Een UV-gebaseerde ChIRP-methode voor de verifieerbare identificatie van eiwitten die direct interageren met LncRNA: van gekweekte cellen tot muistestikels

Samenvatting

Een UV-gebaseerde ChIRP-methode om directe interacties tussen lncRNA en eiwitten te identificeren.

Samenvatting

Lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) zijn uitgegroeid tot belangrijke regulatoren van diverse biologische processen. De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de functies van de meeste lncRNA's blijven echter slecht begrepen. Het identificeren van interacterende eiwitten, met name RNA-bindende eiwitten (RBP's), is een belangrijke strategie om de functie van lncRNA te verduidelijken. Onder de beschikbare benaderingen wordt uitgebreide identificatie van RNA-bindende eiwitten (ChIRP) in combinatie met massaspectrometrie veel gebruikt vanwege het eenvoudige probe-ontwerp en de eenvoudige workflow. Conventionele ChIRP maakt gebruik van paraformaldehyde (PFA) crosslinking, die zowel directe RNA-eiwitcontacten als indirecte interacties die worden gemedieerd door brugfactoren vastlegt. Daarentegen behoudt UV-crosslinking gecombineerd met strenge wasvoorwaarden bij voorkeur directe RNA-eiwitinteracties. Met behulp van het lncRNA Tug1 als model werden UV-crosslinking en PFA-crosslinking vergeleken binnen het ChIRP-kader in gekweekte cellen, wat aantoonde dat UV-gebaseerde ChIRP verrijkt voor directe lncRNA-eiwitinteracties. Deze UV-gebaseerde workflow werd later uitgebreid naar muistestikels, waarbij weefsels werden gedissocieerd in single-cel suspensies voorafgaand aan UV-crosslinking, waardoor de identificatie van Tug1-bindende eiwitten in een native weefselcontext mogelijk werd. Vergelijking met cellijn-afgeleide interactomen toonde zowel gedeelde als weefselspecifieke interactoren aan. Twee gedeelde directe interacties werden onafhankelijk gevalideerd door enhanced crosslinking immunoprecipitation (eCLIP). Deze UV-gebaseerde ChIRP-benadering wordt cPDiRT genoemd (het vangen van eiwitten die direct interacteren met een RNA-doel). Samen maakt cPDiRT de identificatie van lncRNA-bindende eiwitten mogelijk in zowel gekweekte cellen als inheemse weefsels. De combinatie van weefseldissociatie en UV-kruisbinding biedt een breed toepasbare strategie voor het bestuderen van directe lncRNA-eiwitinteracties over diverse orgaansystemen.

Inleiding

Recente high-throughput transcriptomische studies hebben duizenden lange niet-coderende RNA's (lncRNA's) blootgelegd die deelnemen aan diverse biologische processen, variërend van chromatineorganisatie tot cellulaire signalering ^1,2. Ondanks hun brede expressie en functionele belang blijven de moleculaire mechanismen van de meeste lncRNA's slecht gedefinieerd. Een groot obstakel is de identificatie van hun fysische eiwitpartners, met name RNA-bindende eiwitten (RBP's)^3,4,5.

Huidige RNA-centrische methoden zijn voornamelijk gebaseerd op chemische crosslinking, die zowel directe als indirecte RNA-eiwitinteracties vastlegt. Als gevolg hiervan zijn deze benaderingen geschikter voor globale interactommapping dan voor het identificeren van bona fide directe contacten⁶. Uitgebreide identificatie van RNA-bindende eiwitten gevolgd door massaspectrometrie (ChIRP-MS) is een veelgebruikte techniek voor het in kaart brengen van lncRNA-RBP-interacties vanwege het eenvoudige probeontwerp en de efficiënte workflow ^7,8. Conventionele ChIRP-MS gebruikt paraformaldehyde (PFA) crosslinking, die zowel directe RNA-eiwitcontacten als indirecte associaties gevangen die worden gemedieerd door brugfactoren ^9,10.

Daarentegen biedt UV-crosslinking bij 254 nm een cruciaal voordeel. Het koppelt RNA en eiwitten covalent alleen wanneer ze in contact zijn met bijna nul afstand (meestal <1 Å)¹¹. Dit proces zet waterstofbruggen om in stabiele covalente bindingen en maakt strenge wasvoorwaarden met een hoog zoutgehalte mogelijk die niet-covalent gebonden indirecte interactoren verwijderen. UV-gebaseerde benaderingen bieden daarom een grotere specificiteit voor directe RNA-eiwitinteracties dan chemische crosslinkingmethoden ^12,13. Desalniettemin blijven UV-gebaseerde benaderingen onderbenut in weefselafgeleide lncRNA-interactomstudies, grotendeels vanwege zorgen over de efficiëntie van kruisverbindingen en beperkte UV-penetratie.

