Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
Deze studie integreert netwerkfarmacologie, moleculaire docking en simulatie van moleculaire dynamica (MD) om kerncomponenten en therapeutische doelen van Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD) bij autismespectrumstoornis (ASS) te verduidelijken, belangrijke bindingsresiduen te identificeren via alaninescanning en de effecten te valideren in een door valproïnezuur geïnduceerd ASD-rattenmodel.
Autismespectrumstoornis (ASS) is een complexe neuro-ontwikkelingsstoornis, en de pathogenese ervan is nauw verbonden met chronische neuro-inflammatie. Als klassieke traditionele Chinese geneeskundeformule (TCM) wordt Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD) gebruikt voor neuro-ontwikkelings- en geheugenstoornissen vanwege de gerapporteerde neuroprotectieve effecten, maar het specifieke moleculaire mechanisme bij ASS blijft onduidelijk. Deze studie integreert netwerkfarmacologie, moleculaire dockinganalyse en MD-simulatie om systematisch de kernactieve componenten en kandidaat-therapeutische doelen van KSZZD voor ASS op zowel systemisch als atomair niveau te verduidelijken. Vervolgens worden belangrijke bindingsresiduen geïdentificeerd door alanine-flexibele scanning, en worden de biologische effecten beoordeeld met behulp van een door valproïnezuur (VPA) geïnduceerd ASD-ratmodel. Netwerkfarmacologische analyse toonde aan dat quercetine, een sleutelcomponent in KSZZD, deels kan werken door het reguleren van de door TNF-α gemedieerde ontstekingssignaleringsroute. Moleculaire koppelingsresultaten toonden aan dat de bindingsenergieën van de kerncomponenten van KSZZD aan hun doelwitten allemaal lager waren dan -5,0 kcal/mol, waarbij quercetine de sterkste bindingsaffiniteit met TNF vertoonde (-8,52 kcal/mol). MD-simulatie suggereerde dat quercetine stabiele binding aan de actieve pocket van TNF-α kon behouden, en alaninescanning identificeerde verder GLU104 en GLN102 als belangrijke aminozuurresiduen voor het behouden van de structurele stabiliteit van het complex. In vivo-experimenten toonden aan dat quercetine-interventie het locomotorische en exploratieve gedrag bij door VPA geïnduceerde ASS-ratten significant verbeterde, en effectief het expressieniveau van TNF-α in serum en hersenweefsel verlaagde. Deze bevindingen suggereren dat quercetine kan bijdragen aan de voorspelde effecten van KSZZD, althans gedeeltelijk, door het remmen van de TNF-α signaalroute.
Autismespectrumstoornis (ASS) is een complexe neuro-ontwikkelingsstoornis die wordt gekenmerkt door verminderde sociale communicatie, beperkte interesses en herhalend stereotiep gedrag1. Het pathologische mechanisme van ASS is zeer complex en omvat de wisselwerking van genetische variaties, epigenetische regulatie en omgevingsfactoren, wat uiteindelijk leidt tot verminderde synaptische plasticiteit en abnormale neurale circuitconnectiviteit 2,3. Chronische ontsteking in het centrale zenuwstelsel (CZS) speelt een centrale rol in de pathogenese van ASS, en interventies gericht op neuro-ontsteking zijn naar voren gekomen als veelbelovende therapeutische strategieën.
Kongsheng Zhenzhong Dan (KSZZD), een klassieke TCM-formule, werd voor het eerst opgenomen in Essential Prescriptions Worth a Thousand Gold for Emergencies. Het bestaat uit vier medicinale kruiden: Schildpadcarapax, Os Draconis, Polygalae Radix en Acori Tatarinowii Rhizoma. KSZZD wordt traditioneel gebruikt om het hart en de nier te versterken, de geest te kalmeren en de geest te stabiliseren. Klinisch wordt het vaak gebruikt om intellectuele ontwikkelingsachterstand en geheugenstoornissen te behandelen4. Moderne farmacologische studies suggereren dat KSZZD en de actieve componenten neuroprotectieve, ontstekingsremmende en antioxidante effecten uitoefenen, en mogelijk leren – geheugen en angstachtig gedrag in modellen5 van neuro-ontwikkelingsstoornissen kunnen verbeteren. Onze fytochemische analyse toonde aan dat quercetine en andere flavonoïden de belangrijkste actieve componenten van deze formule zijn, die de bloed-hersenbarrière kunnen doordringen en een significante ontstekingsremmende activiteit kunnen vertonen6. Het mechanisme waarmee deze actieve componenten de therapeutische effecten van KSZZD bij ASS bemiddelen, is echter nog slecht begrepen.
