Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Om de fabricage en assemblage te beschrijven van een verticaal gestapeld organ-on-a-chip-apparaat van het dentine-pulpa-complex, bestaande uit een menselijke dentineschijf en via fotolithografie vervaardigde microkanalen, gevolgd door het zaaien en kweken van dentinale pulpa-stamcellen.
Conventionele preklinische modellen die in tandheelkundig onderzoek worden gebruikt, waaronder diermodellen en statische celkweken, vertonen belangrijke beperkingen bij het reproduceren van de fysiologische omstandigheden van de dentine-pulpa-interface en het voorspellen van menselijke biologische reacties op tandheelkundige biomaterialen. Organ-on-a-chip (OoC)-technologie biedt een alternatieve benadering door de recreatie van weefselspecifieke micro-omgevingen binnen gecontroleerde microfluïdische systemen mogelijk te maken. Dit manuscript beschrijft een stap-voor-stap protocol voor de fabricage en assemblage van een dentine-pulpa-complex OoC-apparaat, waarbij een menselijke dentineschijf is geïntegreerd in een drie-laags polydimethylsiloxaan (PDMS) microfluïdisch platform. Het protocol omvat de preparatie van de dentineschijf, de fabricage van microgestructureerde mallen middels fotolithografie, het gieten en uitharden van PDMS, plasma-ondersteunde laagbinding, de assemblage van het apparaat, lektesten en het zaaien van tandpulpa-stamcellen onder statische kweekcondities. Kritische fabricageparameters die de prestaties van het apparaat beïnvloeden worden besproken, waaronder de controle van de PDMS-laagdikte, plasmasurfacebehandeling en de integratie van de dentineschijf binnen het apparaat om lekkage te minimaliseren. Celadhesie en levensvatbaarheid binnen het apparaat werden geëvalueerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie en confocale live/dead-kleuring. Representatieve resultaten tonen een succesvolle integratie van de dentineschijf binnen de microfluïdische assemblage, het behoud van lekvrije condities en de adhesie van levensvatbare tandpulpa-stamcellen aan het dentine-oppervlak. Dit protocol biedt een reproduceerbare benadering voor de fabricage van een dentine-pulpa-complex OoC-platform dat toekomstige studies naar cellulaire reacties op tandheelkundige biomaterialen en micro-omgevingsstimuli kan ondersteunen.
Dierproeven zijn al lange tijd instrumenteel geweest bij het verbeteren van het begrip van pathologische en fysiologische processen en hebben een centrale rol gespeeld in de vroege stadia van geneesmiddelenontwikkeling1. In de loop van de 20e eeuw is de menselijke levensverwachting aanzienlijk toegenomen, en hoewel het niet mogelijk is om precies te kwantificeren in welke mate deze verbetering uitsluitend aan dieronderzoek kan worden toegeschreven, wordt algemeen erkend dat veel hedendaagse medische behandelingen zijn ontwikkeld of gevalideerd met behulp van diermodellen2. Opvallende voorbeelden zijn de ontwikkeling van ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en is goedgekeurd door de Ethische Commissie van de Universidad de La Frontera voor studies met menselijke monsters.
1. Verkrijging van dentineschijfjes
OPMERKING: Bereid het ontwerp van het apparaat voor voordat u aan het protocol begint (Figuur 1A–1C).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De succesvolle vervaardiging van het tooth-on-a-chip-apparaat volgde de workflow die wordt geïllustreerd in Figuur 1A–1I, inclusief de bereiding van de dentineschijf (Figuur 1D), de vervaardiging van de via fotolithografie verkregen mal (Figuur 1E), het verwijderen van de uitgeharde PDMS-lagen (Figuur 1F), plasma-activatie voorafgaand aan de hechting (Figuur 1G
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Deze studie beschrijft een stapsgewijs protocol voor de fabricage van een verticaal gestapeld tooth-on-a-chip-apparaat waarin dentine en stamcellen uit het tandpulpa zijn geïntegreerd, en demonstreert representatieve celadhesie en levensvatbaarheid binnen het apparaat onder statische kweekcondities. Het protocol is ontwikkeld om een reproduceerbare workflow te bieden voor de fabricage en assemblage van een dentine-pulpa-complex OoC-platform, geschikt voor in vitro studies van de dentine-interface. De totstandkoming van e.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs verklaren dat er geen concurrerende financiële belangen zijn en dat er geen belangenverstrengelingen zijn om te openbaren.