Om directe interacties tussen lncRNA en eiwitten in een fysiologisch relevante context te onderzoeken, werd het lncRNA Tug1 geselecteerd als modelsysteem. Tug1 vormt een ideale maatstaf voor het valideren van een weefselcompatibele direct-interaction workflow vanwege het ernstige knockoutfenotype en hoge verrijking in de testis. Genetische ablatie van Tug1 resulteert in volledige mannelijke steriliteit, verminderde spermatogenese en abnormale spermamorfologie¹⁴. Daarnaast ondersteunt Tug1 de functie van Sertoli-cellen en de integriteit van de bloedtestisbarrière bij muizen met een hoog vetdieet¹⁵. Ondanks deze goed gevestigde fenotypes blijven de directe eiwitpartners die de functie van Tug1 in de testis bemiddelen—een orgaan dat grote aantallen RBP's uitdrukt die recent experimenteel zijn geprofileerd^{met 16}—onbekend. Deze kenniskloof weerspiegelt grotendeels het feit dat de meeste lncRNA-eiwitinteractie-mappingmethoden zijn ontwikkeld voor gekweekte celsystemen.

Om deze beperking aan te pakken, werd het ChIRP-framework aangepast door PFA-crosslinking te vervangen door UV-crosslinking om eiwitten te vangen die direct met Tug1 interageren. Kandidaatinteracties werden onafhankelijk gevalideerd door versterkte crosslinking immunoprecipitatie gevolgd door deep sequencing (eCLIP-seq)¹⁷. De workflow werd verder uitgebreid naar weefseltoepassingen door vers muistestikelweefsel te dissociëren in enkele cellen voorafgaand aan UV-crosslinking. Deze geoptimaliseerde aanpak werd aangeduid als cPDiRT (het vangen van eiwitten die direct interacteren met een RNA-doel).

De toepassing van cPDiRT op Tug1 in de muistestikel maakte direct-interactie mapping mogelijk in een native weefselcontext. Parallelle experimenten in gekweekte cellen leverden een vergelijking naast elkaar op PFA- en UV-gebaseerde interactieprofielen op. In combinatie met onafhankelijke eCLIP-validatie genereerde deze aanpak een hoogvertrouwende set van moleculaire partners die mogelijk bijdragen aan de functie van Tug1 tijdens de spermatogenese. Het hier gepresenteerde protocol maakt het mogelijk eiwitten te vangen die direct interageren met een doel-lncRNA in zowel gekweekte cellen als native weefsels. Door het directe interactoom van Tug1 in de testis te definiëren, bevordert deze methode mechanistische studies van een vruchtbaarheidsessentieel lncRNA en biedt het een generaliseerbaar platform voor het onderzoeken van lncRNA-eiwitinteracties in voortplantings- en andere complexe weefsels.

Protocol

Alle oplossingen werden bereid met nucleasevrij, proteasevrij ultrazuiver water en reagentia. Alle reagentia en apparatuur staan vermeld in de Materiaaltabel.

Alle dierproeven werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee van de Nanjing Medical University (Goedkeuringsnummer: IACUC-1812003-4) en werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de Zorg en het Gebruik van Laboratoriumdieren (National Research Council, 8e editie). Houd mannelijke C57BL/6 muizen (4 weken oud) onder een 12 uur licht/12 uur donker cyclus met ad libitum toegang tot voedsel en water. Minimaliseer het lijden van dieren door zo min mogelijk dieren te gebruiken die nodig zijn om statistische significantie te bereiken. Euthanaser muizen door CO₂-inademing gevolgd door een cervicale dislocatie volgens goedgekeurde institutionele protocollen.