Met de snelle ontwikkeling van computationele biologie hebben technieken zoals netwerkfarmacologie, moleculaire docking, simulatie van moleculaire dynamica en quantumchemie-berekening krachtige hulpmiddelen geboden om de interacties tussen actieve componenten van de traditionele Chinese geneeskunde en ziektedoelen op atomair niveaute verduidelijken 7,8,9,10,11 . Door heterogene databronnen te integreren, maakt netwerkfarmacologie de constructie mogelijk van een complex, interactief "component-doel-pathway" netwerk vanuit systeembiologisch perspectief, waarmee voorlopige belangrijke biologische knooppunten worden geïdentificeerd voor interventie in de traditionele Chinese geneeskunde bij ziekten.
Op basis hiervan kan moleculaire koppeling verder worden gebruikt om de geometrische matching en energiepassing tussen componenten en doeleiwitten te simuleren, en hun bindingsmodi en potentiële activiteiten te voorspellen. Vervolgens wordt een moleculaire dynamica (MD) simulatie uitgevoerd om de structurele fluctuatie en bindingsstabiliteit van het complex onder waterige en fysiologische omstandigheden te onderzoeken. In combinatie met alaninescanning wordt site-directed mutagenese-simulatie toegepast om de kern-hotspotresiduen die verantwoordelijk zijn voor het behouden van bindingsaffiniteit nauwkeurig te lokaliseren en om het bijdragegewicht van de farmacofore op aminozuurniveau te verduidelijken. Ten slotte kan verificatie op basis van goed ontworpen farmacologische experimenten effectief het moleculaire mechanisme onthullen achter de therapeutische effecten van traditionele Chinese geneeskundeverbindingen op specifieke ziekten.
Daarom is deze studie in eerste instantie bedoeld om de kerncomponenten en doelwitten van KSZZD te screenen bij de behandeling van ASS via netwerkfarmacologie. Vervolgens zal, gecombineerd met moleculaire koppeling, simulatie van moleculaire dynamica en alanine-flexibele scanning, de "hot-spot residuen" die complexe stabiliteit behouden worden geïdentificeerd, en zal het dynamische interactiepatroon tussen quercetine en TNF-α worden geëvalueerd. Ten slotte zullen de computationele resultaten experimenteel worden geverifieerd in een door VPA geïnduceerd ASD-rattenmodel met behulp van beoordelingen van diergedrag, hersenhistopathologie en ontstekingsfactorexpressieniveaus. Deze studie heeft als doel mogelijke mechanismen te onderzoeken waarmee KSZZD-afgeleide componenten autisme-gerelateerde ontstekingsroutes vanuit een multischaal perspectief kunnen beïnvloeden, en zo een basis biedt voor verder onderzoek naar traditionele Chinese geneeskundeinterventies bij neuro-ontwikkelingsstoornissen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Netwerkfarmacologieanalyse
"Autisme" werd als trefwoord gebruikt om in de GeneCards-database (https://www.genecards.org/) te zoeken naar autisme-gerelateerde doelen 12,13,14. Doelen die uit de databases werden gehaald, werden samengevoegd nadat dubbele vermeldingen waren verwijderd. Bekende doelen van actieve componenten die niet door databasevoorspellingen worden vastgelegd, werden aangevuld op basis van literatuurrapporten15. De ziektedoelen en potentiële doelwitten van geneesmiddelcomponenten werden uniform gestandaardiseerd naar gensymbolen met behulp van de UniProt-eiwitdatabase (https://www.uniprot.org/), en deze twee doelsets werden in kaart gebracht om de potentiële therapeutische doelen van KSZZD voor autisme16 te identificeren.
