Methodenartikel

L5 lumbale laminectomie bij oudere C57BL/6J-muizen om postoperatieve cognitieve dysfunctie te modelleren

43 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71733

⸱

22 september 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shuguang Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Pharmacology, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde L5 lumbaire laminectomie bij oudere C57BL/6J muizen om een model van postoperatieve cognitieve dysfunctie te vestigen terwijl locomotorische beperkingen worden geminimaliseerd, ter ondersteuning van gedragsmatige, histologische en mechanistische studies naar perioperatieve neurocognitieve stoornissen.

Samenvatting

Postoperatieve cognitieve dysfunctie (POCD) is een veelvoorkomende neurologische complicatie na chirurgie en anesthesie, met name bij ouderen, en is geassocieerd met een vertraagd herstel, een verlengd ziekenhuisverblijf en een verminderde kwaliteit van leven. Orthopedische en spinale ingrepen zijn gekoppeld aan een relatief hoog risico op POCD; preklinische modellen die de perioperatieve kenmerken van rugchirurgie nauwkeurig weerspiegelen, blijven echter beperkt. Veelgebruikte modellen, waaronder laparotomie en tibiale fracturen, kunnen leiden tot aanhoudende locomotorische beperkingen en langdurige perifere ontsteking, wat de interpretatie van cognitieve gedragsuitkomsten kan bemoeilijken. Hier beschrijft dit protocol een gestandaardiseerd, kosteneffectief protocol voor het modelleren van POCD middels een L5 lumbale laminectomie onder sevofluraan-anesthesie bij mannelijke C57BL/6J-muizen van 18 maanden oud. De procedure wordt uitgevoerd met routinematige chirurgische instrumenten en veroorzaakt een gecontroleerde chirurgische letseling, terwijl aanhoudende motorische tekorten worden geminimaliseerd. De cognitieve functie wordt geëvalueerd met de 'novel object recognition test', de 'novel arm Y-maze' en de Barnes-maze, terwijl hippocampale neuronale beschadiging en neuroinflammatoire veranderingen respectievelijk worden beoordeeld via Nissl-kleuring en Iba1-immunofluorescentie. Representatieve resultaten tonen een behouden locomotorische activiteit, een verminderde cognitieve prestatie, een verminderde hippocampale neuronale integriteit en een verhoogde hippocampale neuroinflammatie na de operatie. Dit gestandaardiseerde en toegankelijke model biedt een klinisch relevant platform voor het onderzoeken van de mechanismen die ten grondslag liggen aan cognitieve dysfunctie geassocieerd met rugchirurgie en voor het evalueren van potentiële perioperatieve neuroprotectieve interventies.

Inleiding

Postoperatieve cognitieve dysfunctie (POCD) wordt gedefinieerd als een afname van het leervermogen en geheugen, de aandacht, de verwerkingssnelheid en de executieve functies na anesthesie en chirurgie1, waarbij met name oudere patiënten worden getroffen, en de gerapporteerde incidentie lijkt te variëren afhankelijk van de chirurgische context en de patiëntenpopulatie2,3. Er is gerapporteerd dat POCD frequent voorkomt bij oudere volwassenen die een electieve orthopedische ingreep ondergaan4. Klinisch gezien kan POCD weken tot maanden na de operatie aanhouden en is het geassocieerd met een verlengde ziekenhuisopname en een verhoogde mortaliteit5,6,7. Met de voortdurende vergrijzing van de bevolking en het stijgende aantal chirurgische ingrepen wereldwijd, is POCD een belangrijk volksgezondheidsvraagstuk en een relevant punt binnen de perioperatieve zorg geworden.

Pathofysiologisch gezien wordt POCD beschouwd als een multifactoriaal syndroom dat wordt uitgelokt door chirurgisch trauma en blootstelling aan anesthetica, waarbij neuroinflammatie, oxidatieve stress, ontregeling van autofagie en synaptische dysfunctie tot de voorgestelde mechanismen behoren die ten grondslag liggen aan neuronale dysfunctie in cognitie-relevante regio's zoals de hippocampus8. Om deze mechanismen te ontleden en kandidaatinterventies te evalueren, is een reeks preklinische POCD-paradigma's ontwikkeld. Preklinische paradigma's omvatten modellen met enkel anesthesie, modellen op basis van abdominale chirurgie en orthopedische letselmodellen zoals een tibiale fractuur9. Hoewel deze modellen het vakgebied hebben vooruitgestuwd, recapituleren ze mogelijk niet volledig de perioperatieve kenmerken die relevant zijn voor rugchirurgie, en sommige kunnen confounders introduceren, zoals aanhoudende locomotorische tekorten en langdurige weefselinflammatie, die cognitieve read-outs en mechanistische interpretaties bemoeilijken.

Van de beschikbare chirurgische strategieën hebben we gekozen voor een model van een lumbale laminectomie van L5 om vroege postoperatieve cognitieve stoornissen te onderzoeken in een gestandaardiseerde en ruggengraat-relevante chirurgische context. Deze procedure biedt een gecontroleerde, gelokaliseerde chirurgische beschadiging onder inhalatieanesthesie, waardoor onderzoek naar postoperatieve neuro-inflammatoire reacties en cognitieve dysfunctie mogelijk is zonder overduidelijke motorische beperkingen te veroorzaken. Door verfijning van cruciale operatieve stappen biedt dit protocol een gestandaardiseerde, praktische en kosteneffectieve methode voor het bestuderen van cognitieve stoornissen geassocieerd met ruggengraatchirurgie en het evalueren van perioperatieve neuroprotectieve strategieën.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Zhejiang University (ethische goedkeuringsnummer: ZJU20260153).