1. Bereid buffers voor

1. Bereid cellysisbuffer voor
   1. Bereid cellysisbuffer voor met 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 10 mM EDTA en 1% SDS.
   2. Voeg direct voor gebruik 1 mM PMSF, proteaseremmercocktail en gespecialiseerde RNase-remmer toe.
      VOORZICHTIG: SDS is een huid- en oogirritant. Vermijd het inademen van stof of aerosolen. PMSF is zeer giftig, werkt als cholinesterase-remmer en is onstabiel in waterige oplossing. Bereid PMSF direct voor gebruik voor. Draag handschoenen en veiligheidsbril bij het hanteren van deze reagentia. Behandel PMSF in een chemische dampafzuigkap.
2. Bereid hybridisatiebuffer voor
   1. Bereid een hybridisatiebuffer voor met 750 mM NaCl, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA en 15% formamide.
   2. Voeg direct voor gebruik 1 mM PMSF, proteaseremmercocktail en gespecialiseerde RNase-remmer toe.
      OPMERKING: Bewaar formamide bij 4 °C, beschermd tegen licht.
      VOORZICHTIG: Formamide is een teratogeen- en voortplantingsrisico. Hanteer formamide in een chemische dampkap terwijl je handschoenen, een laboratoriumjas en veiligheidsbril draagt. Vermijd inademing en huidcontact.
3. Maak wasbuffer klaar
   1. Bereid wasbuffer voor met 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40, 0,1% SDS en 0,5% natriumdeoxycholaat.
   2. Bescherm de wasbuffer tegen licht tijdens het opbergen.
4. Bereid proteïnase K (PK) buffer voor
   1. Bereid een PK-buffer voor met 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,0), 1 mM EDTA en 0,5% SDS.
   2. Voeg direct voor gebruik proteïnase K toe aan een uiteindelijke concentratie van 5%.

2. Ontwerp en bereid sondes voor

1. Ontwerp antisense-probes
   1. Ontwerp antisense-oligonucleotideprobes met de online probe designer beschikbaar op singlemoleculefish.com¹⁸.
2. Verkrijg biotinylerende sondes
   1. Bestel antisense DNA-probes met een 3'-BiotinTEG-modificatie.
3. Bereid de sondepool voor
   1. Verdun elke probe afzonderlijk tot 100 μM.
   2. Meng gelijke volumes van alle probes om een probe pool te genereren. Houd een uiteindelijke gecombineerde oligonucleotideconcentratie van 100 μM.
   3. Bewaar de sondepool op -20 °C.
      OPMERKING: Aanbevolen ontwerpparameters van de probe zijn als volgt: (i) één probe per 100 bp doel-RNA, (ii) target GC-inhoud van 45%, (iii) probelengte van 20 nt, en (iv) afstand van 60–80 nt tussen de probes.
      OPMERKING: Als het RNA de door de probe-ontwerper geaccepteerde groottelimiet overschrijdt, verdeel dan de sequentie in kleinere segmenten vóór het ontwerp. Sluit repetitieve regio's en regio's met uitgebreide sequentiehomologie uit.

3. Voer celoogst, weefseldissociatie en UV-crosslinking uit

1. Bereid no-UV-besturingen voor
   1. Bereid controlemonsters voor parallel aan experimentele monsters.
   2. Laat de UV-crosslinkingstap weg uit controlemonsters.
   3. Voer alle volgende procedures uit, inclusief sonicatie, RNA-eiwit pull-down, RNA-extractie en eiwitextractie, identiek uit voor beide groepen.
      OPMERKING: Gebruik de no-UV-controle om UV-afhankelijke RNA-eiwitinteracties te onderscheiden van niet-specifieke achtergrondbinding.
2. Cellen oogsten en UV-kruisbinding uitvoeren
   1. Wash gekweekte cellen
      1. Was cellen drie keer met PBS om het resterende kweekmedium te verwijderen.
   2. Crosslinkcellen
      1. Verdeel 3 mL PBS gelijkmatig op een 15 cm kweekschaal.
      2. Bestral cellen in een 254 nm UV-kruisverbinder bij een dosis van 4000 mJ/^cm2.
   3. Verzamel gekruiste geschakelde cellen
      1. Verzamel cellen in PBS na crosslinking.
      2. Centrifugeer de suspensie en gooi het supernatant weg.
      3. Weeg de pellet en controleer een minimale pelletmassa van 500 mg per monster.
3. Dissocieer testikelweefsel en voer UV-crosslinking uit
   1. Maak testikels klaar
      1. Decapsuleer de testikels.
      2. Was het tissue twee keer met DMEM.
   2. Voer collagenase-vertering uit
      1. Incubeer weefsel in DMEM met 1 mg/mL collagenase IV bij 37 °C gedurende 5–15 minuten.
      2. Blijf verteren totdat samenkomende tubuli vrijkomen.
         OPMERKING: Blijf niet langer dan 15 minuten verteren.
   3. Was de samenkomende buisjes
      1. Centrifugeer de suspensie op 1000 × g gedurende 1 minuut bij 4 °C.
      2. Verwijder het supernatant.
      3. Was de pellet met 5–10 mL DMEM.
      4. Centrifugeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden.
   4. Voer trypsine vertering uit
      1. Sussie de pellet opnieuw in 0,25% trypsine met 1 mg/mL DNase I.
      2. Incubeus op 37 °C gedurende 5–15 minuten.
         OPMERKING: Blijf niet langer dan 15 minuten verteren.
   5. Enzymatische vertering stoppen
      1. Voeg een gelijke hoeveelheid DMEM toe, aangevuld met 10% FBS.
   6. Genereer een single-cell suspension
      1. Filter de suspensie door een 70 μm celfilter.
   7. Wascellen
      1. Centrifugecellen op 2000 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
      2. Gooi het supernatant weg.
      3. Was de pellet met 5–10 mL PBS.
      4. Centrifugeer opnieuw onder dezelfde omstandigheden.
   8. Crosslink-testikelcellen
      1. Suspenseer de single-cell suspension opnieuw in PBS.
      2. Verdeel de suspensie gelijkmatig op een 15 cm kweekschaal.
      3. Bestral cellen in een 254 nm UV-kruisverbinder bij een dosis van 4000 mJ/^cm2.
   9. Verzamel gekruiste geschakelde cellen
      1. Voor niet-UV-regelaars moet je irstraling weglaten.
      2. Verzamel cellen in PBS.
      3. Centrifugeer de suspensie en gooi het supernatant weg.
      4. Weeg de pellet en controleer een minimale pelletmassa van 500 mg per monster.
         OPMERKING: Het aantal muizen dat nodig is om ongeveer 500 mg celpellet te verkrijgen, hangt af van leeftijd en weefselopbrengst. In deze studie werden ongeveer 10–12 muizen van vier weken oud gebruikt.