Op basis van de Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP, http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php) werden de potentiële bioactieve verbindingen in KSZZD en hun bijbehorende doelwitten gescreend volgens de criteria van orale biobeschikbaarheid (OB ≥ 0,30) en geneesmiddelgelijkheidsindex (DL ≥ 0,18)17. De SMILES-identificaties van de verbindingen werden opgehaald uit de PubChem-database (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/), en Swiss Target Prediction (http://swisstargetprediction.ch/) werd verder gebruikt om de potentiële doelen te onderzoeken die niet in het TCMSP-platform18 waren opgenomen. Vervolgens werd de HERB-database (http://herb.ac.cn) gebruikt voor aanvullende screening volgens de Lipinski's Regel van Vijf, met de volgende criteria: molecuulgewicht (MW ≤ 500 Da), octanol-water partitiecoëfficiënt (AlogP ≤ 5), aantal waterstofbindingsdonoren (Hdon ≤ 5), aantal waterstofbindingsacceptoren (Hacc ≤ 10) en aantal roteerbare bindingen (RBN ≤ 10). Vervolgens werd de doelscreening uitgevoerd met behulp van de BATMAN-TCM database (http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/) met de volgende criteria: scoregrens (≥0,84), drugsscore (≥0,10) en P-waarde (≤0,05). Ten slotte werd de UniProt-database (https://www.uniprot.org) gebruikt om de geselecteerde doelnamen om te zetten in standaard gensymbolen.
De overlappende doelwitten tussen de drugsdoelwitten en autismedoelwitten werden geïdentificeerd met behulp van de online Draw Venn Diagram-tool (http://bioinformatics.psb.ugent.be). Deze overlappende doelen werden geïmporteerd in de STRING-database (https://string-db.org/) om een eiwit-eiwitinteractie (PPI) netwerk19 te construeren. De soort werd ingesteld op Homo sapiens, en eiwit-eiwitinteracties met betrouwbaarheidsscores onder 0,40 werden eruit gefilterd. Het resulterende netwerk werd geïmporteerd in Cytoscape 3.10.0-software voor visuele analyse16, waarbij geneesmiddelen, verbindingen en doelwitten respectievelijk werden weergegeven door rode diamanten, blauwe cirkels en groene driehoeken, en de randgewichten de graadcentraliteit van de knooppunten weerspiegelden. De CytoNCA-plugin werd vervolgens gebruikt om gradencentraliteitswaarden te berekenen, de kernverbindingen te rangschikken en de belangrijkste kernverbindingen te identificeren. Bio-informatica verrijkingsanalyse van de doelgenen werd uitgevoerd met behulp van het Metascape-platform20, inclusief GO-analyse (biologisch proces, BP; moleculaire functie, MF; cellulaire component, CC) en KEGG-routeanalyse.
Moleculaire koppeling
De hierboven geïdentificeerde autisme-gerelateerde receptoreiwitten werden voorbewerkt vóór het docken door ontbrekende residuen te herstellen, de protonatietoestand te optimaliseren en kristalwatermoleculen te verwijderen om de structurele integriteit van de receptoren te behouden. De semi-flexibele koppelmethode in de CDOCKER-module21 werd toen toegepast. Residuen binnen 10 Å van de cokristalligand werden gedefinieerd als de actieve pocket, en de binding tussen ligand en receptor werd in dit gebied gesimuleerd.
Koppelingsresultaten werden beoordeeld met CDOCKER Interaction Energy als belangrijkste index, waarbij lagere energiewaarden duiden op een stabielere voorspelde binding tussen ligand en receptor. De betrouwbaarheid van de koppelingsmodus werd geëvalueerd door de ruimtelijke bindingsconformatie van het kerncomponent te vergelijken met die van de co-kristal ligand in de actieve pocket. Het complex met de optimale bindingsenergie en sterkste interactie werd geselecteerd als de initiële conformatie voor de daaropvolgende moleculaire dynamica-simulatie.
