SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology): Een geïntegreerd computationeel platform voor het stroomlijnen van de cryo-elektronenmicroscopieworkflow

Samenvatting

Dit protocol demonstreert een stapsgewijze cryo-elektronenmicroscopieworkflow met behulp van een geïntegreerd softwareplatform (SMART) dat gegevensverwerving, driedimensionale reconstructie en het bouwen van atomaire modellen verbindt in één browsergebaseerde interface. Als representatief voorbeeld wordt de menselijke TRPML1-structuur bepaald met een resolutie van 2,38 Å.

Samenvatting

Cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) is een centraal hulpmiddel geworden in de structurele biologie, maar huidige workflows vereisen doorgaans meerdere gespecialiseerde softwarepakketten voor dataverzameling, driedimensionale (3D) reconstructie en het bouwen van atomaire modellen, wat leidt tot gefragmenteerde pijpleidingen en frequente handmatige interventie. Hier presenteren we SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology), een geïntegreerd softwareplatform dat drie modules combineert—DataSmart voor geautomatiseerde dataverzameling, CryoSmart voor beeldverwerking en 3D-reconstructie, en ModelSmart voor het bouwen van atomaire modellen op basis van deep learning—binnen een uniforme, door de browser toegankelijke interface. Dit protocol biedt stapsgewijze instructies voor het bedienen van alle drie de modules. De workflow omvat geautomatiseerde monsternavigatie en gegevensverzameling, bewegingscorrectie, schatting van contrastoverdrachtsfunctie (CTF), deeltjesselectie, tweedimensionale (2D) classificatie, 3D-verfijning, kaartverbetering en het genereren van atomaire modellen. Als representatief voorbeeld hebben we de volledige workflow toegepast om de structuur van menselijke TRPML1 te bepalen, een Ca²⁺-doorlaatbaar lysosomaal kationenkanaal, waarbij we een globale resolutie van 2,38 Å behaalden volgens de goudstandaard Fourier-schelpcorrelatie (FSC) bij het 0,143-criterium. Alle drie de modules (DataSmart, CryoSmart en ModelSmart) werden sequentieel toegepast op dezelfde TRPML1-dataset binnen deze studie. Het protocol is ontworpen om toegankelijk te zijn voor gebruikers met verschillende niveaus van cryo-EM-ervaring.

Inleiding

Cryo-elektronenmicroscopie: technologische evolutie en biologische impact. De bepaling van de driedimensionale eiwitstructuur blijft een centrale uitdaging in de moleculaire biologie, aangezien biologische functie nauw verbonden is met de ruimtelijke ordening van aminozuurresiduen. Het ophelderen van deze structurele configuraties is essentieel om enzymatische mechanismen, ligandinteracties en cellulaire signaalroutes bij atomaire resolutie te ontcijferen. Dit imperatief heeft de transformatieve ontwikkelingen in cryo-EM aangedreven, dat is uitgegroeid tot een breed geaccepteerde structurele biologietechniek ^1,2.

Cryo-EM enkeldeeltjesanalyse (SPA) dient als een krachtige benadering om biologische inzichten te verkrijgen over diverse monstertypen door het oplossen van hoogresolutiestructuren van geïsoleerde complexen³. Deze omvatten virussen, membraaneiwitten, helixvormige assemblages en andere dynamische en heterogene macromoleculaire complexen, die een breed scala aan moleculaire groottes beslaan—van ongeveer 50 kDa tot tientallen megadaltons.

Cryo-EM SPA is uitgegroeid tot een hoeksteentechniek voor het oplossen van de driedimensionale (3D) architecturen van biologische macromoleculen, die drie onderling afhankelijke computationele fasen omvat: gegevensverzameling, 3D-reconstructie en het bouwen van atomaire modellen (Figuur 1).

Tijdens gegevensverzameling worden gevitrificeerde monsters onder lage dosisomstandigheden gefotografeerd om micrografische films te maken, waarbij duizenden deeltjesprojecties in bijna-natuurlijke toestanden worden vastgelegd. Deze ruwe datasets worden vervolgens verwerkt via iteratieve uitlijnings- en classificatie-algoritmen om volumetrische dichtheidskaarten te reconstrueren. Ten slotte worden atomaire modellen gebouwd en verfijnd om de dichtheid te passen, waarbij moleculaire interacties met een bijna-atomaire resolutie worden verduidelijkt.

De bovenstaande analyse toont aan dat de output van cryo-EM slechts het startpunt van de structurele pijplijn vertegenwoordigt. Het omzetten van deze ruwe data in interpreteerbare atomaire modellen vereist een cascade van gespecialiseerde computationele softwaretools. Software dient dus als de cruciale brug die ruwe data omzet in atomaire modellen.

