen uit bij 2 × 105 cellen/mL in een witte 96-wells plaat met transparante bodem met behulp van 100 µL volledig kweekmedium per putje. Incubeer de cellen gedurende de nacht.
    2. Vervang het kweekmedium door vers medium met IL-4 en IL-13 in finale concentraties van elk 10 ng/mL. Voeg de selectieve remmers gelijktijdig als volgt toe: 10 nM AS151749 (STAT6-remmer), 2.5 µM AC-4-130 (STAT5-remmer), of 2.5 µM Stattic (STAT3-remmer).
    3. Voeg een vehikelcontrole toe die 0,1% dimethylsulfoxide (DMSO) bevat. Incubeer de cellen gedurende 24 u.
    4. Bepaal de cellevensvatbaarheid met de celttelmethode zoals beschreven in stappen 1.2.3–1.2.5.
    5. Meet de luciferase-activiteit zoals beschreven in stappen 1.3.6–1.3.7.
    6. Normaliseer het luminescentiesignaal van elke well naar de bijbehorende cellevensvatbaarheid. Druk de genormaliseerde waarden uit relatief aan de controle groep die behandeld is met cytokinen.
      LET OP: Verminderde cellevensvatbaarheid kan het luciferase-signaal verlagen, onafhankelijk van de STAT6-activiteit. Interpreteer de reporteractiviteit pas nadat een aanvaardbare cellevensvatbaarheid is bevestigd.
  2. Evaluatie van de robuustheid van de assay
    1. Evalueer de robuustheid van de assay door de Z′-factor te berekenen met gebruik van 21 replica-wells voor zowel de positieve- als de negatievecontroles.
    2. Bereken de Z′-factor met behulp van vergelijking 3.
      Statische evenwichtsvergelijking, Z-factorformule, wiskundige expressie voor kwaliteitscontrole van assays.
      waar:
      Vergelijking voor statisch evenwicht, σₚ staat voor de standaarddeviatie in de controlegroep, illustratie van een educatieve formule.
      Standaarddeviatievergelijking, σn, gebruikt in statistische analyse voor de nauwkeurigheid van de negatieve controle.
      Vergelijking μ<sub>p</sub>=gemiddeld signaal van de positieve controle; concept van statistische data-analyse.
      Statisch evenwicht, vergelijking μn= gemiddeld signaal van de negatieve controle, educatieve analyse.
      OPMERKING: Een Z′-factor tussen 0,5 en 1,0 geeft aan dat de assay geschikt is voor high-throughput screening.

3. Toepassing van de STAT6-reporterassay voor screening van milieutoxica

WAARSCHUWING: Behandel polycyclische aromatische koolwaterstoffen en zware metaalzouten als toxische en potentieel carcinogene materialen. Gebruik geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, voer alle handelingen uit in een gecertificeerde chemische zuurkast en beschik over besmette materialen in overeenstemming met de institutionele procedures voor gevaarlijk afval.

  1. Screening van milieutoxicanten
    1. Zaai de STAT6-reportercellen uit bij 2 × 105 cellen/ml in een witte 96-wellplaat met transparante bodem met behulp van 100 µL volledig kweekmedium per putje. Incubeer de cellen gedurende de nacht.
    2. Vervang het kweekmedium door vers medium dat elke testverbinding bevat in de gewenste eindconcentratie, welke is 10 µM voor dit protocol en behandel de cellen in afwezigheid van IL-4 en IL-13.
    3. Voeg een negatieve controlegroep toe die 0,1% dimethylsulfoxide bevat en een positieve controlegroep die IL-4 en IL-13 bevat, elk in een concentratie van 10 ng/mL. Incubeer de cellen gedurende 24 uur.
    4. Bepaal de cellevensvatbaarheid met behulp van de celtel-assay zoals beschreven in stappen 1.2.3–1.2.5.
    5. Meet de luciferase-activiteit zoals beschreven in stappen 1.3.6–1.3.7.
    6. Normaliseer het luminescentiesignaal van elke well ten opzichte van de overeenkomstige waarde voor celviabiliteit. Druk het genormaliseerde resultaat uit relatief ten opzichte van de negatieve controlegroep.
    7. Sluit verbindingen die de celviabiliteit tot onder de 80% verlagen uit van de interpretatie van de STAT6-reporteractiviteit.
      OPMERKING: Behandel reportersignalen verkregen onder cytotoxische omstandigheden als onbetrouwbaar, aangezien een verminderde celviabiliteit de luminescentie kan beïnvloeden onafhankelijk van de activiteit van het STAT6-pad.