Moleculaire dynamica-simulatie
Op basis van de bevindingen van moleculaire koppeling werd een moleculaire dynamica-simulatie uitgevoerd om het bindingsmechanisme tussen het quercetinecomplex en TNF-α te onderzoeken. Deze benadering simuleert moleculaire beweging en interacties op atomair niveau en analyseert dynamische veranderingen in eiwitten, liganden en de omringende omgeving, waardoor informatie wordt geleverd over moleculaire conformationele verandering, bindingsstabiliteit en eiwit-liganddynamiek. Het receptor-ligandencomplex werd gesolveerd met behulp van het TIP3P-watermodel, met een bufferafstand van minstens 12 Å tussen het complex en de systeemgrens om volledige solvatie te waarborgen en randeffecten te verminderen. De ionische concentratie werd ingesteld op 0,154 M, en Na⁺- en Cl⁻-ionen werden toegevoegd om de systeemlading te neutraliseren. Om de nauwkeurigheid van de simulatie te verbeteren, werd het Amber14SB-eiwitkrachtveld22 toegepast, dat effectief niet-gebonden intermoleculaire interacties en bindingsmodi beschrijft en bijzonder geschikt is voor eiwit-ligandencomplexstudies23.
Voor initiële energieminimalisatie werd de steilste dalingsmethode uitgevoerd over 5000 stappen om onredelijke contacten en hoog-energetische conformaties te verwijderen, waarbij een convergentiedrempel van 10 kJ/mol/nm werd gebruikt om ontspanning van de krachtveldparameters te waarborgen. De geconjugeerde gradiëntmethode werd vervolgens 2.000 stappen uitgevoerd om de thermodynamische toestand verder te optimaliseren en systeemstabiliteitte waarborgen.
Tijdens de evenwicht werd NVT-ensemblesimulatie voor het eerst uitgevoerd voor 100 ps met een tijdstap van 2 fs. Het systeem werd geleidelijk verhit tot 300 K om de invloed van de oorspronkelijke structuur te verminderen en thermodynamisch evenwicht te bereiken. Het ensemble werd vervolgens omgezet op NPT, en er werd een extra equilibratie van 100 ps uitgevoerd bij een constante druk van 1 bar om dichtheid en druk te stabiliseren. Deze fase werd gebruikt om het systeem naar een stabiele thermodynamische toestand te brengen vóór productiesimulatie25. De formele moleculaire dynamica-simulatie werd uitgevoerd voor 20 ns, met een temperatuur op 300 K, druk op 1 bar en een tijdstap van 2 fs. De baan werd elke 10 ps opgeslagen. Om de stabiliteit en nauwkeurigheid van de simulatie te waarborgen, werden fysieke parameters, waaronder temperatuur, druk en volume, regelmatig gecontroleerd om te bevestigen dat ze binnen de verwachte bereiken bleven.
Alanine flexibele scanning
Op basis van de stabiele conformatie verkregen uit moleculaire dynamica-simulatie werd alaninescanning uitgevoerd op alle aminozuurresiduen binnen een straal van 3 Å van het ligandbindende grensvlak. In deze procedure worden doelresiduen systematisch vervangen door alanine, waardoor de zijketen wordt afgekapt, terwijl de hoofdketenconformiteit behouden blijft en zijketen-gemedieerde specifieke interacties worden verwijderd. Het bijdragegewicht van elk residu aan bindingsaffiniteit werd gekwantificeerd door de verandering in bindingsvrije energie tussen het wildtype- en mutantcomplex te berekenen. In tegenstelling tot traditionele statische modellen introduceerde deze studie een zijketting-flexibel relaxatiemechanisme, waardoor de omgeving rond de mutatieplaats structurele relaxatie kon ondergaan en de dynamische respons van de bindingsinterface realistischer kon simuleren. Deze analyse was bedoeld om kandidaat-hotspotresiduen te identificeren die complexe stabiliteit behouden, en zo een energetische vingerafdruk bieden voor het optimaliseren van leadverbindingen gericht op autisme-gerelateerde eiwitten.
Dierproeven
Proefdieren
Gezonde SPF-klasse Sprague-Dawley (SD) ratten (drie mannetjes en drie vrouwtjes van 3 maanden), geboren en grootgebracht onder identieke omstandigheden, werden geselecteerd. De kamertemperatuur werd geregeld op 18–22 °C, de relatieve luchtvochtigheid bleef gehandhaafd op 60%–70%, en de lichtcyclus was 12 uur: 12 uur (licht: donker). Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Ethics Committee voor Experimentele Dieren van het First People's Hospital of Zunyi (Goedkeuringsnr.: LunShen (2025)-2-362).