1. Preoperatieve voorbereiding

  1. Proefdieren, groepsindeling, analgesie en blindering
    1. Gebruik 18 maanden oude mannelijke C57BL/6J-muizen met een gewicht van 30–34 g. Huisvest de muizen onder een licht-/donkercyclus van 12 h met vrije toegang tot voedsel en water.
    2. Laat de muizen zich gedurende ten minste 7 dagen aanpassen aan de huisvestingscondities vóór de chirurgie. Verdeel de muizen na de acclimatisatie willekeurig over de L5-laminectomiegroep of de controlegroep.
    3. Ken aan elke muis een gecodeerd identificatienummer toe vóór de experimentele procedures. Houd de code voor de groepsindeling bij, zodat de gedragsbeoordelingen geblindeerd voor de behandeling kunnen worden uitgevoerd.
    4. Onderga voor de muizen in de L5-laminectomiegroep sevofluraan-anesthesie, gevolgd door een L5 lumbale laminectomie. Stel de muizen in de controlegroep niet bloot aan sevofluraan-anesthesie, voorbereiding van de operatielocatie of chirurgische interventie.
    5. Dien meloxicam subcutaan toe in een dosis van 2 mg/kg aan muizen in beide groepen. Dien de eerste dosis toe na de inductie van de anesthesie in de L5-laminectomiegroep en op het tijdstip dat overeenkomt met het einde van de chirurgie in de controlegroep.
    6. Dien vervolgens elke 24 h gedurende 48 h subcutane doses meloxicam van 2 mg/kg toe aan muizen in beide groepen. Huisvest, hanteer en monitor beide groepen onder dezelfde condities gedurende de gehele experimentele periode.
    7. Voer alle gedragsbeoordelingen uit volgens hetzelfde experimentele schema voor beide groepen. Zorg ervoor dat de onderzoeker die de gedragsbeoordelingen uitvoert geblindeerd blijft voor de groepsindeling.
  2. Steriliseer alle chirurgische instrumenten en desinfecteer de chirurgische werkruimte. Verwarm een warmtemat voor om de lichaamstemperatuur tijdens de anesthesie op peil te houden. Bereid meloxicam voor voor perioperatieve toediening.
  3. Zet het gasanesthesieapparaat aan en plaats de muis in een inductiekamer. Induceer algehele anesthesie met 3–5% sevofluraan gedurende 3–5 min, terwijl een zuurstofstroom van 1 L/min wordt gehandhaafd.
  4. Verplaats de geanestheseerde muis naar het chirurgische platform. Handhaaf de anesthesie met 1,5–3% sevofluraan via een anesthesiemasker bij een zuurstofstroom van 0,5–0,8 L/min. Dien meloxicam subcutaan toe in een dosis van 2 mg/kg. De totale duur van de anesthesie, gemeten vanaf het begin van de sevofluraan-inductie, is ongeveer 4 h. Pas de sevofluraanconcentratie naar behoefte aan om een stabiel chirurgisch anesthesievlak te handhaven.
  5. Positioneer de muis in buikligging met de lumbale wervelkolom naar boven gericht. Zet de voorpoten voorzichtig vast met tape om het dier te stabiliseren en een onbelemmerde toegang tot het L5-operatieveld te verkrijgen.
  6. Bevestig een adequate diepte van de anesthesie door de afwezigheid van de pedaalreflex te verifiëren. Breng oogzalf aan om uitdroging van het hoornvlies te voorkomen.
  7. Verwijder het haar van de lumbale middellijn (ongeveer L3–S1) met een trimmer voor kleine dieren. Desinfecteer de blootgestelde huid met 75% ethanol en vervolgens met povidonjodium, waarbij de procedure 2–3 keer wordt herhaald om aseptische condities te waarborgen.

2. L5 lumbale laminectomie-operatie

OPMERKING: In het huidige protocol werden alle chirurgische stappen uitgevoerd onder directe visualisatie, zonder stereomicroscoop of vergrotingsbrillen.