Resultaten

Om de optimale puromycineconcentratie voor stabiele selectie te bepalen, werden ouderlijke 16HBE14o− cellen behandeld met toenemende concentraties puromycine (0,5–4 µg/mL), waarna de celviabiliteit na 24, 48 en 72 u werd beoordeeld met behulp van een celviabiliteitstest. Puromycine verminderde de celviabiliteit op een dosis- en tijdsafhankelijke wijze, waarbij alle concentraties de viabiliteit na 48–72 u tot onder de 20% verlaagden (Figuur 3). Een concentratie van 1 µg/mL was de laagste concentratie die niet-getransduceerde cellen volledig elimineerde, waardoor het residuele viabiliteitssignaal binnen 48 u werd gereduceerd tot ongeveer 4,5% (p < 0,01). Een verhoging van de puromycineconcentratie leidde niet tot een verdere afname van de celviabiliteit. Daarom werd 1 µg/mL puromycine gekozen voor de daaropvolgende selectie van getransduceerde cellen.

Om de efficiëntie van de lentivirale transductie te optimaliseren, werden 16HBE14o− cellen getransduceerd met het STAT6 luciferase reporter-lentivirus bij multipliciteiten van infectie (MOI's) van 1, 5, 10 en 20 gedurende 48 u, gevolgd door stimulatie met IL-4 en IL-13 (beide 10 ng/mL) gedurende 24 u om de STAT6-signalering te activeren. Zoals getoond in Figuur 4, namen de relatieve luminescentie-eenheden (RLU's) toe op een MOI-afhankelijke manier. Een MOI van 20 produceerde de grootste reporter-inductie, wat resulteerde in een ongeveer 50-voudige toename van de luminescentie vergeleken met de ongestimuleerde controle (p < 0,001). Op basis van deze resultaten werd een MOI van 20 gekozen voor daaropvolgende experimenten.

Na transductie en puromycine-selectie onder de geoptimaliseerde omstandigheden vertoonden niet-getransduceerde cellen uitgebreide celdood, terwijl getransduceerde cellen een normale morfologie en levensvatbaarheid behielden (Figuur 5). De overlevende cellen werden vervolgens onderworpen aan limiterende verdunning om monoclonale STAT6-reportercellijnen te vestigen.

Drie monoklonale reporter-cellijnen, afgeleid van individuele cellen, werden geëvalueerd op STAT6-reporteractiviteit. Alle klonen vertoonden een lage basale luminescentie (<1.0 RLU). Stimulatie met IL-4 en IL-13 induceerde een robuuste reporteractiviteit in kloon 2 en 3, waarbij de luminescentie de 20.0 RLU overschreed en overeenkwam met een inductie van meer dan 20-voudig (Figuur 6A). Kloon 3 vertoonde de laagste basale luminescentie en werd daarom geselecteerd voor verdere karakterisering. De reporteractiviteit in kloon 3 werd geëvalueerd over opeenvolgende passages (P9–P21) om de stabiliteit op lange termijn te beoordelen. Zoals shown in Figuur 6B, bleef de STAT6-afhankelijke reporterinductie stabiel gedurende het geëvalueerde passagebereik. Een kloon werd als geschikt beschouwd voor daaropvolgende experimenten wanneer deze een normale groeisnelheid vertoonde, een basale luminescentie onder ongeveer 1.0 RLU had en een meer dan 20-voudige inductie vertoonde na cytokinestimulatie.

