Bereiding van membraaneiwit-gefunctionaliseerde polymeer en polymeer/lipide hybride grote en gigantische unilamellaire blaasjes

Samenvatting

Dit protocol demonstreert detergent-gemedieerde reconstitutie van een membraaneiwit, cytochroom bo3 ubiquinol oxidase, tot grote unilamellaire blaasjes gemaakt van PDMS-g-PEO en hun omzetting in gigantische blaasjes via fusie-elektroformatie. De resulterende functionele polymeercompartimenten zijn geschikt voor geavanceerde biochemische en biofysische studies.

Samenvatting

Blaasjes gevormd uit amfifiele copolymeren, alleen of gemengd met fosfolipiden, bieden superieure mechanische en chemische stabiliteit vergeleken met conventionele lipideblaasjes. Dit maakt ze een aantrekkelijk chassis, dat verder ontwikkeld en uitgebreid kan worden om specifieke toepassingen mogelijk te maken, zoals medicijnafgifte, diagnostische biosensing, de bouw van kunstmatige cellen en bio-geïnspireerde micro- en nanoreactoren. In het bijzonder is functionalisatie door membraaneiwitincorporatie essentieel voor veel van deze toepassingen. Hier presenteren we een protocol voor het bereiden van membraaneiwit-gefunctionaliseerde grote unilamellaire vesikels (LUV's) uit het graftcopolymeer PDMS-g-PEO via detergent-gemedieerde reconstitutie. Verder beschrijven we hoe deze grote blaasjes kunnen worden omgezet in gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) met behulp van een fusie-elektroformatiebenadering. Het protocol omvat fluorescentielabeling van membraaneiwitten, voorbereiding van polymeer- en hybride LUV's, membraaneiwitreconstitutie, analyse van grootteverdeling via dynamische lichtverstrooiing (DLS), beoordeling van eiwitactiviteit via zuurstofverbruiksmetingen, bereiding van eiwit-functionaliseerde GUV's, en analyse van eiwitinsertie en protonpompactiviteit in GUV's via confocale microscopie. Representatieve resultaten tonen de vorming aan van monodisperse proteo-LUV's met een polydispersie-index (PDI) onder 0,2, en succesvolle generatie van proteo-GUV's variërend van 5–35 μm in diameter. De eiwitactiviteit wordt bevestigd door zuurstofopnamemetingen in zowel polymeer-LUV's (18,2 nmol/min/mL) als hybride LUV's (26,9 nmol/min/mL). Eiwitinsertie in GUV's wordt gekwantificeerd via fluorescentie-intensiteit, wat resulteert in 20,6 ± 3,7 a.u. voor polymeer-GUV's en 26,2 ± 5,0 a.u. voor hybride GUV's. De activiteit van de protonpomp in GUV's, gemonitord via een ingekapselde pH-gevoelige kleurstof, is consistent met de functionaliteit van eiwitten, waarbij inwendige protonpompen de overhand heeft. De mechanische zachtheid en lipideachtige dubbellaagdikte van het copolymeer (~5,3 nm) ondersteunen efficiënte eiwitinsertie en behoud van functionaliteit.

Inleiding

Amfifiele blokcopolymeren kunnen zichzelf assembleren in waterige oplossing tot membranen, die spontaan krommen en sluiten om bolvormige, membraanomheinde compartimenten te vormen die bekend staan als polymersomen (polymeerblaasjes). In vergelijking met lipidemembranen bieden polymeergebaseerde compartimenten een grotere chemische veelzijdigheid en verbeterde chemische¹ en mechanische stabiliteit², waardoor ze zeer aantrekkelijk zijn voor toepassingen zoals medicijnafgifte, nano- en microreactoren, en de bouw van duurzame kunstcellen. Zowel onze groep als anderen hebben polymeermembranen gefunctionaliseerd door membraaneiwitten in te brengen om kunstmatige organellen en cellen^{te creëren} 1,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Polymeren met een poly(dimethylsiloxaan) (PDMS) hydrofobe kern zijn bijzonder geschikt voor de incorporatie van membraaneiwitten vanwege de hoge ketenflexibiliteit en de mogelijkheid om de hydrofobe dikte van het membraan beter aan te passen bij het transmembraandomein⁵ van het eiwit. Hoewel ons laboratorium zich voornamelijk heeft gericht op het graft copolymeer poly(dimethylsiloxaan)-graft-poly(ethyleenoxide) (PDMS-g-PEO), dat zeer dynamische membranen ^{vormt 4,16,17} die zachter zijn dan conventionele lipide-dubbellagen en een dikte van ongeveer 5,3 nm¹ vertonen, hebben andere groepen met succes PDMS-gebaseerde triblokcopolymeren zoals PMOXA-b-PDMS-b-PMOXA⁵ toegepast^,6,7,8,9,10,11 en PEtOz-b-PDMS-b-PEtOz¹² voor membraaneiwitreconstitutie. Zelfs relatief rigide diblokcopolymeren zoals PBD-b-PEO, vooral in hybride systemen gemengd met lipiden, zijn gebruikt voor succesvolle eiwitopname¹³. Deze voorbeelden benadrukken de veelzijdigheid van polymeergebaseerde membranen als reconstitutieplatforms, die bovendien een verbeterde chemische stabiliteit¹ en een verlengde functionele levensduur¹⁴ kunnen bieden voor geïntegreerde membraaneiwitten. Hoewel polymeer/lipidehybride membranen niet altijd de chemische stabiliteit van zuivere polymeersystemen¹ evenaren, bieden ze een aantrekkelijk compromis door de mechanische robuustheid van polymeren te combineren met de biologische relevantie van lipiden. Dit resulteert in een membraanomgeving die beter lijkt op inheemse biologische membranen, terwijl de belangrijkste voordelen van synthetische materialen behouden blijven. Dergelijke hybride architecturen kunnen extra voordelen bieden, waaronder een verminderde protonpermeabiliteit die ontstaat door nanoschaalherschikking¹ en domeinvorming binnen het membraan¹⁵.

Er bestaan verschillende technieken om membraaneiwitten te reconstitueren tot nanogrote blaasjes (LUV's), waaronder organisch-oplosmiddelgemedieerde reconstitutie (bijv. reverse-fase verdamping, rehydratatie van lipide-eiwitfilms), mechanische benaderingen (bijv. sonicatie, French press, vries-dooi) en detergent-gemedieerde reconstitutie (via detergentverwijdering, verdunning of directe inbouw)¹⁸, en recentere strategieën zoals directe overdracht van styreen-maleïnezuur copolymeer-nanodiscs¹⁹. Porines zijn met succes opgenomen in polymeer-LUV's via directe insertie, bijvoorbeeld door het eiwit aan de polymeerfilm toe te voegen tijdens rehydratatie⁸. Deze aanpak resulteert over het algemeen in een lage insertie-efficiëntie voor grotere of complexere membraaneiwitten en leidt vaak tot willekeurige eiwitoriëntatie. Daarom blijft detergent-gemedieerde reconstitutie, waarbij gecontroleerd wasmiddel wordt toegevoegd gevolgd door het verwijderen, de meest gebruikte methode. Het is ook de voorkeursstrategie om grotere membraaneiwitten in polymeer-gebaseerde LUV's te integreren, vooral voor asymmetrische eiwitten waarbij gecontroleerde oriëntatie cruciaal is voor de functie. Bij deze benadering worden membranen van blaasjes eerst verzadigd met het gewenste detergent (de verzadigde detergentconcentratie wordt aangeduid als R_sat), gedeeltelijk opgelost (co-existentie van blaasjes en micellen), of volledig opgelost, d.w.z. afgebroken tot micellen (detergentconcentratie wordt aangeduid als R_sol). Deze eerste membraanbehandeling wordt gevolgd door eiwittoevoeging, incubatie en detergentverwijdering¹⁸. Dit laatste kan worden bereikt via dialyse, grootte-uitsluitingschromatografie of adsorptie op hydrofobe polystyreenkralen (bijv. Bio-Beads). De keuze van detergent, concentratie en verwijderingsmethode zijn geoptimaliseerd voor elk membraantype en eiwit om de incorporatie-efficiëntie te maximaliseren en de eiwitoriëntatie^te beheersen.