Gefragmenteerd cryo-EM software-ecosysteem: Huidige tools en beperkingen. Moderne cryo-EM-workflows zijn gebaseerd op een lappendeken van gespecialiseerde softwaretools, die elk afzonderlijke fasen aanpakken:

Data-acquisitie. Hoewel talrijke cryo-EM dataverzamelingssoftwarepakketten openbaar beschikbaar zijn—waaronder Leginon ^4,5, SerialEM⁶, UCSFImage4⁷, TFS EPU ^8,9, Gatan Latitude, JEOL JADAS¹⁰ en Auto-EMation¹¹—leveren deze tools voornamelijk ruwe filmgegevens met beperkte post-acquisitiemogelijkheden. Kritieke workflowstappen, zoals parameterinstelling en sjabloonaanpassing, vereisen nog steeds arbeidsintensieve handmatige handelingen, vaak te veel parameters per dataset. Deze afhankelijkheid van deskundige interventie brengt reproduceerbaarheidsuitdagingen en workflow-inefficiënties met zich mee, vooral in scenario's met hoge doorvoer.

3D-reconstructie. cryo-EM heeft aanzienlijke vooruitgang geboekt in 3D-reconstructiesoftware, waardoor bijna-atomaire resolutie van biologische macromoleculen mogelijk is. Tot de meest gebruikte tools behoren RELION, cryoSPARC en EMAN2, die elk unieke voordelen en beperkingen bieden. RELION hanteert een Bayesiaanse benadering voor iteratieve verfijning, waarbij het uitblinkt in het omgaan met heterogene datasets en het bereiken van reconstructies in hoge resolutie¹². De rekenintensiteit en steile leercurve vereisen echter vaak deskundige tussenkomst. cryoSPARC, dat gebruikmaakt van GPU-versnelling en deep learning, vermindert de verwerkingstijd aanzienlijk en is gebruiksvriendelijk¹³. EMAN2 biedt een uitgebreid pakket voor deeltjespluk en 3D-reconstructie, maar vereist uitgebreide handmatige afstelling en mist realtime feedbackmogelijkheden¹⁴. Hoewel deze tools uitblinken in specifieke aspecten van 3D-reconstructie, blijven ze beperkt tot singulare functionaliteiten en missen ze integratie met upstream data-acquisitie of downstream atomaire modellering. Zo vereisen RELION en cryoSPARC handmatige gegevensoverdracht vanuit microscoopbesturingssoftware, wat inefficiënties en mogelijke fouten met zich meebrengt. Bovendien bieden geen van deze tools realtime kwaliteitsbeoordeling tijdens dataverzameling of naadloze overgang naar atomaire modelbouw, wat resulteert in gefragmenteerde workflows die doorvoer en reproduceerbaarheid belemmeren.

De laatste computationele fase in cryo-EM-gebaseerde structurele bepaling is het bouwen van atomaire modellen, waarbij moleculaire coördinaten iteratief worden ingevoegd in gereconstrueerde dichtheidskaarten om interacties op atomair niveau te verduidelijken.

Hoewel conventionele modelbouwbenaderingen gebruikmaken van fysica-gebaseerde energieminimalisatie-algoritmen—met inbegrip van elektrostatische potentialen, van der Waals-interacties en covalente bindingsgeometriebeperkingen—blijven ze sterk afhankelijk van handmatige interventie voor initiële modelplaatsing, dichtheidsinterpretatie en stereochemische validatie 15,16,17,18. Deze afhankelijkheid van expertcuratie beperkt niet alleen de doorvoer, maar introduceert ook subjectieve biases, vooral in laagresolutie-regimes (< 4 Å) waar dichtheidskenmerken ambigu zijn.

Om deze beperkingen te overwinnen, zijn deep learning (DL)-gebaseerde methodologieën ontstaan als transformerende oplossingen, waarbij neurale netwerken worden ingezet om feature-extractie, modelinitialisatie en verfijning te automatiseren. Deze benaderingen tonen verbeterde prestaties bij het omgaan met ruisachtige of onvolledige dichtheidskaarten, terwijl handmatige interventie aanzienlijk wordt verminderd, zoals blijkt uit recente benchmarks die 40–60% verminderingen in gebruikersafhankelijke stappen laten zien vergeleken met conventionele pijpleidingen ^19,20,21,22.

Deze methoden vereisen echter onvermijdelijk het exporteren van dichtheidskaarten uit 3D-reconstructiesoftware en het importeren ervan in modelbouwsystemen. Voorafgaand aan de import kunnen extra preprocessing-stappen—vaak met externe tools—nodig zijn om de dichtheidskaarten te optimaliseren. Deze gefragmenteerde workflow vereist herhaalde datatransfers en formaatconversies, wat inefficiënties veroorzaakt. Bovendien moeten onderzoekers, als de eerste resultaten van het modelbouwen onbevredigend zijn, terugkeren naar de reconstructiefase voor herberekening, gevolgd door een nieuwe ronde van modelbouw en validatie. Dergelijke iteratieve cycli belemmeren aanzienlijk de doorvoer en operationele efficiëntie van cryo-EM structurele bepalingspijplijnen.