Dit werk werd ondersteund door Project DIM24-0004 en Project PP24-0031, Dirección de Investigación, Universidad de La Frontera; FONDECYT Regular No. 1260116; en FONDECYT de Iniciación No. 11230701, National Agency for Research and Development (ANID), Chili.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Biologische en chemische materialen | |||
| Aceton | ExpertQ | SOLV 8 | Reiniging van siliciumwafers |
| Alpha MEM-kweekmedium | Cytiva | SH30265.02 | Kweekmedium voor stamcellen uit dentinepulp |
| Chloramine (0,5%) | Merck | 7080-50-4 | Bewaaroplossing voor dentineschijfjes |
| Stamcellen uit dentinepulp | Niet van toepassing | Niet van toepassing | Primaire celkweek. Zie stappen 3.2.1 en 3.2.2 |
| EDTA (10%) | Winkler | N2222158E | Verwijdering van de smearlaag |
| Epoxy-gebaseerde negatieve fotoresist | Gersteltec | GM1060 | Fabricage van fotolithografische mal |
| Glutaaraldehyde (2,5%) in 0,1 M Sorensen’s fosfaatbuffer | Sigma-Aldrich | 210908-06 | SEM-fixatie |
| Gezonde menselijke tanden (molaren of premolaren) | Niet van toepassing | Niet van toepassing | Menselijk monster |
| Isopropanol | ExpertQ | SOLV 16 | Waferreiniging, stopzetten van ontwikkeling en PDMS-reiniging |
| LIVE/DEAD Viability Kit | Sigma-Aldrich | 451 | Fluorescentie-levensvatbaarheidskleuring. |
| PBS (fosfaatgebufferde zoutoplossing) | Corning | 46-013-CM | Wassen en lektesten |
| PDMS-basis en uithardingsmiddel (polydimethylsiloxaan) | Dow | Sylgard 184 | Fabricage van het device |
| PGMEA | Sigma Aldrich | 484431 | Ontwikkeling van fotoresist |
| Trypanblauw | Sigma Aldrich | T8154-100ml | Beoordeling van cellevensvatbaarheid |
| Trypsine | Corning | 25-053-CI | Celdetachement |
| Ultrazuiver water | Cytiva | SH30529.01 | Wasoplossing |
| Verbruiksartikelen en laboratoriummateriaal | |||
| 19G spuitnaalden | Vmatic | VCB19050 | Verbinding van device met micropomp of spuit |
| Biopsietpons (diameter: 1 mm) | Harris Unicore | WHAWB100073 | Fabricage van in- en uitlaatpoorten |
| Snijmat | Nicecool | Niet van toepassing | Oppervlaktebescherming tijdens ponsen |
| Dentale afwerkingsschijven (bijv. Sof-Lex) | 3M | Sof-Lex | Polijsten van dentine |
| Female Luer-naar-gekartelde adapters | Runze Fluidics | RH-M016 | Slangverbinding |
| Mengstokje van glas of plastic | Duran | Niet van toepassing | Mengen van PDMS |
| Hypodermische spuiten | Cranberry | pc-12246 | Celzaaien en lektesten |
| Pluisvrij steriel gaas | Linderson | Niet van toepassing | Verwijderen van ponsresten |
| Male Luer-adapters | Runze Fluidics | RH-G016 | Slangverbinding |
| Mengvat | Duran | Niet van toepassing | Bereiding van PDMS |
| Petrischaal (140 mm × 20 mm) | Deltalab | 2000219 | Celkweek/incubatie |
| Polytetrafluoretheleenbasis | CCTVal | Niet van toepassing | Fabricage van tussenlaag van dentine |
| Siliciumwafer | Jiaozuo Commercial FineWin | Niet van toepassing | Fabricage van mal |
| Siliconenslang | Runze Fluidics | 96421 | Fluidische verbinding |
| T75-fles | Corning | 353136 | Expansie van stamcellen uit dentinepulp |
| Wellplate | SPL Life Sciences | 30006 | Voorbereiding voor confocale kleuring en imaging |
| Apparatuur en instrumenten | |||
| Luchtdroger | METALPLAN | TITAN-040 | Drogen van perslucht |
| Persluchtbron | SCHULZ | CSD-18.1 | Reinigen van mal en oppervlak |
| Confocale microscoop | Olympus | Niet van toepassing | Model: FV1000 |
| Direct laser lithografie systeem | Heidelberg | uPG 101 | Belichting van fotoresist |
| Environmental scanning electron microscope | Hitachi | Niet van toepassing | Model: Quanta 400 |
| Hogesnelheids handstuk | Nakanishi | Niet van toepassing | Model: Pana-max2 |
| Hitteplaat | LabTech | EH20A Plus | Bakken van wafer en fotoresist |
| Laminaire flowkast | BioBase | BBS8V1708313D | Sterilisatie van device |
| Microfluidische pomp | New Era | Niet van toepassing | Model: 1002X-ES. Lektesten bij 10 µL/min |
| Microgestructureerde mal (gefabriceerd via fotolithografie) | CCTVal | Niet van toepassing | Zie stap 2.2 voor specificaties van malfabricage |
| Oven of incubator | Memmert | UN110 | Uitharding van PDMS bij 50°C en consolidatie van verbinding bij 75°C |
| Vacuümplasmareinigingskamer | Fari Plasma | GD-5 | Plasma-activatie van wafer |
| Hand corona-plasma | Aurora Pro Scientific | APS-CD-20AC | Plasma-activatie van PDMS |
| Ultrasonicator | Elma Sonic | S 10 (H) | Waferreiniging |
| Vacuümkamer of desiccator (250 mm) | Winglass | Niet van toepassing | Ontgassen van PDMS |
| Vacuümpomp | ROCKER | 300 | Ontgassen van PDMS |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar