Dit protocol beschrijft het opzetten van een met ovalbumine (OVA) geïnduceerd muismodel voor allergische astma (AA) om de therapeutische mechanismen van Kechuanting Acupoint Sticking Therapy (KAST) op type 2 luchtwegontsteking te evalueren door pulmonale Groep 2 innate lymfoïde cellen (ILC2s) te moduleren via het calcitonine gene-related peptide (CGRP)/receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1) pad.
Onderzoeksartikel
Kechuanting-acupuntplaktherapie verlicht type 2-luchtwegontsteking bij muizen met allergisch astma door het aantal ILC2's te moduleren
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Kechuanting Acupoint Sticking Therapy (KAST) is effectief gebleken bij het verminderen van luchtwegontstekingen bij patiënten met allergische astma (AA); de onderliggende mechanismen hiervan blijven echter onduidelijk. Deze studie was erop gericht de therapeutische mechanismen van KAST in een AA-muismodel te onderzoeken vanuit een neuro-immuunperspectief. Er werd een door ovalbumine (OVA) geïnduceerd muismodel voor allergische astma opgezet, waarbij de muizen werden behandeld met KAST. De effecten van KAST op pulmonale groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's) en type 2 luchtwegontsteking werden geëvalueerd met behulp van flowcytometrie, hematoxylin-eosin (HE)-kleuring en immunohistochemie. Western blotting (WB) en ELISA werden gebruikt om de proteineniveaus van calcitoninegen-gerelateerd peptide (CGRP) in longweefsels te bepalen. Intranasale toediening van CGRP of de CGRP-receptorremmer BIBN-4096 werd uitgevoerd bij muizen met allergische astma om de regulerende rol van het CGRP/receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1)-pad op ILC2's en type 2 luchtwegontsteking te onderzoeken. KAST verminderde het aantal ILC2's en verzachtte de type 2 luchtwegontsteking, gepaard gaand met een afname van de CGRP-expressie in longweefsels. Intranasaal CGRP verhoogde het aantal RAMP1+ILC2's en het totaal aantal ILC2's in de longen en verergerde de type 2 luchtwegontsteking. Omgekeerd verminderde intranasaal BIBN-4096 de pulmonale ILC2's en mitigeerde het de type 2 luchtwegontsteking. KAST vermindert luchtwegontsteking bij allergische astma, wat nauw verbonden is met de downregulatie van het CGRP/RAMP1-pad en de daaropvolgende onderdrukking van pulmonale ILC2's, zoals ondersteund door farmacologische inhibitie.
Inleiding
Allergisch astma (AA) is het meest voorkomende astmafenotype en is verantwoordelijk voor 60–80% van alle astmagevallen in China1. Het wordt gekenmerkt door een hoge prevalentie en een suboptimale ziektecontrole, wat de levenskwaliteit van patiënten ernstig beperkt en aanzienlijke economische lasten met zich meebrengt2,3,4,5. Hoewel geïnhaleerde corticosteroïden (ICS) de hoeksteen van de klinische behandeling blijven6, vertonen sommige patiënten een beperkte respons, en is langdurig gebruik vaak geassocieerd met bijwerkingen en een onvermogen om de progressie van de ziekte te stoppen7. Daarom blijft de ontwikkeling van veilige en effectieve nieuwe therapeutische strategieën een prioriteit in zowel de klinische als de onderzoeksomgeving. Kechuanting Acupoint Sticking Therapy (KAST), een externe applicatie uit de traditionele Chinese geneeskunde, brengt actieve verbindingen transdermaal over, waardoor het hepatische first-pass effect potentieel wordt vermeden en systemische bijwerkingen worden geminimaliseerd8,9. Klinische studies hebben aangetoond dat KAST astmasymptomen kan verlichten, de longfunctie gedeeltelijk kan herstellen en de levenskwaliteit van patiënten kan verbeteren10,11,12. Tegelijkertijd suggereren serummetabolomics, netwerkfarmacologie en dierstudies met astmamodellen dat KAST luchtweginflammatie vermindert door de spiegels van inflammatoire mediatoren in het serum en in het bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) te verlagen, inclusief de downregulatie van de expressie van IgE, IL-4 en IL-139,13,14. Gezamenlijk leveren deze bevindingen ondersteunend bewijs voor de therapeutische effectiviteit van KAST bij astma. De precieze werkingsmechanismen ervan blijven echter onduidelijk.