1.3 SMART: Een geïntegreerde oplossing voor end-to-end cryo-EM

Ondanks aanzienlijke vooruitgang in cryo-EM SPA blijft het ontbreken van volledig geïntegreerde computationele oplossingen het potentieel voor high-throughput structurele biologie belemmeren. Bestaande softwarepakketten blinken uit, hoewel ze uitblinken in het automatiseren van geïsoleerde workflowcomponenten – zoals data-acquisitie of 3D-reconstructie – maar slagen er niet in kritieke kloof te overbruggen tussen ruwe micrografische verzameling, verfijning van dichtheidskaarten en het bouwen van atomaire modellen. Deze fragmentatie vereist handmatige gegevensoverdracht, formatconversies en redundante parameterafstemming, wat resulteert in inefficiënties die zich opvullen met de schaal van de dataset.

Om deze beperkingen aan te pakken, presenteren we het geïntegreerde cryo-EM workflowplatform, een geïntegreerd computationeel platform dat de volledige cryo-EM SPA-pijplijn verenigt in een samenhangende, door AI aangedreven workflow. Het geïntegreerde platform integreert drie kernmodules: DataSmart (geautomatiseerde dataverwerving), CryoSmart (hybride neurale netwerk-ondersteunde 3D-reconstructie) en ModelSmart (op deep learning gebaseerde atomaire modellering).

De drie computationele modules van het platform zijn met elkaar verbonden via een gestandaardiseerde datastroom, waardoor een gestroomlijnde datastroom mogelijk is waarbij output van één module parameteraanpassingen in volgende verwerkingsstappen kan ondersteunen. Deze integratie is bedoeld om het aantal handmatige stappen en gegevensoverdrachten in conventionele cryo-EM-workflows te verminderen, wat mogelijk de toegankelijkheid en efficiëntie van structurele biologielaboratoria verbetert.

Protocol

De Expi293F-cellijn die wordt gebruikt voor eiwitexpressie voor het humaan TRPML1-eiwit is gekocht van Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd (catalogusnummer: SC0236058). De identiteit van de cellijn werd correct geauthenticeerd via Short Tandem Repeat (STR) profilering (Supplementary File 1).

Ethische verklaring
Deze studie betrof geen menselijke deelnemers, dieren of monsters die rechtstreeks van mensen of dieren waren verkregen. Het humane TRPML1-eiwit werd geproduceerd door recombinante expressie en in vitro gezuiverd. De Expi293F-cellijn die wordt gebruikt voor recombinante eiwitexpressie is een commercieel verkrijgbare, gevestigde geïmmortaliseerde cellijn. Daarom waren institutionele ethische goedkeuring en schriftelijke geïnformeerde toestemming niet vereist.

OPMERKING: Het geïntegreerde cryo-EM workflowplatform is gestructureerd in drie kernmodules: een geautomatiseerde data-acquisitiemodule, een hybride neuraal netwerk-ondersteunde 3D-reconstructiemodule en een op deep learning gebaseerde atomaire modelleringsmodule, waarbij data dient als communicatieinterface tussen deze softwarecomponenten, zoals geïllustreerd in Figuur 2. Het geïntegreerde cryo-EM workflowplatformsysteem hanteert een Browser-Server (B/S) architectuur, waardoor gebruikers alle bewerkingen via een webinterface kunnen uitvoeren, waardoor bruikbaarheid en operationele toegankelijkheid worden gegarandeerd.

1. Geautomatiseerde gegevensverzameling

OPMERKING: Het geïntegreerde cryo-EM workflowplatform bestaat uit drie kernmodules: een geautomatiseerde data-acquisitiemodule, een hybride neuraal netwerk-ondersteunde 3D-reconstructiemodule en een op deep learning gebaseerde atomaire modelleringsmodule. Data dient als communicatieinterface tussen deze softwarecomponenten (Figuur 2). Het systeem gebruikt een Browser-Server (B/S) architectuur die alle bewerkingen via een webinterface mogelijk maakt.

