Fabricage van een verticaal gestapeld dentine-pulpa complex organ-on-a-chip-apparaat met behulp van een menselijke dentineschijf

Samenvatting

Om de fabricage en assemblage te beschrijven van een verticaal gestapeld organ-on-a-chip-apparaat van het dentine-pulpa-complex, bestaande uit een menselijke dentineschijf en via fotolithografie vervaardigde microkanalen, gevolgd door het zaaien en kweken van dentinale pulpa-stamcellen.

Samenvatting

Conventionele preklinische modellen die in tandheelkundig onderzoek worden gebruikt, waaronder diermodellen en statische celkweken, vertonen belangrijke beperkingen bij het reproduceren van de fysiologische omstandigheden van de dentine-pulpa-interface en het voorspellen van menselijke biologische reacties op tandheelkundige biomaterialen. Organ-on-a-chip (OoC)-technologie biedt een alternatieve benadering door de recreatie van weefselspecifieke micro-omgevingen binnen gecontroleerde microfluïdische systemen mogelijk te maken. Dit manuscript beschrijft een stap-voor-stap protocol voor de fabricage en assemblage van een dentine-pulpa-complex OoC-apparaat, waarbij een menselijke dentineschijf is geïntegreerd in een drie-laags polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdisch platform. Het protocol omvat de preparatie van de dentineschijf, de fabricage van microgestructureerde mallen middels fotolithografie, het gieten en uitharden van PDMS, plasma-ondersteunde laagbinding, de assemblage van het apparaat, lektesten en het zaaien van tandpulpa-stamcellen onder statische kweekcondities. Kritische fabricageparameters die de prestaties van het apparaat beïnvloeden worden besproken, waaronder de controle van de PDMS-laagdikte, plasmasurfacebehandeling en de integratie van de dentineschijf binnen het apparaat om lekkage te minimaliseren. Celadhesie en levensvatbaarheid binnen het apparaat werden geëvalueerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie en confocale live/dead-kleuring. Representatieve resultaten tonen een succesvolle integratie van de dentineschijf binnen de microfluïdische assemblage, het behoud van lekvrije condities en de adhesie van levensvatbare tandpulpa-stamcellen aan het dentine-oppervlak. Dit protocol biedt een reproduceerbare benadering voor de fabricage van een dentine-pulpa-complex OoC-platform dat toekomstige studies naar cellulaire reacties op tandheelkundige biomaterialen en micro-omgevingsstimuli kan ondersteunen.

Inleiding

Dierproeven zijn al lange tijd instrumenteel geweest bij het verbeteren van het begrip van pathologische en fysiologische processen en hebben een centrale rol gespeeld in de vroege stadia van geneesmiddelenontwikkeling¹. In de loop van de 20e eeuw is de menselijke levensverwachting aanzienlijk toegenomen, en hoewel het niet mogelijk is om precies te kwantificeren in welke mate deze verbetering uitsluitend aan dieronderzoek kan worden toegeschreven, wordt algemeen erkend dat veel hedendaagse medische behandelingen zijn ontwikkeld of gevalideerd met behulp van diermodellen². Opvallende voorbeelden zijn de ontwikkeling van vaccins tegen poliomyelitis, mazelen en hepatitis B, de evaluatie van de veiligheid en werkzaamheid van penicilline en de productie van insuline. Op het gebied van onderzoek naar tandheelkundige materialen en biomaterialen zijn deze modellen cruciaal geweest voor het onderzoeken van het cariësproces, de biologie en regeneratie van het dentine-pulpa complex en de fysiopathologie van de parodontale weefsels^3,4.

Ondanks het uitgebreide gebruik van deze methodologieën blijven de huidige trajecten voor geneesmiddelenontwikkeling hoge faalpercentages vertonen, waarbij veel kandidaat-geneesmiddelen tijdens klinische studies falen ondanks het aantonen van werkzaamheid en veiligheid in preklinische laboratoriumsettings en diermodellen⁵. Deze discrepantie wordt in verband gebracht met interspeciesverschillen die de translationele voorspellende waarde van diermodellen kunnen beperken vanwege anatomische, genetische en fysiologische verschillen tussen soorten⁶. Daarnaast blijft de ontwikkeling van nieuwe therapeutische benaderingen tijdrovend en kostbaar⁷. Bovendien maken conventionele in vitro-modellen voornamelijk gebruik van simplistische tweedimensionale (2D) monolaagculturen op niet-fysiologische plastic substraten, waardoor ze er niet in slagen de biochemische en fysieke signalen, cel-celinteracties en extracellulaire matrix (ECM)-signalering die aanwezig zijn in de menselijke mondholte te reproduceren^8,9. Hoewel 2D-modellen bepaalde experimentele voordelen bieden, zijn ze inherent niet in staat om de complexe interacties te reproduceren die gelijktijdig optreden tussen meerdere componenten, zoals biofilms, biomaterialen, dentine en pulpacellen¹⁰. Bijgevolg is er een toenemende belangstelling voor de ontwikkeling van alternatieve experimentele platforms die in staat zijn om menselijke biologische reacties nauwkeuriger te reproduceren. In 2022 hief de FDA Modernization Act 2.0 de verplichte eis voor dierproeven in het proces voor de goedkeuring van geneesmiddelen op en erkende het potentiële gebruik van alternatieve platforms, waaronder organ-on-a-chip (OoC)-technologieën, in preklinisch onderzoek¹¹.

Een OoC is een microfluïdisch apparaat dat is ontworpen om de structuur, functie en micro-omgeving van een specifiek orgaan of weefselcomponent te repliceren¹². Deze apparaten zijn bevolkt met levende cellen en weefsels die zijn gekweekt in technisch ontworpen microkanalen die belangrijke aspecten van de fysiologische micro-omgeving nabootsen waaraan cellen van nature worden blootgesteld. Naast structurele nabootsing maken microkanalen spatiotemporele controle over de cellulaire omgeving mogelijk en ondersteunen ze het behoud van weefselspecifieke functies, waardoor experimentele condities worden geboden die nauwer kunnen aansluiten bij de in vivo fysiologie dan conventionele cultuursystemen¹². Bijzonder relevant is dat microkanalen in OoC-apparaten de gecontroleerde stroming van cultuurmedium faciliteren, wat schuifspanning uitoefent op de aanwezige cellen¹³. Deze mechanische stimuli beïnvloeden cellulaire responsen, waaronder adhesie, proliferatie, migratie, genexpressie en cel-celinteracties^14,15. Daarnaast draagt een continue mediumstroom bij aan het behoud van de micro-omgeving door de toevoer van nutriënten en de verwijdering van metabolische afvalproducten¹⁶. Bovendien is er gemeld dat sommige OoC-platforms, vergeleken met conventionele 2D-culturen, een verbeterde controle ondersteunen van read-outs gerelateerd aan oxidatieve stress, waaronder intracellulaire reactieve zuurstofspecies en celviabiliteit, in driedimensionale (3D) on-chip modellen¹⁷. OoC-systemen zijn daarom naar voren gekomen als veelbelovende platforms voor het bestuderen van weefselfysiologie, biomateriaalinteracties en ziekteprocessen onder gecontroleerde experimentele condities¹⁸. In het tandheelkundig onderzoek is OoC-technologie stapsgewijs toegepast om steeds complexere interfaces van oraal weefsel te modelleren¹⁹. Vroege tooth-on-a-chip-platforms emuleerden de interface tussen biomateriaal, dentine en pulpa²⁰, terwijl geavanceerdere iteraties sindsdien vasculatuur en trigeminale innervatie hebben geïntegreerd om de structurele en functionele complexiteit van het pulpa-dentinecomplex getrouwer te repliceren²¹. Naast de pulpa hebben 3D-modellen van onvolgroeide wortelkanalen de evaluatie mogelijk gemaakt van endodontische irrigatiemiddelen en angiogeen sprouting van stamcellen uit de apicale papil^22,23. Op parodontaal niveau zijn gum-on-a-chip-platforms ingezet om gastheer-microbe-interacties te onderzoeken en het immunomodulerende potentieel van probiotica als therapeutische middelen te evalueren²⁴, terwijl periodontal ligament-on-chip-apparaten hebben aangetoond hoe interstitiële vloeistofstroom de vorming van het vasculaire netwerk en de osteogene differentiatie van periodontal ligament stamcel-sferoïden moduleert^25,26. Ter aanvulling op deze modellen hebben gespecialiseerde oral mucosa-on-a-chip en dental implant-on-a-chip-systemen de scope van tandheelkundig microfluïdisch onderzoek verder verbreed door gastheer-materiaalinteracties en de cytotoxiciteit van tandheelkundige monomeren onder fysiologisch relevante condities te karakteriseren^27,28.