Een kernmechanisme van de pathologie dat bijdraagt aan de recidive van AA is type 2-luchtwegontsteking, waarbij groep 2 aangeboren lymfoïde cellen (ILC2's) een sleutelrol spelen15. Na stimulatie met allergenen scheiden ILC2's cytokinen uit zoals IL-5 en IL-13, waardoor luchtwegontsteking wordt aangewakkerd16,17. Studies hebben aangetoond dat de uitputting van ILC2's de luchtwegontsteking bij astmatische muizen significant vermindert, wat hun centrale rol in de ziekteprogressie onderstreept18. Opvallend is dat de activering en functie van ILC2's nauw worden gereguleerd door meerdere mechanismen, waarbij neuro-immuuninteracties de laatste jaren steeds meer aandacht trekken. Opkomend bewijs wijst erop dat calcitonine-gen-gerelateerd peptide (CGRP) kan binden aan receptor activity-modifying protein 1 (RAMP1) op het oppervlak van ILC2's, wat hun activering en de daaropvolgende afgifte van type 2-cytokinen induceert, wat de luchtwegontsteking bij AA verergert19,20,21. In de huidige studie identificeerde onze high-throughput RNA-sequencing (RNA-seq) screening CGRP als een kritisch responsief neuropeptide dat sterk wordt gemoduleerd door KAST-interventie. Daarom hebben we, met de focus op het CGRP/RAMP1-pad, KAST ingezet als interventie in AA-muizen om de potentiële mechanismen te onderzoeken bij het moduleren van de ILC2-activiteit en het verlichten van type 2-luchtwegontsteking.
Protocol
Alle dierprocedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, gepubliceerd door de National Academies of Sciences. Het protocol is goedgekeurd door de Commissie voor Dierethiek van het Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine (goedkeuringsnummer 2023DW-059-01). Een uitgebreide lijst van alle materialen, reagentia, instrumenten en software die in deze studie zijn gebruikt, is opgenomen in de Tabel met materialen.
Experimentele dieren en groepering
Gezonde vrouwelijke BALB/c-muizen (SPF-graad, 8–10 weken oud) werden verkregen van het Experimental Animal Center van de Nanjing University of Chinese Medicine (licentienr. SYXK (Su) 2018-0049). De dieren werden gehouden onder standaardcondities met een licht-/donkercyclus van 12 u bij 24–26 °C. Steriel voer en water werden ad libitum verstrekt, de bodembedekking werd regelmatig vervangen en de kooien werden routinematig gereinigd. Na 7 dagen adaptatie werden de muizen willekeurig verdeeld over zes groepen (n = 7/groep): de normale groep, de modelgroep, de CGRP-groep, de BIBN-4096-groep, de KAST-groep en de KAST + CGRP-groep. De dieren werden willekeurig aan de groepen toegewezen met behulp van een door de computer gegenereerde willekeurige getallentabel. De groepsindeling bleef geheim voor de onderzoekers totdat de interventies waren toegewezen. Om het weefselgebruik te optimaliseren, werden longmonsters van de gerandomiseerde cohort (n = 7 per groep) systematisch toegewezen aan verschillende verwerkingspaden, waarbij de exacte geanalyseerde steekproefgroottes (n = 5, 4 of 3) voor specifieke histologische en moleculaire assays expliciet zijn aangegeven in de respectievelijke figuurlegenda's. Er zijn geen gegevens uitgesloten van de analyse.