Omdat IL-4 en IL-13 aanvullende leden van de STAT-familie kunnen activeren, waaronder STAT3 en STAT5, werd de specificiteit van de reporterassay verder geëvalueerd17,18. STAT6-reportercellen werden 24 uur gestimuleerd met IL-4 en IL-13 in aanwezigheid of afwezigheid van selectieve remmers gericht op STAT6, STAT5 of STAT319,20,21. De celviabiliteit bleef onder alle behandelingscondities boven de 90% (STAT6-remmer AS151749, 10 nM: 98,4%; STAT5-remmer AC-4-130, 2,5 µM: 97,4%; STAT3-remmer Stattic, 2,5 µM: 96,2%; Figuur 7A). Remming van STAT6 verminderde de luciferase-activiteit aanzienlijk (p < 0,01), terwijl remming van STAT5 of STAT3 geen significant effect had op de reporteractiviteit (p = 0,2593 en p = 0,857, respectievelijk; Figuur 7B). Deze resultaten bevestigden dat de reporteractivatie hoofdzakelijk STAT6-afhankelijk was.

De robuustheid van de assay werd geëvalueerd door de Z′-factor te berekenen, waarbij IL-4- en IL-13-gestimuleerde cellen werden gebruikt als controle met een hoog signaal en met STAT6-remmer behandelde cellen als controle met een laag signaal. De assay leverde een Z′-factor op van 0,703 ± 0,097, wat duidt op uitstekende assay-prestaties, een breed signaalvenster en geschiktheid voor high-throughput screening.

Ten slotte werd de STAT6-reporterassay toegepast om geselecteerde milieucomponenten van fijnstof te screenen op hun vermogen om de STAT6-signalering te moduleren. Na 24 u behandeling verhoogde benzo[b]fluorantheen (10 µM) de STAT6-reporteractiviteit significant met ongeveer 1,75-voudig (p = 0,06), terwijl fijnstof (10 µg/mL) de reporteractiviteit met ongeveer 1,5-voudig verhoogde (p = 0,0398; Figuur 8). In tegenstelling hiermee veranderden de overige polycyclische aromatische koolwaterstoffen en zware metaalverbindingen, waaronder CdCl2, HgCl2 en NiSO4 (elk 10 µM), de reporteractiviteit niet significant. Gezamenlijk tonen deze resultaten aan dat de STAT6-reporterassay stabiel, specifiek, robuust en geschikt is voor high-throughput screening van milieuverbindingen die de STAT6-signalering moduleren.