1. Projectinitialisatie
   1. Maak een nieuw project op in een geautomatiseerd softwareplatform voor data-acquisitiemodules.
   2. Selecteer indien gewenst de optie om configuratie-instellingen van een recent project te erven. Hergebruik de geërfde parameters voor het opstellen van de elektronenmicroscoop in plaats van een nieuwe configuratie te creëren.
2. Beam shift inspectie
   OPMERKING: Voer de bundelverschuiving uit binnen de transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) besturingssoftware.
   1. Controle met lage vergroting (Atlas en GridSquare)
      1. Open de screeningmodule . Maak beelden met de Atlas - en GridSquare-vergrotingen.
      2. Controleer of de beelden goed verlicht zijn en vrij van bundelverschuiving. Zorg ervoor dat het beeldcentrum niet boven de rasterbalken ligt.
   2. Controle van vergroting van gegevensverzameling
      1. Maakt beelden met de vergroting van de data-acquisitie (bijv. 60K of 100K). Evalueer de uitlijning van de bundel.
      2. Corrigeer de bundelverschuiving voordat je verder gaat als beeldacquisitie faalt of er een significante bundelverschuiving wordt waargenomen.
   3. Hole Eucentric Vergroting Check
      1. Maak beelden bij het gat/eucentrische vergroting (meestal 8K). Pas de bundelverschuiving aan totdat de verlichtingsplek gecentreerd is als de bundel niet gecentreerd is.
      2. Verander de diafragmapositie niet. Controleer of de diafragmagrootte overeenkomt met het diafragma dat tijdens de gegevensverzameling wordt gebruikt.
3. Z-hoogte aanpassing
   1. Auto-Eucentrisch Aanpassing
      1. Ga naar de pagina Screening . Verplaats het podium naar een schoon koolstoffilmgebied bij de vergroting van het gat/eucentrische hoogte. Open de Auto-Eucentric-module op de AutoFunction-pagina .
      2. Klik op Start. Houd het logboek in de gaten voor feedback. Ga naar een ander gebied en herhaal de procedure als de operatie mislukt.
   2. Autofocus-instelling
      1. Open de AutoFocus-module op de AutoFunction-pagina . Klik op Start.
      2. Bekijk de logberichten. Pas de parameters aan zoals aangegeven of herhaal sectie 1.3.1 als de autofocus uitvalt.
4. Vergrotingsuitlijningscontrole
   1. Uitlijningsinspectie
      1. Zoek een herkenbaar kenmerk bij de Data-vergroting en maak een afbeelding. Maak een afbeelding met de Hole/EucentricHeight-vergroting.
      2. Vergelijk de centrale gebieden van beide afbeeldingen. Ga over tot kalibratie als er een misalignering wordt waargenomen tussen de data- en gatvergrotingen.
      3. Inspecteer de uitlijning tussen de Hole- en GridSquare-vergrotingen als de Data- en Hole-vergrotingen zijn uitgelijnd. Ga zonder kalibratie door als alle vergrotingsniveaus uitgelijnd zijn.
   2. Grootheidsverschuiving Kalibratie
      1. Ga naar de kalibratiepagina . Open de Magnification Shift-module . Begin met de datavergroting of de laagst uitgelijnde vergroting.
      2. Neem een afbeelding met hoge vergroting met een duidelijk kenmerk. Neem een overeenkomstige afbeelding met lage vergroting. Beoordeel de verplaatsing tussen de twee beelden.
      3. Klik met de rechtermuisknop op de locatie die overeenkomt met het featurecentrum in de afbeelding met lage vergroting. Selecteer Hier bewegen. Haal het beeld met hoge vergroting opnieuw en controleer de uitlijning.
      4. Herhaal de aanpassing indien nodig. Klik op Volgend om door te gaan naar het volgende vergrotingspaar nadat de uitlijning is bereikt. Herhaal de kalibratieprocedure voor alle resterende verkeerd uitgelijnde vergrotingsparen.
5. Voorbereiding op gegevensverzameling
   1. Voer atlasverwerving, vierkantselectie, vierkantbeeldvorming en gatselectie uit