  1. Plaats de geanestheseerde muis in buikligging op een voorverwarmd chirurgisch platform. Zet de voorpoten met tape vast om het lichaam te stabiliseren en de lumbaalregio volledig bloot te leggen (Figuur 1).
  2. Identificeer het L5-wervelniveau aan de hand van oppervlakkige referentiepunten. Palpeer de bilaterale crista iliaca en trek een denkbeeldige transversale lijn die hun hoogste punten verbindt.
  3. Gebruik de transversale lijn als bijbenadering voor de L5–L6 intervertebrale ruimte. Centreer de geplande huidincisie iets craniaal ten opzichte van deze lijn om de L5-lamina te targeten.
  4. Desinfecteer de chirurgische plek. Maak een midline longitudinale huidincisie van ongeveer 1,5–2,0 cm lang over het vooraf bepaalde L5-niveau om de L4–L6 regio bloot te leggen.
  5. Retraheer de huidranden met steriele pincetten. Leg de dorsale fascia bloot en identificeer de midline fasciale raphe.
  6. Bevestig het wervelniveau na het blootleggen van de wervelkolom. Identificeer de lumbosacrale overgang en de meest caudale lumbale wervel.
  7. Identificeer L5 als de wervel direct craniaal van L6, aangezien C57BL/6-muizen doorgaans zes lumbale wervels hebben. Bevestig het niveau door twee wervels craniaal vanaf de lumbosacrale overgang te tellen.
  8. Maak een kleine opening langs de midline fasciale raphe. Retraheer de paraspinale spieren bilateraal onder directe visualisatie.
  9. Scheid de spieren naast het L5-doornfortuitum om de onderliggende lamina bloot te leggen. Breid de blootlegging craniaal uit tot het L4-doornfortuitum en caudaal tot het L6-doornfortuitum, totdat alle drie de doornfortuita duidelijk zichtbaar zijn.
  10. Voer primair bot-nabije botte dissectie uit met wattenstaafjes of fijne pincetten. Gebruik scherpe dissectie alleen indien nodig om fasciale adhesies los te maken en bloedingen te minimaliseren.
  11. Houd de laterale retractie in stand met wattenstaafjes om de L5-lamina en de L5–L6 interlaminaire ruimte volledig bloot te leggen. Bevestig het wervelniveau opnieuw voordat u verder gaat.
  12. Pak het L5-doornfortuitum voorzichtig vast met een pincet en til het doornfortuitum en de aangrenzende lumbale wervelkolom op tot een hoek van ongeveer 30° ten opzichte van het chirurgisch platform om de L5–L6 interlaminaire ruimte te verbreden.
  13. Voer de gesloten punten van de oogheelkundige schaar onder directe visualisatie in de L5–L6 interlaminaire ruimte in. Beweeg de schaar voort langs een ondiep vlak direct onder de caudale rand van de L5-lamina.
  14. Open de schaar lichtjes om de initiële botopening te maken. Vergroot het laminectomievenster door opeenvolgend kleine botfragmenten langs de laminaire randen te verwijderen. Beperk de botverwijdering tot de dorsale L5-lamina en voorkom dat het botvenster lateraal uitbreidt naar de bilaterale facetgewrichten.
  15. Vermijd een excessieve insertiediepte en excessieve snijkracht om letsel aan de dura mater te voorkomen.
  16. Ga verder met het stapsgewijs verwijderen van de lamina totdat de dura mater duidelijk zichtbaar is door het botvenster.
  17. Inspecteer het operatieveld zorgvuldig. Bevestig de afwezigheid van actieve bloedingen en verifieer dat de dura mater intact is gebleven.
  18. Spoel de chirurgische plek uit met warme steriele zoutoplossing. Bereik hemostase door middel van zachte compressie.
  19. Sluit de wond in lagen. Sluit de huid met 6-0 nylon hechtingen en desinfecteer de incisieplaats.
  20. Zet na wondsluiting de sevofluraan-anesthesie voort totdat de totale anesthesieduur ongeveer 4 u bedraagt. Stop daarna de toediening van sevofluraan en begin met de postoperatieve zorg.

3. Postoperatieve zorg

  1. Dien op het tijdstip dat overeenkomt met het einde van de operatie in de laminectomiegroep meloxicam subcutaan toe in een dosis van 2 mg/kg aan de muizen in de controlegroep. Plaats elke muis in de laminectomiegroep op een temperatuurgecontroleerd warmtekussen en handhaaf de lichaamstemperatuur totdat de muis het bewustzijn terugkrijgt en een stabiele spontane ademhaling en motorische activiteit vertoont.
  2. Plaats elke muis in de laminectomiegroep na volledig herstel van de anesthesie terug in de eigen kooi. Monitor het dier vervolgens totdat een normale voortbeweging is waargenomen. Dien in beide groepen elke 24 u gedurende 48 u opeenvolgende doses meloxicam subcutaan toe in een dosis van 2 mg/kg.
  3. Inspecteer dagelijks tot postoperatieve dag 3 de chirurgische incisie en de integriteit van de hechtingen. Anestheseer de muis opnieuw en vervang indien nodig losgeraakte of gebroken hechtingen.
  4. Controleer de incisie dagelijks op zwelling, bloedingen, uitscheiding of tekenen van lokale ontsteking.
  5. Monitor het lichaamsgewicht, het verzorgingsgedrag, de spontane activiteit en de voedsel- en waterinname gedurende de gehele postoperatieve periode.
  6. Euthanaseer elke muis op humane wijze vóór het geplande experimentele eindpunt indien aan een van de volgende vooraf gedefinieerde humane eindpuntcriteria wordt voldaan: een verlies van ≥20% van het preoperatieve lichaamsgewicht; volledige anorexie gedurende 24 u of een voedselinname lager dan 50% van de normale hoeveelheid gedurende 3 opeenvolgende dagen; onvermogen of sterke onwil om te staan of toegang te krijgen tot voedsel of water, aanhoudend gedurende 24 u na herstel van de anesthesie; of een moribunde toestand gekenmerkt door een uitgesproken depressie vergezeld van een lichaamstemperatuur onder 37 °C.