Diagram van celtransductie; STAT6 luciferase-reporter; antibioticaselectie; MOI-optimalisatie.
Figuur 1Workflow voor de generatie van 16HBE14o− STAT6-reportercellen. Schematisch overzicht van het protocol voor het genereren van 16HBE14o− cellen die stabiel een STAT6-luciferasereporter tot expressie brengen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Procesdiagram van de STAT6-reportercelassay; IL4/13-stimulatie, CCK8, toevoeging van luciferase, resultaten.
Figuur 2Workflow voor de totstandebringing en toepassing van de STAT6-reporterassay. Schematisch overzicht van de STAT6-reporterassay voor assayvalidatie en screening van milieugifstoffen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagram van de cellevensvatbaarheid dat de effecten van puromycine bij 0,5-4 µg/mL over 24-72 uur weergeeft; statistische analyse.
Figuur 3Bepaling van de optimale puromycineconcentratie voor de selectie van stabiele cellen. Parentale 16HBE14o− cellen werden behandeld met puromycine (0,5, 1, 2, of 4 µg/mL) gedurende 24, 48 of 72 u. Voertuigcontrole-cellen ontvingen 0,1% dimethylsulfoxide (DMSO). De celviabiliteit werd bepaald met een celviabiliteitsassay. De celviabiliteit werd berekend uit het verschil in absorptie tussen 450 en 650 nm na aftrek van de blanco en normalisatie ten opzichte van de voertuigcontrole. Gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische replica's met technische duplicaten (n = 3). De statistische significantie werd bepaald met eenweg-ANOVA, gevolgd door de multiple-comparisons-test van Dunnett. p-waarden voor vergelijkingen met de voertuigcontrole zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagrammen van luminescentie versus MOI; data-analyse van RLU-vouwverandering en statistische p-waarden.
Figuur 4Optimalisatie van de efficiëntie van lentivirale transductie. 16HBE14o− cellen werden getransduceerd met een STAT6-luciferase-reporter-lentivirus bij multipliciteiten van infectie (MOI's) van 1, 5, 10 of 20 gedurende 48 u. Na een herstelperiode van 24 u werden de cellen gedurende 24 u gestimuleerd met IL-4 en IL-13 (beide 10 ng/mL).A) Relatieve luminescentie-eenheden (RLU's) in mock-getransduceerde cellen en reporter-getransduceerde cellen bij de aangegeven MOI's. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een-weg ANOVA, gevolgd door de multiple-vergelijkingstest van Dunnett. (B) Fold-inductie na cytokinestimulatie ten opzichte van de ongestimuleerde MOI 20-controle. De statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van een ongepaarde Student's t-toets. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische replica's (n = 3). p-waarden zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Celmorfologie bij blootstelling aan puromycine; microscopiebeeld dat variaties toont op een schaal van 50 μm.
Figuur 5Representatieve beelden van cellen na puromycineselectie. 16HBE14o− cellen werden getransduceerd met of zonder het STAT6-luciferase-reporter-lentivirus (MOI = 20) en vervolgens behandeld met 1 µg/mL puromycine gedurende 5 dagen. De beelden zijn vastgelegd met een fasecontrast-omgekeerde microscoop bij een 10× vergroting onder identieke beeldvormingscondities. Onbehandelde oudercellen vormden een normale epitheliale monolaag (links). Puromycine-behandelde niet-getransduceerde cellen vertoonden uitgebreide celdood en detachering (midden), terwijl puromycine-geselecteerde getransduceerde cellen levensvatbaar bleven en hun normale morfologie behielden (rechts). Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten van de luminescentie-assay; staafdiagram dat de controle-conditites vergelijkt met IL-condities in celklonen en passages.
Figuur 6Identificatie van STAT6-reporterklonen en evaluatie van de stabiliteit van de reporter. Na limiterende verdunning werden drie monoklonale STAT6-reportercellijnen uitgebreid en gedurende 24 uur gestimuleerd met IL-4 en IL-13 (beide 10 ng/mL).A) Luciferase-activiteit van individuele reporterklonen na cytokinestimulatie vergeleken met ongestimuleerde controles. (B) Stabiliteit van de STAT6-reporteractiviteit in kloon 3 gedurende opeenvolgende passages (P9–P21). Gegevens zijn weergegeven als het gemiddelde ± SD van technische duplicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagrammen die de % cellevensvatbaarheid en genormaliseerde luminescentie vergelijken in celassays behandeld met geneesmiddelen.
Figuur 7Selectieve inhibitie van STAT6-reporteractiviteit zonder de cellevensvatbaarheid te beïnvloeden. STAT6-reportercellen werden 24 uur gestimuleerd met IL-4 en IL-13 (elk 10 ng/mL) in aanwezigheid van de STAT6-remmer AS151749 (100 nM), de STAT5-remmer AC-4-130 (2.5 µM), of de STAT3-remmer Stattic (2.5 µM). De cytokine-gestimuleerde vehicle-controlegroep ontving 0,1% DMSO. (A) De cellevensvatbaarheid werd bepaald met behulp van een cellevensvatbaarheidstest. (B) STAT6-afhankelijke luciferase-activiteit, genormaliseerd naar de cytokine-gestimuleerde controle. Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische replica's (n = 3). p-waarden zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Staafdiagram van genormaliseerde luminescentie-assayresultaten waarin chemische behandelingen worden vergeleken met controlemonsters.
Figuur 8Evaluatie van de STAT6-modulerende effecten van milieu-toxische stoffen. STAT6-reportercellen werden gedurende 24 uur behandeld met fijnstof (100 µg/mL) of de aangegeven milieutoxicanten, waaronder polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) en zware metalen (10 µM elk). STAT6-afhankelijke luciferase-activiteit werd genormaliseerd naar de vehikelcontrole (0,1% DMSO). Gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische replica's (n = 3). Statistische significantie werd bepaald door vergelijking met de vehikelcontrole, en p-waarden zijn aangegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Specificaties van de kweekvaten en passageparameters voor 16HBE14o− celkweek.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: Vergelijking van methoden voor het meten van STAT6-activiteit.Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