      1. Open de Atlas-module . Laat het tegelveld leeg om alle 81 tegels te verkrijgen, of voer het gewenste aantal tegels in om te verzamelen.
      2. Navigeer naar de Square Selection-interface . Klik met de rechtermuisknop om geschikte vierkanten te selecteren.
      3. Ga naar de pagina voor gatselectie. Klik op Alles voorbereiden. Monitor het logboekvenster totdat de beeldacquisitie is voltooid.
      4. Selecteer een vastgelegd vierkant beeld uit de afbeeldingenlijst. Gebruik de functie 'Gaten zoeken ' om automatische gatselectie uit te voeren wanneer gaten duidelijk zichtbaar zijn.
         VOORZICHTIG: Automatische gatdetectie kan falen op roosters met dik ijs of oppervlaktebesmetting. Controleer de gedetecteerde gaten visueel vóór de acquisitie en gebruik de semi-geautomatiseerde methode voor gatselectie wanneer automatische detectie onbetrouwbaar is.
      5. Gebruik de Zaadselectiefunctie wanneer dik ijs of besmetting een betrouwbare automatische selectie verhindert (Figuur 3).
         1. Kies een centraal gat. Kies twee aangrenzende gaten die een rechte hoek vormen.
         2. Selecteer twee verre gaten langs de richtingen die door het tweede en derde gat worden bepaald.
         3. Klik op Verzenden. Schakel Move All in bij het verwerken van een ander vakje. Sleep een van de vijf zaadgaten naar een vrij gat. Klik op Verzenden.
   2. Sjabloondefinitie
      1. Ga naar de pagina Sjabloondefinitie . Klik op Acquire om een afbeelding te krijgen. Controleer of het beeld een volledig gat bevat.
      2. Klik met de rechtermuisknop op het doelgebied en selecteer MoveStageTo als er geen volledig gat zichtbaar is. Haal de sjabloonafbeelding opnieuw op. Geef de beeldpositie en autofocuslocatie aan door de bijbehorende markers te slepen.
      3. Voer het aantal frames per gat in. Voer de gewenste defocuswaarde in (bijv. −1,5 μm). Controleer alle acquisitieparameters (Figuur 4).
6. Beam shift hercontrole
   1. Herhaal sectie 1.2 nadat alle voorbereidingsprocedures zijn afgerond.
7. Astigmatisme en comacorrectie
   1. Astigmatismecorrectie
      1. Verplaats het podium naar een schoon koolstoffilmgebied. Stel de hoogte aan met AutoFocus naar de gewenste defocuswaarde (bijv. −1,5 μm). Open de Autostigmate-module op de AutoFunction-pagina .
      2. Klik op Start. Monitor de Ctffind-output in het logpaneel. Bekijk de waarden voor astigmatisme en resolutie-fit. Herhaal de procedure op een andere plek als het astigmatisme hoog blijft.
   2. Comacorrectie
      1. Open de Autocoma-module als de resultaten van Autostigmate na meerdere pogingen suboptimaal blijven. Klik op Start.
8. Geautomatiseerde gegevensverzameling
   1. Ga naar de AutoCollect-pagina . Klik op Start. Laat het systeem AutoEmission en AutoZLP-kalibraties automatisch uitvoeren.
   2. Verkrijg gegevens met behulp van de parameters die zijn gedefinieerd in de instellingen Screening, Data Acquisition, and Preparation. Monitor het geautomatiseerde incassoproces (Figuur 5).
      PAUZEPUNT: Nadat de gegevensverzameling is voltooid, kunnen de verkregen filmstacks worden opgeslagen en het protocol later worden hervat in de beeldverwerkingsfase zonder dat de downstreamresultaten worden beïnvloed.
9. Directe Remote Monitoring
   1. Monitor de voortgang van de verzameling met behulp van de remote monitoring-module. Bekijk realtime bewegingscorrectieresultaten die zijn gegenereerd met MotionCor2²³. Bekijk realtime astigmatisme en defocusmetingen.
   2. Deel de monitoring-URL met geautoriseerde gebruikers. Toegang tot de status van de verzameling en gegevenskwaliteit vanaf een computer of mobiel apparaat. Bekijk een voorbeeld van functionaliteit voor remote monitoring in Figuur 6.