4. Gedragsmatige beoordeling van POCD

  1. Open Field-test (Locomotieve controle; postoperatieve dag 3)
    1. Voer de open-field-test uit in een arena van 45 cm × 45 cm met wanden van 40 cm hoog bij een verlichtingsniveau van 20 lux. Positioneer de videocamera direct boven het midden van de arena, zodat het gehele testgebied binnen het gezichtsveld valt.
    2. Plaats de muis in het midden van de arena en start de videotracking onmiddellijk na plaatsing. Laat de muis 5 min vrij verkennen. Analyseer de volledige sessie van 5 min en bereken de totale afgelegde afstand en de gemiddelde bewegingssnelheid met behulp van het videotrackingsysteem.
  2. Ganganalyse
    1. Voer op postoperatieve dag 3 een ganganalyse uit met een geautomatiseerd ganganalysesysteem.
    2. Plaats elke muis aan één uiteinde van de loopbaan en laat deze vrij over de loopbaan lopen. Registreer de pootafdrukken tijdens de locomotie met de hogesnelheidscamera die in het ganganalysesysteem is geïntegreerd.
    3. Registreer gangtesten voor elke muis en verzamel drie geldige runs met een continue voorwaartse beweging over de loopbaan voor verdere analyse.
    4. Analyseer de geregistreerde pootafdrukgegevens met de ganganalysesoftware. Beoordeel de automatisch geïdentificeerde pootafdrukken en corrigeer indien nodig handmatig de classificatie van de rechtervoorpoot, linkervoorpoot, rechterachterpoot en linkerachterpoot voordat de gangparameters worden geëxtraheerd.
    5. Kwantificeer de staplengte, standtijd, zwaaisnelheid en afdrukoppervlak, en bereken de gemiddelde waarde van de drie geldige runs per muis voor statistische analyse.
  3. Barnes-doolhof (Ruimtelijk leren en geheugen; postoperatieve dagen 4–6)
    ​OPMERKING: Voer de Barnes-doolhof-test eenmaal per dag uit gedurende drie opeenvolgende dagen, beginnend op postoperatieve dag 4. Voer de tests uit binnen hetzelfde dagelijkse tijdvenster om circadiane variabiliteit te minimaliseren.
    1. Positioneer de ontsnappingsbox onder het aangewezen doelgat. Behoud gedurende het hele experiment dezelfde doellocatie.
    2. Plaats de muis in het midden van het doolhof om elke test te beginnen. Geef de muis maximaal 3 min de tijd om de ontsnappingsbox te zoeken. Beëindig de test zodra de muis de ontsnappingsbox binnengaat.
    3. Leid de muis voorzichtig naar het doelgat als deze de ontsnappingsbox niet binnen 3 min kan vinden. Laat de muis kort in de ontsnappingsbox blijven om het aanleren van de taak te versterken.
    4. Registreer de ontsnappingstijd en de afgelegde afstand met het videotrackingsysteem. Ken voor tests waarbij de muis de ontsnappingsbox niet binnen 3 min binnengaat een ontsnappingstijd van 180 s toe. Neem alleen de ontsnappingstijd en afgelegde afstand die tijdens de laatste sessie op dag 3 zijn geregistreerd op in de statistische analyse.
  4. Herkenning van nieuwe objecten (Herkenningsgeheugen; postoperatieve dagen 3–4)
    ​OPMERKING: Gebruik dezelfde arena en hetzelfde videotrackingsysteem als beschreven voor de open-field-test. Gebruik de open-field-sessie op postoperatieve dag 3 om de muizen te laten wennen aan de testarena vóór de training voor de herkenning van nieuwe objecten.
    1. Plaats tijdens de trainingssessie twee identieke cilindrische objecten op symmetrische posities in de arena. Laat de muis 5 min vrij verkennen.
    2. Na een retentie-interval van 1 u wordt één bekend cilindrisch object vervangen door een nieuw kubusvormig object. Varieer de positie van het nieuwe object willekeurig tussen de muizen om een eventuele zijvoorkeur te minimaliseren. Laat de muis 5 min verkennen.
    3. Registreer de exploratietijd voor de bekende en nieuwe objecten met het videotrackingsysteem. Neem alleen muizen mee in de analyse met een totale objectexploratietijd van ten minste 3 s.
    4. Bereken de voorkeursindex (PI) als:
      Formule voor voorkeursindex: PI = T_novel / (T_novel + T_familiar) × 100%.
      Definieer Tnovel en Tfamiliar als respectievelijk de tijd besteed aan het verkennen van de nieuwe en de bekende objecten tijdens de testsessie.
  5. Y-doolhof met nieuwe arm (Ruimtelijk erkenningsgeheugen; postoperatieve dag 5)
    1. Voer de test uit in een Y-vormig doolhof bestaande uit drie identieke armen die onder een hoek van 120° van elkaar staan. Blokkeer willekeurig één arm met een ondoorzichtige deur en wijs deze arm aan als de nieuwe arm.
    2. Selecteer willekeurig één van de twee open armen als startarm. Wijs de overgebleven open arm aan als de bekende arm. Plaats de muis aan het uiteinde van de startarm en laat deze 5 min vrij de twee toegankelijke armen verkennen.
    3. Na een inter-testinterval van 1 u wordt de ondoorzichtige deur verwijderd en keert de muis terug naar het uiteinde van dezelfde startarm.
    4. Laat de muis 5 min vrij alle drie de armen verkennen.
    5. Definieer een armingang als het moment waarop het getrackte lichaamscentrum vanuit de centrale zone een vooraf gedefinieerde armzone binnengaat. Registreer het aantal ingangen en de tijd die in elke arm wordt doorgebracht met het videotrackingsysteem.
    6. Bereken de op tijd gebaseerde voorkeursindex voor de nieuwe arm als:
      Tijdberekeningsformule voor gedragsstudie; vergelijking die het percentage tijd in de nieuwe arm toont.
      Definieer Tnovel, Tstart en Tfamiliar als respectievelijk de tijd doorgebracht in de nieuwe, start- en bekende arm.
    7. Bereken de op ingangen gebaseerde voorkeursindex als:
      Formule voor ingangen in de nieuwe arm, E_novel/E_total, vergelijking voor analyse van gedragsexperiment.
      Definieer Enovel als het aantal ingangen in de nieuwe arm, en Etotal als het totale aantal ingangen in alle drie de armen tijdens de testrun.