4. Sonicatie uitvoeren

1. Maak lysaten klaar
   1. Sussen celpellets opnieuw in een cellysebuffer met een verhouding van 100 mg pellet per 1 mL buffer.
   2. Meng grondig om een homogene suspensie te verkrijgen.
2. Sonicate-monsters
   1. Sonicaat lysaten met behulp van een sonicator in het waterbad of een gerichte ultrasone.
   2. Ga door met de sonicatie totdat het lysaat visueel helder is.
      OPMERKING: Verifieer DNA-fragmentatie door agarosegel-elektroforese. Ga door met sonicatie totdat de meeste DNA-fragmenten tussen 1 kb en 2 kb liggen.

5. Voer RNA-eiwit pull-down uit

1. Verzamel invoermonsters
   1. Verwijder aliquots van lysaat voor inputcontroles.
   2. Reserveer ongeveer 10 μL voor RNA-analyse en 10 μL voor eiwitanalyse.
   3. Houd de invoermonsters op 37 °C tijdens de hybridisatie- en wasprocedures.
2. Preclear lysaten
   1. Voeg 30 μL voorgewassen magnetische kralen toe aan elk monster.
   2. Incubeer monsters bij 37 °C gedurende 30 minuten met voorzichtig mengen in een hybridisatieoven.
      OPMERKING: Was magnetische kralen voor gebruik. Plaats kralenaliquoten op een magnetische standaard voor 1 minuut of totdat de oplossing helder is. Verwijder de opslagoplossing volledig. Was de kralen twee keer met 500 μL cellysebuffer.
3. Verwijder preclearing-kralen
   1. Plaats monsters op een magnetische standaard.
   2. Breng het supernatant over in een verse buis.
   3. Herhaal de overdracht één keer om de resterende kralen volledig te verwijderen.
4. Hybridiseer-probes
   1. Voeg twee volumes hybridisatiebuffer toe aan elk monster.
   2. Voeg probes toe in een verhouding van 1 μL van 100 μM probe-materiaal per 1 mL lysaat (Aanvullende Tabel 1).
5. Incubate hybridisatiereacties
   1. Incubeer monsters bij 37 °C met een over-end rotatie gedurende 12–16 uur in een hybridisatieoven.
6. Bereid vangkralen voor
   1. Was 100 μL magnetische kralen drie keer met een cellysebuffer direct voor het einde van de hybridisatie.
   2. Verwijder alle resterende buffer na de laatste was.
7. Capture probe-bound complexen
   1. Kort centrifugehybridisatie-reacties.
   2. Suspendeer de gewassen kralen opnieuw in 1 ml gehybridiseerd monster.
8. Bind complexen aan kralen
   1. Zet de kraalophanging terug in de originele buis.
   2. Incubeer op 37 °C en meng 30–40 minuten.
9. Terugwinnen van kralen
   1. Kort centrifugemonsters.
   2. Plaats buizen op een magnetische standaard gedurende 1–2 minuten of totdat de oplossing helder is.
   3. Gooi het supernatant weg.
   4. Verwijder restvloeistof met een pipettip.
      OPMERKING: Vermijd het verstoren van de magnetische kraalkorrel tijdens het verwijderen van vloeistof.
10. Wash veroverde complexen
    1. Voeg 1 ml wasfilter toe.
    2. Was kralen op 37 °C en meng continu 5 minuten.
    3. Herhaal de wasprocedure vijf keer.
       OPMERKING: De washbuffer bevat 1 M NaCl, dat niet-covalente interacties tussen eiwit-eiwit en eiwit-RNA verstoort terwijl covalente UV-geïnduceerde kruisverbindingen behouden blijven. Deze strenge voorwaarden verwijderen indirecte interactoren en niet-specifieke achtergrond, waardoor directe eiwitpartners worden verrijkt¹⁹.
11. Reservemateriaal voor RNA-analyse
    1. Breng 1%–10% van de gewassen kralen over in een verse buis voor RNA-analyse.
    2. Gebruik de resterende kralen direct voor eiwitextractie of bewaar ze bij -80 °C.
       OPMERKING: Pauzeer het protocol indien nodig. Bewaar kraalmonsters bij -80 °C tot eiwitextractie.
12. Elute-eiwitten
    1. Voeg SDS sample buffer toe aan de kralen.
    2. Kook monsters op 95 °C gedurende 30 minuten om eiwitten te elueren en crosslinks om te keren.
    3. Ga verder met massaspectrometrie-analyse.