IL-4/IL-13–JAK–STAT6-signalering is niet alleen een belangrijk therapeutisch doelwit, maar ook een drijvende kracht achter de pathogenese van allergische aandoeningen, waaronder astma en allergische rinitis22. Dit protocol beschrijft een eenvoudige, stabiele reporterassay op basis van cellijnen voor het identificeren van modulatoren van de STAT6-activiteit. De assay kan worden toegepast om de STAT6-modulerende effecten van een breed scala aan omgevingsverbindingen te evalueren en is eenvoudig aan te passen voor high-throughput screening, zoals aangetoond in de proof-of-concept screeningstudie (Figuur 8). Door een luciferase-reporter te combineren met een parallelle celviabiliteitsassay, maakt deze methode een kwantitatieve beoordeling van de modulatie van het STAT6-pad mogelijk, terwijl verstorende effecten door verbinding-geïnduceerde cytotoxiciteit tot een minimum worden beperkt.

Een onderscheidend kenmerk van deze methode is het gebruik van stabiel getransduceerde humane bronchiale epitheelcellen 16HBE14o−, een fysiologisch relevant celtype waarin door vervuiling geïnduceerde IL-4/IL-13-signalering bijdraagt aan allergische ontsteking van de luchtwegen. Bestaande benaderingen voor het meten van STAT6-activiteit hebben belangrijke praktische beperkingen. Detectie van STAT6-fosforylering of stroomafwaartse doelwitproteïnen via Western blotting of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is arbeidsintensief en heeft een relatief lage doorvoersnelheid. Luciferase-reporterassays via transiënte transfectie meten de transcriptionele activiteit van STAT6 direct, maar worden beïnvloed door variabele transfectie-efficiëntie, variabiliteit tussen batches en de noodzaak om transfectie voor elk experiment te herhalen, wat de reproduceerbaarheid en doorvoersnelheid vermindert.

De stabiele reporter-cellijn die in de studie wordt beschreven, overwint veel van deze beperkingen. Omdat het reporterconstruct genomisch is geïntegreerd en klonaal is geselecteerd, blijft de reporterexpressie uniform over de celpopulatie en reproduceerbaar over passages, waardoor de variabiliteit die gepaard gaat met transiënte transfectie wordt geëlimineerd. Het luminescentiesignaal wordt gemeten in levende cellen en kan worden genormaliseerd aan een parallelle meting van de celviabiliteit om cytotoxische artefacten uit te sluiten. Bovendien is de assay eenvoudig compatibel met een 96-well formaat voor medium- tot high-throughput toepassingen. De assay leverde een Z′-factor van 0,703 op, wat wijst op een uitstekende scheiding tussen controles met een hoog en een laag signaal en de geschiktheid voor high-throughput screening bevestigt. Een vergelijking van veelgebruikte methoden voor het meten van STAT6-activiteit is opgenomen in Aanvullende Tabel 2. Desalniettemin blijft orthogonale validatie met behulp van downstream STAT6-targets, zoals MUC5AC en CCL26, belangrijk, aangezien de assay de activatie van een STAT6-responsieve promoter rapporteert in plaats van de endogene expressie van targetgenen.

Verschillende stappen zijn cruciaal voor de succesvolle totstandkoming en toepassing van de STAT6-reporterassay. Optimalisatie van de lentivirale multiplicity of infection (MOI) is essentieel, omdat onvoldoende virale input de transductie-efficiëntie vermindert, terwijl overmatige virale blootstelling cellulaire stress kan induceren en de celviabiliteit kan compromitteren. Evenzo is optimalisatie van de puromycineselectieconcentratie vereist om niet-getransduceerde cellen te elimineren terwijl de viabiliteit van resistente reportercellen behouden blijft. Omdat de gevoeligheid voor lentivirale transductie en antibioticaselectie varieert tussen celtypen, moeten beide parameters empirisch worden geoptimaliseerd voordat stabiele reportercellijnen worden vastgesteld. De 16HBE14o− cellijn is een geïmmortaliseerde humane bronchiale epitheelcellijn die veelvuldig wordt gebruikt om luchtwegontstekingen te onderzoeken, omdat deze functionele tight junctions vormt en mucus produceert8,23. Cellen die zijn geselecteerd voor de generatie van reporters moeten functionele IL-4- en IL-13-receptoren tot expressie brengen en een intacte downstream JAK–STAT-signalering behouden24. Voordat stabiele reporterlijnen worden vastgesteld, moet het reporterconstruct worden gevalideerd door de respons op cytokinestimulatie, onderdrukking door route-specifieke remmers en de afwezigheid van cytotoxische effecten onder de geselecteerde assaycondities te bevestigen. Deze validatiestappen helpen ervoor te zorgen dat veranderingen in de reporteractiviteit nauwkeurig de STAT6-afhankelijke signalering weerspiegelen in plaats van aspecifieke cellulaire stress.