Hoewel OoC-systemen in toenemende mate worden toegepast in het tandheelkundig, oraal en craniofaciaal onderzoek, blijven voortdurende inspanningen voor de standaardisatie en reproduceerbaarheid van fabricageworkflows van groot belang. In de literatuur zijn verschillende tooth-on-a-chip-modellen beschreven^20,29,30,31, waarin verschillende apparaatconfiguraties en experimentele toepassingen worden aangetoond. Variaties in apparaatarchitectuur, fabricagemethoden, de integratie van dentine en de rapportage van experimentele parameters kunnen echter de reproduceerbaarheid en directe vergelijking tussen studies beperken. In het bijzonder kunnen verschillen in de geometrie van de microkanalen, strategieën voor dentine-integratie en fabricagebenaderingen de biologische en mechanische micro-omgeving binnen het apparaat beïnvloeden. Sommige beschreven modellen bevatten dentine om aspecten van de dentine-pulpa-interface te reproduceren^20,29,30, terwijl andere alternatieve configuraties gebruiken³¹. Bovendien bieden fabricagemethoden zoals fotolithografie, lasersnijden, micromilling en 3D-printen elk specifieke voordelen en beperkingen, afhankelijk van het beoogde ontwerp en de toepassing van het apparaat. Verder is de architecturale oriëntatie van het apparaat een kritieke bepalende factor voor het biologisch nut, specifiek of de kanalen en de dentinesnede in een horizontale of verticale configuratie zijn gerangschikt^19,32. Bij horizontaal gestapelde configuraties vergemakkelijken compartimenten die naast elkaar zijn geplaatst de laterale compartimentering en real-time visualisatie van cellen, waardoor ze bijzonder geschikt zijn voor het modelleren van weefsels met een inherent laterale ruimtelijke organisatie, zoals het parodontale complex^24,32. Dit ontwerp is echter inherent beperkt in zijn vermogen om loodrechte biologische interfaces te recreëren, zoals het biomateriaal-dentine-pulpa-complex, aangezien de laterale rangschikking van compartimenten de in vivo oriëntatie van de dentinebarrière tussen de caviteit en de pulpa niet getrouw repliceert^20,32. Verticaal gestapelde configuraties adresseren deze beperkingen door twee compartimenten langs de y-as over elkaar heen te plaatsen, gescheiden door een native dentinesnede, wat de gelijktijdige kwantificering van moleculair transport door intacte dentine en real-time monitoring van pulpcelresponsen gemeten in het uitstroommedium mogelijk maakt³⁰. Een erkende beperking van deze oriëntatie betreft echter de dwarsdoorsnedebeelding van de dentine-celinterface, aangezien het verkrijgen van dwarsdoorsnedebeelden van de dentine-celinterface binnen hetzelfde brandvlak technisch uitdagender blijft dan in horizontaal gestapelde configuraties, waarbij cellen en extracellulaire matrices lateraal zijn gerangschikt. Hoewel er in de literatuur meerdere modellen van het dentine-pulpa-complex-on-a-chip zijn beschreven, hanteert de meerderheid een horizontaal gestapelde configuratie waarin compartimenten naast elkaar in hetzelfde vlak zijn gerangschikt^10,20,21,29, terwijl er relatief weinig zijn die een native dentinesnede binnen een verticaal gestapelde configuratie hebben geïntegreerd³⁰. Desondanks blijven variaties in fabricagebenaderingen en rapportageparameters tussen deze modellen de reproduceerbaarheid en vergelijkingen tussen studies beperken³³. Het huidige manuscript streeft ernaar de methodologische reproduceerbaarheid te verbeteren door een gedetailleerd fabricageprotocol te bieden voor een verticaal gestapeld tooth-on-a-chip-apparaat, om zo een bredere adoptie van het platform binnen de tandheelkundige onderzoeksgemeenschap te faciliteren.

Dit manuscript beschrijft een stapsgewijs fabricage- en assemblageprotocol voor een verticaal gestapeld dentine-pulpacomplex OoC-apparaat, waarbij een menselijke dentineschijf is geïntegreerd in een microfluïdisch platform van drie lagen polydimethylsiloxaan (PDMS), vervaardigd met behulp van een via fotolithografie geproduceerde mal. Het protocol beschrijft daarnaast het zaaien en kweken van dentale pulpastamcellen binnen het apparaat onder statische condities.

Protocol

De studie is uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en is goedgekeurd door de Ethiekcommissie van de Universidad de La Frontera voor studies met menselijke monsters.

1. Verkrijging van dentineschijfjes

OPMERKING: Bereid het ontwerp van het apparaat voor voordat u met het protocol begint (Figuur 1A–1C).

1. Verzameling en bewaring van tanden
   1. Verzamel gezonde menselijke molaren of premolaren na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming van de patiënt.
   2. Bewaar alle specimens in een 0,5% chloramine-oplossing bij 4°C om dehydratie van het dentine en denaturatie van eiwitten te voorkomen.
   3. Vervang de chloramine-oplossing één keer per week tijdens de bewaring.
2. Bereiding van dentineschijfjes
   1. Zaag elke tand horizontaal door op het middelste derde deel van de kroon met een hogesnelheidsboormachine die werkt op 350.000 rpm en is uitgerust met een cilindrische diamantboor (1 mm diameter; 100–150 µm korrelgrootte).
   2. Voer het zagen uit onder continue waterirrigatie van ongeveer 50 mL/min.
   3. Positioneer de doorsnede op het middelste derde deel van de kroon om de pulpakamer en het glazuur bij de occlusale groeven en fissuren te vermijden, waardoor een schijfje wordt verkregen dat hoofdzakelijk uit dentineweefsel bestaat.
      WAARSCHUWING: Voer het zagen van de tand uit onder continue irrigatie en draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder handschoenen, een masker en een beschermbril.
3. Afwerking van dentineschijfjes
   1. Polijst het dentineschijfje met behulp van afwerkingsschijven met opeenvolgend afnemende korrelgrootte.
   2. Ga door met polijsten tot een uiteindelijke dentinedikte van ongeveer 0,8 mm (±± 0,3 mm) en laterale afmetingen van ongeveer 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) zijn bereikt (Figuur 1D).
4. Bewaring van dentineschijfjes
   1. Bewaar de bereide dentineschijfjes in een 0,5% chloramine-oplossing bij 4°C tot aan de assemblage van het OoC-apparaat.