6. RNA extraheren

1. Digestieve eiwitten
   1. Suss de kraalgebonden RNA-monsters opnieuw in 100 μL PK-buffer.
   2. Stel RNA-invoermonsters aan tot een eindvolume van 100 μL met behulp van PK-buffer.
2. Incubeer met proteïnase K
   1. Incubeer monsters bij 50 °C gedurende 45 minuten met continue menging.
3. Inactiveer proteïnase K
   1. Verwarm monsters op 95 °C gedurende 10 minuten.
4. Voeg TRIzol-reagens toe
   1. Voeg 500 μL TRIzol-reagens toe aan elk monster.
   2. Vortex grondig.
   3. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur.
      VOORZICHTIG: Trizolreagens bevat fenol en guanidinethiocyanaat. Behandel het reagens in een chemische dampkap terwijl je handschoenen, een labjas en veiligheidsbril draagt. Vermijd inademing en huidcontact. Als er huidcontact is, was het dan direct met zeep en water.
5. Voer fasescheiding uit
   1. Voeg 100 μL chloroform toe aan elk monster.
   2. Vortex grondig.
   3. Incubeer 5 minuten op kamertemperatuur.
6. Herstel de waterige fase
   1. Centrifugemonsters bij 4 °C gedurende 15 minuten.
   2. Breng de bovenste waterige fase over naar een verse buis.
7. Bind RNA aan zuiveringskolommen
   1. Voeg een gelijk volume van 100% ethanol toe aan de waterige fase.
   2. Meng grondig.
   3. Laad monsters op RNA-zuiveringskolommen.
8. RNA zuiveren
   1. Voer RNA-opruiming uit volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Eluteer RNA in 30 μL nucleasevrij water.
9. Verifieer RNA-verrijking met qRT-PCR
   1. Gebruik 1 μL geëlueerd RNA per reactie voor kwantitatieve reverse transcription PCR (qRT-PCR).
   2. Beoordeel de verrijking van het doel-RNA ten opzichte van de controlegroepen.