Paring van dieren, zwangerschapsidentificatie en groepering
Alle ratten werden adaptief gevoerd in een SPF-omgeving gedurende 1 week na aankoop. Elke middag om 18:00 uur zaten een vrouwelijke rat en één mannelijke rat samen opgesloten. De vaginale plug-onderzoek werd de volgende ochtend om 8:00 uur uitgevoerd (12 uur na de caging). De aanwezigheid van een vaginale plug werd beschouwd als een succesvolle paring en dezelfde dag werd aangeduid als zwangerschapsdag 0,5 (GD0,5). Drachtige ratten werden individueel in aparte kooien gehouden. Het lichaamsgewicht van zwangere ratten werd dagelijks gemeten en geregistreerd. Het lichaamsgewicht van zwangere ratten nam continu toe, met een gemiddelde dagelijkse toename van 2–5 g, en het totale lichaamsgewicht kon met ongeveer 30% toenemen vóór de bevalling. Na ongeveer 10 dagen zwangerschap was een typische peervormige asymmetrische uitstulping van de buik zichtbaar, en waren harde massa's foetussen voelbaar door palpatie, wat werd onderscheiden van de uniforme en zachte buikomtrek veroorzaakt door obesitas.
Modelopbouw en groepsopstelling:
Voor de modelgroep werden twee zwangere ratten willekeurig geselecteerd en intraperitoneaal geïnjecteerd met VPA-oplossing (600 mg/kg) op de zwangerschapsdag 12,5 (GD12,5). VPA werd toegediend via een enkele intraperitoneale injectie in een dosis van 600 mg/kg op de zwangerschapsdag 12,5. Dit regime werd geselecteerd op basis van het baanbrekende werk van Schneider en Przewłocki26, die vaststelden dat VPA-blootstelling op dit specifieke zwangerschapsmoment zowel de neuroanatomische als gedragskenmerken van menselijke ASS herhaalt. Dit protocol is sindsdien het standaardmodel geworden en is consequent gevalideerd in recente farmacologische studies met identieke parameters27. Voor de blanke controlegroep werd één zwangere rat geselecteerd en intraperitoneaal geïnjecteerd met een gelijk volume van 0,9% normale zoutoplossing op hetzelfde tijdstip. Drachtige ratten werden natuurlijk geboren, en de geboortedag van het nageslacht werd geregistreerd als postnatale dag 0 (PND0). Alle nakomelingen werden op PND21 gespent en apart gehuisvest op basis van geslacht.
Nakomelingen groeperen en interventie
Op PND28 werden 12 mannelijke pups willekeurig geselecteerd uit de nakomelingen van door VPA blootgestelde zwangere ratten (6 in de modelgroep en 6 in de quercetine-interventiegroep), en 6 mannelijke pups werden willekeurig geselecteerd uit de nakomelingen van normale met zoutoplossing blootgestelde zwangere ratten (6 in de blanco groep). Er werd ervoor gezorgd dat er geen significant verschil in lichaamsgewicht was tussen de jongen van elke groep. Nakomelingen geboren van zwangere ratten die met normale zoutoplossing werden behandeld, werden toegewezen aan de blanke groep, degenen geboren uit zwangere ratten met VPA aan de modelgroep, en degenen geboren uit zwangere ratten met VPA aan de quercetine-interventiegroep.