2. Driedimensionale reconstructie

OPMERKING: Gebruik de 3D-reconstructiemodule om driedimensionale reconstructie uit te voeren uit eerder verkregen beelddatasets. De workflow omvat projectcreatie, micrografie-import, contrastoverdrachtsfunctie (CTF) schatting, deeltjespicking, deeltjesextractie, 2D-classificatie, initiële modelgeneratie en 3D-verfijning (Figuur 7).

1. Projectcreatie
   1. Ga naar de homepage van de 3D-reconstructiemodule. Klik op Projecten om de projectmanagementpagina te openen. Klik op NIEUW PROJECT.
   2. Voer de projectnaam in en geef de opslaglocatie op. Klik op PROJECT AANMAKEN. Klik op Openen naast het nieuw aangemaakte project. Klik op NIEUW Experiment om een nieuw experiment te maken.
      OPMERKING: Een project vertegenwoordigt een totale dataverwerkingssessie, terwijl een experiment een individuele verwerkingsworkflow binnen een project vertegenwoordigt. Meerdere experimenten kunnen binnen één project worden opgezet.
2. Bestanden importeren
   1. Klik op Nieuwe Baan. Selecteer Importeren en klik op Aanmaken. Selecteer het juiste bestandstype. Importeer de .mrc-bestanden die tijdens de gegevensverzameling zijn gegenereerd. Voer de pixelgrootte, versnellingsspanning en aantal CPU's in. Klik op Queue Job.
      OPMERKING: Om een lopende taak te beëindigen, klik je op Kill en vervolgens op Clear om de job terug te brengen naar de Bouwstatus. Voor voltooide of in de wachtrij staande taken klik je op Clear om de status van de taak te resetten.
3. CTF-schatting
   1. Klik op Nieuwe Baan. Selecteer CTF-schatting en klik op Aanmaken.
      OPMERKING: De 3D-reconstructiemodule ondersteunt meerdere CTF-schattingsalgoritmen. Dit protocol gebruikt CTFFIND4.
   2. Klik op de Connect-knop voor belichtingen. Selecteer de geïmporteerde microfoto's. Stel het amplitudecontrast in op 0,1, minimale fittingresolutie op 30 Å. maximale fitingresolutie op 4 Å, minimale defocuszoekwaarde op 5.000 Å, maximale defocuszoekwaarde op 50.000 Å en defocuszoekstap op 500 Å.
   3. Klik op Queue Job.
4. Handmatige deeltjespluk
   1. Klik op Nieuwe Baan. Selecteer Particle Picking en selecteer vervolgens Blob Picker. Klik op Aanmaken. Klik op de Connect-knop voor Micrographs (Exposures).
   2. Selecteer de geïmporteerde microfoto's. Voer de vereiste parameters in. Klik op Queue Job. Bekijk 3–4 representatieve microfoto's. Selecteer deeltjes met de linkermuisknop.
   3. Deselecteer deeltjes met de rechtermuisknop. Bepaal het deeltjesdiameterbereik ten opzichte van de geselecteerde deeltjes. Klik op Klaar met kiezen! Extraheer deeltjes.
      OPMERKING: Meet deeltjes van ten minste drie micrografieën.
5. Blob Picker
   1. Klik op Nieuwe Baan. Selecteer Particle Picking en selecteer vervolgens Blob Picker. Klik op Aanmaken. Verbind de micrografische (exposures) input.
   2. Selecteer de geïmporteerde microfoto's. Voer de vereiste parameters in. Klik op Queue Job.
6. Inspecteer deeltjespicks
   1. Klik op Nieuwe Baan. Selecteer Inspecteren Deeltjesplekken. Klik op Aanmaken. Verbind de micrografische (exposures) input. Verbind de Particle-ingang.
   2. Selecteer de bijbehorende bestanden. Voer de vereiste parameters in. Klik op Queue Job. Bekijk 3–4 representatieve beelden na voltooiing van de klus.
   3. Controleer de juiste deeltjesselectie. Klik op Klaar met kiezen! Uitvoerlocaties.
7. Deeltjes uit micrografieën extraheren
   1. Klik op Nieuwe Baan. Selecteer extract uit micrografieën. Klik op Aanmaken. Verbind de micrografische (exposures) input. Verbind de Particle-ingang. Selecteer de bijbehorende bestanden.
   2. Stel de grootte van de extractiebox in op 2–3 keer de deeltjesdiameter. Gebruik een extractiebox van 400 pixels voor TRPML1. Stel de Fourier-cropgrootte in op een kwart tot de helft van de extractiebox.
   3. Gebruik een Fourier-crop size van 100 pixels voor TRPML1. Klik op Queue Job.
      OPMERKING: Het verkleinen van de Fourier-cropgrootte vermindert de rekenkundige vraag van de GPU.
8. Tweedimensionale classificatie
   1. Klik op Nieuwe Baan. Selecteer 2D-classificatie. Klik op Aanmaken. Verbind de Particle-ingang.
   2. Importeer de deeltjesstapel. Voer de vereiste parameters in. Klik op Queue Job.
      OPMERKING: Selecteer 50–200 klassen. Gebruik minder klassen voor kleinere datasets en meer klassen voor grotere datasets.
9. Selecteer tweedimensionale klassen
   1. Klik op Nieuwe Baan. Selecteer Select 2D Classes. Klik op Aanmaken. Verbind de Particle-ingang. Verbind de Templates-invoer.
   2. Importeer de benodigde bestanden. Klik op Queue Job. Wacht tot de baan in de Wacht-toestand komt. Klik op Wachten.
   3. Selecteer duidelijke en goed gedefinieerde 2D-klassen. Klik op Klaar.
10. Eerste modelgeneratie
    1. Klik op Nieuwe Baan. Selecteer Abinit Reconstructie. Verbind de Particle-ingang. Importeer de geselecteerde deeltjes.
    2. Hier komt het aantal initiële klassen in. Voer de symmetrieparameter in. Klik op Queue Job.
11. Heterogene verfijning
    OPMERKING: Gebruik heterogene raffinage voor heterogene monsters en homogene verfijning voor homogene monsters.
    1. Klik op Nieuwe Baan. Maak een Heterogene Verfijningstaak . Verbind de Particle-ingang. Sluit de volume-ingang aan.
    2. Selecteer de bijbehorende bestanden. Voer de verfijningsparameters in. Specificeer de juiste symmetrie (bijv. C1). Klik op Queue Job.
12. Homogene Verfijning
    1. Klik op Nieuwe Baan. Maak een Homogene Verfijningstaak . Verbind de Particle-ingang. Sluit de volume-ingang aan.
    2. Sluit optioneel de Mask-invoer aan. Importeer de deeltjesstapel en de best presterende volumeklasse uit de vorige verfijningsstap. Voer de vereiste parameters in.
    3. Specificeer de juiste symmetrie (bijv. O of C1). Klik op Queue Job. Klik op Uitvoeren na het voltooien van de taak. Bekijk de gereconstrueerde dichtheidskaart in de browserinterface (Figuur 8).
13. Kaartverbetering
    OPMERKING: Map Enhancer gebruikt DeepEMhancer²⁴. Gebruik halve kaarten waar mogelijk. Posttranslationele modificaties en ligandmoleculen werden niet opgenomen in de DeepEMhancer-trainingsset en zijn mogelijk niet nauwkeurig verbeterd. Map Enhancer voert lokale scherpmaak, geautomatiseerd maskeren en deoising uit.
    1. Klik op Nieuwe Baan. Maak een Map Enhancer-taak aan. Importeer het volume dat tijdens de homogene verfijning is gegenereerd.
    2. Importeer het bijbehorende masker. Importeer kaartbestanden via de optie Map Data Path indien nodig. Voer de klus uit.