7. LC-MS/MS-analyse uitvoeren

1. Eiwitten gescheiden door SDS-PAGE
   1. Meng eiwitten verkregen in stap 5.12 met 4× LDS-monsterbuffer.
   2. Verdeel eiwitten op een Bis-Tris gel van 4%–12%.
   3. Beits de gel met een zilverkleurset.
   4. Verwijder de hele eiwitbaan als één band.
2. Accisegelstukken
   1. Verwijder de eiwitband met een schone scalpel.
   2. Minimaliseer de hoeveelheid overtollige gel.
   3. Snijd de gel in ongeveer 1 mm^{van 3} stukken.
   4. Breng gelstukjes over in een buisje van 0,5 mL.
3. Destain-gelstukken
   1. Voeg 100 μL ontkleuringsoplossing toe.
   2. Vortex voor 10 minuten.
   3. Centrifugeer op 14.000 × g gedurende 1 minuut.
   4. Verwijder het supernatant.
   5. Herhaal de ontkleuringsprocedure totdat de gelstukjes transparant zijn.
4. Verminder eiwitten
   1. Voeg 100 μL reductieoplossing toe.
   2. Bred 30 minuten uit bij 56 °C.
   3. Koel monsters tot kamertemperatuur.
   4. Centrifugeer kort en verwijder het supernatant.
5. Alkylaateiwitten
   1. Voeg 100 μL alkylatieoplossing toe.
   2. Incubeer 20 minuten op kamertemperatuur in het donker.
   3. Verwijder het supernatant.
   4. Was gelstukken met 100 μL verteringsbuffer gedurende 5 minuten.
6. Digestieve eiwitten
   1. Voeg voldoende trypsine toe om de gelstukken volledig te bedekken.
   2. Broeden op 37 °C gedurende 16–18 uur.
7. Peptiden extraheren
   1. Voeg 30 μL extractieoplossing toe.
   2. Sonicate 15 minuten of vortex 30 minuten.
   3. Centrifugeer op 14.000 × g gedurende 1 minuut.
   4. Breng het supernatant over in een verse buis.
   5. Herhaal de extractieprocedure twee keer.
   6. Verzamel alle extracten.
   7. Droog gepoolde extracten in een vacuümconcentrator gedurende ongeveer 1 uur.
8. Maak peptiden schoon met een StageTip
   1. Resuspendeer gedroogde peptiden in 20 μL 0,1% mierenzuur (FA).
   2. Laad samples op een C18 StageTip.
   3. Centrifugeer op 1.000 × g gedurende 2 minuten.
   4. Was de StageTip met 20 μL 0,1% FA.
   5. Eluteer peptiden met 20 μL van 60% acetonitril/0,1% FA in een LC-MS-buisje.
   6. Droog de eluate.
   7. Resuspendeer peptiden in 10 μL van 0,1% FA.
      OPMERKING: Pauzeer het protocol indien nodig. Bewaar gezuiverde peptiden bij -80 °C vóór de LC-MS/MS-analyse.
9. LC-MS/MS-gegevens verkrijgen
   1. Peptiden worden opnieuw samengesteld in 0,1% mierenzuur.
   2. Afzonderlijke peptiden op een 75 μm × 250 mm C18 analytische kolom met een debiet van 300 nL/min.
   3. Pas de volgende oplossing B-gradiënt aan (0,1% mierenzuur in acetonitril):
      2%–25% B over 0–40 min
      25%–40% B over 40–48 min
      40%–99% B over 50–57 min
      Houd 3 minuten op 99% B
   4. Bedien de massaspectrometer in data-afhankelijke verzamelmodus.
   5. Verkrijg full-scan MS-spectra over een m/z-bereik van 350–1200 met een resolutie van 70.000.
   6. Verkrijg vijftien opeenvolgende hogere-energie collisional dissociation (HCD) MS/MS-scans met een resolutie van 17.500.
   7. Neem één microscan per scan op.
   8. Stel dynamische uitsluiting in op 30 seconden.
10. Proces-massaspectrometriegegevens
    1. Verwerk ruwe data met MaxQuant (v2.1.0.0).
    2. Zoek spectra tegen muiseiwitsequenties die zijn gedownload van UniProt.
    3. Specificeer trypsine als verteringsenzym.
    4. Sta maximaal twee gemiste decolletés toe.
    5. Specificeer methionineoxidatie als een variabele aanpassing.
    6. Specificeer cysteïnecarbamidomethylering als een vaste aanpassing.
    7. Stel de toleranties voor de massa van de voorloper en fragmenten in op respectievelijk 15 ppm en 20 ppm.
    8. Beheers het percentage valse ontdekkingen op 1% op zowel peptide- als eiwitniveau.
    9. Schat de eiwitabundantie met iBAQ-gebaseerde labelvrije kwantificatie.

8. Voer genontologie-verrijkingsanalyse uit

1. Functionele verrijking analyseren
   1. Voer Gene Ontology (GO) verrijkingsanalyse uit met het clusterProfiler R-pakket (v4.6.0).
   2. Gebruik de GO-database (v2024-09-20) als bron voor referentieannotatie.
   3. Pas de Benjamini-Hochberg-correctie toe voor meerdere tests.
   4. Definieer statistische significantie als een aangepaste P-waarde (FDR) < 0,05.