Er werd een continue interventie uitgevoerd gedurende 4 weken, beginnend vanaf PND28. Voor de quercetine-interventiegroep werd quercetine-suspensie intragastrisch toegediend op een vast tijdstip elke dag met een dosis van 100 mg/kg/dag. Deze dosering werd geselecteerd op basis van het volgende geïntegreerde bewijs: (i) een eerdere dosis-intervalstudie identificeerde 100 mg/kg als de optimale dosis om angstachtig gedrag te verlichten en pro-inflammatoire cytokines te verminderen in een door LPS geïnduceerde neuro-inflammatie ratmodel 28; (ii) quercetine bij 50 mg/kg is aangetoond sociale interactietekorten en oxidatieve hersenschade te voorkomen bij een prenatale VPA-geïnduceerde autisme rat, model29; en (iii) orale quercetine is onlangs aangetoond dat het TNF-α in de hersenen verlaagt en autistisch gedrag verzacht in een door propionzuur veroorzaakt autisme rat model30. Gezamenlijk ondersteunen deze onafhankelijke validaties de selectie van 100 mg/kg om robuuste betrokkenheid van het TNF-α-gemedieerde ontstekingspad in het huidige postnatale VPA-geïnduceerde ASS-model te waarborgen. Voor de blanke en modelgroepen werd elke dag een gelijke hoeveelheid 0,5% CMC-Na normale zoutoplossing intragastrisch toegediend. Alle dieren hadden tijdens de interventieperiode vrije toegang tot voedsel en water, en hun lichaamsgewicht werd wekelijks gemeten om het toedieningsvolume aan te passen aan hun lichaamsgewicht.
Open veldtest
Na 4 weken interventie (ongeveer PND56) werd de open veldtest uitgevoerd om spontane activiteit en angstniveaus te evalueren. De open veldtest (OFT) is een klassiek gedragsexperiment om angstgerelateerd gedrag bij proefdieren te evalueren. De gemeten indicatoren waren het spontane bewegingsvermogen van ratten in een open omgeving en de tijd die ze in het midden van het open veld doorbrachten. Het OFT-apparaat voor ratten was 30 cm hoog, 50 cm lang en 50 cm breed aan de onderkant, met witte binnenmuren, en was kunstmatig verdeeld in 16 kleine roosters, waaronder 4 roosters in het binnenste gebied en 12 roosters in het buitenste gebied. De experimentele locatie werd stil gehouden om geluidsstimulatie te voorkomen die de nauwkeurigheid van de experimentele resultaten kon beïnvloeden. Elke rat werd in het midden van de bodem van de doos geplaatst, en video-opname en timing werden gelijktijdig uitgevoerd. Het cameraveld besloeg het gehele open veld en registreerde de spontane beweging van de ratten en het aantal overgangen tussen rasters. Elke test duurde 5 minuten, waarna de video-opname werd gestopt. De binnenwand en onderkant van de open doos werden met 75% alcohol afgeveegd om te voorkomen dat uitwerpselen en lichaamsgeur van het ene dier de testresultaten van het volgende dier zouden beïnvloeden. De operatie werd herhaald nadat de ratten waren vervangen totdat alle ratten de test hadden voltooid.
Pathologische detectiemethode
Na fixatie met 4% paraformaldehyde werd het hersenweefsel onderworpen aan gradiëntdehydratie met een volledig automatische dehydrator: 75% ethanol voor 2 uur, 85% ethanol voor 1 uur, 95% ethanol voor 1 uur en absolute ethanol I-IV voor elk 20 minuten. De weefsels werden vervolgens 25 minuten verwijderd met reinigingsmiddel I en 30 minuten met reinigingsmiddel II, gevolgd door paraffine-inbedding. Secties met een dikte van 5 μm werden met ontwassoplossing I en II voor elk 30 minuten gedewaxed en vervolgens gerehydrateerd met gradient ethanol. De secties werden 5–10 minuten gekleurd met hematoxyline, 3 seconden gedifferentieerd met zoutzuuralcohol en gekleurd met alkalisch water om blauw te kleuren. Daarna werden ze 3 minuten tegengekleurd met alcohol-oplosbare eosine, gedehydrateerd met gradiëntethanol, gezuiverd, bedekt met een neutrale montagelaag en onder een microscoop bekeken.