Figuur 1: Ontwerp en fabricagewerkflow van het dentine-pulpa complex organ-on-a-chip (OoC) apparaat. (A) Driedimensionaal ontwerp van het apparaat waarop de drielaagse architectuur te zien is. (B) Bovenaanzicht van het ontwerp van het apparaat met de belangrijkste afmetingen. (C) Zijaanzicht van de drielaagse configuratie van het apparaat. (D) Representatieve dentineschijf geprepareerd met een geschatte dikte van 0,8 mm en laterale afmetingen van ongeveer 5 mm × 5 mm. (E) Silicium mastermold gefabriceerd door fotolithografie en gebruikt voor het gieten van de bovenste en onderste polydimethylsiloxaan (PDMS) lagen. (F) Verwijdering van een uitgeharde PDMS-laag uit de siliciumvorm na thermische polymerisatie. (G) Plasmabehandeling van het PDMS-oppervlak voorafgaand aan de laagbinding. (H) Definitief drielaags dentine-pulpa complex OoC-apparaat geassembleerd door plasmabinding en inclusief de dentine-interface. (I) Geassembleerd apparaat aangesloten op slangjes voor lektesten en voorbereiding op microfluïdische experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Fabricage van het dentine-pulpa complex OoC-apparaat

1. Voorbereiding van de werkruimte en materialen
   1. Materialen en apparatuur klaarmaken
      1. Bereid alle materialen en apparatuur voor die zijn vermeld in de Tabel met Materialen voordat u begint met de fabricage van het apparaat.
      2. Bereid de biopsietponsjes voor voordat u het apparaat assembleert.
      3. Voer alle fabricageprocedures uit in een schone, stofvrije omgeving.
      4. Draag gedurende de gehele fabricage en assemblage van het apparaat handschoenen, een veiligheidsbril en geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen.
         OPMERKING: Bereid de via fotolithografie geproduceerde mal voor voordat u begint met het protocol (Figuur 1E).
2. Fabricage van de microgestructureerde mal
   1. Voorbereiding van de siliciumwafer
      1. Fabriceer de mal op een 4-inch, enkelzijdig gepolijste siliciumwafer (N-type, As-gedoteerd, CZ-groeimethode, <100> oriëntatie, 500 ±± 25 µm dikte, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, resistiviteit 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Reinig de wafer opeenvolgend in aceton, isopropanol en ultrapuur water gedurende elk 10 min onder ultrasonificatie.
      3. Droog de wafer met perslucht.
      4. Bak de wafer 10 min bij 200°C op een warmteplaat om resterend vocht te verwijderen.
      5. Laat de wafer afkoelen tot kamertemperatuur (RT; 20°C–25°C).
   2. Oppervlakactivering en aanbrengen van de fotoresist
      1. Activeer het oppervlak van de siliciumwafer met een vacuümplasmareiniger die werkt met luchtplasma op niveau 7 gedurende 120 s.
      2. Breng GM 1060 epoxy-gebaseerde negatieve fotoresist aan door spin-coating bij 300 rpm gedurende 10 s.
      3. Zet de spin-coating voort bij 565 rpm gedurende 100 s en bij 965 rpm gedurende 1 s met een versnelling van 200 rpm/s.
      4. Laat de gecoate wafer 10 min rusten.
      5. Voer een pre-bake uit bij 65°C gedurende 10 min.
      6. Zet de pre-bake voort bij 95°C gedurende 1 u.
      7. Laat de wafer afkoelen tot RT.
   3. Belichting en ontwikkeling
      1. Belicht de fotoresist met een direct laserlithographiesysteem bij een dosis van 1.950 mJ/cm².
      2. Voer een post-bake uit bij 65°C gedurende 10 min.
      3. Zet de post-bake voort bij 95°C gedurende 30 min.
      4. Laat de wafer afkoelen tot RT.
      5. Laat de wafer 10 min rusten.
      6. Ontwikkel het patroon in PGMEA gedurende 4 min.
      7. Verleng de ontwikkeling in intervallen van 30 s als er resterende fotoresist aanwezig is.
      8. Stop de ontwikkeling door te spoelen met isopropanol.
      9. Droog de wafer met perslucht.
   4. Hard bake
      1. Voer een hard bake uit bij 135°C gedurende 2 u.
      2. Verkrijg een microgestructureerde mastermal met microkanalen van 1 mm breed en 50 µm hoog.
3. Bereiding en ontgassing van het PDMS-mengsel
   1. Bereiding van het PDMS-mengsel
      1. Meng de PDMS-base en het uithardingsmiddel in een gewichtsverhouding van 10:1.
      2. Roer het mengsel handmatig met een glazen staaf in een plastic bekerglas gedurende ongeveer 5 min.
      3. Houd tijdens het mengen langzame en continue cirkelvormige bewegingen aan.
         OPMERKING: Vermijd het introduceren van luchtbellen tijdens het mengen.
   2. Ontgassing
      1. Plaats het PDMS-mengsel in een vacuümdesiccator die is aangesloten op een vacuümpomp.
      2. Ontgas het mengsel bij ongeveer 700 mmHg gedurende 5 min.
      3. Laat het vacuüm kortstondig los zodat oppervlaktebellen kunnen knappen.
      4. Breng het vacuüm opnieuw aan.
      5. Herhaal de cyclus totdat er geen zichtbare bellen meer overblijven.
         OPMERKING: De totale ontgassingstijd is doorgaans ongeveer 30 min.
4. Gieten van PDMS op de mal
   1. Voorbereiding van de mal
      1. Plaats de mal op een vlak oppervlak.
      2. Reinig de mal met perslucht.
      3. Vermijd direct contact met het gepatroneerde oppervlak.
      4. Controleer of de mal vrij is van stof en verontreinigingen.
   2. Doseren van PDMS
      1. doseer ongeveer 8 g PDMS rond de dentineschijf om de dentine-inbeddingslaag te fabriceren.
      2. Pas de PDMS-hoogte aan zodat deze overeenkomt met de dikte van de dentineschijf (0,8 ±± 0,3 mm).
      3. Voorkom dat PDMS het dentine-oppervlak bedekt.
      4. doseer ongeveer 0,26 g PDMS per maleenheid om elke microkanaallaag te fabriceren.
      5. Tik voorzichtig op de mal of breng trillingen aan om het vullen van de microstructuren te vergemakkelijken.
      6. Laat het PDMS in de kleinste structuren zakken.
      7. Dek de mal af met een deksel of vlakke afdekking zonder het PDMS-oppervlak te raken.
         OPMERKING: De dentine-inbeddingslaag is ongeveer 0,8 mm dik en elke microkanaallaag is ongeveer 0,4 mm dik, wat resulteert in een totale apparaatdikte van ongeveer 1,6 mm.
         OPMERKING: Pas de laagdikte aan op basis van de werkafstand van het confocale objectief wanneer confocale beeldvorming is gepland.
5. Uitharding
   1. Plaats de mallen in een oven bij 50°C.
   2. Hard het PDMS uit gedurende 4 u.
6. Verwijderen van de PDMS-lagen
   1. Verwijderen van uitgehard PDMS
      1. Pel de uitgeharde PDMS-lagen voorzichtig van de mal (Figuur 1F).