Bereiding van de KAST-formulering
De formulering werd bereid door de afdeling Farmacie van het Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine22. Er werden negen traditionele Chinese medicinale kruiden gebruikt: Semen Brassicae (2 delen), Rhizoma Corydalis (2 delen), Radix Kansui behandeld met azijn (1 deel), Asarum (1 deel), Ephedra (1 deel), Semen Lepidii (1 deel), kruidnagel (1 deel), kaneelbast (1 deel) en Gleditsia sinensis (1 deel). Elk kruid werd tot een fijn poeder gemalen en door een zeef van 80 mesh gezeefd. Aan elke 100 g van het gemengde poeder werden 70 mL vers gember sap en 30 mL vloeibare paraffine toegevoegd, grondig gemengd en verwerkt tot pleisters van 0,3 g ± 5% met een diameter van 0,5 cm. In het bijzonder werden alle kruidbestanddelen en de verse gember geauthenticeerd door hoofdfarmaceut Lin-gang Zhao en vóór gebruik bij 4 °C bewaard in een donkere, droge omgeving9. Om de reproduceerbaarheid van de interventie en de stabiliteit tussen batches te garanderen, werd een strikte kwaliteitscontolestandaard geïmplementeerd op basis van de door ons team vastgestelde UPLC-Q-TOF-MS- en HPLC-methoden, waarmee de consistente aanwezigheid van belangrijke actieve markers zoals sinapinethiocyanaat werd bevestigd23. In de praktijk werden de pleisters van 0,5 cm vastgezet met medische, ademende, hypoallergene plakband van 2,5 cm × 5,5 cm om een optimale transdermale afgifte te waarborgen.
Vestiging van het AA-muismodel
Het AA-model werd geïnduceerd volgens een gevestigd protocol uit de literatuur met behulp van OVA-sensibilisatie en intranasale uitdaging24. Behalve voor de Normale groep werden alle muizen gesensibiliseerd door intraperitonele injectie van 200 µL saline bevattend 100 µg OVA en 2 mg aluminiumhydroxide op dag 0 en 12. Van dag 18 tot 23 werden de muizen dagelijks éénmaal intranasaal uitgedaagd met 50 µg OVA in 50 µL saline. Van dag 24 tot 53 werd OVA om de dag intranasaal toegediend. Op dag 54 werden de muizen gewogen, waarna euthanasie werd uitgevoerd via cervicale dislocatie en de weefsels werden verzameld. Vervolgens werd de longcoëfficiënt bepaald door het totale longgewicht te delen door het lichaamsgewicht.
Interventies
Van dag 40 tot 53 werden de muizen in de KAST-groep en de KAST + CGRP-groep geschoren over een dorsaal gebied van 3 cm × 6 cm. Pleisters werden aangebracht over de bilaterale acupunten Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) en Shenshu (BL23), en met plakband gefixeerd gedurende 1,5 h één keer per dag gedurende 14 opeenvolgende dagen. Muizen in de CGRP- en KAST + CGRP-groepen kregen om de dag van dag 40 tot 53 een intranasale toediening van 10 µL Calcitonin/CALCA-oplossing (1 pg/µL). Muizen in de BIBN-4096-groep kregen om de dag een intranasale toediening van 10 µL BIBN-4096-oplossing (0,3 mg/mL, CGRP-receptorantagonist). De normale groep en de modelgroep kregen standaardvoeding zonder interventie. KAST werd toegediend van dag 40 tot dag 53, na de totstandkoming van allergische luchtweginflammatie (beginnend op dag 40, wat 22 dagen na de eerste OVA-challenge op dag 18 is). Bijgevolg diende KAST in deze studie als een therapeutische in plaats van een profylactische interventie.
Voor de voorbereiding van de huid werd het haar op het aangewezen dorsale gebied verwijderd met een elektrische trimmer. De lokalisatie van de acupunctuurpunten geschiedde strikt volgens de standaard Nomenclature and Location of Acupoints for Laboratory Animals - Part 3: Mice (T/CAAM 0002-2020) uitgegeven door de Chinese Acupuncture-Moxibustion Society. De vier paren bilaterale dorsale locaties werden nauwkeurig gemarkeerd en als volgt gedefinieerd: Feishu (BL13: tussen de ribben onder de doornuitsteeksel van de 3e thoracische wervel, 3 mm lateraal van de posterieure middellijn), Geshu (BL17: onder de doornuitsteeksel van de 7e thoracische wervel, 3 mm lateraal van de middellijn), Pishu (BL20: onder de doornuitsteeksel van de 12e thoracische wervel, 3 mm lateraal van de middellijn) en Shenshu (BL23: onder de doornuitsteeksel van de 2e lumbale wervel, 3 mm lateraal van de middellijn). De 3M-tape werd strak omwikkeld om een stabiele hechting te bereiken, zodat er geen verschuiving van de patch of secundaire huiderosie optrad tijdens de retentieperiode van 1,5 h.