Detectie van TNF-α niveaus in serum en hersenweefsel
Na de laatste toediening werd abdominaal aortabloed van ratten verzameld en 15 minuten gecentrifugeerd bij 3.000 r/min bij 4 °C, waarna het serumsupernatant werd verzameld. Ondertussen werden hippocampale en corticale weefsels ontleed en werd voorgekoeld PBS toegevoegd in een verhouding van 1:9 voor mechanische homogenisatie. Het homogenaat werd vervolgens 20 minuten gecentrifugeerd op 12.000 r/min bij 4 °C om het supernatant op te vangen. De BCA-methode werd gebruikt voor de kwantificatie van weefselproteïnen. Volgens de instructies van de ELISA-kit werden de te testen monsters en biotinyleerde antilichamen sequenties aan de microplaat toegevoegd. Na incubatie en wassen werd het avidin-peroxidasecomplex toegevoegd en geïncubeerd. Na een andere wash werd substraatoplossing toegevoegd voor kleurontwikkeling, de reactie werd beëindigd met stopoplossing en werd de absorptie gemeten op 450 nm met een microplaatlezer. De concentraties TNF-α in serum (pg/mL) en hersenweefsel (pg/mg prot) werden berekend met behulp van de standaardcurve.
Statistische analyse
De RANDBETWEEN-functie in Microsoft Excel werd gebruikt om de ratten te randomiseren en willekeurige getallen te genereren voor rattentoewijzing. Alle experimentele gegevens in deze studie werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). Voor de statistische analyse werden eerst de normaliteitstest (Shapiro-Wilk test) en de homogeniteit van variantietest (Levene-test) uitgevoerd op de gegevens van elke groep. Voor gegevens die voldeden aan de normale verdeling en homogeniteit van variantie werd eenrichtingsanalyse van variantie (eenrichtings-ANOVA) gebruikt. Als het verschil statistisch significant was, werd de LSD-methode verder gebruikt voor meervoudige vergelijkingen. Een waarde van *p < 0,05, **p < 0,01 en ***p < 0,001 werd als statistisch significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Analyse van de resultaten van netwerkfarmacologiestudie over KSZZD bij de behandeling van autisme
In totaal werden 15.770 autisme-gerelateerde doelwitten opgehaald uit de GeneCards-database. Doelwitten met een relevantiescore ≥ 4,21 werden geselecteerd als potentiële doelwitten voor autisme, wat resulteerde in 1014 ziektedoelen. De 827 doelen van KSZZD werden gekruist met de 1.014 autismedoelen, en er werden 125 gemeenschappelijke doelen behaa...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Een cruciale vraag is waarom quercetine, in plaats van andere kerncomponenten, werd geselecteerd voor experimentele validatie en of het de holistische effecten van KSZZD kan weergeven. Deze selectie was gebaseerd op de volgende convergerende bewijslijnen: (i) in een prenataal VPA-geïnduceerd rattenmodel voorkwam quercetine significant sociale interactietekorten en oxidatieve hersenschade29; (ii) in een door propionzuur geïnduceerd autismemodel verlaagde orale quer...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hoeven geen belangenconflicten aan te geven.
Dit werk maakt deel uit van nr.: Zun Shi Ke He HZ Zi (2024) nr. 54. Projecttitel: Studie naar het therapeutisch effect van Jiawei Kongsheng Zhenzhong Dan op autisme gebaseerd op het BDNF-ERK-CREB signaalpad.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.5% CMC-Na normal saline solution | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | Voertuig gebruikt voor blank/model groepen en quercetine suspensie. |
| 0.9% normale zoutoplossing | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | Voertuig voor blank-control moederlijke injecties. |
| 4% Paraformaldehyde in PBS | Thermo Scientific Chemicals | J61899.AK | Gebruikt voor fixatie van hersenweefsel. |
| 75% alcohol | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | Gebruikt om het open-veld apparaat schoon te maken tussen dieren. |
| Absolute ethanol | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | Gebruikt voor weefseldrogering voordat het wordt ingebed. |
| Alkaline water | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | Gebruikt om hematoxyline-gekleurde secties blauw te maken. |
| Amber14SB eiwit force field | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Eiwit force field gebruikt voor moleculaire dynamica simulaties. |
| BATMAN-TCM database | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Online doelwit-screening database: http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/ |
| BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | Gebruikt voor eiwit kwantificering van weefsel homogenaten. |
| Bluing reagent | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7301 | Gebruikt na hematoxyline kleuring om kernen blauw te maken. |