5. Weefselverwerking, Nissl-kleuring en immunofluorescentiekleuring

  1. Weefselverwerking
    1. Anestheseer de muis diep bij het vastgestelde experimentele eindpunt met 3% sevofluraan, toegediend met een zuurstofstroomsnelheid van 2 L/min.
    2. Bevestig een adequate diepte van de anesthesie door de afwezigheid van de pedale terugtrekreflex. Voer, terwijl de diepe anesthesie wordt gehandhaafd en vóór de hartstilstand, een transcardiale perfusie uit met 20 mL fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om intravasculair bloed te verwijderen.
    3. Perfundeer de muis onmiddellijk met 20 mL 4% paraformaldehyde (PFA).
    4. Disseceer de volledige hersenen zorgvuldig. Dompel de hersenen 24 u gedurende 4 °C onder in 4% PFA voor postfixatie.
    5. Breng de hersenen over naar 30% sucrose totdat het weefsel volledig zinkt.
    6. Bed μια de hersenen in optimal cutting temperature (OCT) compound.
    7. Bevries het ingebedde weefsel snel en bewaar het bij −80 °C tot de cryosectie.
  2. Nissl-kleuring
    1. Breng cryosecties van 16 µm naar kamertemperatuur. Laat de coupes 20 min aan de lucht drogen.
    2. Spoel de coupes 2 min met PBS.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de weefselsecties stevig aan de coupes blijven kleven vóór het kleuren.
    3. Bedek de secties volledig met toluidineblauw-kleuringsoplossing. Incubeer 30 min bij 55 °C.
      OPMERKING: Optimaliseer de kleuringstijd empirisch voor secties van 16 µm om overkleuring te voorkomen.
    4. Spoel de coupes kort gedurende 10–30 s met gedestilleerd water.
    5. Differentieer de secties opeenvolgend in 95%, 85% en 75% ethanol gedurende elk 2 min.
      OPMERKING: Pas de differentiatietijd indien nodig aan om de kleurintensiteit te optimaliseren.
    6. Klaar de coupes twee keer gedurende elk 5 min in vers xyleen.
      OPMERKING: Voer alle stappen met xyleen uit in een chemische zuigkast.
    7. Monteer de secties met neutraal balsam. Plaats voorzichtig een dekglas over elke sectie.
    8. Beeld de gekleurde secties af met een lichtmicroscoop met een 20× objectief. Identificeer de CA1-regio op basis van de karakteristieke compacte piramidale cellaag in de coronale hippocampussectie. Analyseer voor elke muis één coronale sectie en neem twee niet-overlappende velden op uit de CA1-regio van elke hippocampushemisfeer.
    9. Tel handmatig morfologisch intacte Nissl-positieve neuronen en Nissl-lichaampjes met de cell-counting plugin in beeldanalyse-software. Identificeer intacte neuronen aan een intact soma, een ronde kern met een zichtbare nucleolus en overvloedige cytoplasmatische Nissl-substantie; identificeer Nissl-lichaampjes als intens basofiele granulaire of geclusterde structuren binnen het neuronale cytoplasma.
    10. Bereken het gemiddelde van de waarden verkregen uit alle geanalyseerde velden om één waarde per dier te genereren. Zorg ervoor dat de waarnemer die de tellingen uitvoert geblindeerd blijft voor de groepsindeling.
  3. Iba1-immunofluorescentiekleuring
    1. Laat de hersensecties equilibreren naar kamertemperatuur vóór het kleuren.
    2. Dompel de coupes onder in natriumcitraat-antigeenhersteloplossing en voer het antigeenherstel uit in een waterbad van 80 °C gedurende 25 min. Laat de coupes en de antigeenhersteloplossing na het antigeenherstel natuurlijk afkoelen tot kamertemperatuur.
    3. Was de secties drie keer gedurende elk 3 min met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    4. Permeabiliseer de secties met 0,2% Triton X-100 in PBS gedurende 30 min bij kamertemperatuur, gevolgd door drie wasbeurten met PBS van elk 3 min.
    5. Blokkeer aspecifieke binding door de secties 1 u bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer te incuberen met 3% runder serumalbumine (BSA) in PBS.
    6. Was de secties drie keer gedurende elk 3 min met PBS.
    7. Verdun het primaire antilichaam tegen ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1; 1:100) in blokkeringsoplossing (3% BSA in PBS) en incubeer de secties met het verdunde primaire antilichaam overnacht bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
    8. Was de secties drie keer gedurende elk 3 min met PBS.
    9. Incubeer de secties met 488-geconjugeerd geiten anti-konijn IgG (H+L) (1:1000) gedurende 90 min bij kamertemperatuur in het donker.
    10. Was de secties drie keer gedurende elk 3 min met PBS in het donker.
    11. Tegenkleur de kernen met DAPI (1:8000) gedurende 5 min in het donker.
    12. Was de secties drie keer gedurende elk 3 min met PBS in het donker.
    13. Monteer de secties met antifade monteermedium, breng dekglazen aan en bescherm de secties tegen licht tot de beeldvorming.
    14. Neem fluorescentiebeelden van de CA1-regio van de hippocampus op met een confocale fluorescentiemicroscoop met een 20× objectief. Gebruik identieke beeldacquisitie-instellingen voor alle secties die in kwantitatieve vergelijkingen worden opgenomen. Analyseer voor elke muis één coronale sectie en neem twee niet-overlappende velden op uit de CA1-regio van elke hippocampushemisfeer.
    15. Kwantificeer de gemiddelde Iba1-fluorescentie-intensiteit in de CA1-regio van de hippocampus met identieke drempelinstellingen voor alle beelden. Bereken het gemiddelde van de waarden van alle velden om één waarde per dier te verkrijgen.

6. Statistische analyse

  1. Voer alle statistische analyses uit met behulp van software voor statistische analyse. Presenteer de gegevens als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD).
  2. Beoordeel de normaliteit van de gegevens met de Shapiro–Wilk-toets. Beoordeel de gelijkheid van varianties met de F-toets.
  3. Vergelijk de controlegroep en de L5-laminectomiegroep met een ongepaarde tweezijdige Student's t-toets wanneer aan de aanname van variantie is voldaan. Gebruik de t-toets van Welch wanneer niet aan de aanname van variantie is voldaan.
  4. Definieer n als het aantal dieren dat in elke analyse is opgenomen. Beschouw een P-waarde < 0,05 als statistisch significant.