Hoewel LUV's goed geschikt zijn voor bulkactiviteitenmetingen, vereisen enkelblaasstudies en analyses op basis van optische microscopie dat membraaneiwitten worden gereconstitueerd tot gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's). Vijf hoofdbenaderingen worden gebruikt voor eiwitincorporatie in GUV's: coformatie in aanwezigheid van eiwit en organisch oplosmiddel²¹, coformatie in aanwezigheid van detergent²², invoeging in voorgevormde GUV's via detergentverdunning²³, invoeging via membraanfusie met proteo-LUV's^16,24, en fusie-elektroformatie²⁵. Hoewel deze benaderingen met succes zijn toegepast op lipide GUV's, is hun overdracht naar polymeer- of polymeer/lipidehybride GUV's vaak uitdagend. In het bijzonder leiden co-formatie- en detergent-verdunningsmethoden vaak tot lage insertie-efficiënties in polymeermembranen of zijn ze onverenigbaar met bepaalde polymeersamenstellingen¹⁵. Fusie-gebaseerde strategieën 4,16,24,26,27 die afhankelijk zijn van extra fusogene middelen kunnen ook problematisch zijn, aangezien synthetische kationische lipiden/polymeren of fusogene peptiden de stabiliteit van membraaneiwitten kunnen aantasten, de membraaneigenschappen kunnen veranderen of de incorporatie-efficiëntie van het doeleiwit kunnen verminderen. Fusie-elektroformatie overwint veel van deze beperkingen en is bewezen een robuuste en efficiënte methode te zijn om membraaneiwitten te integreren in polymeer- en polymeer/lipidehybride GUV's ^1,5,15. Deze aanpak maakt gecontroleerde eiwitopname mogelijk, terwijl membraanintegriteit en eiwitfunctionaliteit behouden blijven, waardoor het bijzonder geschikt is voor de generatie van eiwitgefunctionaliseerde polymeer-GUV's.

Het reconstitueren van protonpompen in polymeer-gebaseerde blaasjes is essentieel voor het construeren van duurzame kunstcellen, omdat het de generatie van transmembrane protongradiënten mogelijk maakt—de fundamentele energie-eenheid van levende systemen. Door chemiosmotische energieconversie te recreëren in een gecontroleerde minimale membraanomgeving²⁸, kunnen deze blaasjes ATP-synthese, actief transport en metabole reacties aansturen, waarmee de energetische basis wordt gelegd die nodig is voor autonome, levensechte functionaliteit. Een representatieve protonpomp die in dergelijke systemen wordt gebruikt, is cytochroom _bo3 oxidase uit E. coli, een terminale respiratoire enzym die zuurstofreductie koppelt aan protontranslocatie over het membraan. Omdat elektronenoverdracht en protonpompen nauw gekoppeld zijn, kan hun activiteit in synthetische blaasjes kwantitatief worden gemonitord, hetzij door zuurstofverbruik ^1,20 of door het volgen van protongradiëntvorming¹.

In dit protocol presenteren we een gedetailleerde workflow voor de voorbereiding van PDMS-g-PEO-gebaseerde LUV's, inclusief pure polymeer- en polymeer/lipidehybride membranen, hun functionalisatie met membraaneiwitten, opschaling naar GUV's en activiteitsmetingen van de gereconstitueerde protonpomp cytochroom bo₃ oxidase via zowel bulk-zuurstofverbruiksassays als single-vesikel-protonpompmetingen.

Protocol

OPMERKING: Al het gevaarlijke chemische afval dat tijdens dit protocol wordt geproduceerd, moet worden afgevoerd in overeenstemming met institutionele en lokale regelgeving.

1. Voorbereiding op Bio-Beads SM-2

OPMERKING: Bio-Beads SM-2 worden voorgewassen met methanol om conserveermiddelen en organische verontreinigingen te verwijderen voorafgaand aan detergentadsorptie.

1. Plaats filterpapier in een glazen trechter die boven een schoon glazen bekerglas of fles is geplaatst.
2. Voeg minstens 600 mg Bio-Beads SM-2 toe aan de trechter (voldoende voor 3 herhalingen van reconstitutie voor zowel hybride als polymeer LUV's).
   OPMERKING: Een minimum van 90 mg Bio-Beads SM-2 is vereist per reconstitutie, zoals gespecificeerd in stap 4.4.1. Een grotere hoeveelheid kan worden bereid als er meer reconstructies worden gepland.
3. Was de kralen drie keer met pure methanol, waarbij je voldoende volume gebruikt om de kralen elke keer volledig onder te dompelen.
   VOORZICHTIG: Voer alle stappen voor de behandeling van methanol uit in een chemische afzuigkap.
4. Was de kralen onmiddellijk drie keer met Milli-Q water om restanten van methanol te verwijderen.
   OPMERKING: Laat de kralen niet drogen tijdens het wassen. Zorg er bij het verwijderen van wasmiddelen voor dat de kralen vochtig blijven en niet volledig droog worden.
5. Breng de gewassen kralen over in een geschikte opslagcontainer (bijvoorbeeld een steriele 50 mL polypropyleen centrifugebuis of glazen fles met een goed afgesloten dop), voeg Milli-Q water toe totdat de kralen volledig onder water zijn en bewaar tot 3 maanden bij 4 °C.

2. Fluorescentielabeling van membraaneiwitten

1. Eiwitverdunning
   1. Los cytochroom bo₃ oxidase op tot 2,2 mg/mL in een 20 mM HEPES-buffer met 0,05% n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) (w/v), pH 8,3. Deze pH zorgt voor een voldoende aandeel niet-geprotoneerde (reactieve) primaire aminen voor efficiënte labeling.
      OPMERKING: Voor optimale etikettering met ATTO N-hydroxysuccinimidyl (NHS) kleurstoffen, houd de buffer-pH tussen 8,3 en 8,5. Voor andere kleurstoffen volgt u de instructies van de fabrikant voor eiwitconjugatie, inclusief de aanbevolen etiketteringsvoorwaarden.
2. Kleurstoftoevoeging
   1. Voeg een achtvoudig molair overschot aan amine-reactief ATTO 643 N-hydroxysuccinimidyl (NHS) ester, opgelost bij 2 mg/mL in anhydre DMSO, toe aan de eiwitoplossing.
      OPMERKING: Voor andere kleurstoffen volgt u de instructies van de fabrikant voor eiwitconjugatie, inclusief het aanbevolen overschot van kleurstof tot eiwitmolaire.
   2. Meng voorzichtig door drie keer op de microcentrifugebuis te tikken om een homogene verspreiding van de kleurstof te garanderen.
3. Incubatie
   1. Incubeer het reactiemengsel bij kamertemperatuur (20–25 °C) gedurende 1,5 uur onder zachte beweging (250 tpm) in een thermomixer, in het donker om fotobleeken te voorkomen.
4. Verwijdering van ongebonden kleurstof
   1. Breng de Superdex 200 10/300 GL-kolom (CV: 23,562 mL) in evenwicht met ten minste 2 kolomvolumes (ongeveer 48 mL) membraaneiwit-elusiebuffer (20 mM HEPES, pH 7,5, 200 mM KCl, 0,05% DDM (w/v)) bij een debiet van 0,3 mL/min met behulp van een ÄKTA-zuiveringssysteem.
      OPMERKING: Voor het verwijderen van overtollige fluorescerende kleurstof zijn kortere gelfiltratiekolommen (10–20 cm bedlengte) over het algemeen voldoende, vooral voor minder hydrofiele kleurstoffen. De verffabrikant raadt aan om te ontzouten met een Sephadex G-25 matrix. Een Superdex 200 10/300 GL-kolom werd in deze studie gebruikt vanwege de beschikbaarheid van het instrument.
   2. Laad tot 500 μL van het gelabelde eiwit met een capillaire lus van 1 mL en elueer met dezelfde buffer bij 0,3 mL/min.
   3. Monitor de elutie door de absorptie te meten bij 280 nm voor eiwit en 643 nm voor ATTO 643 kleurstof.
   4. Verzamel 0,5 mL fracties over volumes van 1,5 kolom. Identificeer fracties die zowel eiwit als kleurstof bevatten. Gebruik direct als het voldoende geconcentreerd is, of concentreer met Amicon centrifugale filterunits. Voor concentratie met Amicon-filters gebruik je een centrifugaalfilter met een molecuulgewichtsgrens van 30 kDa en centrifugeer je op 14.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
5. Bepaling van eiwitconcentratie en mate van labeling (DOL)
   1. Meet de absorptiespectra van het gezuiverde geconjugeerde.
   2. Bereken de eiwitconcentratie en het gemiddelde aantal kleurstofmoleculen per enzym met behulp van:
      
      waarbij A_max de absorptie van het geconjugeerde object bij het kleurstofabsorptiemaximum (λ_abs; ATTO 643, λ = 643 nm), A₂₈₀ is de absorptie bij 280 nm (absorptiemaximum van eiwitten), ε_prot is de molaire extinctiecoëfficiënt van gedenatureerd cytochroom bo₃ oxidase (184.720 M⁻¹cm⁻¹), ε_kleurstof is de molaire extinctiecoëfficiënt van de kleurstof (150.000 M⁻¹cm⁻¹), en CF₂₈₀ is de correctiefactor voor ATTO 643 absorptie bij 280 nm (0,04).