| CDOCKER module | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Semi-flexibele docking module gebruikt voor moleculaire docking. |
| Clearing / dewaxing reagent | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | Clear-Rite 3, 6901 | Kan worden gebruikt voor clearing en deparaffinisatie in histologie workflows. |
| CytoNCA plugin | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Cytoscape plugin gebruikt voor graad centraliteit analyse. |
| Cytoscape software | Not specified in manuscript | Version 3.10.0 | Gebruikt voor netwerk visualisatie en eiwit-eiwit interactie analyse. |
| Discovery Studio software | Not specified in manuscript | Versions 2019 en 2021 | Gebruikt voor receptor voorverwerking, docking en alanine scanning. |
| Draw Venn Diagram online tool | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Online tool voor Venn diagrammen: http://bioinformatics.psb.ugent.be |
| Eosin-Y (alcoholisch) | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7111 | Gebruikt voor cytoplasmatische tegenkleuring in H&E kleuring. |
| Volledig automatische dehydrator | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | Gebruikt voor gradiënt dehydratie van gefixeerd hersenweefsel. |
| GeneCards database | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Online database gebruikt om autisme-gerelateerde doelen op te halen: https://www.genecards.org/ |
| GraphPad Prism software | Not specified in manuscript | Version 9.5 | Gebruikt voor statistische analyse en het maken van grafieken. |
| Hematoxyline kleuringsoplossing | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 7211 | Gebruikt voor kernkleuring in H&E kleuring. |
| HERB database | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Online database gebruikt voor aanvullende verbindingen screening: http://herb.ac.cn |
| Hydrochloorzuur alcohol | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | Gebruikt voor differentiatie tijdens H&E kleuring. |
| Metascape platform | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Online platform gebruikt voor GO en KEGG verrijkingsanalyse. |
| Microplate reader | Thermo Scientific | Multiskan FC, 51119000 | Gebruikt voor absorptie lezing bij 450 nm. |
| Microscoop | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | Gebruikt om H&E-gekleurde hersensecties te observeren. |
| Microsoft Excel software | Microsoft | Niet gespecificeerd | Gebruikt om ratten te randomiseren met de RANDBETWEEN functie. |
| Mounting medium | Thermo Scientific Richard-Allan Scientific | 4111 | Gebruikt voor coverslips en permanente montage van gekleurde secties. |
| Open field test apparaat | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | 50 cm × 50 cm × 30 cm doos gebruikt voor gedragstests. |
| Paraffine | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | Gebruikt voor paraffine inbedding van hersenweefsel. |
| Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7.4 | Gibco | 10010023 | Gebruikt als voorgekoelde buffer voor weefsel homogenisatie. |
| PLIP interactie vingerafdruk | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Gebruikt voor eiwit-ligand interactie vingerafdruk analyse. |
| PubChem database | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Online database gebruikt om SMILES identificers op te halen: https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ |
| Quercetine | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | Toegediend via een slang op 100 mg/kg/dag. |
| Rat TNF-α ELISA Kit | Invitrogen | ERA56RB | Geschikt voor TNF-α detectie in serum en weefsel homogenaat. |
| Gekoelde centrifuge | Thermo Scientific | Sorvall ST 16R, 75004383 | Gebruikt voor centrifugatie van serum en weefsel homogenaat. |
| Schrödinger Suite software | Schrödinger, LLC | Version 2024 | Gebruikt om het moleculaire dynamica simulatie systeem te construeren. |
| SPF-graad Sprague-Dawley ratten | Not specified in manuscript | Niet gespecificeerd | 3 mannelijke en 3 vrouwelijke ratten gebruikt voor oprichting van diermodel. |
| SPSS software | Not specified in manuscript | Version 25.0 | Gebruikt voor statistische analyse. |
| SRplot platform | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Online platform gebruikt voor visualisatie: https://www.bioinformatics.com.cn/ |
| STRING database | Not specified in manuscript | Version 12.0 | Gebruikt om het eiwit-eiwit interactie netwerk te construeren: https://string-db.org/ |
| SwissTargetPrediction platform | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Online platform gebruikt voor doelwit voorspelling: http://swisstargetprediction.ch/ |
| TCMSP database | Not specified in manuscript | Niet van toepassing | Online platform gebruikt voor bioactive verbindingen screening: http://lsp.nwu.edu.cn/tcms |