      2. Hanteer de PDMS-lagen voorzichtig om beschadiging van de microstructuren te voorkomen.
7. Bonden van de PDMS-lagen en fabricage van inlaat- en uitlaatpoorten
   1. Fabricage van inlaat- en uitlaatpoorten
      1. Maak perforaties op de aangewezen inlaat- en uitlaatlocaties met een 1 mm biopsietpons.
      2. Positioneer de zijde met de microkanalen naar boven tijdens het ponsen.
         OPMERKING: Plaats de PDMS-laag op een snijmat om structurele schade te voorkomen.
      3. Maak twee perforaties in de bovenste laag die overeenkomen met het bovenste microkanaal.
   2. Reinigen van de PDMS-lagen
      1. Reinig de PDMS-lagen met isopropylalcohol of ethanol.
      2. Verwijder resterende stofdeeltjes met steriele plakband.
      3. Controleer of alle bondoppervlakken vrij zijn van verontreinigingen vóór de assemblage.
   3. Plasma-activering van PDMS-oppervlakken
      1. Positioneer de bovenste en middelste PDMS-lagen voor plasmabehandeling (Figuur 1G).
      2. Activeer de oppervlakken met een handbediende coronaplasmabehandelaar die werkt bij ongeveer 25 W met omgevingslucht als werkgas.
      3. Houd een werkafstand van ongeveer 1 mm aan tussen de plasmabron en het PDMS-oppervlak.
         WAARSCHUWING: Voer de plasmabehandeling uit onder geschikte ventilatie en vermijd directe blootstelling aan door plasma gegenereerd ozon.
      4. Activeer het plasmabehandelingsapparaat en laat het 5 s stabiliseren.
      5. Controleer de generatie van een uniforme plasmastraal vóór de behandeling.
      6. Behandel de bovenste PDMS-laag 10 s met een continue heen-en-weergaande beweging van ongeveer 5 mm/s.
      7. Behandel de middelste PDMS-laag 10 s met dezelfde beweging en afstand.
      8. Pas vlak voor het bonden een extra plasmabehandeling van 1 s toe op de bovenste laag.
   4. Bonden van de bovenste en middelste lagen
      1. Lijn het bovenste microkanaal direct na de plasmabehandeling uit met de dentineschijf.
      2. Bond de bovenste en middelste lagen aan elkaar.
      3. Plaats de gebonden assemblage in een oven bij 75°C gedurende 5 min.
      4. Consolideer de verbinding tijdens de incubatie.
         OPMERKING: De dentineschijf en het microkanaal zijn met het blote oog zichtbaar en kunnen zonder aanvullende uitlijningstools worden uitgelijnd.
   5. Fabricage van poorten voor het onderste microkanaal
      1. Pons twee perforaties die overeenkomen met het onderste microkanaal door de gebonden bovenste en middelste lagen.
      2. Voer het ponsen door beide lagen tegelijkertijd uit om de uitlijning te waarborgen.
         OPMERKING: Deze procedure genereert vier perforaties in de bovenste laag en twee perforaties in de middelste laag.
      3. Plaats de gebonden assemblage op een stevige snijmat vóór het ponsen.
      4. Oefen in één beweging een gestage neerwaartse druk uit.
         OPMERKING: Vermijd rotatie- of zijdelingse krachten om het risico op delaminatie te minimaliseren.
      5. Verwijder resten van de perforatieplaatsen met pluisvrij steriel gaas bevochtigd met isopropylalcohol.
      6. Inspecteer de perforaties en omliggende gebonden gebieden onder adequate verlichting.
      7. Controleer op de afwezigheid van delaminatie, scheuren of onvolledige perforaties voordat u verdergaat.
   6. Bonden van de onderste laag
      1. Behandel de onderste laag met plasma zoals beschreven in stap 2.7.4.
      2. Lijn de inlaat- en uitlaatpoorten van het onderste microkanaal uit met de perforaties in de bovenste en middelste lagen.
      3. Bond de onderste laag om de assemblage van het apparaat te voltooien.
         OPMERKING: Markeer de inlaat- en uitlaatlocaties op het externe oppervlak van de onderste laag vóór het bonden om de uitlijning te vergemakkelijken.
         OPMERKING: Plasmakamers kunnen een sterkere verbinding opleveren dan plasmaspuiten, zoals gerapporteerd in de literatuur³⁶.
         OPMERKING: Het voltooide apparaat bestaat uit een drielaags microfluïdisch platform met een dentine-interface (Figuur 1H). Het onderste dentine-oppervlak vertegenwoordigt de pulpzijde van het model, terwijl het bovenste dentine-oppervlak de coronale zijde vertegenwoordigt voor blootstelling aan dentale biomaterialen of bacteriële preparaten.
8. Lektest van het microfluïdische apparaat
   1. Inspectie van het geassembleerde apparaat
      1. Inspecteer het geassembleerde apparaat op uitlijningsfouten.
      2. Inspecteer de assemblage op onvolledige bonding en zichtbare lekkage.
   2. Lektest
      1. Sluit 19G Luer-lock naalden aan op de inlaatpoorten (Figuur 1E).
      2. Sluit de naalden aan op de slangen van de microfluïdische pomp.
      3. Druk de naaldhubs voorzichtig in de geponste poorten voor een luchtdichte pasvorm.
      4. Injecteer steriele PBS of kweekmedium met een stroomsnelheid van 10 µL/min.
      5. Houd de vloeistofstroom gedurende ten minste 5 min aan.
      6. Inspecteer alle gebonden interfaces, kanaalranden en randen van de dentineschijf tijdens de stroming.
      7. Observeer het apparaat onder adequate verlichting tijdens en na de injectie.
      8. Bevestig de afwezigheid van vloeistofophoping, vochtigheid of druppelvorming.
      9. Classificeer het apparaat als lekvrij als er geen lekkage wordt gedetecteerd.
      10. Verwerp apparaten die lekkage vertonen.
          OPMERKING: Voer een lektest uit op elk gefabriceerd apparaat vóór het zaaien van cellen of experimenteel gebruik.
9. Sterilisatie en opslag van het microfluïdische apparaat
   1. Sterilisatie
      1. Stel het bovenoppervlak van het geassembleerde apparaat 30 min bloot aan UV-licht (254 nm) in een laminaire flowkast.
      2. Stel het bottomoppervlak nog eens 30 min bloot aan UV-licht.
      3. Spoel de microkanalen 20 min door met 70% ethanol.
      4. Was de microkanalen drie keer met steriele PBS om resterende ethanol te verwijderen.
   2. Opslag
      1. Gebruik het gesteriliseerde apparaat onmiddellijk voor celkweekexperimenten.
      2. Bewaar het apparaat anders ondergedompeld in steriele PBS bij 4°C in een steriele container tot gebruik.
         ​WAARSCHUWING: Gebruik na assemblage van het apparaat geen chloramine of andere desinfecterende oplossingen, omdat PDMS deze verbindingen kan absorberen en de cellevensvatbaarheid kan in gevaar brengen.