3. Bereiding van grote unilamellaire blaasjes (LUV's)

1. Bereiding van een dunne polymeer of polymeer/lipidefilm
   1. Gebruik verplaatsingspipetten met oplosmiddelbestendige tips of gasdichte glazen spuiten om polymeer-, lipide- en fluorescerende kleurstofoplossingen, opgelost in chloroform:methanol (2:1, v/v), over te brengen in een schoon glazen flesje volgens de samenstellingen vermeld in Tabel 1.
      VOORZICHTIG: Voer alle oplossing onder een afzuigkap terwijl je beschermende handschoenen en veiligheidsbril draagt.
   2. Meng de oplossing grondig door zachtjes te vortexen terwijl je het flesje rechtop houdt om homogeniteit te garanderen.
      VOORZICHTIG: Pas de vortexsnelheid zorgvuldig aan om te voorkomen dat de vloeistof spat of uit het flesje op je handen spuit.
   3. Verdamp de organische oplosmiddelen onder een zachte stroom stikstof in de afzuigkap gedurende ongeveer 1 uur, totdat er een uniforme dunne film op de buiswand vormt (Figuur 1).
      OPMERKING: Pas de stikstofstroom zo aan dat de vloeistof zachtjes beweegt zonder te spetteren; Een te hoge stroming kan leiden tot ongelijkmatige filmvorming. Na 5–10 minuten kan de stroom iets worden verhoogd om volledige droogte en gelijkmatige verspreiding van het blaasmengsel over de bodem van het flesje te waarborgen.
2. Filmrehydratatie
   1. Rehydrateer de gedroogde film met 1 mL rehydratiebuffer (1 mM Tris-HCl, pH 7,5, 200 mM sucrose) om een uiteindelijke amfifielconcentratie van 5 mg/mL te verkrijgen (overeenkomend met 1,67 mM voor polymersomen en 2,14 mM voor hybride vesikels). Als polymersomen worden gebruikt voor reconstitutie, vul dan de rehydratatiebuffer aan met 0,1% natriumcholaat.
      VOORZICHTIG: Natriumcholaat is een milde irriterende stof. Vermijd langdurig huidcontact en het inademen van poeder. Hanteer volgens het veiligheidsinformatieblad van de fabrikant (SDS).
   2. Vortex krachtig totdat de film volledig losgekoppeld en opgehangen is, waarbij multilamellaire blaasjes (MLV's) ontstaan.
3. Vries-dooicycli (alleen hybride blaasjes)
   1. Onderwerp hybride MLV-suspensies aan vijf vries-ontdooicycli als volgt: vries de monsters in vloeibare stikstof gedurende 1 minuut, ontdooi ze in een waterbad van 35 °C tot ze volledig gesmolten zijn, en vortex 300–3000 rpm gedurende 30 seconden met een buisshaker. Herhaal deze procedure in totaal vijf cycli.
      OPMERKING: Sla deze stap over voor pure polymersomen.
      VOORZICHTIG: Vloeibare stikstof (−196 °C) kan ernstige cryogene brandwonden veroorzaken. Hanteer het in een goed geventileerde ruimte met geschikte PBM (cryogene handschoenen, veiligheidsbril en een labjas). Vermijd contact met huid en ogen.
4. Extrusie
   1. Breng de vesikelsuspensie over naar een mini-extruder uitgerust met een polycarbonaatmembraan van 100 nm poriegrootte.
   2. Extrudeer de suspensie 21 keer om grootte-homogene LUV's te verkrijgen.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de laatste extrusiestap de LUV-suspensie in de spuit tegenover de initiële laadspuit achterlaat. Dit minimaliseert besmetting van het eindmonster met grotere blaasjes of restmateriaal dat mogelijk niet volledig door het membraan is gegaan.
5. Opslag
   1. Bewaar de LUV-suspensie bij 4 °C en gebruik deze binnen een week om de verdeling van de blaasgrootte te behouden en aggregatie of microbiële groei in de sucrosehoudende buffer te voorkomen.
   2. Homogeniseer de LUV-suspensie voor gebruik voorzichtig door vortexen.

4. Reconstitutie van membraaneiwit in LUV's

1. Voorbehandeling van blaasjes met detergent
   1. Breng 200 μL LUV's over in een 2 mL microcentrifugebuis (Figuur 1). Bij gebruik van hybride LUV's voeg je 1 μL van 20% (w/v) natriumcholaat toe om een uiteindelijke detergentconcentratie van 0,1% (w/v) te verkrijgen. Bij gebruik van polymeer LUV's is geen extra detergent nodig omdat natriumcholaat al aanwezig is.
      OPMERKING: Bereid de detergentvoorraad voor in dezelfde buffer als voor de experimenten om compatibiliteit met de blaasjes te waarborgen.
   2. Meng voorzichtig door de microcentrifugebuis drie keer licht te tikken. Vermijd hevige beweging of vortexvorming, die schuim kan vormen en luchtbellen kan veroorzaken.
2. Introductie van eiwitten in detergent-behandelde blaasjes
   1. Voeg cytochroom bo₃ oxidase (voor activiteitsmetingen) of cytochroom bo₃ oxidase–ATTO 643 (voor fluorescentiebeeldvorming) toe aan de detergent-gedestabiliseerde blaasjes om de volgende uiteindelijke eiwitconcentraties te bereiken: voor polymersomen, 0,556 μM voor LUV-experimenten en 1,112 μM voor GUV-experimenten; voor hybride vesikels, 0,714 μM voor LUV-experimenten en 1,428 μM voor GUV-experimenten.
      OPMERKING: Deze concentraties komen overeen met een eiwit-naar-polymeer molaire verhouding van 1:3.000 voor LUV's en 1:1.500 voor GUV's.
   2. Voeg het eiwit langzaam toe terwijl je voorzichtig mengt, met als doel het gelijkmatig over de oplossing te verdelen en lokale overconcentratie te voorkomen.
      OPMERKING: Het toegevoegde eiwitvolume kan per fractie variëren door verschillen in eiwitvoorraadconcentratie.
3. Assemblage van eiwit-detergent-polymeercomplexen
   1. Incubeer het mengsel bij 4 °C gedurende 30 minuten met milde beweging (400 rpm) in een thermomixer om de vorming van gemengde eiwit-detergent-polymeer-assemblages vóór het verwijderen van het detergent mogelijk te maken.
4. Detergent verwijderen
   1. Verwijder wasmiddel door sequentiële toevoeging van Bio-Beads SM-2 (Bio-Rad). Haal 30 mg Bio-Beads uit de opslagoplossing, zodat ze vochtig blijven (nat, maar zonder overtollig vocht). Voeg de kralen toe aan het monster en incubeer 30 minuten bij 4 °C met zachte beweging bij 600 toeren per minuut in een thermomixer. Herhaal deze stap nog twee keer, voor een totaal van 90 mg Bio-Beads en een totale incubatietijd van 1,5 uur.
      OPMERKING: Gebruik alleen volledig gehydrateerde bio-kralen. Plaats geen droge kralen, kralen die aan de wanden van de Bio-Beads stock tube blijven plakken, of kralen die aan het oppervlak zweven. Als de kralen na toevoeging aan de wand van de reconstitutiebuis boven het vloeistofniveau blijven hechten, centrifugeer dan kort de buis (bijvoorbeeld 3–5 s in een minicentrifuge op een werkbank) om de kralen onderaan te verzamelen vóór de incubatie.
   2. Pellet de Bio-Beads door centrifugatie op 2.000 × g gedurende 2 minuten met een mini-centrifuge op het werk. Verzamel het supernatant zorgvuldig zonder de kraalkorrel te verstoren.
      OPMERKING: Als alternatief voor centrifugatie laat je de kralen ongeveer 5 minuten door de zwaartekracht zakken en verwijder je daarna voorzichtig het supernatant.
5. Opslag
   1. Bewaar gereconstitueerde bo 3-LUVs bij 4 °C en gebruik ze dezelfde dag voor eiwitactiviteitsmetingen.

5. Grootte en dispersiteit van LUV's door dynamische lichtverstrooiing (DLS)

1. LUV's laden voor DLS-metingen
   1. Breng 45 μL onverdund LUV- of proteo-LUV-ophanging over in een schone kwartscuvet. Zorg ervoor dat de cuvette vrij is van stof, vingerafdrukken of andere resten om lichtverstrooiingsartefacten te minimaliseren.
      OPMERKING: Vermijd het introduceren van luchtbellen, omdat deze de DLS-metingen kunnen verstoren. Om belletjes te voorkomen, pipette je het monster langzaam langs de wand van de cuvette en stoot je de laatste druppel niet krachtig uit. Als er kleine belletjes ontstaan, laat ze dan opstijgen en oplossen voordat je meet.
2. Bepaling van LUV-grootte en dispersiteit door DLS
   1. Meet de hydrodynamische diameter en polydispersie-index (PDI) met een DLS-instrument uitgerust met een 633 nm helium-neon laser en terugverstrooiingsdetectie bij een vaste hoek van 173°.
   2. Voer minstens drie onafhankelijke metingen per monster uit om reproduceerbaarheid te waarborgen.
   3. Analyseer de gegevens met behulp van het algemene (normale verdeling) model om de gemiddelde grootte en PDI te verkrijgen.