De doses CGRP/CALCA (1 pg/µL, 10 µL per muis) en BIBN-4096 (0,3 mg/mL, 10 µL per muis) werden gekozen op basis van gepubliceerde studies25. Specifiek voor de CGRP-interventie werd een 0,1% BSA-oplossing bereid door 1 mg BSA op te lossen in 1 mL ddH2O, gevolgd door vortexen om een uiteindelijke concentratie van 1 mg/mL te bereiken. Voorafgaand aan de reconstitutie werd het geliofyiliseerde Calcitonin/CALCA-eiwitpoeder gecentrifugeerd bij 12.000 × g gedurende 30 s bij 4 °C. Vervolgens werd 20 µL van de bereide 0,1% BSA-oplossing toegevoegd om een stockoplossing van 1 µg/µL te verkrijgen. Het vial werd voorzichtig enkele keren omgekeerd (zonder te vortexen), enkele seconden gecentrifugeerd en enkele minuten bij kamertemperatuur gelaten om volledige reconstitutie van het eiwit te garanderen. Om de 1 pg/µL werkoplossing te bereiden zonder een onbeheersbaar groot volume in één stap te genereren, werd een standaard seriële verdunning in twee stappen uitgevoerd: 1 µL van de 1 µg/µL stockoplossing werd eerst verdund in 999 µL steriele zoutoplossing om een tussenoplossing van 1 ng/µL te formuleren, waarna 1 µL van deze tussenoplossing verder werd gemengd met nog eens 999 µL steriele zoutoplossing om de uiteindelijke 1 pg/µL werkoplossing te verkrijgen. De werkoplossing werd bewaard bij 4 °C, terwijl de overgebleven aliquots werden bewaard bij -20 °C voor maximaal 2–3 maanden. Voor de BIBN-4096-groep werd 1 mg BIBN-4096-poeder opgelost in 333 µL ddH2O om een stockoplossing van 3 mg/mL te verkrijgen, die werd verdeeld in aliquots van 50 µL per vial en bewaard bij -80 °C. Om de 0,3 mg/mL werkoplossing te bereiden, werd elke aliquot van 50 µL stockoplossing grondig gemengd met 450 µL steriele zoutoplossing. Van dag 40 tot 53 werd om de dag een volume van 10 µL van ofwel de 1 pg/µL CGRP-oplossing of de 0,3 mg/mL BIBN-4096-oplossing intranasaal toegediend aan elke muis onder milde fixatie zonder anesthesie.
Uitkomstmaten en detectiemethoden
Gedragstesten
Op dag 53, na de laatste intranasale uitdaging, werden de frequenties van neuswrijven en niesepisoden gedurende 10 min gemonitord en geregistreerd met behulp van een digitaal videosysteem. De gedragsfrequenties in de video's werden onafhankelijk door twee onderzoekers in een dubbelblind onderzoek geteld. In gevallen van een significant verschil tussen hun tellingen evalueerde een derde onderzoeker de video opnieuw, en de gegevens met de hoogste consistentie werden uiteindelijk geselecteerd voor statistische analyse.