3. Evaluatie van de adhesie en levensvatbaarheid van dentale pulpstamcellen

1. Preconditionering van het dentine-oppervlak
   1. Injecteer 10% EDTA in het apparaat.
   2. Handhaaf het contact tussen de EDTA-oplossing en het dentine-oppervlak gedurende 15 min.
   3. Injecteer elke 3 min 0,5 mL EDTA om de vloeistofbeweging binnen het microkanaal te behouden.
   4. Was de dentineschijf drie keer met ultrapuur water.
   5. Handhaaf elke wasbeurt gedurende 5 min.
      OPMERKING: De EDTA-behandeling verwijdert de smearlaag en legt dentine-matrixeiwitten bloot.
      WAARSCHUWING: Hanteer EDTA-oplossingen met handschoenen en een beschermbril om huid- en oogirritatie te voorkomen.
2. Uitzaaien van stamcellen uit het tandpulpa
   1. Expansie van stamcellen uit het tandpulpa
      1. Zaai stamcellen uit het tandpulpa uit in een T75-fles met een dichtheid van 1 × 10⁶ cellen per fles.
      2. Incubeer de cellen bij 37°C en 5% CO₂ totdat een confluentie van ongeveer 80% is bereikt.
      3. Los de cellen los met trypsine.
      4. Neutraliseer de trypsine met volledig kweekmedium.
      5. Centrifugeer de celsuspensie om een celpellet te verkrijgen.
      6. Beoordeel de celviabiliteit met trypaanblauw.
      7. Gebruik celsuspensies met een viabiliteit ≥90%.
   2. Bereiding van de celsuspensie
      1. Bereid een voorverwarmde celsuspensie bij 37°C.
      2. Stel de celconcentratie in op 100.000 cellen/mL in volledig kweekmedium.
      3. Bereid een finaal suspensievolume van 1–2 mL.
         OPMERKING: In de huidige studie werden cellen in passage 5 gebruikt.
   3. Celuitzaaiing
      1. Injecteer de celsuspensie in de inlaatpoort van het onderste microkanaal.
      2. Keer het apparaat na het uitzaaien van de cellen om
         OPMERKING: Het omkeren van het apparaat bevordert de sedimentatie van de cellen naar het dentine-oppervlak en verbetert de celadhesie.
   4. Incubatie
      1. Plaats het omgekeerde apparaat in een Petrischaal.
      2. Voeg 1 mL kweekmedium toe aan de Petrischaal om verdamping te minimaliseren.
      3. Incubeer het apparaat bij 37°C en 5% CO₂ gedurende 24 u.
      4. Handhaaf statische kweekcondities gedurende de gehele incubatieperiode.
         OPMERKING: Validatie van de dynamische flow is in de huidige studie niet uitgevoerd.
         OPMERKING: Het huidige protocol beschrijft statische kweekcondities voor de initiële validatie van het apparaat en de beoordeling van de celadhesie.
   5. Initiële validatie van het apparaat
      1. Evalueer de celadhesie met behulp van scanning-elektronenmicroscopie.
      2. Verwijder de dentineschijf door het apparaat te demonteren vóór de analyse.
3. Bereiding van monsters voor scanning-elektronenmicroscopie
   1. Verwijderen en wassen van monsters
      1. Demonteer het apparaat na 24 u incubatie.
      2. Verwijder de dentineschijf en breng deze over naar een kweekplaat of Petrischaal.
      3. Positioneer het met cellen bezaaide dentine-oppervlak naar boven gericht.
      4. Was de dentineschijf twee keer met 1 mL PBS.
   2. Fixatie
      1. Voeg 2 mL 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M Sorensen-fosfaatbuffer toe.
      2. Incubeer het monster gedurende 30 min bij RT.
         WAARSCHUWING: Glutaaraldehyde is toxisch en kan irritatie aan de huid, ogen en luchtwegen veroorzaken. Voer fixatieprocedures uit in een chemische zuigkast terwijl u geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen draagt.
   3. Wassen na fixatie
      1. Verwijder de glutaaraldehyde-oplossing.
      2. Was de dentineschijf drie keer met ultrapuur gedestilleerd water bij RT.
   4. SEM-analyse
      1. Analyseer de monsters met een environmental scanning-elektronenmicroscoop.
      2. Bedien de microscoop onder lage-vacuümomstandigheden (25 Pa).
      3. Gebruik een versnellingsspanning van 10,0 kV en een werkafstand van 7,0 mm.
      4. Verwerf beelden met de backscattered electron 3D-detectiemodus (BSE-3D).
      5. Leg beelden vast bij een vergroting van ×200 (Afbeelding 2A).
4. Evaluatie van de celviabiliteit via confocale microscopie
   1. Monsterbereiding
      1. Zaai cellen uit en kweek deze zoals beschreven in Stap 3.2.
      2. Incubeer het apparaat gedurende 24 u bij 37°C en 5% CO₂.
      3. Demonteer het apparaat en leg het dentine-oppervlak bloot.
      4. Breng de dentineschijf over naar een wellplate met voorverwarmde HBSS⁺/+ aangevuld met Ca²⁺ en Mg²⁺.
   2. Wassen van monsters
      1. Was de dentineschijf twee keer met HBSS⁺/⁺.
      2. Verwijder resterend serum en fenolrood vóór de kleuring.
         OPMERKING: Resterend serum en fenolrood kunnen de achtergrondautofluorescentie verhogen.
   3. Kleuring van levende cellen
      1. Bereid een verse Calcein AM-werkoplossing van 2 µM in HBSS⁺/⁺.
      2. Voeg voldoende kleuringsoplossing toe om het dentine-oppervlak volledig te bedekken.
      3. Incubeer het monster gedurende 20 min bij 37°C in het donker.
      4. Verwijder de kleuringsoplossing na incubatie.
   4. Kleuring van dode cellen
      1. Voeg Propidiumjodide-werkoplossing toe (1–2 µg/mL in HBSS⁺/⁺).
      2. Incubeer het monster gedurende 5–8 min bij 37°C in het donker.
      3. Overschrijd de incubatietijd van 10 min niet.
      4. Was het monster twee keer met HBSS⁺/⁺.
      5. Houd het monster ondergedompeld in buffer tot aan de beeldvorming.
   5. Confocale microscopie acquisitie
      1. Verwerf confocale beelden binnen 30 min na kleuring.
      2. Verwerf beelden sequentieel in de groene en rode kanalen.
      3. Gebruik λ_ex 490 nm en λ_em 515 nm voor beeldvorming van levende cellen.
      4. Gebruik λ_ex 535 nm en λ_em 617 nm voor beeldvorming van dode cellen.
         ​OPMERKING: Bescherm fluorescerende kleuringsoplossingen en gekleurde monsters tegen blootstelling aan licht tijdens incubatie- en beeldvormingsprocedures (Afbeelding 2B).