6. Analyse van zuurstofverbruik van LUV's

1. Temperatuurinstelling
   1. Stel de meetkamer van een Clark-type zuurstofelektrodesysteem in op 22 °C en laat het systeem in evenwicht komen.
2. Toevoeging van buffer
   1. Voeg 1 mM Tris-HCl (pH 7,5), 200 mM sucrosebuffer toe aan de meetkamer tot een totaalvolume van 1.000 μL. Pas het buffervolume aan volgens het monstertype: 942,9 μL voor polymeer Bo 3-LUV's en 953,7 μL voor hybride Bo 3-LUV's.
      OPMERKING: Het resterende volume wordt ingenomen door LUV's en het DTT/Q₁-mengsel om het uiteindelijke meetvolume te bereiken.
3. Toevoeging van VID's
   1. Voeg bo 3-LUV's toe aan de meetkamer en begin voorzichtig te roeren met de magnetische roeraar bij 100 rpm en 22 °C. Pas het volume van bo 3-LUV's aan om een theoretische bo₃ oxidaseconcentratie van ongeveer 27 nM te bereiken: 48,6 μL voor polymeer bo 3-LUV's en 37,8 μL voor hybride bo 3-LUV's.
      OPMERKING: Voor de negatieve controle vervang bo 3-LUV's door een gelijk volume eiwitvrije LUV's met dezelfde lipide/polymeersamenstelling en concentratie. Alle volgende stappen blijven identiek.
4. Basismeting
   1. Laat de zuurstofconcentratie stabiliseren en meet gedurende 3 minuten onder constant roeren bij 22 °C om een stabiele basislijn te verkrijgen.
5. Bereiding van een reducerend/kinonmengsel
   1. Bereid het DTT/Q₁-mengsel direct voor gebruik vers voor gebruik door 9,6 μL van 1 M DTT in Milli-Q water te mengen met 0,6 μL 80 mM ubiquinon-1 (Q₁) in DMSO, en vortex vervolgens grondig te laten vortexen om homogeniteit te waarborgen.
6. Enzymactivatie
   1. Activeer bo3-oxidase door 8,5 μL van het vers bereide DTT/Q₁-mengsel aan de meetkamer toe te voegen, wat resulteert in de uiteindelijke concentraties van 8 mM DTT en 40 μM Q₁.
7. Replicates
   1. Meet elk monster drie keer om reproduceerbaarheid te garanderen.
8. Data-analyse
   1. Plot de zuurstofconcentratie versus de tijd. Bepaal de helling van het lineaire deel van de kromme, die overeenkomt met het zuurstofverbruik.
9. Verslaggeving
   1. Rapporteer het zuurstofverbruik als het gemiddelde van drie metingen, met de standaarddeviatie.

7. Bereiding van eiwit-gefunctionaliseerde GUV's

1. Plasmareiniging van ITO-gecoate glazen glaasjes
   1. Plaats de met indiumtinoxide (ITO) gecoate glasschuifstukken in de plasmareiniger met de geleidende (ITO-gecoate) zijde naar boven gericht. Plasma reinigt ze 1 minuut op hoge vermogensstand ("HI") (230 V, maximaal RF-vermogen 18 W) en een druk van ongeveer 0,5 mbar.
      OPMERKING: Succesvolle plasmaontsteking kan visueel worden bevestigd door het verschijnen van een roze/paarse gloed in de kamer.
2. Gedeeltelijke uitdroging van proteo-LUV's
   1. Meng 20 μL eiwitvrije LUV's met 20 μL proteo-LUV's die gereconstitueerd bo₃ oxidase-ATTO 643 bevatten. Zachtjes vortexen om homogene menging te garanderen.
   2. Plaats zeven 2 μL druppels van de resulterende 5 mg/mL LUV/proteo-LUV suspensie op het geleidende (ITO-gecoate) oppervlak van elke schuin die voor elektroformatie wordt gebruikt (Figuur 2A). Verdeel de druppels gelijkmatig over het 160,6 mm² oppervlak, waarbij je ze gescheiden houdt om een uniforme filmvorming te bevorderen.
      OPMERKING: Voor andere polymeersystemen kunnen de LUV-concentratie en druppelvolume optimalisatie vereisen (typisch bereik: 5–100 mg/mL LUV's; 0,2–2 μL druppels).
   3. Laat de druppels gedeeltelijk uitdrogen bij kamertemperatuur (∼22 °C) en ∼20% luchtvochtigheid gedurende ongeveer 40 minuten, of totdat er een witte ring vormt aan de rand van de druppel (Figuur 2B).
      OPMERKING: Uitdroging hangt af van de luchtvochtigheid. Als de relatieve luchtvochtigheid boven de 40% ligt, verleng dan de uitdrogingstijd indien nodig (tot 20 minuten). Bepaal het eindpunt op basis van het uiterlijk van een witte ring aan de rand van de druppel in plaats van op een vaste tijd. Onder consistente omgevingsomstandigheden (temperatuur en luchtvochtigheid) is de vereiste droogtijd reproduceerbaar. Vermijd overmatige droging, wat zichtbaar is als volledig platte, gelijkmatig witte druppels, omdat dit eiwitneerslag kan veroorzaken.
3. Assemblage van de elektroformatiekamer
   1. Assembleer de elektroformatiekamer door twee ITO-gecoate geleiders (gecoate zijden naar binnen gericht) te sandwichen, gescheiden door een 1,81 mm dikke siliconen afstandhouder met een snede aan één kant, waardoor buffer kan worden toegevoegd of verwijderd tijdens het vullen en verzamelen.
   2. Vul de kamer met rehydratatiebuffer (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM sucrose).
      Voor pH-gevoelige experimenten voeg je 10 μM pyranine (8-hydroxypyreen-1,3,6-trisulfonzuurtrinatriumzout, HPTS) toe aan de buffer.
4. Elektroformatie
   1. Pas een sinusvormig wisselend elektrisch veld toe met het volgende programma: 50 Hz bij 50, 100, 200, 300, 500, 700 en 900 mV gedurende elk 6 minuten; 50 Hz bij 1,1 V gedurende 2 uur.
      OPMERKING: Om de vorming van grotere proteo-GUV's te bevorderen, kan deze stap worden verlengd tot 12 uur, en 4 Hz bij 2 V gedurende 30 minuten voor de detachementstap. Wanneer de buffer 10 μM pyranine bevat, verhoog dan de frequentie tot 500 Hz tijdens de eerste twee spanningsopbouwstappen.
5. Collectie GUV's
   1. Open de kamer voorzichtig met een pincet en verzamel GUV's met FineTip Ultra-Micro Pastette-pipetten (of equivalente laag-afschuif transferpipetten) om mechanische spanning te minimaliseren.
      OPMERKING: Vermijd het gebruik van standaard pipetten met laag volume onder de 200 μL, omdat deze grotere GOV's kunnen laten scheuren. Alternatief kunnen standaard tips aan het uiteinde worden afgezaagd om de opening te verbreden, waardoor de afschuiving tijdens het verzamelen wordt verminderd.
6. Opslag
   1. Bewaar proteo-GUV's bij 4 °C en gebruik binnen 48 uur om de eiwitactiviteit te behouden.
      OPMERKING: Het tempo van activiteitsverlies hangt af van het type en de stabiliteit van het gereconstitueerde membraaneiwit, evenals van de samenstelling van het membraan.