Verschillende beperkingen van deze methode moeten ook in overweging worden genomen. Lentivirale vectoren integreren willekeurig in het genoom van de gastheer, wat kan leiden tot variatie tussen klonen in de basale reporteractiviteit, induceerbaarheid en stabiliteit van de expressie op lange termijn. Daarnaast meet de assay de activering van een STAT6-responsieve promotor en wordt daarmee niet direct de activatie van upstream receptoren of downstream endogene signaleringsgebeurtenissen beoordeeld. Langdurige kweek van stabiele reportercellen kan bovendien leiden tot epigenetische silencing of een verminderde expressie van het transgen. Om deze effecten te minimaliseren, moeten master-celbanken met een laag passagegetal worden aangemaakt en moet de responsiviteit van de reporter periodiek worden geverifieerd binnen een gedefinieerd bereik van passages. Bovendien is de assay nog niet gevalideerd in primaire menselijke luchtwegepitheelcellen of in een volledig geautomatiseerd high-throughput screeningplatform. Tot slot vertegenwoordigen de in deze studie geëvalueerde milieu-toxicanten een proof-of-concept panel in plaats van een uitgebreide chemische bibliotheek.

Luchtvervuiling, in het bijzonder fijnstof (PM2.5), bestaat uit een complex mengsel van chemisch en fysisch diverse bestanddelen, waaronder roet, anorganische zouten, polycyclische aromatische koolwaterstoffen en zware metalen12,13. Variaties in emissiebronnen en atmosferische processen leiden tot aanzienlijke verschillen in de samenstelling van het fijnstof, wat kan bijdragen aan uiteenlopende nadelige gezondheidseffecten. Bijgevolg blijft het identificeren van de specifieke componenten die verantwoordelijk zijn voor allergische reacties een uitdaging in epidemiologische en in vivo studies. De in deze studie beschreven STAT6-reporterassay biedt een praktisch in vitro platform voor het screenen van de STAT6-modulerende activiteit van individuele luchtgedragen toxicanten, extracten van fijnstof uit specifieke bronnen of chemisch gedefinieerde fijnstoffracties. Dit protocol kan helpen bij het prioriteren van kandidaat-toxicanten voor mechanistische studies en kan de risicogerichte evaluatie van complexe mengsels van luchtvervuiling ondersteunen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen belangenverstrengeling is.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Research Council of Thailand (NRCT) (beursnr. N42A680388), en dit onderzoeksproject wordt ondersteund door de Mahidol University (Strategic Research Fund: 2025) (beursnr. 35). Figuur 1 en 2 zijn gemaakt met BioRender.com (Pothipan, P. (2026). https://BioRender.com/h44gy3h).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0,25% Trypsine-EDTAGibco25200072Cel-dissociatiereagens
15 mL conische centrifugebuisCorningCLS430791Steriele centrifugebuis van polypropyleen