3. Een op deep learning gebaseerde atomaire modellering

OPMERKING: Een op deep learning gebaseerde atomaire modelleringsmodule is gebaseerd op het eerder ontwikkelde SMARTFold framework²⁵ en ondersteunt het bouwen van atomaire modellen voor eiwitten en nucleïnezuren (RNA/DNA) uit cryo-EM dichtheidskaarten.

1. Lancering van een op deep learning gebaseerde atomaire modelleringsmodule
   1. Log in op een op deep learning gebaseerd atomair modelleringsmodulesysteem. Open de taak-inleverinterface. Upload de cryo-EM dichtheidskaart in het linkerpaneel.
   2. Voer de vereiste invoerparameters in. Dien de modellentaak in.
2. Upload de Cryo-EM dichtheidskaart
   1. Upload de dichtheidskaart in .mrc-, .ccp4- of .map-formaat. Controleer of de bestandsgrootte minder dan 100 MB is.
      OPMERKING: Als de dichtheidskaart meer dan 100 MB is, verklein dan de bestandsgrootte voordat je uploadt.
      1. Snijd de dichtheidskaart naar de regio van interesse met UCSF ChimeraX²⁶ met het commando: volume zone. Resample de kaart naar een grotere pixelgrootte.
      2. Breng een zacht masker aan om oplosmiddelgebieden te verwijderen.
         OPMERKING: Controleer de dichtheidskaart voordat u uploadt om optimale modelprestaties te waarborgen en het risico op verwerkingsfouten te verminderen.
3. Inspecteer en bereid de dichtheidskaart voor
   1. Voer dichtheidskaartbesnijden uit. Voor deze Crop moet je de dichtheidskaart gebruiken om onnodige gebieden te verwijderen. Controleer of de bijgesneden kaart alleen het gebied bevat dat nodig is voor modelbouw.
      OPMERKING: Bijsnijden vermindert de bestandsgrootte en helpt geheugenoverloop tijdens modelgeneratie te voorkomen.
   2. Controleer dan op Mirror Inversion. Inspecteer de dichtheidskaart op mogelijke spiegelinversion. Onderzoek α-helixvormige gebieden binnen de kaart. Controleer dat α-helices een rechtshandige configuratie vertonen en omhoog spiraalsen in een tegen de klok in. Draai de dichtheidskaart om als er een gespiegelde structuur wordt gedetecteerd.
4. Upload het sequentiebestand
   1. Upload het bijbehorende sequentiebestand. Voer de volgorde handmatig in. Geef alle eiwit- of nucleïnezuursequenties die in de reconstructie zijn opgenomen.
   2. Specificeer heteromere of homomere sequentie-informatie waar van toepassing. Voer de Eiwitnaam in, indien gewenst (optionele stap).
5. Specificeer de mapresolutie. Hier komt de gerapporteerde resolutie van de cryo-EM dichtheidskaart. Selecteer de Computing-partitie. Selecteer de GPU-computingnode die gebruikt moet worden voor modelgeneratie.
6. Om CPU-bronnen te specificeren, voer je het aantal toegewezen CPU's in. Niet meer dan acht CPU's. Bekijk alle geüploade bestanden en parameters. Klik op VERZENDEN om modelgeneratie te starten.
7. Inspecteer het voorspelde atomaire model
   1. Open het interactieve visualisatievenster na het voltooien van de taak. Draai het model om structurele kenmerken te inspecteren. Zoom in en uit om lokale en globale structurele details te bekijken.
   2. Inspecteer het model vanuit meerdere oriëntaties. Evalueer modelkwaliteit, ruimtelijke conformatie en atomaire kenmerken zelf. Gebruik het gegenereerde model voor downstream analyse en validatie.
   3. Zie Figuur 9 voor een voorbeeld van de visualisatie-interface.

Resultaten

TRPML1, ook bekend als mucolipine-1 (MCOLN1), is een lysosomaal kationenkanaal dat essentieel is voor het behouden van ionische homeostase, het reguleren van vesiculaire transport en het ondersteunen van autophagie in zoogdiercellen^27,28. Disfunctie van TRPML1 door genetische mutaties is direct in verband gebracht met mucolipidose type IV, een ernstige neurodegeneratieve lysosomale opslagstoornis die wordt gekenmerkt door abnormale neuroontwikkeling, retinale deg...