8. Microscopie van eiwitgefunctionaliseerde GUV's

1. Microscoopopstelling
   1. Zet de confocale microscoop aan. Als je het Leica-systeem gebruikt, start dan de LAS X-software. Voor andere microscoopmerken gebruik je de door de fabrikant aanbevolen acquisitiesoftware.
   2. Selecteer een 63× olie-onderdompelingsobjectief (NA 1.40); pas indien nodig aan op een hogere of lagere vergroting, afhankelijk van de grootte van de GUV.
   3. Open twee beeldvormingskanalen die overeenkomen met de fluoroforen: Rhodamine Red (membraan) en ATTO 643 (gereconstitueerd eiwit).
      OPMERKING: Voor fluoroforen met gedeeltelijk overlappende spectra, selecteer geschikte laserlijnen en smalle detectievensters om spectrale kruisspraak te minimaliseren. Verzamel elk kanaal sequentieel om signaaldoorvloeiing te voorkomen en om nauwkeurige fluorescentiekwantificering te garanderen.
2. Sedimentatie van GUV's
   1. Plaats een press-to-seal siliconen isolator op een schone 1,5 glazen deklaag (0,17 mm dikte).
      OPMERKING: Voor rechtopstaande (niet-omgekeerde) microscopen kunnen dikkere glazen glaasjes worden gebruikt.
   2. Pipet 60 μL buffer (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM glucose) in het midden van de spacer.
   3. Voeg voorzichtig 20 μL van de GUV-ophanging toe bovenop de buffer.
   4. Bedek de kamer onmiddellijk met een tweede glazen schuifstuk om verdamping te voorkomen.
   5. Laat de GUV's ~5 minuten sedimenteren voordat je beelden neemt.
3. Beeldverwerving
   1. Focus op de onderkant van de kamer om dwarsdoorsneden van GUV's vast te leggen.
   2. Verzamel beelden van verschillende GUV's door de kamer door systematisch van linksboven naar rechtsonder te scannen ("slangenpatroon") om een representatieve populatie te verkrijgen (~100 GUV's). Maak een afbeelding van alle blaasjes die tijdens de scan worden aangetroffen zonder preselectie, ongeacht grootte of fluorescentie-intensiteit, om selectiebias te voorkomen en reproduceerbaarheid te waarborgen.
      OPMERKING: Vermijd herhaalde beeldvorming van dezelfde GUV om fotobleaching te voorkomen.
4. Beeldanalyse
   1. Kwantificeer de fluorescentieintensiteit van gereconstitueerd ATTO 643-gelabeld eiwit door een polyline langs het membraan van individuele GUV's te tekenen. Bij gebruik van LAS X-software selecteer je Quantify → Line Profile, kies vervolgens de polyline-tool en volg het membraan van elke GUV. Om de gemiddelde fluorescentieintensiteit te verkrijgen, open je Statistiek en noteer je de gemiddelde waarde. Analyseer alleen schone, unilamellaire GUV's; Sluit multivesiculaire blaasjes en aggregerige blaasjes uit de analyse.
      OPMERKING: Als metingen op verschillende dagen worden verkregen, moeten fluorescentieintensiteiten worden genormaliseerd op het laservermogen, gemeten onder identieke beeldvormingsinstellingen (golflengte en nominaal vermogen). Om rekening te houden met dagelijkse variaties in laseruitgang wordt de volgende normalisatie toegepast: , waarbij F_a.u. de gemeten fluorescentieintensiteit in willekeurige eenheden is, P-referentie de laserkracht is die op de referentiedag wordt gemeten, en de laserkracht die op de dag van verwerving wordt gemeten. Deze correctie gaat uit van een lineaire relatie tussen laservermogen en fluorescentieintensiteit onder niet-verzadigende verlichtingsomstandigheden. In de huidige studie werden alle beelden op dezelfde dag gemaakt, waardoor normalisatie niet nodig was.
   2. Rapporteer de fluorescentieintensiteit als gemiddeld 100 GDV's met de bijbehorende standaarddeviatie.

9. Protonpompanalyse in proteo-GUV's

1. Microscoopopstelling
   1. Zet de confocale microscoop aan en start de juiste acquisitiesoftware (bijv. LAS X voor Leica-systemen).
   2. Selecteer een 63× olie-onderdompelingsobjectief (NA 1.40). Pas indien nodig aan op een hogere of lagere vergroting, afhankelijk van de grootte van de GUV.
   3. Configureer drie beeldvormingskanalen die overeenkomen met de fluoroforen. Voor Rhodamine Red (membraanmarker) gebruik een excitatie van 561 nm en een emissiebereik van 570–620 nm. Voor pyranine (een inkapselde pH-gevoelige kleurstof) gebruik excitaties bij 448 nm en 405 nm, en verzamel emissie over 499–551 nm.
      OPMERKING: Als er een laser van 458 nm beschikbaar is, gebruik deze dan in plaats van 448 nm om de gedeprotoneerde (basische) vorm van pyranine te exciteren.
   4. Pas laservermogen en detectorversterking aan om pixelverzadiging te voorkomen en fotobleaching te minimaliseren. Houd de acquisitie-instellingen constant gedurende het experiment.
2. Sedimentatie van GUV's
   1. Voeg 280 μL buffer (1 mM Tris-HCl, pH 7,5; 200 mM glucose) toe aan één put van een 8-well gekamerde dia-laag (totaal putvolume: ~874 μL).
      OPMERKING: Gebruik niet minder dan 200 μL, omdat volumes onder 200 μL de verdamping en pH-drift verhogen. Haal niet meer dan 400 μL om morsen te voorkomen en comfortabel te pipetteren. Als je een ander kamerformaat gebruikt, pas dan het volume dienovereenkomstig aan. Voor omgekeerde microscopen gebruik je kamerglaasjes die compatibel zijn met een deklaagdijte van #1,5H.
   2. Voeg voorzichtig 20 μL van de bo_3-GUV vering toe bovenop de buffer zonder luchtbellen toe te voegen.
      OPMERKING: Voor de negatieve controle vervang je de bo 3-GUV-suspensie door een equivalent volume (20 μL) eiwitvrije GUV's van dezelfde lipide/polymeersamenstelling, bereid en gesedimenteerd onder identieke omstandigheden. Deze controle houdt rekening met eventuele niet-specifieke effecten van DTT en Q₁ op de pyraninefluorescentieverhouding die onafhankelijk zijn van de activiteit van de oxidase van bo3.
   3. Laat de GUV's ongeveer 5 minuten sedimenteren voordat je beelden maakt.
3. Basisverwerving
   1. Focus op het onderste vlak van de kamer waar de GUV's zijn afgedaald.
   2. Pas de zoom aan om 3–6 GUV's binnen het gezichtsveld te verkrijgen.
   3. Noteer de basisfluorescentie in alle kanalen gedurende 5 minuten vóór activatie.
4. Activatie van protonpompen
   1. Maak direct voor gebruik een nieuw DTT–Q₁-mengsel door 4,8 μL van 1 M DTT te mengen met 0,3 μL 80 mM Q₁ in DMSO, en meng vervolgens grondig door vortexen.
   2. Activeer cytochroom bo₃ oxidase door voorzichtig 2,6 μL van het DTT–Q₁-mengsel aan het oppervlak van de oplossing toe te voegen zonder de pipettip in de buffer te plaatsen, wat resulteert in uiteindelijke concentraties van ongeveer 8 mM DTT en 40 μM Q₁ in de kamer.
   3. Monitor de intravesiculaire pyraninefluorescentie gedurende 30 minuten onder continue opname.
5. Analyse van intravesiculaire pyraninefluorescentie
   1. Definieer voor elke GUV een interessegebied (ROI) binnen het blaassel-lumen. In de LAS X-software ga je naar Quantify → Stack Profile, selecteer je Draw Ellipse en teken je een cirkelvormige ROI binnen elke GUV.
   2. Om de gemiddelde fluorescentieintensiteit bij 499–551 nm voor beide excitatiegolflengten (448 nm en 405 nm) te bepalen, open je Statistics in de software en noteer je de gemiddelde waarde.
   3. Bereken de fluorescentieverhouding als R = I₄₄₈/I₄₀₅.
   4. Plot de verhouding over de tijd om kinetische sporen van intravesiculaire pH-verandering te verkrijgen.

Resultaten

De E. coli cytochroom _bo3 oxidase werd tot expressie gebracht uit plasmide pETcyo in E. coli-stam C43 (DE3) ΔcyoABCDE en gezuiverd zoals eerder beschreven²⁹. Gezuiverde bo3-oxidase werd direct gebruikt voor reconstitutie- en activiteitsmetingen, of gelabeld met fluorescerende kleurstoffen, zoals ATTO 643 (deze studie) of andere ATTO-kleurstoffen ^1,15. Voor sterk hydrofiele kleurstoffen zoals ATTO 643 werd een kolom van 30 cm gebruikt om een efficiënte scheiding van ongebonden kleurstof van gelabeld eiwit te bereiken (Figuur 3A). De mate van labeling (DOL), berekend uit absorptiespectra, varieerde doorgaans van 1,1–1,3 kleurstofmoleculen per enzym, afhankelijk van de gebruikte ATTO-kleurstof. Voor bo₃ oxidase gelabeld met ATTO 643 was de DOL 1,16 (Figuur 3B).

Voor eiwitreconstitutie werden LUV's eerst bereid via dunne film rehydratatie, gevolgd door vries-dooicycli en extrusie om uniforme blaasgroottes te verkrijgen. Voor polymersomen werd de rehydratatiebuffer aangevuld met detergent. Blaasgrootteverdelingen werden geanalyseerd door dynamische lichtverstrooiing voorafgaand aan de reconstitutie (Figuur 4, Tabel 2). Zowel hybride als polymeer-LUV's vertoonden doorgaans gemiddelde diameters van 85–95 nm met smalle grootteverdelingen (PDI < 0,2). PDMS-g-PEO-gebaseerde blaasjes worden verwacht iets kleiner te zijn dan de nominale poriegrootte van het extrusiemembraan. Typische polymersomen vertoonden zeer uniforme groottes, met PDI-waarden onder 0,1, terwijl hybride blaasjes redelijk uniforme populaties vormden met PDI-waarden soms boven 0,1 maar consequent onder 0,2.