Bronchiale provocatietest
Binnen 24 u na de laatste challenge werd de reactiviteit van de luchtwegen beoordeeld met behulp van geneveliseerd acetylcholine (ACh) bij concentraties van 0, 5, 10, 20 en 40 mg/mL (300 µL per concentratie, 1 min geneveliseerd). De waarden voor de versterkte pauze (Penh), een dimensieloze index die empirisch wordt gebruikt om luchtwegvernauwing aan te geven en luchtweghyperreactiviteit (AHR) te evalueren, werden gedurende 5 min na elke nebulisatie geregistreerd met behulp van niet-invasieve whole-body plethysmografie. De muizen werden voorafgaand aan de registratie 10 min aan de kamer gewend. Penh werd automatisch berekend met de software van het geïntegreerde handmatige opslag-/streaming-systeem volgens de empirische formule voor de balans tussen expiratoire/inspiratoire tijd en piekstromen.
Histopathologie (HE-kleuring)
Longweefsels gefixeerd in 4% paraformaldehyd werden gedehydrateerd via een graduele alcoholserie, ontkleurd in xyleen en ingebed in paraffineblokken met behulp van een automatische processor. De blokken werden gesneden met een dikte van 4 µm, gedreven in een waterbad van 42 °C en gemonteerd op glazen objectglazen. De glaasjes werden 2 u gebakken op 80 °C en gedurende de nacht gedroogd voordat ze werden afgekoeld tot kamertemperatuur. Voor de kleuring werden de secties gedeparaffiniseerd in xyleen (I en II, elk 20 min), gerehydrateerd via een graduele ethanolserie (100% I/II en 75%, elk 5 min) en gespoeld met kraanwater. De glaasjes werden 3–5 min gekleurd met hematoxyline, gedifferentieerd met 1% zuur alcohol en blauw gemaakt in een blauwoplossing. Na het wassen werden de secties gedehydrateerd via 85% en 95% ethanol (elk 5 min) en 5 min tegengekleurd met eosine. Tot slot werden de glaasjes gedehydrateerd in absolute ethanol (I, II en III, elk 5 min), ontkleurd in xyleen (I en II, elk 5 min), gemonteerd met neutraal balsam en aan de lucht gedroogd. Beelden werden vastgelegd van willekeurige velden bij een vergroting van 200× met behulp van een lichtmicroscoop en het CaseViewer-systeem. Longontsteking en epitheliale verdikking werden blind gegradeerd op een schaal van 0–4: 0, geen ontsteking; 1, incidentele ontstekingscellen; 2, enkele (<3) ontstekingshaarden; 3, meerdere (≥3) ontstekingshaarden; 4, diffuse infiltratie door de gehele long. Epitheliale verdikking werd gescoord als: 0, normaal; 1, zichtbare verdikking; 2, gedeeltelijke verdikking van de luchtweg; 3, bijna volledige obstructie; 4, afwezigheid van normale structuur. Voor elke experimentele groep werden in totaal 20 willekeurige microscopische velden gefotografeerd en geëvalueerd om de ruwe histopathologische scores te verkrijgen. De gegevens van elke vier velden werden gemiddeld om één onafhankelijk datapunt te verkrijgen, wat resulteerde in een uiteindelijke steekproefomvang van n = 5 replica's per groep voor statistische analyse. De scoring werd blind uitgevoerd.
RNA-seq
Totaal RNA werd geëxtraheerd uit muizenlongweefsels met TRIzol-reagens volgens het protocol van de fabrikant. De zuiverheid, concentratie en integriteit van het RNA werden geëvalueerd met een spectrofotometer en een platform op basis van microfluidica. Transcriptoombibliotheken werden samengesteld met een commerciële kit voor bibliotheekpreparatie en gesequenced op een high-throughput sequencingplatform om 150 bp paired-end reads te genereren. De ruwe data werden onderworpen aan kwaliteitscontrole met behulp van geschikte filtersoftware om schone reads te verkrijgen, die vervolgens met een splice-aware alignment-tool in kaart werden gebracht op het referentiegenoom. Genexpressieniveaus werden berekend als FPKM, en read counts werden samengesteld via een read-counting utility. De analyse van differentiële expressie werd uitgevoerd met een gespecialiseerd statistisch pakket, waarbij de drempelwaarden werden ingesteld op |log2 Fold Change| ≥ 1 en een aangepaste p < 0,05.