16HBE14o- humane bronchiale epitheelcellijnSchenkung van Dr. Nawiya Huipao (Prince of Songkla University, Thailand) en Prof. Dr. Dieter C. Gruenert (University of California San Francisco, USA)RRID:CVCL_0112Menselijke bronchiale epitheellijn (passage 35–40); bevestigd mycoplasma-vrij en behoudt de gedifferentieerde morfologie en barrière-eigenschappen van het luchtwegepitheel. Referentie: Cozens AL, et al. Am J Respir Cell Mol Biol. 1994;10(1):38–47.
transparante 24-well plaat met vlakke bodem en weefselkweekbehandelingCorning3527Celkweekplaat
transparante 6-wells plaat met vlakke bodem voor weefselkweekCorning3516Kweekplaat voor cellen
transparante microplaat met 96 putjes, vlakke bodem, van polystyreen, behandeld voor weefselkweekCorning3599Plaat voor celviabiliteitsassay
witte polystyreen microplate met 96 putjes en transparante bodem, behandeld voor weefselkweekCorning3610Luminescentie-assayplaat
AC-4-130 (STAT5-remmer)MedChemExpressHY-124500Selectieve STAT5-remmer
AS1517499 (STAT6-remmer)MedChemExpressHY-100614Selectieve STAT6-remmer
Benzo[b]fluorantheenAccuStandardH-128NPolycyclische aromatische koolwaterstof
Biologische veiligheidskabinet, klasse IINuaireNU-543-400EVoor aseptische celkweekprocedures
Cadmiumchloride (CdCl2)Sigma202908Zwaremetaalverbinding
Cell counting kit-8 (CCK-8)MedChemExpressHY-K0301Celviabiliteitsassay
Celkweekfles, 25 cm² (T-25)Corning430639Weefkulturfles
Koolmonoxide2 incubatorNuaireNU-5710EBehouden op 37 °C, 5% CO22, bevochtigte atmosfeer
Dimethylsulfoxide (DMSO)SigmaD2650Oplosmiddel (0,1% eindconcentratie) en cryoprotectant (10%)
Foetaal runderserum (FBS)SigmaF7524Mediumsupplement (10%) en cryopreservatiemedium (10%)
HemocytometerBOECOBOE14Handmatige celtelling
InverteerfasecontrastlichtmicroscoopZEISSPrimovertObservatie van celmorfologie
Luciferase-assay-systeem (éénstaps)BPS Bioscience60690Luciferase-reporterassay
Kwikchloride (HgCl2)Sigma215465Zware metaalverbinding
MicroplaatlezerBioTekSynergy Neo2Multimode microplatelezer/luminometer aangestuurd door Gen5-software (v3.08.01). Absorbantie gemeten bij 450 nm met 650 nm referentie na 15–20 s lineair schudden. Luminescentie gemeten in endpoint-modus met een detectorversterking van 120 na 20 s lineair schudden.
Minimum Essential Medium Eagle (MEM)Gibco11095-080Basaal kweekmedium
Nikkelsulfaat (NiSO4)Tokyo Chemical IndustryN1203Zwaar metaalverbinding
Fijnstof (PM)National Institute of Standards and TechnologySRM 2975Standaardreferentiemateriaal voor fijnstof
Penicilline-streptomycine (100×)Gibco15140122Antibioticasupplement (1% eindconcentratie)
Fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS)Gibco18912014Wasbuffer
PolybreneSigmaTR-1003-GLentivirale transductie-enhancer
PuromycineMedChemExpressHY-B1743AAntibioticum voor selectie van stabiele cellijnen
Recombinant menselijke IL-13Thermo Fisher ScientificA42526Cytokine voor stimulatie
Recombinant menselijk IL-4Thermo Fisher ScientificA42602Cytokine voor stimulatie
STAT6 luciferase reporter lentivirusBPS Bioscience78799Lentiviraal reporterconstruct; voorraaditer 5 × 107 TU/mL
Stattic (STAT3-remmer)MedChemExpressHY-13818Selectieve STAT3-remmer