Membraaneiwit _bo-3 oxidase werd vervolgens in LUV's ingebracht in aanwezigheid van detergent (natriumcholaat in deze studie). Daarna werd het wasmiddel verwijderd met behulp van Bio-Beads. Na reconstitutie nam de polyzeeomgrootte slechts licht toe (Figuur 4A), terwijl de grootte van de hybride blaasjes ongewijzigd bleef (Figuur 4B). In beide systemen werd een kleine toename van PDI waargenomen (Tabel 2). Dergelijke kleine grootteverschillen zijn te verwachten, omdat detergent-gemedieerde oplosbaarheid en verwijdering de polymeerketens in het membraan kunnen reorganiseren. De eiwitactiviteit werd beoordeeld door het meten van zuurstofverbruik, wat aangeeft of het eiwit functionele activiteit behield (Figuur 5A). De afwezigheid van zuurstofverbruik in de eiwitvrije LUV-negatieve controle bevestigt dat het waargenomen signaal specifiek voortkomt uit de activiteit van bo3-oxidase. Bij natriumcholaat-gemedieerde reconstitutie bij de hier gebruikte concentraties was de eiwitactiviteit doorgaans iets hoger in hybride vesikels vergeleken met polymersomen (Figuur 5B). Er werd enige variabiliteit in eiwitactiviteit waargenomen tussen zuiveringsbatches en zelfs tussen fracties binnen dezelfde batch. Daarom moet voor vergelijkende studies—zoals het vergelijken van eiwitactiviteit tussen verschillende membraansystemen—hetzelfde aandeel gezuiverd eiwit worden gebruikt om consistentie te waarborgen.

Om eiwit-gefunctionaliseerde PDMS-g-PEO en PDMS-g-PEO/soja PC GUV's te genereren, werd een fusie-elektroformatiebenadering toegepast. Bij deze methode werden proteo-LUV's gemengd met eiwitvrije LUV's en op ITO-gecoate glazen glaasjes afgezet, gevolgd door gedeeltelijke dehydratie om blaasfusie en vorming van een polymeer/eiwit of polymeer/lipide/eiwitfilm te bevorderen. Onvoldoende dehydratie resulteerde in een lage proteo-GUV-opbrengst, kleinere GUV-grootte en de aanwezigheid van niet-gefuseerde (proteo-)LUV's.

De succesvolle opname van het gelabelde eiwit, bo₃ oxidase–ATTO 643, in het membraan werd bevestigd door confocale microscopie na sedimentatie van de GUV's in een sucrose/glucose dichtheidsgradiënt (Figuur 6A, B). Kwantificering van membraan-geassocieerde fluorescentie met behulp van een eenvoudig lijnprofiel kan worden gebiaseerd, aangezien de gemeten intensiteit afhangt van de hoek waaronder de lijn wordt getrokken. Om dit effect te minimaliseren werd de fluorescentieintensiteit geëvalueerd met behulp van een polyline die langs de gehele membraancontour van elke GUV werd getrokken.

Om mogelijke correlaties tussen blaasgrootte en eiwitincorporatie te beoordelen, werd de diameter van GUV parallel geanalyseerd (Figuur 6C, D). Grotere GUV's (boven de 20 μm) vertoonden doorgaans een lagere membraan-geassocieerde eiwitfluorescentie vergeleken met kleinere blaasjes. Deze observatie kan worden toegeschreven aan het fusie-elektroformatiemechanisme: kleinere blaasjes vormen zich eerder en kunnen eiwitten efficiënter bevatten, terwijl grotere blaasjes ontstaan door latere fusiegebeurtenissen en membraangroei, wat mogelijk leidt tot verdunning met eiwitarm materiaal.

De totale eiwitopname wordt voornamelijk bepaald in de vroege fase van de reconstitutie tot LUV's, met name door het wasmiddeltype, de concentratie en het stap waarin het wordt toegevoegd. Voor polymeer-LUV's werd een iets lagere incorporatie waargenomen wanneer detergent werd toegevoegd aan vooraf gevormde blaasjes in vergelijking met toevoeging tijdens de vorming van de vesikels (rehydratiestap), wat resulteerde in fluorescentieintensiteiten van respectievelijk 18,9 ± 3,9 a.u. en 20,6 ± 3,7 a.u. (Figuur 6C, D, links). Voor hybride systemen, waarbij detergent wordt toegevoegd na de vorming van een blaasje, speelt de detergentconcentratie een belangrijke rol: het verhogen van natriumcholaat van 0,015% naar 0,1% leidde tot een duidelijke toename van eiwitopname (22,1 ± 5,2 a.u. versus 26,2 ± 5,0 a.u., Figuur 6C, D, rechts). Bij vergelijking van polymeer- en hybride systemen werd over het algemeen een iets hogere membraanopname van Bo3-oxidase waargenomen bij hybride GUV's. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van pakdefecten op polymeer-lipide-interfaces, die naast detergent-geïnduceerde defecten gunstige insertieplaatsen voor membraaneiwitten bieden.

Met een tweede elektroformatiestap van 2 uur was de gemiddelde diameter van bo₃ oxidase-gefunctionaliseerde GUV's ongeveer 14–15 μm (13,5 ± 3,7 μm voor polymeer-GUV's en 15,4 ± 6,3 μm voor hybride GUV's), hoewel er ook aanzienlijk grotere blaasjes aanwezig waren (Figuur 6C, D). Het verlengen van de duur van de tweede elektroformatiestap tot 12 uur resulteerde in een totale toename van de GUV-grootte ^1,27.

Het fusie-elektroformatieprotocol maakt het ook mogelijk om wateroplosbare stoffen in te kapselen, zoals pH-gevoelige kleurstoffen (bijv. pyranine), door de kleurstof aan de rehydratatiebuffer toe te voegen tijdens elektroformatie (Figuur 7A). De grootte van de GUV neemt meestal af wanneer blaasjes worden gevormd in aanwezigheid van wateroplosbare kleurstoffen. Om dit effect te compenseren, moet de frequentie tijdens de initiële elektroformatiestappen worden verhoogd van 50–500 Hz.

Het inkapselen van een ratiometrische pH-gevoelige kleurstof, zoals pyranine, maakt enkelblaasmonitoring van protonpompen mogelijk en geeft inzicht in de oriëntatie van de protonpompen. Bij verzuring van het blaaslumen neemt de fluorescentieverhouding van pyranine die bij 448 nm en 405 nm wordt geëxciteerd af. Deze verhouding weerspiegelt de protonatietoestand van pyranine en correleert daarmee met de pH. Ratiometrische metingen zijn voordelig, omdat ze grotendeels ongevoelig zijn voor variaties in kleurstof-inkapselingsefficiëntie en fotobleaching. Een voorbeeld van protonpompactiviteit is te zien in Figuur 7B, waar een afname van de intravesiculaire pyraninefluorescentieverhouding (I₄₄₈/I₄₀₅) wordt waargenomen in hybride GUV's die gereconstitueerde bo3-oxidase bevatten na toevoeging van de elektronendonor DTT en de elektronenmediator Q₁. De fluorescentieverhouding begint ongeveer 1 minuut na activatie sterk af te nemen en blijft ongeveer 1 minuut snel dalen, waarna deze in de volgende ~18 minuten afneemt. Dit gedrag geeft aan dat het merendeel van de bo3-oxidasemoleculen zo is georiënteerd dat protonpompen plaatsvindt naar het binnenste van de GUV's. Eiwitvrije GUV's die aan identieke omstandigheden werden onderworpen, vertoonden een kleinere afname in de fluorescentieverhouding, wat als negatieve controle diende en bevestigde dat de grotere afname in bo 3-GUV's specifiek voortkomt uit de pompactiviteit van de_bo-3 oxidase protonen in plaats van de niet-specifieke effecten van DTT en Q 1 op de pyraninefluorescentieverhouding.