9. Voer eCLIP-seq validatie uit

1. Bereid eCLIP-samples voor
   1. Voer enhanced crosslinking immunoprecipitation (eCLIP) uit zoals eerder beschreven¹⁷.
   2. Bereid UV-crosslinked celmonsters voor voor immunoprecipitatie van PABPC1 en CCT3.
   3. Lyse-monsters gebruiken met eCLIP lysisbuffer.
2. Immunoprecipitate RNA-eiwitcomplexen
   1. Voeg 10 μg antistof toe aan elk monster.
   2. Vang RNA-eiwitcomplexen op magnetische kralen.
   3. Verzamel inputmonsters vóór immunoprecipitatie.
3. Bereid RNA-bibliotheken voor
   1. Defosforyleert eiwitgebonden RNA's.
   2. Ligateer een 3' RNA-adapter aan teruggewonnen RNA.
   3. Was immunoprecipitatieve en invoermonsters onder strenge omstandigheden.
   4. Elote complexen door de kralen te koken.
   5. Resolutie van monsters op een 4%–12% Bis-Tris gradient gel.
   6. Verwijder gescheiden complexen naar een nitrocellulosemembraan.
4. RNA terugwinnen
   1. Verwijder een membraangebied dat op maat is afgestemd.
   2. Eiwitten verteren met ureum en proteïnase K.
   3. Herstel RNA uit het membraan.
5. Genereer sequencingbibliotheken
   1. Omgekeerd transcrib teruggewonnen RNA in cDNA.
   2. Zuiver cDNA met een exonuclease I en garnalen-alkalische fosfatase-mengsel.
   3. Ligateer een DNA-adapter aan het 3'-uiteinde van het cDNA met behulp van T4 RNA-ligase.
   4. Versterk bibliotheken met behulp van een high-fidelity DNA-polymerase.
   5. Afzonderlijke versterkte bibliotheken op een agarosegel met een laag smeltpunt van 3%.
   6. Zuiver grootte-geselecteerde bibliotheken met behulp van een gelextractiekit.
   7. Sequentiebibliotheken op een Illumina-platform.
6. Analyseer eCLIP-seq-gegevens
   1. Analyseer sequencinggegevens met behulp van de ENCODE eCLIP-pijplijn²⁰.
   2. Trimadapters en 3' adapterdimers met cutadapt (v1.14).
   3. Align leest naar UCSC-repeat-elementen met STAR (v2.7.6a).
   4. Verwijder reads mapping naar repeat-elementen.
   5. Lijn de resterende reads uit op het mm10 referentiegenoom (GENCODE vM23).
   6. Verwijder PCR-duplicaten.
   7. Identificeer verrijkte bindingsplaatsen met CLIPPER.
   8. Definieer significante pieken als die met fold-verrijking ≥ 8 en een aangepaste P ≤ 0,001.
   9. Identificeer reproduceerbare pieken met behulp van een onreproduceerbare ontdekkingssnelheid (IDR) drempel van 0,01.

Resultaten

Om Tug1-bindende eiwitten te identificeren, werd UV-crosslinking opgenomen in de ChIRP-workflow, waarbij een methode werd vastgesteld met de naam cPDiRT (Figuur 1). Conventionele ChIRP werd voor het eerst uitgevoerd in GC2-cellen om Tug1-interagerende eiwitten te verrijken (Figuur 2A, B). Massaspectrometrieanalyse identificeerde meer dan 190 eiwitten die verrijkt waren ten opzichte van de negat...