Discussie

De structurele bepaling van biologische macromoleculen via cryo-elektronenmicroscopie (cryo-EM) vereist inherent een langdurige, meerfasige workflow die een strakke integratie van computationele tools en het vertrouwen op deskundige interventie vereist. Het geïntegreerde platform pakt deze uitdaging aan door data-acquisitie, 3D-reconstructie en atomaire modellering te verenigen in één verticaal geïntegreerd raamwerk—een stap richting meer gestroomlijnde cryo-EM-workflows. Door AI-gedreve...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CryoSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	3D reconstructiemodule van het SMART-platform; hybride neurale netwerk-geactiveerd
Cryo-elektronenmicroscoop	Shuimu BioSciences Ltd.	SHUIMU TOTEM 300S	Wordt gebruikt voor dataverwerving; uitgerust met energiefilter
DataSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Geautomatiseerde dataverwervingsmodule van het SMART-platform
DeepEMhancer	Open source	V0.17	Diep leren gebaseerde cryo-EM volume nabewerking; geïntegreerd binnen CryoSmart Map Enhancer
Directe elektronendetector	Gatan	GATAN K3 (6k x 4k)	Camera gebruikt voor filmopnames
Grid	Quantifoil	Au R1.2,1.3	Cryo-EM monsterraster
ModelSmart	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Diep leren gebaseerde atomaire modelleringsmodule van het SMART-platform; breidt het SMARTFold-framework uit
SMART Platform	Shuimu BioSciences Ltd.	V 1.0	Geïntegreerde cryo-EM-platform; Browser-Server (B/S) architectuur; omvat DataSmart, CryoSmart en ModelSmart modules
TEM besturingssoftware	Shuimu BioSciences Ltd.	V1.0	Elektronenmicroscoop besturingssoftware voor straalverschuivingsaanpassing
Topaz	Open source	V 2.5	Diep leren gebaseerde deeltje-picktool; geïntegreerd als plug-in binnen CryoSmart
TRPML1-eiwitmonster	Shuimu Biosciences Ltd.	SMPP-0053	Humaan TRPML1 (mucolipine-1); zelf bereid door het Protein and Crystallography Department
Vitrificatieapparaat	Thermo Fisher Scientific	Vitrobot Mark IV	Voor cryo-EM monstervoorbereiding
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Algemeen gebruik software voor weergave, analyse en meer
SMART (Shuimu Automated Reconstruction Technology)	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Geïntegreerde cryo-EM workflow platform
SMARTFold	Shuimu BioSciences Ltd.	N/A	Diep leren framework onderliggend ModelSmart
Leginon	National Resource for Automated Molecular Microscopy (NRAMM)	RRID:SCR_016731	Geautomatiseerde cryo-EM dataverwervingssoftware
SerialEM	University of Colorado	RRID:SCR_017293	Geautomatiseerde TEM/cryo-EM verwervingssoftware
EPU	Thermo Fisher Scientific	N/A	Geautomatiseerde cryo-EM dataverzamelingssoftware
EPU Multigrid	Thermo Fisher Scientific	N/A	Multi-grid geautomatiseerde cryo-EM verwerving
Gatan Latitude	Gatan Inc.	N/A	Elektronenmicroscoop verwervingssoftware
JADAS	JEOL Ltd.	N/A	Geautomatiseerd cryo-EM verwervingssysteem
Auto-EMation	Tsinghua University	N/A	Geautomatiseerde cryo-EM verwervingssoftware
RELION	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016274	Bayesiaanse cryo-EM reconstructiesoftware
cryoSPARC	Structura Biotechnology Inc.	RRID:SCR_016501	Cryo-EM beeldverwerking en reconstructie
EMAN2	Baylor College of Medicine	RRID:SCR_017270	Cryo-EM beeldverwerkingssuite
CTFFIND4	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016732	CTF-schattingssoftware
Gctf	MRC Laboratory of Molecular Biology	RRID:SCR_016500	GPU-versnelde CTF-schatting
MotionCor2	Howard Hughes Medical Institute / UCSF	RRID:SCR_016499	Bewegingscorrectiesoftware
DeepEMhancer	Spanish National Center for Biotechnology (CNB-CSIC)	RRID:SCR_021214	Diep leren cryo-EM kaartverbetering
Topaz	University of California Berkeley	RRID:SCR_018037	Diep leren deeltje-picking
UCSF ChimeraX	University of California San Francisco	RRID:SCR_015872	Molecuul visualisatiesoftware
CTFFIND4	Grigorieff Lab	RRID:SCR_016732	CTF fitting gebruikt in CryoSmart workflow
EMDB-8840	Electron Microscopy Data Bank	Toegang: EMD-8840	Humaan TRPML1 referentiemap
EMPIAR-10204	Electron Microscopy Public Image Archive	Toegang: EMPIAR-10204	β-galactosidase benchmark dataset
Transmissie-elektronenmicroscoop (TEM)	Niet gespecificeerd	N/A	Wordt gebruikt voor cryo-EM dataverwerving
FEI Tecnai Elektronenmicroscoop	FEI (nu Thermo Fisher Scientific)	Niet gespecificeerd	Vermeld in geciteerde workflow
Energiefilter	Niet gespecificeerd	N/A	Gebruikt tijdens geautomatiseerde verzameling
GPU Computing Node	Niet gespecificeerd	N/A	Gebruikt voor ModelSmart berekeningen