Een UV-gebaseerde ChIRP-methode voor de verifieerbare identificatie van eiwitten die direct interageren met LncRNA: van gekweekte cellen tot muistestikels

Lingxiu Tong; Yiting Ye; Wanyin Jiang; Yingying Ye; Xiaolian Shi; Siyuan Song; Lumei Zhou; Lan Ye; Yang Li; Ke Zheng

doi:10.3791/71732

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode voor de verifieerbare identificatie van eiwitten die direct interageren met LncRNA: van gekweekte cellen tot muistestikels

301 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71732

⸱

10 juli 2026

Lingxiu Tong^*¹^,² , Yiting Ye^*¹^,² , Wanyin Jiang^*¹^,² , Yingying Ye^*¹^,³ , Xiaolian Shi¹ , Siyuan Song¹^,² , Lumei Zhou¹^,² , Lan Ye³ , Yang Li⁴ , Ke Zheng¹^,²^,³

¹State Key Laboratory of Reproductive Medicine and Offspring Health, Nanjing Medical University, ²Key Laboratory of Systems Biomedicine (Ministry of Education), Institute of Systems Biomedicine, Shanghai Jiao Tong University, ³School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, ⁴School of Life Science and Technology, China Pharmaceutical University

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode om directe interacties tussen lncRNA en eiwitten te identificeren.

Samenvatting

Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) zijn uitgegroeid tot belangrijke regulatoren van diverse biologische processen. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de functies van de meeste lncRNA's blijven echter slecht begrepen. Het identificeren van interacterende eiwitten, met name RNA-bindende eiwitten (RBP's), is een belangrijke strategie om de functie van lncRNA te verduidelijken. Onder de beschikbare benaderingen wordt uitgebreide identificatie van RNA-bindende eiwitten (ChIRP) in combinatie met massaspectrometrie veel gebruikt vanwege het eenvoudige probe-ontwerp en de eenvoudige workflow. Conventionele ChIRP maakt gebruik van paraformaldehyde (PFA) crosslinking, die zowel directe RNA-eiwitcontacten als indirecte interacties die worden gemedieerd door brugfactoren vastlegt. Daarentegen behoudt UV-crosslinking gecombineerd met strenge wasvoorwaarden bij voorkeur directe RNA-eiwitinteracties. Met behulp van het lncRNA Tug1 als model werden UV-crosslinking en PFA-crosslinking vergeleken binnen het ChIRP-kader in gekweekte cellen, wat aantoonde dat UV-gebaseerde ChIRP verrijkt voor directe lncRNA-eiwitinteracties. Deze UV-gebaseerde workflow werd later uitgebreid naar muistestikels, waarbij weefsels werden gedissocieerd in single-cel suspensies voorafgaand aan UV-crosslinking, waardoor de identificatie van Tug1-bindende eiwitten in een native weefselcontext mogelijk werd. Vergelijking met cellijn-afgeleide interactomen toonde zowel gedeelde als weefselspecifieke interactoren aan. Twee gedeelde directe interacties werden onafhankelijk gevalideerd door enhanced crosslinking immunoprecipitation (eCLIP). Deze UV-gebaseerde ChIRP-benadering wordt cPDiRT genoemd (het vangen van eiwitten die direct interacteren met een RNA-doel). Samen maakt cPDiRT de identificatie van lncRNA-bindende eiwitten mogelijk in zowel gekweekte cellen als inheemse weefsels. De combinatie van weefseldissociatie en UV-kruisbinding biedt een breed toepasbare strategie voor het bestuderen van directe lncRNA-eiwitinteracties over diverse orgaansystemen.

Inleiding

Recente high-throughput transcriptomische studies hebben duizenden lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) blootgelegd die deelnemen aan diverse biologische processen, variërend van chromatineorganisatie tot cellulaire signalering ^1,2. Ondanks hun brede expressie en functionele belang blijven de moleculaire mechanismen van de meeste lncRNA's slecht gedefinieerd. Een groot obstakel is de identificatie van hun fysische eiwitpartners, met name RNA-bindende eiwitten (RBP's)^3,4,5.