Alle lokale, nationale en internationale richtlijnen en wetgeving werden nageleefd voor het gebruik van planten in deze studie. De reagentia en de gebruikte apparatuur worden vermeld in de Materiaaltabel.
Experimentele indeling en materiaal
Er werd een potexperiment georganiseerd op het dak van het gebouw van de afdeling landbouwtechniek van de Khwaja Fareed University of Engineering and Information Technology, Pakistan (28,42° N, 70,30° E), om de rol van vermiculiet en Azospirillum brasilense te onderzoeken bij het verminderen van cadmium (Cd) toxiciteit in tarwegewassen tijdens het winterseizoen 2023–2024. Voor dit experiment werd een volledig gerandomiseerd ontwerp (CRD) gebruikt, met drie replicaties. Een goedgekeurde tarwevariëteit van "Dilkash-20" werd verkregen van de Adoptive Research Farm, Rahim Yar Khan, die geschikt is voor de lokale regio. Er werd een potmaat van 1 x 1 x 1 voet (30,48 cm × 30,48 cm × 30,48 cm) gebruikt, met 12 kg grond. Zaadsterilisatie werd vóór het experiment uitgevoerd in het agronomielaboratorium met 70% ethanol. De zaden werden geplant op 10 november 2023. In elke pot werden 8 tarwezaden geplaatst en 4 planten werden onderhouden tijdens de tillerfase. Vermiculiet werd verkregen van de lokale markt en toegepast tijdens de toevoeging van de bodem met een snelheid van 150 g/kg grond. Azospirillum brasilense werd verkregen aan het Government College University Lahore (GCUL), Lahore, Pakistan. Azospirillum brasilense werd samen met de zaadinoculatie in tarwegewassen aangebracht volgens de standaardprocedure zoals gerapporteerd door Zaheer et al.17. Het experiment bestond uit 9 behandelingen (T0 = Controle (geen bodemverbeteraar, geen CD-toxiciteit), T1 = Cd toxiciteit 100 mg/kg bodem, T2 = Cd 100 mg/kg bodem + vermiculiet, T3 = Cd 100 mg/kg bodem + A. brasilense, T4 = Cd 100 mg/kg bodem + Vermiculiet + A. brasilense, T5 = Cd toxiciteit 200 mg/kg bodem, T6 = Cd 200 mg/kg bodem + Vermiculiet, T7 = Cd 200 mg/kg grond + A. brasilense, T8 = Cd 200 mg/kg grond + Vermiculiet + A. brasilense). De gemiddelde maandtemperatuur in °C en de luchtvochtigheid in % op de experimentele locatie worden weergegeven in Tabel 1. Voor de start van het experiment werd bodemanalyse uitgevoerd en de bodemeigenschappen worden weergegeven in Tabel 2. Irrigatie werd toegepast volgens de benodigdheid bij het tilleren, opbouwen, anthese- en graanvullen, en meststoffen werden ook uniform aangebracht volgens de aanbevelingen. De irrigatie werd handmatig toegepast met behulp van een waterpot en hield 70% bodemvocht in elke pot, zonder droogtestress. Meststoffen werden aangebracht volgens de aanbevelingen van het landbouwdepartement (120-80-60 kg NPK ha-1). De meststoffen werden berekend op basis van de grootte van elke pot. Volledige doses P en K en een halve dosis N werden toegediend tijdens het zaaien, en de resterende halve dosis N werd toegediend in de tilleringfase. Destructieve bemonstering voor metingen van wortel- en scheutlengtes (30 dagen na het zaaien) werd uitgevoerd in aparte potten die bestemd waren voor de vroege oogstfase; Deze potten werden niet gebruikt voor uiteindelijke opbrengstmetingen, waardoor vroege destructieve bemonstering geen invloed had op latere opbrengstgegevens. Een schematische tijdlijn van het experiment is als volgt: Dag 0 (bodemvoorbereiding, CD-spiking, vermiculietmenging, zaaien, zaaien), Dag 10–30 (wortelbemonstering voor qPCR), Dag 30 (wortel- en scheutlengte), Dag 85 (anthesie: fysiologische metingen) en Dag 120 (oogst: opbrengstparameters). Plantmonsters werden op drie tijdstippen verzameld. Op 10, 20 en 30 dagen na het zaaien (DAS) werden de wortels uit aparte potten verzameld. Bij 30 DAS werden aparte potten destructief geoogst voor wortel- en scheutlengte. Bij 85 DAS (anthesie) werden fysiologische parameters niet-destructief gemeten. Bij 120 DAS werden de uiteindelijke opbrengstparameters geregistreerd. Potten die werden gebruikt voor vroege destructieve bemonstering (10–30 DAS) werden niet gebruikt voor opbrengstmetingen.