Discussie

cPDiRT is ontwikkeld als een aangepast ChIRP-gebaseerd protocol dat paraformaldehyde (PFA) crosslinking vervangt door UV-crosslinking om selectief directe lncRNA-eiwitinteracties vast te leggen. Door enzymatische dissociatie van vers testikelweefsel in individuele cellen te combineren met UV-crosslinking, werd direct-interactie mapping uitgebreid van gekweekte cellijnen naar native weefsels. Parallelle experimenten in gekweekte cellen maakten een vergelijking naast elkaar mogelijk van PF...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Gibco	25200056	voor weefsel dissociatie en bereiding van eencellen suspensie
100% Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	voor RNA opruiming
AffinityScript Reverse Transcriptase	Agilent	600107	voor eCLIP cDNA synthese
Anti-CCT3 Antilichaam	Abcam	Ab225878	antilichaam voor eCLIP
Anti-PABPC1 Antilichaam	Abcam	Ab312314	antilichaam voor eCLIP
Chloroform	Sigma-Aldrich	C2432	voor RNA extractie
Collageenase Type IV	Sigma-Aldrich	C5138	voor enzymatische dissociatie van testiculaire weefsel
Defosforyleringsreagentia (T4 PNK)	New England Biolabs	M0201S	voor eCLIP RNA defosforylering
DMEM Hoog Glucose Medium	Gibco	11965092	voor celkweek en weefsel dissociatie buffer
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Magnetische Kralen	Thermo Fisher Scientific	65001	voor het vastleggen van biotinyleerde probe-RNA-eiwit complexen
DynaMag-15 Magneet	Thermo Fisher Scientific	12301D	voor magnetische kralenscheiding
DynaMag-2 Magneet	Thermo Fisher Scientific	12321D	voor magnetische kralenscheiding
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884	voor het cheleren van divalente cationen in lysis- en wasbuffers
Exonuclease I	New England Biolabs	M0293S	voor eCLIP cDNA zuivering
Foetaal Rund Serum (FBS)	Gibco	10099141C	voor het stoppen van trypsine spijsvertering
Formamide	Thermo Fisher Scientific	AM9342	voor hybridisatie buffer bereiding
Hybridisatie Oven	TUOHE	LF-I	voor sonde hybridisatie en kralen wassen
Laag-Smelt Temperatuur Agarose	Sigma-Aldrich	A9414	voor eCLIP bibliotheek grootte selectie
MinElute Gel Extractie Kit	Qiagen	28604	voor eCLIP bibliotheek grootte selectie
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	voor RNA zuivering
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653	voor het bereiden van hoge zout wasbuffer
Nitrocellulose Membraan	GE Healthcare / Amersham	10600002	voor eCLIP western blot overdracht
NP-40	Thermo Fisher Scientific	85125	voor wasbuffer detergent
Nuclease- en protease-vrij water	Thermo Fisher Scientific	10977035	voor het bereiden van nuclease-vrije oplossingen
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Thermo Fisher Scientific	NP0322BOX	voor eCLIP grootte selectie
NuPAGE Bis-Tris Precast Gels	Thermo Fisher Scientific	NP0321BOX	voor SDS-PAGE eiwitscheiding
PBS (pH 7.4)	Thermo Fisher Scientific	10010023	voor cel wassen en resuspenderen
Fenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Sigma-Aldrich	P7626	serine protease remmer voor cel lysis buffer; vers toegevoegd voor gebruik
Protease Inhibitor Cocktail	Roche	4693132001	breed-spectrum protease remmer voor cel lysis buffer; vers toegevoegd voor gebruik
Proteinase K	Sigma-Aldrich	P4850	voor eiwit spijsvertering in RNA extractie
qRT-PCR Master Mix	Thermo Fisher Scientific	11704044	voor kwantitatieve RT-PCR om RNA verrijking te bevestigen
RNase/Protease-Vrije DNase I Oplossing	Thermo Fisher Scientific	EN0521	voor weefsel dissociatie
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104	voor RNA zuivering
SDS-PAGE Sample Loading Buffer	Beyotime	P0286	voor eiwit monster voorbereiding
Garnaal Alkalische Fosfatase	New England Biolabs	M0371S	voor eCLIP cDNA zuivering
Zilver Stain Kit	Beyotime	P00175	voor het visualiseren van eiwitten in SDS-PAGE gels
Natrium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750	voor wasbuffer detergent
Natrium dodecylsulfaat (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	voor cel lysis en eiwit denaturatie
Superase-in RNase Remmer	Thermo Fisher Scientific	AM2694	speciale RNase remmer; vers toegevoegd voor gebruik
T4 RNA Ligase	New England Biolabs	M0204	voor eCLIP adapter ligatie
Tris–HCl (pH 7.0)	Sigma-Aldrich	T5941	voor het bereiden van lysis, hybridisatie en was buffers
TRIzol Reagent	Thermo Fisher Scientific	15596026CN	voor RNA extractie
Ultrasoon cel breker	ATPIO	ATPIO-650D	voor cel lysis en DNA fragmentatie
Ultraviolet Crosslinker	Analytik Jena	UVP CL-1000	voor UV crosslinking van RNA-eiwit interacties
ureum	Sigma-Aldrich	U5128	voor eCLIP eiwit degradatie op membraan