Resultaten

Alle muizen overleefden tot het geplande experimentele eindpunt, geen enkele voldeed aan de vooraf gedefinieerde criteria voor het humane eindpunt en alle dieren werden opgenomen in de uiteindelijke analyses. De motorische functie werd op postoperatieve dag 3 geëvalueerd met behulp van open-field- en ganganalyses. Noch de totale afgelegde afstand, noch de gemiddelde snelheid in de open-field-test verschilden tussen de groepen, wat wijst op een vergelijkbare spontane locomotorische activiteit (Figuur 2A). De ganganalyse liet eveneens geen significante verschillen tussen de groepen zien in paslengte, standtijd, zwaaisnelheid of voetafdrukareaal (Figuur 2B). Samen geven deze resultaten aan dat de L5-laminectomieprocedure geen overduideld motorisch defect veroorzaakte dat groot genoeg was om de daaropvolgende verschillen in cognitief-gedragsmatige prestaties te verklaren.

De cognitieve prestaties werden geëvalueerd met behulp van de novel object recognition (NOR)-test, de novel-arm Y-maze en de Barnes-maze. In de NOR-test vertoonde de L5-laminectomiegroep een significant lagere voorkeurindex (PI) voor het nieuwe object dan de controlegroep (Figuur 3A). In de novel-arm Y-maze vertoonde de L5-laminectomiegroep significant lagere PI's voor zowel de tijd doorgebracht in als het aantal betredingen van de nieuwe arm (Figuur 3B). In de Barnes-maze vertoonde de L5-laminectomiegroep een langere ontsnappingstijd en een grotere afgelegde afstand op dag 3 van de Barnes-maze-test (Figuur 3C). Samen wijzen deze gedragsmatige bevindingen op een verslechterde postoperatieve cognitieve prestatie na L5-laminectomie.

In de hippocampale CA1-regio vertoonde de L5-laminectomiegroep significant minder Nissl-positieve neuronen en significant minder Nissl-lichaampjes dan de controlegroep, wat duidt op neuronale structurele schade (Figuur 4A, B). Daarnaast was de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van Iba1 significant verhoogd in de L5-laminectomiegroep, wat consistent is met een toegenomen microgliële activatie (Figuur 4C, D).

Diagram en proces van de dissectie van de lumbale wervelkolom van de muis, met identificatie van de L4, L5 en L6 wervels.
Figuur 1: De L5 lumbale laminectomie procedure voor het modelleren van postoperatieve cognitieve dysfunctie (POCD) bij muizen. (A) Illustratie van het chirurgische doelwit bij de L5 lamina en het expositiebereik dat de aangrenzende wervelniveaus (L4–L6) omvat. (B) Intraoperatieve beelden die de belangrijkste stappen van de L5 lumbale laminectomie procedure illustreren. (a) De lumbale regio na het scheren, waarbij de spinale middellijn is geïdentificeerd; pijlen geven de richting van de geplande huidincisie aan. (b) Middellijn incisie van de huid over de lumbale wervelkolom. (c) Incisie van de fascia met stapsgewijze separatie van de paraspinale spieren om de doornuitsteeksels bloot te leggen en het weefsel rond het L5 doornuitsteeksel en de lamina verder te verwijderen om de L5 lamina volledig bloot te leggen. (d) L5 laminectomie na verwijdering van de L5 lamina. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Laminectomie versus controlestudie; bewegingspad, staafdiagram, vergelijking van gangdata, experimentresultaten.
Figuur 2: Beoordeling van de locomotorische activiteit en gang na L5 lumbale laminectomie. (A>) Open-field test die de totale afgelegde afstand en de gemiddelde snelheid toont (n = 10). (B>) Ganganalyse die de paslengte, standtijd, zwaaisnelheid en afdrukoppervlak toont (n = 6). Gegevens representeren het gemiddelde ± SD. Statistische significantie is aangegeven als ns, niet significant. Afkortingen: Control = controlegroep; Laminectomy = L5 laminectomiegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Doolhofdiagrammen en staafdiagrammen analyseren de effecten van controle versus laminectomie op de prestaties bij cognitieve taken.
Figuur 3: Cognitieve gedragsbeoordelingen na L5 lumbale laminectomie. (A) Test voor herkenning van nieuwe objecten (n = 10). (B) Test met nieuwe arm in Y-doolhof (n = 10). (C) Barnes-doolhof test (n = 10). Gegevens representeren het gemiddelde ± SD. Statistische significantie wordt aangegeven als *P < 0,05, **P < 0,01 en ***P < 0,001. Afkortingen: Control = controlegroep; Laminectomy = L5 laminectomiegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Laminectomie-resultaten; histologiebeelden en staafdiagrammen van IBA1-intensiteit in controle en laminectomie.
Figuur 4: Histologische beoordeling van de hippocampale CA1-regio na L5 lombaire laminectomie. (A) Representatieve beelden van Nissl-kleuring in de hippocampale CA1-regio. (B) Kwantificering van Nissl-positieve neuronen (links) en Nissl-lichaampjes (rechts) (n = 5). (C) Representatieve beelden van Iba1-immunofluorescentie in de hippocampale CA1-regio. Schaalbalk = 100 µm. (D) Kwantificering van de gemiddelde Iba1-fluorescentie-intensiteit (n = 6). Gegevens representeren het gemiddelde ± SD. Statistische significantie wordt aangegeven als **P < 0,01 en ***P < 0,001. Afkortingen: Control = controlegroep; Laminectomy = L5 laminectomiegroep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Postoperatieve cognitieve dysfunctie is gerapporteerd bij oudere volwassenen die een ruggenmergoperatie ondergaan10. Experimentele bewijzen geven verder aan dat veroudering de vatbaarheid voor operatie-gerelateerde cognitieve beperkingen en neuroinflammatoire reacties verhoogt11,12. Het huidige protocol combineert ongeveer 4 u sevofluraan-anesthesie met een L5-laminectomie bij oudere muizen om vroege postoperatieve cognitieve beperkingen te modelleren. De belangrijkste methodologische waarde ligt in het bieden van een praktische, toegankelijke procedure voor het onderzoeken van gedragsmatige en hippocampale histologische veranderingen na een ruggenmergoperatie.