Figuur 2: Representatieve evaluatie van de adhesie en viabiliteit van dentale pulpa-stamcellen binnen het dentine-pulpa complex OoC-apparaat. (A) Scanning elektronenmicroscopie-opname die adherente dentale pulpa-stamcellen (wit asterisk) toont op het dentinoppervlak na 24 u statische cultuur binnen het OoC-apparaat. Na 24 u cultuur bedekten adherente cellen 54,35 ± 0,92% van het dentinoppervlak dat was blootgesteld aan het microkanaal. Er zijn geen cellen waargenomen in het dentine-gebied dat bedekt is door PDMS (zwart asterisk), wat wijst op een effectieve afdichting tussen de apparaatlagen. Schaalbalk = 200 µm. (B) Confocale microscopie-opname die viabele dentale pulpa-stamcellen toont, groen gekleurd en geadhereerd aan het dentinoppervlak (witte pijlen) na 24 u statische cultuur. Niet-viabele cellen, rood gekleurd, zijn ook waargenomen (blauwe pijlen). Schaalbalk = 50 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

De succesvolle fabricage van het tooth-on-a-chip-apparaat volgde de workflow zoals geïllustreerd in Figuur 1A–1I, inclusief de preparatie van de dentineschijf (Figuur 1D), de fabricage van de via fotolithografie verkregen mal (Figuur 1E), het verwijderen van de uitgeharden PDMS-lagen (Figuur 1F), plasma-activatie voorafgaand aan het bondingen (Figuur 1G), de assemblage van het uiteindelijke apparaat (Figuur 1H) en de aansluiting van het apparaat op de microfluïdische opstelling (Figuur 1I). Het resulterende apparaat bestond uit een PDMS-assemblage van drie lagen waarin de dentineschijf volledig was geïntegreerd in de middelste laag, waarbij de bovenste en onderste microkanalen aan weerszijden van het dentine-oppervlak waren gepositioneerd (Figuur 1H).

Een positief resultaat in deze fase werd gekenmerkt door de afwezigheid van zichtbare luchtbellen of delaminatie en door een lekvrije vloeistofstroom na injectie van PBS of cultuurmedium via de inlaatpoorten (Figuur 1I). Een verkeerde uitlijning van de microkanaalpoorten, onvolledige plasmabinding of lekkage bij de interface tussen dentine en PDMS waren indicatief voor een mislukte assemblage en vereisten herhaling van de fabricageprocedure.

In totaal werden 30 apparaten gefabriceerd, waarvan ongeveer 20% faalde tijdens de fabricage of het testen. De defecten waren hoofdzakelijk gerelateerd aan vloeistoflekkage buiten de grenzen van het microkanaal door onvolledige plasmabinding, terwijl een kleiner deel van de mislukkingen het gevolg was van delaminatie in andere regio's van het apparaat. Geen enkele fout werd toegeschreven aan lekkage bij de interface tussen dentine en PDMS of aan een verkeerde uitlijning van de in- en uitlaatpoorten van het microkanaal.

Na 24 u statische kweek werd succesvolle celzaaiing bevestigd door de aanwezigheid van adherente tandpulpmeststamcellen met een fibroblastische morfologie op het dentinoppervlak. Scanning elektronenmicroscopie maakte een beoordeling mogelijk van zowel de celadhesie als de integriteit van het apparaat (Figuur 2A). Met het huidige protocol bedekten adherente cellen na 24 u kweek 54,35 ± 0,92% van het dentinoppervlak dat was blootgesteld aan het microkanaal. Een positief resultaat werd aangetoond door de aanwezigheid van adherente cellen uitsluitend binnen het gebied van het microkanaal, terwijl het dentinoppervlak dat bedekt was met PDMS vrij bleef van celaanhechting (Figuur 2A). Deze ruimtelijke verdeling bevestigde een succesvolle afdichting tussen de lagen van het apparaat en een correcte assemblage van het apparaat. Omgekeerd wees de aanwezigheid van cellen buiten de grenzen van het microkanaal op lekkage en moest dit als een negatief resultaat worden beschouwd.

Confocale microscopie met gebruik van live/dead-kleuring maakte een niet-destructieve beoordeling van de celviabiliteit binnen het apparaat mogelijk. Een succesvol resultaat werd gekenmerkt door een overwicht aan levensvatbare cellen die groene fluorescentie en een fibroblastische morfologie vertoonden, met slechts incidentele niet-levensvatbare cellen die rood waren gekleurd (Figuur 2B). In tegenstelling hiermee zou een hoog aandeel niet-levensvatbare cellen wijzen op een suboptimale dentine-preconditioning, onvoldoende wassen of ongeschikte kweekcondities.

Tijdens de optimalisatie van het protocol werd een initiële fabricatiestrategie geëvalueerd waarbij een vaste mal met een vooraf gedefinieerde uitsparing werd gebruikt om de dentineschijf in de middelste PDMS-laag te positioneren (Figuur 3A). Hoewel deze aanpak bedoeld was om de plaatsing van de schijf te standaardiseren en lekkage bij de interface tussen de schijf en het PDMS te verminderen, bleek dit in de praktijk inefficiënt. Omdat het gebied dat overeenkwam met de uitsparing voor de dentineschijf handmatig uit de uitgeharde PDMS-laag gesneden moest worden, kon een nauwkeurige aansluiting tussen de randen van de schijf en de gesneden PDMS-randen niet betrouwbaar worden bereikt, wat leidde tot interstitiële openingen die in ongeveer 50% van de gefabriceerde apparaten lekkage veroorzaakten (Figuur 3A).

Figuur 3: Representatieve afbeeldingen die mislukte fabricagebenaderingen illustreren, geïdentificeerd tijdens de optimalisatie van het dentine-pulpa complex OoC-apparaat. (A) Siliconen mal met vaste uitsparingen ontworpen voor gestandaardiseerde positionering van de dentineschijf (witte pijlen). Vanwege de inherente variabiliteit in de afmetingen van de dentineschijven als gevolg van handmatige monstervoorbereiding, kon een betrouwbare aanpassing aan de vaste malgeometrie niet worden bereikt, wat leidde tot interfase-openingen en lekkage in ongeveer 50% van de gefabriceerde apparaten. (B) Scanning-elektronenmicroscopie-afbeelding van het dentine-oppervlak na applicatie van een afdichtingsmateriaal op de interface tussen de schijf en PDMS. Blootgesteld dentine (zwart sterretje) en afzettingen van het afdichtingsmateriaal (wit sterretje) zijn aangegeven. Onbedoelde verspreiding van het afdichtingsmateriaal over het dentine-oppervlak belemmerde de celadhesie en verminderde het beschikbare oppervlak voor celkolonisatie. Schaalbalk = 100 µm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om deze beperking aan te pakken, werd een afdichtingsmateriaal aangebracht op de interface tussen de schijf en de PDMS. Deze aanpak introduceerde echter een aanvullend nadeel, aangezien het afdichtingsmateriaal zich verspreidde over het dentine-oppervlak en celadhesie in de bedekte regio's verhinderde, zoals aangetoond door scanning elektronenmicroscopie (Figuur 3B). Deze suboptimale resultaten benadrukten twee kritieke beperkingen van de initiële fabricatiestrategie: een inadequate passing tussen de handmatig uitgesneden PDMS-uitsparing en de dentineschijf, en een verminderde celadhesie geassocieerd met het afdichtingsmateriaal.