Figuur 1. Schematische weergave van de voorbereiding van grote unilamellaire blaasjes (LUV), reconstitutie van membraaneiwitcytochroom bo₃ oxidase tot LUV's, en vorming van bo₃ oxidase-gefunctionaliseerde gigantische unilamellaire vesikels (GUV's) via de fusie-elektroformatie-benadering. LUV's worden bereid door dunne film rehydratatie, vries-dooicycli en extrusie via een 100 nm poriegrootte membraan. Reconstitutie van cytochroom _bo3 oxidase wordt uitgevoerd in aanwezigheid van detergent, dat vervolgens wordt verwijderd met behulp van Bio-Beads. bo 3-GUV's worden gevormd door bo 3-LUV's af te brengen op met indiumtinoxide (ITO) gecoate glazen glaasjes, gevolgd door gedeeltelijke dehydratatie en rehydratatie in aanwezigheid van elektrische stroom. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Vorming van een gefuseerde grote unilamellaire blaasfilm (LUV) door uitdroging. Zeven 2-μL druppels van gemengde proteo-LUV's en LUV's werden afgezet op met indiumtinoxide (ITO)-gecoate glazen glaasjes: (A) direct na depositie en (B) na gedeeltelijke dehydratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Fluorescerende labeling van cytochroom bo₃ oxidase. (A) Chromatogram (elusieprofiel) van bo₃ oxidase-ATTO 643 gezuiverd op een Superdex 200 10/300 GL kolom. De in grijs gemarkeerde fracties werden verzameld en vervolgens geconcentreerd. (B) Absorptiespectra van geconcentreerde bo₃ oxidase-ATTO 643, met pieken bij 280 nm (eiwit), 400 nm (Soret-band van heemcofactoren in bo₃ oxidase) en 643 nm (kleurstof). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4. Grootteverdelingen van grote unilamellaire vesikels (LUVs) vóór en na eiwitreconstitutie: (A) poly(dimethylsiloxaan)-graft-poly (ethyleenoxide) (PDMS-g-PEO) polymeer en (B) PDMS-g-PEO/sojafosfatidylcholine (PC) hybride vesikels. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. Zuurstofverbruik door bo3-oxidase gereconstitueerd in grote unilamellaire vesikels (LUV's). (A) Representatieve sporen van zuurstofconcentratie over tijd na activatie van gereconstitueerde cytochroom bo 3-oxidase door toevoeging van dithiothreitol (DTT) en ubiquinon-1 (Q₁). De groene spoor komt overeen met eiwit-gereconstitueerde LUV's, en de grijze spoor met de negatieve controle (eiwitvrije LUV's). (B) Zuurstofverbruik (OCR) van bo₃ oxidase gereconstitueerd in poly(dimethylsiloxaan)-graft-poly (ethyleenoxide) (PDMS-g-PEO) en PDMS-g-PEO/sojafosfatidylcholine (PC) LUV's. Balken geven het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van drie onafhankelijke metingen weer (n = 3). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6. Invoeging van fluorescentie-gelabelde bo3-oxidase in gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's). Representative micrografieën van (A) poly(dimethylsiloxaan)-graft-poly(ethyleenoxide) (PDMS-g-PEO) en (B) PDMS-g-PEO/sojafosfatidylcholine (PC) GUV's (membranen gelabeld met fosfatidylethanolamine-Rhodamine (PE-Rho), rood) die gereconstitueerd cytochroom bo₃ oxidase-ATTO 643 (magenta) bevatten. Kwantificering van de fluorescentieintensiteit van bo₃ oxidase-ATTO 643 als functie van de GUV-grootte (N = 100) voor verschillende reconstitutievoorwaarden: (C) toevoeging van 0,2% natriumcholaat (SC) aan voorgevormde polymeergrote unilamellaire vesikels (LUV's) en 0,015% SC aan voorgevormde hybride LUV's; (D) polymeer-LUV's gevormd in aanwezigheid van 0,1% SC en hybride LUV's behandeld met 0,1% SC na de vorming. Waarden geven de fluorescentieintensiteit van individuele GDV's weer (N = 100 per conditie). Gemiddelde ± standaarddeviatiewaarden (SD) worden in de tekst gerapporteerd. Vergelijkingen zijn beschrijvend; er werd geen formele statistische test uitgevoerd. A.U. (willekeurige eenheden). Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. Protonpompen door bo3-oxidase gereconstitueerd in gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's). (A) Representativ fluorescentiemicrograaf van poly(dimethylsiloxaan)-graft-poly (ethyleenoxide) (PDMS-g-PEO)/sojafosfatidylcholine (PC) GUV's, met membranen gelabeld met 0,05 mol% fosfatidylethanolamine-Rhodamine (PE-Rho, rood), met gereconstitueerde cytochroom _bo3 oxidase en ingekapselde pH-gevoelige kleurstof pyranine (excitatie bij 405 en 448 nm; blauwe en groene kanalen), gesedimenteerd in een kamerglazen glaasje. (B) Verandering in de intravesiculaire pyraninefluorescentieverhouding bij activatie met dithiothreitol (DTT) en ubiquinon-1 (Q₁) in PDMS-g-PEO/soja PC GUV's die gereconstitueerde bo3-oxidase bevatten. De groene spoor komt overeen met eiwit-gereconstitueerde GUV's, en het grijze spoor met de negatieve controle (eiwitvrije GUV's). De spoor stelt het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) voor (n = 3 blaasjes). Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

	Component	Materieel	Bedrag	Definitieve membraansamenstelling
Polymersomen	PDMS-g-PEO in chloroform: methanol (2:1, v/v)	10 mg/mL	499,9 μL	99,95 mol%
	PE-Rhodamine in chloroform	1 mg/mL	1,1 μL	0,05 mol%
Hybride blaasjes	PDMS-g-PEO in chloroform: methanol (2:1, v/v)	10 mg/mL	450,1 μL	70 mol%
	Soja PC (95%) in chloroform	10 mg/mL	49,8 μL	29,95 mol%
	PE-Rhodamine in chloroform	1 mg/mL	1,4 μL	0,05 mol%

Tabel 1: Voorraadoplossingen en volumes gebruikt voor dunne filmvoorbereiding voor de vorming van grote unilamellaire blaasjes (LUV). Voorraadconcentraties worden gegeven in mg/mL. Volumes worden berekend voor een totale film van 5 mg/mL amfifielconcentratie. De uiteindelijke membraansamenstelling wordt uitgedrukt in mol%. PDMS-g-PEO: poly(dimethylsiloxaan)-graft-poly (ethyleenoxide); PE-Rhodamine: fosfatidylethanolamine-Rhodamine; soja PC: sojafosfatidylcholine; V/V: volume/volume.

	Toestand van heroprichting	Diameter (nm)	PDI
Polymersomen	Voorafgaand aan de heroprichting	84,34 ± 0,22	0.084
	Na de heroprichting	100,73 ± 0,81	0.109
Hybriden	Voorafgaand aan de heroprichting	89,21 ± 0,77	0.129
	Na de heroprichting	85,01 ± 0,42	0.17

Tabel 2: Gemiddelde blaasgrootte en polydispersie-index (PDI) van polymersomen (poly(dimethylsiloxaan)-graft-poly (ethyleenoxide), PDMS-g-PEO) en hybride vesikels (PDMS-g-PEO/sojafosfatidylcholine (PC)) vóór en na reconstitutie. De gegevens vormen het gemiddelde van drie onafhankelijke metingen.

Discussie

Polymersomen en polymeer/lipide hybride vesikels vertonen een verbeterde chemische en mechanische stabiliteit ten opzichte van conventionele lipideblaasjes, waardoor ze zeer aantrekkelijk zijn voor toepassingen variërend van geneesmiddelafgifte en biosensing tot nano- en microreactoren en kunstcellen. Hun onderscheidende membraanarchitectuur en biofysische eigenschappen voorkomen echter vaak de directe overdracht van protocollen die geoptimaliseerd zijn voor lipideblaasjes naar polymere-gebaseerde systemen 15,20,30. Het hier gepresenteerde protocol pakt deze verschillen aan en biedt een geoptimaliseerde workflow voor membraaneiwitreconstitutie in PDMS-g-PEO-gebaseerde polymeer- en hybride LUV's, gevolgd door schaalverdeling naar GUV's via fusie-elektroformatie.

Een cruciale stap in het protocol is de voorbereiding van LUV's met een smalle en reproduceerbare grootteverdeling. Net als bij lipidefilms assembleren PDMS-g-PEO-films zichzelf tot blaasjes na rehydratatie met een waterige buffer. In tegenstelling tot lipidesystemen, die vaak een mengsel van uni- en multilamellaire vesikels opleveren, vormt PDMS-g-PEO bij voorkeur unilamellaire structuren¹, waardoor de noodzaak van vries-dooicycli die gewoonlijk worden gebruikt om de multilamellariteit in lipidenpreparaten te verminderen, overbodig wordt. Extrusie wordt uitgevoerd om de verdeling van de blaasgrootte te standaardiseren. Door de verhoogde zachtheid van PDMS-g-PEO-membranen ten opzichte van lipidedubbellagen¹ zijn lagere extrusiedrukken voldoende. Hoewel de 11 door de fabrikant aanbevolen 11 extrusiepassen over het algemeen voldoende zijn, leidt het verhogen van het aantal passes doorgaans tot een smallere grootteverdeling en verbeterde reproduceerbaarheid. Overmatige extrusie kan echter blaasjes veroorzaken die iets kleiner zijn dan de nominale poriegrootte van het membraan. Herhaalde extrusie kan ook de blaasopbrengst verminderen door materiaalverlies; eerder hebben we vastgesteld dat ongeveer 31% van PDMS-g-PEO en 25% van het PDMS-g-PEO/soja PC-vesikelmateriaal verloren ging na 21 passes door een 100 nm membraan¹. Daarom moet het aantal extrusiepasses worden geoptimaliseerd om de grootte van uniformiteit in balans te brengen met de integriteit en opbrengst van de blaas.