ELISA
Verse longweefsels van muizen werden nauwkeurig gewogen en gehomogeniseerd in PBS-buffer in een strikte verhouding van 20 mg weefsel op 200 µL buffer. De homogenaten werden gecentrifugeerd bij ongeveer 13.400 × g gedurende 10 min bij 4 °C om de eiwitsupernatanten te oogsten. Voor normalisatie werd het ruwe eiwitgehalte van de supernatanten gekalibreerd met de BCA-methode. De ELISA-procedure werd in technische triplicaten uitgevoerd met behulp van commerciële kits volgens het protocol van de fabrikant. Kort gezegd werden 50 µL standaardverdunningen of 50 µL vooraf verdunde monsters (10 µL eiwitmonster gemengd met 40 µL monsterverdunningsvloeistof, wat resulteerde in een uiteindelijke 5-voudige verdunning) toegevoegd aan de antilichaam-gecoate 96-wells platen. De platen werden afgesloten en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 30 min. Na vijfmaal wassen met een 1:30 verdunde wasbuffer werd 50 µL enzymgekoppeld conjugaatreagens aan elke well toegevoegd (behalve de blanco wells), waarna het mengsel 30 min bij 37 °C werd geïncubeerd. Na nog eens vijf wasbeurten werden 50 µL chromogeenoplossing A en 50 µL chromogeenoplossing B aan elke well toegevoegd, en werd de plaat 10 min in het donker geïncubeerd bij 37 °C. De reactie werd gestopt door toevoeging van 50 µL stopoplossing, waardoor de kleur veranderde van blauw naar geel. De absorbantie (OD-waarde) van elke well werd binnen 15 min gemeten bij 450 nm met een microplate-reader. Standaardcurven werden uitgezet met een vierparameter logistisch of lineair regressiemodel (waarbij R2 > 0,99), waarop de target-eiwitconcentraties in de longweefselhomogenaten werden berekend.
Flowcytometrie
Longweefsels werden uitgesneden, fijngehakt en gedigereerd in 5 mL RPMI-1640 bevattende 10% FBS, 50 µL Liberase TM en 5 µL DNase I bij 37 °C gedurende 45 min met schudden op 80 rpm. De gedigereerde suspensie werd door een cellzeef van 400-mesh geleid en gecentrifugeerd bij 300 × g gedurende 10 min bij 4 °C. De pellet werd geresuspendeerd in 2 mL erytrocyten-lysebuffer gedurende 10 min bij kamertemperatuur in het donker. Na het wassen werden de cellen geresuspendeerd en gekleurd met Ghost Dye Red 780 (1,25 µL per monster) gedurende 20 min bij 4 °C in het donker voor de uitsluiting van dode cellen. Na een wasstap werden de cellen geblokkeerd met 10 µL FcR Blocking Reagent gedurende 10 min bij 4 °C. De cellen werden vervolgens oppervlakte-gekleurd met de volgende fluorochroom-geconjugeerde antilichamen gedurende 30 min bij 4 °C: FITC anti-muis CD45 (0,5 µL), PE anti-muis/mens KLRG1 (1,25 µL), BB700 rat anti-muis CD90.2 (0,5 µL), en een gebiotinyleerde lineage-mix bevattende anti-muis CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G/Ly-6C (Gr-1) (elk 0,5 µL) en anti-muis CD19 (2 µL). Na het wassen werden de cellen geïncubeerd met Brilliant Violet 605 Streptavidine (2 µL) gedurende 30 min bij 4 °C. Gegevens werden verzameld op een BD flowcytometrie-platform en geanalyseerd met FlowJo-software. Fluorescentie spillover-compensatiematrices werden automatisch bewaakt en aangepast door de gekalibreerde acquisitiesoftware van het instrument. De hiërarchische gating-strategie voor de identificatie van pulmonale ILC2's werd sequentieel als volgt geïmplementeerd: totale lymfocyten werden eerst geïsoleerd via forward/side scatter (FSC-A/SSC-A) morfologie, gevolgd door doublet-discriminatie via singlet-gating (FSC-H/FSC-A). Levensvatbare cellen werden vervolgens geïdentificeerd door uitsluiting van dode cellen (Ghost Dye-), waarna standaard gates progressief werden toegepast om de CD45+ en Lineage- populaties te selecteren. Binnen het gating-venster van levensvatbare CD45+ Lineage- cellen werden pulmonale ILC2's expliciet gedefinieerd en gekwantificeerd op basis van de daaropvolgende positieve sequentiële cascadering-gates van CD90.2+ en KLRG1+ clusters.