Cadmium werd aangebracht als cadmiumchloride (CdCl₂•2,5H₂O, analytisch niveau, ≥98% zuiverheid). De vereiste hoeveelheden voor de streefconcentraties van 100 mg Cd kg⁻1 grond en 200 mg Cd kg⁻1 grond werden berekend op basis van het droge gewicht van de grond (12 kg per pot). CdCl₂ werd per pot opgelost in 500 mL gedeïoniseerd water en 15 minuten lang met de bodem gemengd met een mechanische mixer om een homogene verspreiding te garanderen. Na het mengen werd de met spikes beklede potten in met plastic beklede potten geplaatst en 14 dagen in evenwicht gehouden bij kamertemperatuur (25 ± 2 °C) met periodiek mengen elke 3 dagen om de Cd-soortvorming te stabiliseren en veroudering mogelijk te maken. Het bodemvocht bleef tijdens de evenwichtsperiode op 70% van de veldcapaciteit behouden. Na evenwicht werden representatieve bodemmonsters (10 g per pot) verzameld, aan de lucht gedroogd, verteerd met HNO₃/HClO₄ (4:1, v/v) en geanalyseerd op de totale Cd-concentratie met een atomaire absorptiespectrofotometer om de werkelijke Cd-niveaus te verifiëren. De gemeten CD-concentraties waren 98,4 ± 3,2 mg kg⁻1 voor de 100 mg kg⁻1 behandeling en 197,6 ± 5,1 mg kg⁻1 voor de 200 mg kg⁻1 behandeling, wat bevestigde dat de streefwaarden waren bereikt. De fysisch-chemische eigenschappen en het zware metaalgehalte van vermiculiet die in deze studie worden gebruikt, worden weergegeven in Tabel 3.
| Maand | Temperatuur (°C) | Luchtvochtigheid (%) |
| November 2023 | 28 | 56 |
| December 2023 | 18 | 62 |
| Januari, 2024 | 17 | 63 |
| Februari, 2024 | 18 | 32 |
| Maart, 2024 | 21 | 25 |
| April 2024 | 24 | 20 |
Tabel 1: Gemiddelde temperatuur en luchtvochtigheid van het experimentele terrein in 2023–2024.
| Parameters | Waarden (2023-24) |
| Organisch materiaal | 0.56% |
| pH | 7.42 |
| EC | 227 μS/cm |
| T.S.S. | 0.54% |
| Available-P | 5,21 ppm |
| Available-K | 119 ppm |
| Verzadigingspercentage | 34 |
| Bodemgescheiden: zand, slib, klei (%) | 36%, 40 %, 24 % |
Tabel 2: Bodemeigenschappen van de bodem die voor het experiment is gebruikt vóór het zaaien van het gewas.
| Eigendom | Waarde | Metaal | Concentratie (mg kg⁻¹) |
| Graad | Tuinbouwkwaliteit | Cadmium (cd) | < 0,01 (onder detectiegrens) |
| Deeltjesgrootte | 2-4 mm | Lead (PB) | 2.1 |
| pH (1:5 in H₂O) | 7.2 | Koper (Cu) | 1.8 |
| Kationenuitwisselingscapaciteit (CEC) | 85,4 cmolc kg⁻¹ | Zink (Zn) | 5.3 |
| Watervasthoudende capaciteit (WHC) | 450% (w/w) | - | - |
| Bulkdichtheid | 0,12 g cm-3 | - | - |
| Aanvraagsnelheid | 150 g kg⁻¹ grond (15% w/v) | - | - |
| Hoeveelheid per pot (12 kg grond) | 1,8 kg | - | - |
Tabel 3: Fysisch-chemische eigenschappen en het zware metaalgehalte van vermiculiet dat in deze studie werd gebruikt.
Bestudeerde eigenschappen
Alle plantengroeigerelateerde parameters, zoals planthoogte, bloemsteenlengte, aantal aarjes per bloem, korrels per bloem, gewicht van 1000 korrels en korrelopbrengst per plant, werden handmatig geregistreerd met behulp van een meterstok en een gewichtsbalans volgens een standaardprocedure. Biochemische analyse (bepaling van antioxidante enzymactiviteiten) en fysiologische analyse (fotosynthetische snelheid, huidmondgeleiding, chlorofylgehalte, elektrolytenlekkage (EL), gewasgroeisnelheid (CGR) en bladoppervlakte-index (LAI)) werden uitgevoerd in de anthesefase na 85 dagen zaaien. De lengte van wortel en scheuten werd opgemerkt na 30 dagen tarweplantengroei, wanneer planten werden verwijderd om 4 planten in de pot te houden na 20 dagen zaaien. Een infraroodgasanalysator (Cl-340) en een chlorofylmeter (CL-1) werden gebruikt om respectievelijk de fotosynthetische snelheid, de huidmondingsgeleidbaarheid en chlorofylinhoud te observeren. Elektrolytenlekkage (EL) werd gemeten met de vergelijking gerapporteerd door Mussell en Staples18 volgens de standaardprocedure van Zaheer et al.14. EL werd berekend als: EL (%) = (Initiële EC / Final EC) × 100, waarbij Initial EC de elektrische geleidbaarheid is gemeten na 24 uur incubatie bij 25 °C, en Final EC de geleidbaarheid is die wordt gemeten na autoclaven van de monsters bij 121 °C gedurende 20 minuten.
Opgeloste organische stikstof (DOC), opgeloste organische koolstof (DOC) en organische koolstof in de bodem (SOC) werden gemeten volgens de standaardprocedure19. LAI en CGR werden opgemerkt volgens procedure20. De opname van N, P en K door de tarweplant werd waargenomen, zoals gerapporteerd in de procedure beschreven in het vorige rapport21.
Statistische analyse
Alle gegevens voor dit onderzoek zijn verzameld uit drie replicaties, samengesteld en gemiddeld. De gegevens werden statistisch geanalyseerd met behulp van Statistic 8.1 en Microsoft Excel 2010. De gegevens werden geanalyseerd met eenrichtings-ANOVA, gevolgd door de Fisher's Least Significant Difference (LSD)-test op p ≤ 0,05 voor gemiddelde scheiding. Verschillende letters die bij de gegevens/resultaten verschijnen, tonen het statistische verschil tussen de behandelingen.