Discussie

Deze studie beschrijft een stapsgewijs protocol voor de fabricage van een verticaal gestapeld tooth-on-a-chip-apparaat waarin dentine en stamcellen uit het tandpulpa zijn geïntegreerd, en demonstreert representatieve celadhesie en levensvatbaarheid binnen het apparaat onder statische kweekcondities. Het protocol is ontwikkeld om een reproduceerbare workflow te bieden voor de fabricage en assemblage van een dentine-pulpa-complex OoC-platform, geschikt voor in vitro studies van de dentine-interface. De totstandkoming van een dergelijke workflow is bijzonder belangrijk, omdat onze recente systematische review benadrukte dat het veld van microfluïdische modellen voor het dentine-pulpa-complex zich nog in een opkomende fase bevindt, gekenmerkt door een hoge methodologische heterogeniteit in apparaatarchitectuur en materialen, wat de reproduceerbaarheid en standaardisatie van huidige tooth-on-a-chip-modellen ernstig belemmert³⁴. Door een gedetailleerd en reproduceerbaar protocol te bieden, pakt deze studie deze beperkingen aan en draagt ze bij aan de ontwikkeling van beter gedefinieerde biologische modellen. In de bredere context van OoC-ontwikkeling toegepast op de orale biologie, waren França et al.¹⁵ pioniers in het veld met een microfluïdisch tooth-on-a-chip-model met dentineschijven en odontoblast-achtige cellen, waarmee ze de haalbaarheid demonstreerden van het recreëren van de dentine-pulpa-interface in een dynamische microfluïdische omgeving en het evalueren van de cytotoxische respons op tandheelkundige materialen. Sinds deze baanbrekende bijdrage is er in de literatuur melding gemaakt van een groeiend aantal orale OoC-platforms³⁴, die diverse aspecten van de biologie van tandweefsels, interacties met biomaterialen en orale microbiologie behandelen, waardoor deze benadering is gevestigd als een actief en snel expanderend onderzoeksveld. Het huidige protocol draagt bij aan dit landschap door een gedetailleerde en reproduceerbare fabricageworkflow te bieden voor een verticaal gestapeld tooth-on-a-chip-platform dat toegankelijk is voor onderzoeksgroepen met standaard microfluïdische capaciteiten.

Verschillende stappen in het protocol zijn cruciaal voor de succesvolle fabricage en prestaties van het apparaat. In het bijzonder vereist het gieten van PDMS over de mal een zorgvuldige beheersing om een uniforme laagdikte en een correcte vorming van de microkanalen te verkrijgen. De dikte van de PDMS-lagen moet worden gekozen op basis van de beoogde downstream-applicatie. Zo vereist confocale microscopie voldoende dunne PDMS-lagen om optische visualisatie van cellen die aan het dentine-oppervlak hechten mogelijk te maken. Dunnere lagen kunnen echter moeilijker te hanteren zijn tijdens de fabricage- en assemblageprocedures. Bijgevolg vormt de optimalisatie van de PDMS-dikte een belangrijk evenwicht tussen de toegankelijkheid voor beeldvorming en de praktische hanteerbaarheid tijdens de fabricage van het apparaat. Bovendien was confocale microscopie van intacte apparaten in de huidige studie niet haalbaar omdat de PDMS-laag boven de cellen een dikte van 0,4 mm had, wat de penetratiediepte van de beschikbare confocale microscoop (0,2 mm) overschreed. Als gevolg hiervan werd confocale beeldvorming uitgevoerd na demontage van het apparaat en directe blootstelling van het dentine-oppervlak. Daarnaast was fluorescentiemicroscopie niet toepasbaar in dit apparaat omdat de inherente ondoorzichtigheid van dentine de directe optische visualisatie van cellen die aan het oppervlak hechten, belette.

Deze beperking is bijzonder relevant voor verticaal gestapelde OoC-configuraties, waarbij het microkanaal dat de cellen bevat zich onder de dentineschijf bevindt, waardoor de optische toegang wordt belemmerd door zowel de bovenliggende PDMS-laag als de opaciteit van het dentine zelf. Deze beperking komt niet voor bij horizontaal gestapelde chipontwerpen, waarbij de microkanalen zijdelings naast het dentine lopen in plaats van eronder, waardoor directe optische toegang tot het met cellen gezaaide oppervlak mogelijk is zonder interferentie van dentine-opaciteit of PDMS-dikte. De keuze tussen verticale en horizontale stapelconfiguraties moet daarom niet alleen rekening houden met fluïdische en biologische vereisten, maar ook met de in het laboratorium beschikbare beeldvormingsmodaliteiten. In een OoC-systeem speelt het ontwerp van het device een belangrijke rol en moet de micro-omgeving zo dicht mogelijk bij de in vivo-condities worden gehouden. Net als de meeste weefsels wordt de tand blootgesteld aan mechanische stimuli en vertoont deze anisotroop gedrag³⁵, wat betekent dat de eigenschappen variëren afhankelijk van de richting van de uitgeoefende stimulus. Bovendien bestaan er histologische verschillen tussen het coronale deel van het dentine-pulpcomplex, waar dentine en odontoblasten verticaal zijn gerangschikt, en het laterale deel, waar odontoblasten naast het dentine liggen, met opvallende verschillen in celaantal, organisatie en oriëntatie van de dentinetubuli. Een verticaal gestapeld chipontwerp biedt daarom een getrouwere anatomische weergave van cariëse laesies en restauratieve materialen die het coronale aspect van het dentine-pulpcomplex beïnvloeden.

Precieze plasmabehandeling van het oppervlak is essentieel voor een succesvolle assemblage van het device en blijft een van de belangrijkste uitdagingen bij de chipfabricage³⁶. In deze studie trad delaminatie op bij 20% van de gefabriceerde devices. Dit resultaat is niet onverwacht, aangezien PDMS–PDMS-bonding gerealiseerd met een handmatige plasmapen, zoals gebruikt in de huidige studie, een lagere concentratie reactieve zuurstofsoorten genereert dan vacuümgebaseerde plasmakamersystemen; deze systemen maken zuurstofconcentraties boven atmosferische niveaus mogelijk en produceren daardoor een groter aantal covalente oppervlaktegroepen die beschikbaar zijn voor bonding³⁶. Bijgevolg is de bondingsterkte die met een plasmapen wordt behaald inherent lager en minder reproduceerbaar dan die verkregen met een speciale plasmakamer, wat waarschijnlijk heeft bijgedragen aan de waargenomen delaminatiegraad. Optimalisatie van de integratiestrategie voor dentine vereiste daarnaast meerdere fabricatie-iteraties om een intiem contact tussen de dentineschijf en de middelste PDMS-laag te bereiken, terwijl lekkage tot een minimum werd beperkt. Een initiële aanpak hield in dat er een vooraf gedefinieerde uitsparing in de middelste laag werd gefabriceerd voor de plaatsing van de dentine; handmatige uitsnijding van de uitsparing verhinderde echter een consistente aansluiting tussen de dentineschijf en de PDMS-marges, wat leidde tot lekkage tijdens de injectie van het cultuurmedium en resulteerde in een algeheel fabricatiesuccespercentage van ongeveer 50%.