Preklinische POCD-modellen omvatten paradigma's met enkel blootstelling aan anesthesie, abdominale chirurgie en orthopedisch letsel13. Paradigma's met enkel anesthesie maken evaluatie van de effecten van anesthetica mogelijk in afwezigheid van chirurgisch trauma14, maar reproduceren niet de gecombineerde blootstelling aan anesthesie en weefselbeschadiging. Modellen voor abdominale chirurgie en tibiale fracturen bevatten chirurgisch letsel en zijn gebruikt om cognitieve beperkingen geassocieerd met chirurgie te onderzoeken15,16. De operatielocaties en weefselschade-patronen verschillen echter van die bij spinale procedures. Omdat het type en de intensiteit van het chirurgisch trauma de postoperatieve cognitieve uitkomsten en centrale ontstekingsreacties kunnen beïnvloeden9, moet de chirurgische context worden meegewogen bij de selectie van een preklinisch model. Het huidige L5 laminectomie-protocol biedt daarom een experimenteel paradigma gerelateerd aan rugchirurgie voor het onderzoeken van vroege postoperatieve cognitieve beperkingen bij oudere muizen.

De belangrijkste technische uitdaging in dit protocol is het verwijderen van voldoende bot uit de lamina van L5 om de dura duidelijk bloot te leggen, terwijl dural letsel wordt vermeden. Tijdens een laminectomie onder directe visualisatie is een zorgvuldige controle van de instrumentdiepte, de snijkracht en de invoerhoek van de oogheelkundige schaar vereist. Het bot moet stapsgewijs worden verwijderd met kleine, gecontroleerde sneden langs de randen van de lamina. Door de doornfortsatzel van L5 met een pincet vast te pakken en het operatieve lumbale segment onder een hoek van ongeveer 30° ten opzichte van het chirurgische platform te tillen, wordt de interlaminaire ruimte van L5–L6 verbreed. Deze manoeuvre maakt een ondiepe invoering van de schaarpunten onder de botrand mogelijk en vermindert het risico op contact met de dura. Onvolledige botverwijdering kan de chirurgische blootstelling beperken, terwijl te agressief snijden of een te grote invoerdiepte dural letsel kan veroorzaken. Ongecontroleerde bloedingen kunnen het operatieveld onzichtbaar maken, het postoperatieve herstel belemmeren en de variabiliteit in gedragsresultaten vergroten. Wanneer de interlaminaire ruimte onvoldoende is voor een veilige invoering van de schaarpunten, moet de positie en de elevatiehoek van het operatieve lumbale segment opnieuw worden aangepast in plaats van de invoerdiepte te vergroten. Als bloedingen het operatieveld onzichtbaar maken, moet de botverwijdering worden gepauzeerd totdat adequate visualisatie is hersteld, waarna elk overgebleven bot incrementeel moet worden verwijderd.

Separatie van de paraspinale spieren en een L5-laminectomie kunnen bijdragen aan kortstondige postoperatieve pijn, en mechanische hypersensitiviteit is gedocumenteerd na experimentele laminectomie bij muizen17. Meloxicam werd toegediend volgens een vooraf vastgesteld analgesieregime. Er is gerapporteerd dat postoperatieve pijn-gerelateerde gezichtsuitdrukkingen bij muizen ongeveer 36–48 h aanhouden18. Het 48 h analgesieregime was bedoeld om deze vroege postoperatieve periode te overbruggen, en cognitieve gedragstests werden gestart op postoperatieve dag 3, na voltooiing van het analgesieregime, om de potentiële invloed van acute postoperatieve pijn te beperken. De open-field test is in experimentele POCD-studies gebruikt om spontane locomotorische activiteit te beoordelen en om te bepalen of verminderde voortbeweging de cognitief-gedragsprestaties kan beïnvloeden19,20. Bijgevolg werden de open-field test en ganganalyse uitgevoerd op postoperatieve dag 3, voorafgaand aan de cognitieve beoordeling. Er werden geen significante verschillen tussen de groepen waargenomen in de locomotorische activiteit in het open veld of in de gangparameters, wat suggereert dat de daaropvolgende cognitief-gedragsmatige verschillen waarschijnlijk niet primair verklaard kunnen worden door evidente motorische beperkingen. Omdat spontane postoperatieve pijn en wondongemak echter niet direct zijn beoordeeld, kunnen hun residuele effecten op de gedragsprestaties niet geheel worden uitgesloten. Toekomstige studies zouden directe beoordelingen van spontane postoperatieve pijn kunnen bevatten.

Over het algemeen biedt dit protocol een praktische experimentele benadering voor het onderzoeken van vroege postoperatieve cognitieve stoornissen bij oudere muizen na een L5-laminectomie. Het kan worden gebruikt om de gedragsmatige uitkomsten en onderliggende mechanismen van cognitieve stoornissen geassocieerd met ruggenmergchirurgie te onderzoeken, alsof om interventies te evalueren die gericht zijn op het voorkomen of verminderen van postoperatieve cognitieve stoornissen. Validatie in grotere cohorten en in onafhankelijke laboratoria zou de stabiliteit en reproduceerbaarheid van het model verder bevestigen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen te hebben.