Detergent-gemedieerde reconstitutie vormt een andere cruciale factor voor succes. Het optimale type en de concentratie van detergent hangen zowel af van het specifieke membraaneiwit als van de membraansamenstelling ^3,20. In het geval van zuivere polymeermembranen, wanneer de verzadigingsomstandigheden optimaal zijn, levert het toevoegen van detergent tijdens filmrehydratatie hogere insertie-efficiënties op dan het verzadigen van voorgevormde blaasjes. Stijvere polymeermembranen, zoals die gevormd uit PBD-b-PEO, vereisen aanzienlijk hogere detergentconcentraties voor membraansolubilisatie³⁰, wat de noodzaak van polymeerspecifieke optimalisatie onderstreept. Succesvolle inzetting moet niet alleen worden geverifieerd door activiteitsmetingen—vergeleken met detergentmicellen of lipideblaasjes—maar ook door structurele analyse, zoals cryo-TEM, om de inbrengingsdiepte en membraanadaptatie voor hydrofobe mismatch^{te beoordelen 1}. Eiwitoriëntatie is even cruciaal, vooral voor protonpompen, omdat een functionele protongradiënt vereist dat de meeste pompen uniform georiënteerd zijn. Idealiter zouden pompen protonen naar binnen moeten transporteren om koppeling met gradiëntverbruikende processen mogelijk te maken, zoals ATP-synthese ^3,15. De oriëntatie kan worden beoordeeld met eiwittags, bijvoorbeeld door selectief kleurstoffen die aan de buitenkant van het vesikel zijn blootgesteld te quenchen of door fluorescerende labels te verplaatsen die aan His-tags²⁰ zijn bevestigd. Deze benaderingen worden gepresenteerd als algemene aanbevelingen voor protocoloptimalisatie en zijn in deze studie niet uitgevoerd.

Schalen van proteo-LUV's naar proteo-GUV's met fusie-elektroformatie vereist nauwkeurige controle van depositie- en dehydratieparameters. De concentratie van LUV's en de druppelgrootte hebben een kritische invloed op het uiteindelijke GUV-vermogen en de zuiverheid. Te hoge LUV-concentraties (≥10 mg/mL) kunnen ertoe leiden dat niet-gefuseerde LUV's in het eindmonster achterblijven, terwijl te lage concentraties (<5 mg/mL) de GUV-opbrengst verminderen vanwege onvoldoende afgezet materiaal. Uitdroging moet gedeeltelijk zijn in plaats van volledig — aangegeven door het verschijnen van een witte ring aan de rand van de druppel in plaats van een volledig witte druppel — omdat overmatige uitdroging de activiteit van membraaneiwitten kan belemmeren of opheffen, vooral bij protonpompen. Gecontroleerde luchtvochtigheid en temperatuur zijn daarom essentieel om membranen voldoende te destabiliseren voor fusie, terwijl de functionaliteit van het eiwit behouden blijft.

Hoge eiwitladingen kunnen de grootte van de GUV verkleinen, maar dit effect kan worden verminderd door eiwitgefunctionaliseerde LUV's te verdunnen met eiwitvrije LUV's. Op deze manier kan de eiwitdichtheid binnen GUV-membranen nauwkeurig worden gemoduleerd vóór afzetting. Bijvoorbeeld, het mengen van sterk belaste bo 3-LUVs met lege LUVs (tot 1:10, v/v) levert GUV's op met diameters van 5–30 μm en een instelbaar eiwitgehalte terwijl de membraanverdeling²⁷ gelijkmatig wordt behouden. Hoewel deze strategie resulteert in heterogene vesikelpopulaties qua eiwitdichtheid, maken kalibratieprocedures kwantitatieve beoordeling van incorporatieniveaus^{mogelijk 23,31}. Belangrijk is dat de mengmethode een hogere totale eiwitbelasting mogelijk maakt zonder een overmatige vermindering van GUV-grootte²⁷.

Functionele analyse van gereconstitueerde eiwitten kan worden uitgevoerd door pH-gevoelige kleurstoffen zoals pyranine in de elektroformatiebuffer te kapselen om intravesiculaire pH-veranderingen te monitoren. Voor betrouwbare live beeldvorming moeten blaasjes sedimenteren of worden geïmmobiliseerd om beweging te voorkomen, wat fluorescentiesignalen zou vervagen en de nauwkeurige kwantificering van intravesiculaire pH-dynamiek zou belemmeren. Immobilisatie via biotine–streptavidine-koppeling met biotinylatieve lipiden en streptavidine-gecoate oppervlakken³² zorgt voor stabiele hechting, maar kan de membraansamenstelling of spanning veranderen. Semi-immobilisatie in microfluidische vallen biedt een alternatief dat extra membraancomponenten vermijdt en verstoring^{minimaliseert 1,33}. Hoewel bulkfluorescentiemetingen mogelijk zijn na verwijdering van externe kleurstof door herhaalde sedimentatie en bufferuitwisseling, kan residueel membraan-geassocieerde kleurstof de uitlezing verstoren; daarom wordt confocale microscopie van enkele GUV's over het algemeen geprefereerd.

In vergelijking met alternatieve benaderingen die directe eiwitinsertie in vooraf gevormde GUV's proberen te doen, maakt de fusie-elektroformatiestrategie onafhankelijke optimalisatie van reconstitutiecondities op LUV-niveau mogelijk voordat wordt opgeschaald naar GUV's. Deze modulaire workflow verbetert de reproduceerbaarheid en functionele opbrengst, vooral voor polymeer- en hybride membranen die minder geschikt zijn voor conventionele lipide-gebaseerde protocollen. De methode is compatibel met een breed scala aan membraaneiwitten¹, waaronder multi-eiwitsystemen¹⁵, en maakt membraanfunctionalisatie en co-encapsulatie van extra componenten mogelijk. Als zodanig biedt het een veelzijdig platform voor het bouwen van duurzame kunstmatige cellen, microreactoren en modelsystemen voor het onderzoeken van polymeer-eiwitinteracties onder gecontroleerde omstandigheden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
ÄKTA pure™ chromatography system	Cytiva	29018224
18:1 Liss Rhod PE	Avanti Research	810150
8 well chambered coverglass	Cellvis	C8-1.5H-N
Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters	Sigma Aldrich	UFC5030
ATTO 643 NHS ester	ATTO-TEC	AD 643-31
Bio-Beads SM-2	Bio-Rad	1523920
Cholic acid-Na-salt (sodium cholate)	Serva	361-09-1
Coenzyme Q1	TargetMol	TGM-T19594
Confocal microscope STELLARIS 5	Leica Microsystems	603810
DTT (Dithiothreitol)	Merck	10197777001
Fine Tip Ultra Micro Pastette	Pastette	LW4243
HPTS (pyranine, 8-Hydroxypyrene-1,3,6-Trisulfonic Acid, Trisodium Salt)	Sigma Aldrich	6358-69-6
ITO-coated glass slides (25×75×1.1 mm, ≤20 Ohm/sq.)	pgo	CEC020S
LAS X software	Leica	https://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Mini centrifuge MCF-2360	LMS	24572
Mini-extruder	Avanti Research	610000
Oxytherm+P system	Hansatech Instruments	/
Plasma cleaner (benchtop)	Harrick Plasma	PDC-32G-2
Polycarbonate membranes 0.1 μm	Avanti Research	610005
Press-to-seal silicone isolator (round, 20 mm diameter, 1 mm depth)	Grace Bio-Labs	41161502
Silicone spacers (round, 24.2 mm outer diameter, 14.3 mm inner diameter, 1.8 mm depth)			laboratory-made, cut from silicone sheet
Soy PC (95%)	Avanti Research	441601
Specord 50 PLUS spectrophotometer	Analytik Jena	823-0200P-3
Superdex 200 10/300 GL column (column L × I.D. 30 cm × 10 mm)	Cytiva	28-9909-44
Test tube shaker (2800 rpm)	IKA Lab Dancer	3365000
Thermomixer comfort 5355	Eppendorf	5355000.011
Xiameter OFX-5329 (PDMS-g-PEO; MW 3000)	Dow Corning	000000000004109892
Zetasizer Nano ZS	Malvern Panalytical	ZEN3600