Referenties

  1. Organisation for Economic Co-operation and Development. The Economic Consequences of Outdoor Air Pollution. OECD Publishing; Paris; 2016.
  2. Thailand Pollution Control Department. Air Quality Assessments for Health and Environment Policies in Thailand. Thailand Pollution Control Department; Bangkok; 2018.
  3. Health Effects Institute. State of Global Air Report 2024. Available at: https://www.stateofglobalair.org/resources/report/state-global-air-report-2024
  4. State of Global Air. Trends in Air Quality and Health Impacts: Insights from Central, South, and Southeast Asia. 2025. Available at: https://www.stateofglobalair.org/
  5. Shi X. Acute effects of air pollution on human health in China: Evidence and prospects. China CDC Wkly. 2021;3(45):941-942.
  6. Tsai YG, et al. Long-term PM2.5 exposure impairs lung growth and increases airway inflammation in Taiwanese school children. ERJ Open Res. 2025;11(4).
  7. Walford HH, Doherty TA. STAT6 and lung inflammation. JAKSTAT. 2013;2(4):e25301.
  8. Moonwiriyakit A, et al. GPR120/FFAR4 stimulation attenuates airway remodeling and suppresses IL-4- and IL-13-induced airway epithelial injury via inhibition of STAT6 and Akt. Biomed Pharmacother. 2023;168:115774.
  9. Pelaia C, et al. Biological therapy of severe asthma with dupilumab, a dual receptor antagonist of interleukins 4 and 13. Vaccines (Basel). 2022;10(6).
  10. Yang Y, et al. Continuous exposure to PM2.5 exacerbates ovalbumin-induced asthma in mouse lung via the JAK-STAT6 signaling pathway. Adv Clin Exp Med. 2020;29(7):825-832.
  11. Li X, Huang L, Wang N, Yi H, Wang H. Sulfur dioxide exposure enhances Th2 inflammatory responses via activation of the STAT6 pathway in asthmatic mice. Toxicol Lett. 2018;285:43-50.
  12. Reiss R, et al. Evidence of health impacts of sulfate- and nitrate-containing particles in ambient air. Inhal Toxicol. 2007;19(5):419-449.
  13. Li R, et al. Key toxic components and sources affecting oxidative potential of atmospheric particulate matter using interpretable machine learning: Insights from fog episodes. J Hazard Mater. 2024;465:133175.
  14. Posimo JM, et al. Viability assays for cells in culture. J Vis Exp. 2014;(83):e50645.
  15. Baumlin-Schmid N, Salathe M, Fregien NL. Optimal lentivirus production and cell culture conditions necessary to successfully transduce primary human bronchial epithelial cells. J Vis Exp. 2016;(113).
  16. Nozeret K, Pernin A, Buddelmeijer N. Click-chemistry based fluorometric assay for apolipoprotein N-acyltransferase from enzyme characterization to high-throughput screening. J Vis Exp. 2020;(159).
  17. Rolling C, Treton D, Pellegrini S, Galanaud P, Richard Y. IL-4 and IL-13 receptors share the γc chain and activate STAT6, STAT3, and STAT5 proteins in normal human B cells. FEBS Lett. 1996;393(1):53-56.
  18. Deimel LP, Li Z, Roy S, Ranasinghe C. STAT3 determines IL-4 signalling outcomes in naïve T cells. Sci Rep. 2021;11(1):10495.
  19. Wingelhofer B, et al. Pharmacologic inhibition of STAT5 in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2018;32(5):1135-1146.
  20. McMurray JS. A new small-molecule STAT3 inhibitor. Chem Biol. 2006;13(11):1123-1124.
  21. Chiba Y, Todoroki M, Nishida Y, Tanabe M, Misawa M. A novel STAT6 inhibitor, AS1517499, ameliorates antigen-induced bronchial hypercontractility in mice. Am J Respir Cell Mol Biol. 2009;41(5):516-524.
  22. Zhang X, et al. The immunogenetic landscape of allergic rhinitis: From cellular effectors to gene regulation and targeted therapies. Int J Biol Sci. 2026;22(3):1322-1345.
  23. Yu H, Li Q, Kolosov VP, Perelman JM, Zhou X. Interleukin-13 induces mucin 5AC production involving STAT6/SPDEF in human airway epithelial cells. Cell Commun Adhes. 2010;17(4-6):83-92.
  24. White SR, Martin LD, Stern R, Laxman B, Marroquin BA. Expression of IL-4/IL-13 receptors in differentiating human airway epithelial cells. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2010;299(5):L681-L693.

Herprints en machtigingen

Tags

LuchtwegepitheelcellenSTAT6-signaleringluciferase-reporterIL-4-stimulatieIL-13-stimulatieZ-factoranalyselentivirale transductie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.