Dankbetuigingen

Wij danken Sanhua Fang van het kernfaciliteitsplatform van de Zhejiang University School of Medicine, Yanhong Chen en Xuliang Zhang van het dierencentrum van de Zhejiang University voor hun technische ondersteuning. Deze studie werd gefinancierd door de volgende fondsen: National Natural Science Foundation of China (Nos. 82575196, 82074535 en U23A20508).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
C57BL/6J mannelijke muizenSuzhou Industrial Park Ai'er Maite Technology Co., Ltd.SYXK2023-0005Diermodel
ANY-maze Video Tracking SoftwareStoelting Co., USA6000Gedragsmatige videotracking en analyse
Erythromycine oogzalfBeijing Twinluck Pharmaceutical Co,. Ltd.H11021270Voorkomen van uitdroging van het oog
Fijne pincetNANAHuid vastklemmen
WarmtematNANATemperatuurgecontroleerd
Iba1/AIF-1 (E4O4W) Rabbit Monoclonal AntibodyCell Signaling Technology17198Iba1 immunofluorescentiekleuring
Inhalatieanesthesie-apparatuurRWD Life Science Co., Ltd.R581SAnesthesie
MGT-PRAnhui Zhenghua Biological Instrument Equipment Co., Ltd., ChinaMJY2025112704Ganganalyse
Micro-ophthalmische scharenNANABotverwijdering
Nissl-kleuringsoplossingHaoke Biotechnology Co., Ltd.HK2033Nissl-kleuring
ScharenShang Shou Jin Zhong Surgical Instruments Jiangsu ITD.,CorpY00030Huidincisie
SevofluraanShanghai Hengrui Pharmaceutical Co,. Ltd.25062331Anesthesie
Single Use Surgical DrapeJiangxi Zhizheng Medical Equipment Co., Ltd.20212140221Platform voor chirurgische ingreep
Trimmer voor kleine dierenYiwu Leiben Trading Co., Ltd.2504KFZB3592-03310Ontharing
Chirurgische hechtnälden met draadShanghai Pudong Jinhuan Medical Products Co., LTD.F603Huid hechten
Veet ontharingscrèmeRECKITT BENCKISER (India) LtdNAOntharing

Referenties

  1. Zhao Q, Wan H, Pan H, Xu Y. Postoperative cognitive dysfunction-current research progress. Front Behav Neurosci. 2024;18:1328790.
  2. Kong H, Xu LM, Wang DX. Perioperative neurocognitive disorders: A narrative review focusing on diagnosis, prevention, and treatment. CNS Neurosci Ther. 2022;28(8):1147-1167.
  3. Monk TG, et al. Predictors of cognitive dysfunction after major noncardiac surgery. Anesthesiology. 2008;108(1):18-30.
  4. Li X, et al. Risk factors for postoperative cognitive decline after orthopedic surgery in elderly Chinese patients: A retrospective cohort study. Clin Interv Aging. 2024;19:491-502.
  5. Krenk L, et al. Cognitive dysfunction after fast-track hip and knee replacement. Anesth Analg. 2014;118(5):1034-1040.
  6. Yang X, et al. Identification of individuals at risk for postoperative cognitive dysfunction (POCD). Ther Adv Neurol Disord. 2022;15:17562864221114356.
  7. Suraarunsumrit P, et al. Outcomes associated with postoperative cognitive dysfunction: A systematic review and meta-analysis. Age Ageing. 2024;53(7):afae160.
  8. Lin X, et al. The potential mechanism of postoperative cognitive dysfunction in older people. Exp Gerontol. 2020;130:110791.
  9. Lu B, et al. Effects of different types of non-cardiac surgical trauma on hippocampus-dependent memory and neuroinflammation. Front Behav Neurosci. 2022;16:950093.
  10. Park S, et al. Preoperative mild cognitive impairment as a risk factor of postoperative cognitive dysfunction in elderly patients undergoing spine surgery. Front Aging Neurosci. 2024;16:1292942.
  11. Xu Z, et al. Age-dependent postoperative cognitive impairment and Alzheimer-related neuropathology in mice. Sci Rep. 2014;4:3766.
  12. Zhang ZJ, et al. Aging alters Hv1-mediated microglial polarization and enhances neuroinflammation after peripheral surgery. CNS Neurosci Ther. 2020;26(3):374-384.
  13. Eckenhoff RG, et al. Perioperative neurocognitive disorder: State of the preclinical science. Anesthesiology. 2020;132(1):55-68.
  14. Guo LY, et al. Cognitive deficits after general anaesthesia in animal models: A scoping review. Br J Anaesth. 2023;130(2):e351-e360.
  15. Qiu LL, et al. NADPH oxidase 2-derived reactive oxygen species in the hippocampus might contribute to microglial activation in postoperative cognitive dysfunction in aged mice. Brain Behav Immun. 2016;51:109-118.
  16. Cibelli M, et al. Role of interleukin-1beta in postoperative cognitive dysfunction. Ann Neurol. 2010;68(3):360-368.
  17. Yamamoto S, et al. Intraoperative spinal cord stimulation mitigates central sensitization after spine surgery in mice. Spine (Phila Pa 1976). 2023;48(11):E169-E176.
  18. Matsumiya LC, et al. Using the mouse grimace scale to reevaluate the efficacy of postoperative analgesics in laboratory mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 2012;51(1):42-49.
  19. Sun L, et al. Activation of cannabinoid receptor type 2 attenuates surgery-induced cognitive impairment in mice through anti-inflammatory activity. J Neuroinflammation. 2017;14(1):138.
  20. Zhan G, et al. Anesthesia and surgery induce cognitive dysfunction in elderly male mice: The role of gut microbiota. Aging (Albany NY). 2019;11(6):1778-1790.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Model voor ruggenchirurgiesevofluraan-anesthesiecognitieve functietestneuronale beschadiging van de hippocampusneuro-inflammatoire veranderingenNissl-kleuringIba1-immunofluorescentie

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.