Vervolgens werd een kunstgebitslijm geëvalueerd om de afdichting bij de interface tussen dentine en PDMS te verbeteren, maar scanningelektronenmicroscopie toonde interferentie met de celadhesie en een verminderde visualisatie van cellen op het dentine-oppervlak aan. Het uiteindelijke protocol werd daarom geoptimaliseerd door de dentine-schijf direct in de mal te plaatsen voordat het PDMS zorgvuldig rond het specimen werd gegoten, waardoor de integratie van de dentine-schijf in het device werd verbeterd en de noodzaak voor aanvullende afdichtingsmaterialen werd verminderd. Deze aanpak elimineerde effectief lekkage bij de interface tussen dentine en PDMS door een nauwsluitend en conform contact te waarborgen tussen de randen van de dentine-schijf en het omringende PDMS, zonder afhankelijk te zijn van secundaire afdichtingsmiddelen die de celadhesie aan het dentine-oppervlak zouden kunnen beïnvloeden. Ook moeten enkele beperkingen van de huidige methode worden overwogen. De fabricage van microfluïdische devices blijft gedeeltelijk afhankelijk van handmatige handelingen, wat variabiliteit tussen devices en operators kan introduceren. Hoewel fotolithografie een hoge precisie en reproduceerbaarheid biedt voor de fabricage van microkanaalgeometrieën, kan het proces gespecialiseerde apparatuur en technische expertise vereisen. Alternatieve fabricagebenaderingen, waaronder driedimensionale printtechnieken, kunnen het prototypen van devices en de toegankelijkheid voor sommige laboratoria vergemakkelijken; factoren zoals printresolutie, resterende monomeren en biocompatibiliteit van materialen vereisen echter zorgvuldige optimalisatie³⁷.

De continue toevoer van medium biedt cellen een stabiele omgeving en beschermt hen tegen de ophoping van afvalstoffen of een calcium/fosfaat-onbalans¹⁶. Diverse studies hebben aangetoond dat schuifspanning veroorzaakt door een constante stroom mechanotransductieprocessen kan simuleren die vergelijkbaar zijn met in vivo signalering, welke sleutelfactoren zijn voor het celgedrag^38,39, wat bijdraagt aan celdifferentiatie en -rijping en significante veranderingen induceert in celmorfologie, genexpressie en functie³⁹. De huidige studie rapporteert de fabricage en initiële validatie van het apparaat, waarbij celadhesie en viabiliteit na 24 h onder statische kweekcondities werden aangetoond; daarom zijn de effecten van dynamische stroming niet geëvalueerd. De implementatie van dynamische stroomcondities vormt een belangrijke weg voor toekomstig onderzoek en zal in volgende onderzoeken worden behandeld. Het huidige protocol biedt een reproduceerbare workflow voor de fabricage van een verticaal gestapeld dentine-pulpa complex OoC-apparaat waarin dentine is geïntegreerd in een driedubbel PDMS-microfluïdisch platform. Potentiële toepassingen van het model omvatten het onderzoek naar interacties tussen dentine en biomaterialen, cellulaire reacties op tandheelkundige materialen en in vitro evaluatie van de dentine-pulpa-interface onder gecontroleerde experimentele condities.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Biologische en chemische materialen
Aceton	ExpertQ	SOLV 8	Reiniging van siliciumwafers
Alpha MEM-kweekmedium	Cytiva	SH30265.02	Kweekmedium voor stamcellen uit dentinepulp
Chloramine (0,5%)	Merck	7080-50-4	Bewaaroplossing voor dentineschijfjes
Stamcellen uit dentinepulp	Niet van toepassing	Niet van toepassing	Primaire celkweek. Zie stappen 3.2.1 en 3.2.2
EDTA (10%)	Winkler	N2222158E	Verwijdering van de smearlaag
Epoxy-gebaseerde negatieve fotoresist	Gersteltec	GM1060	Fabricage van fotolithografische mal
Glutaaraldehyde (2,5%) in 0,1 M Sorensen’s fosfaatbuffer	Sigma-Aldrich	210908-06	SEM-fixatie
Gezonde menselijke tanden (molaren of premolaren)	Niet van toepassing	Niet van toepassing	Menselijk monster
Isopropanol	ExpertQ	SOLV 16	Waferreiniging, stopzetten van ontwikkeling en PDMS-reiniging
LIVE/DEAD Viability Kit	Sigma-Aldrich	451	Fluorescentie-levensvatbaarheidskleuring.
PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing)	Corning	46-013-CM	Wassen en lektesten
PDMS-basis en uithardingsmiddel (polydimethylsiloxaan)	Dow	Sylgard 184	Fabricage van het device
PGMEA	Sigma Aldrich	484431	Ontwikkeling van fotoresist
Trypanblauw	Sigma Aldrich	T8154-100ml	Beoordeling van cellevensvatbaarheid
Trypsine	Corning	25-053-CI	Celdetachement
Ultrazuiver water	Cytiva	SH30529.01	Wasoplossing
Verbruiksartikelen en laboratoriummateriaal
19G spuitnaalden	Vmatic	VCB19050	Verbinding van device met micropomp of spuit
Biopsietpons (diameter: 1 mm)	Harris Unicore	WHAWB100073	Fabricage van in- en uitlaatpoorten
Snijmat	Nicecool	Niet van toepassing	Oppervlaktebescherming tijdens ponsen
Dentale afwerkingsschijven (bijv. Sof-Lex)	3M	Sof-Lex	Polijsten van dentine
Female Luer-naar-gekartelde adapters	Runze Fluidics	RH-M016	Slangverbinding
Mengstokje van glas of plastic	Duran	Niet van toepassing	Mengen van PDMS
Hypodermische spuiten	Cranberry	pc-12246	Celzaaien en lektesten
Pluisvrij steriel gaas	Linderson	Niet van toepassing	Verwijderen van ponsresten
Male Luer-adapters	Runze Fluidics	RH-G016	Slangverbinding
Mengvat	Duran	Niet van toepassing	Bereiding van PDMS
Petrischaal (140 mm × 20 mm)	Deltalab	2000219	Celkweek/incubatie
Polytetrafluoretheleenbasis	CCTVal	Niet van toepassing	Fabricage van tussenlaag van dentine
Siliciumwafer	Jiaozuo Commercial FineWin	Niet van toepassing	Fabricage van mal
Siliconenslang	Runze Fluidics	96421	Fluidische verbinding
T75-fles	Corning	353136	Expansie van stamcellen uit dentinepulp
Wellplate	SPL Life Sciences	30006	Voorbereiding voor confocale kleuring en imaging
Apparatuur en instrumenten
Luchtdroger	METALPLAN	TITAN-040	Drogen van perslucht
Persluchtbron	SCHULZ	CSD-18.1	Reinigen van mal en oppervlak
Confocale microscoop	Olympus	Niet van toepassing	Model: FV1000
Direct laser lithografie systeem	Heidelberg	uPG 101	Belichting van fotoresist
Environmental scanning electron microscope	Hitachi	Niet van toepassing	Model: Quanta 400
Hogesnelheids handstuk	Nakanishi	Niet van toepassing	Model: Pana-max2
Hitteplaat	LabTech	EH20A Plus	Bakken van wafer en fotoresist
Laminaire flowkast	BioBase	BBS8V1708313D	Sterilisatie van device
Microfluidische pomp	New Era	Niet van toepassing	Model: 1002X-ES. Lektesten bij 10 µL/min
Microgestructureerde mal (gefabriceerd via fotolithografie)	CCTVal	Niet van toepassing	Zie stap 2.2 voor specificaties van malfabricage
Oven of incubator	Memmert	UN110	Uitharding van PDMS bij 50°C en consolidatie van verbinding bij 75°C
Vacuümplasmareinigingskamer	Fari Plasma	GD-5	Plasma-activatie van wafer
Hand corona-plasma	Aurora Pro Scientific	APS-CD-20AC	Plasma-activatie van PDMS
Ultrasonicator	Elma Sonic	S 10 (H)	Waferreiniging
Vacuümkamer of desiccator (250 mm)	Winglass	Niet van toepassing	Ontgassen van PDMS
Vacuümpomp	ROCKER	300	Ontgassen van PDMS