Immunofluorescentie (IF)
Bevroren longcoupes werden 15–30 min bij kamertemperatuur ontdooid en drie keer gedurende elk 6 min gewassen met PBST (PBS met 0,05% Tween-20) om de OCT-compound te verwijderen. Nadat overtollige vloeistof was weggedept, werd met een immunohistochemische pen een hydrofobe barrière rond het weefsel getekend. De coupes werden 100 min bij 37 °C geïncubeerd in een blokkerings- en permeabilisatiebuffer met 0,3% Triton X-100 en 5% geiten serum, gevolgd door een incubatie gedurende de nacht (16–20 u) bij 4 °C met het primaire antilichaam. De volgende dag werden de coupes 30 min bij kamertemperatuur geëquilibreerd, drie keer gewassen met PBST en 60–90 min in het donker bij 37 °C geïncubeerd met een soortspecifiek, fluorofoor-geconjugeerd secundair antilichaam. Na drie extra wasbeurten met PBST werden de kernen gedurende 8 min bij kamertemperatuur in het donker tegengekleurd met DAPI (verdund 1:1 of 2:1 in PBS). Na een laatste ronde PBST-wassingen (3 × 6 min) werden de coupes gemonteerd met een anti-fade monteermedium, afgesloten om belbubbelvorming te voorkomen en in het donker bewaard. Beelden werden vastgelegd met een confocale microscoop bij een vergroting van 400×. Het aantal positieve cellen per veld werd handmatig geteld met Leica LAS X-software. Voor elke experimentele groep werden in totaal 15 willekeurige microscopische velden gefotografeerd om de ruwe celgetallen te verkrijgen. De gegevens van elke drie velden werden gemiddeld om één onafhankelijk datapunt te genereren, wat resulteerde in een uiteindelijke steekproefomvang van n = 5 replicaten per groep voor statistische analyse. Het tellen werd blind uitgevoerd.
Immunohistochemie (IHC)
Paraffinecoupes werden gedeparaffiniseerd in drie opeenvolgende baden xyleen (telkens 15 min), gerehydrateerd via een reeks aflopende ethanolconcentraties (twee keer 100%, 85% en 75%; telkens 5 min) en gespoeld met gedestilleerd water. Antigeenherstel werd uitgevoerd in citraatbuffer (pH 6,0) met behulp van een snelkookpan (3 min onder hoge druk na het koken), gevolgd door afkoeling en drie wasbeurten van 5 min in PBS (pH 7,4). Endogene peroxidase werd geblokkeerd met 3% H2O2 gedurende 15 min bij kamertemperatuur in het donker. Na het wassen werden de coupes omcirkeld met een hydrofobe pen en geblokkeerd met 3% geiten serum gedurende 30 min. De coupes werden vervolgens overnight bij 4 °C geïncubeerd met primaire antilichamen verdund in PBS: anti-IL-4 (1:400), anti-IL-5 (1:300) of anti-IL-13 (1:150). De volgende dag werden de coupes gewassen en gedurende 50 min bij kamertemperatuur geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen (anti-muis voor IL-4; anti-konijn voor IL-5 en IL-13). Signalen werden gevisualiseerd met behulp van een vers bereide DAB-oplossing onder microscopische controle en gestopt met kraanwater. Ten slotte werden de coupes tegengekleurd met hematoxyline, gedifferentieerd, blauwgemaakt, gedehydrateerd via aflopende alcoholseries en xyleen, en gemonteerd met neutraal balsam voor microscopisch onderzoek. De gemiddelde optische dichtheid (IOD/Area) werd gekwantificeerd met behulp van een softwareplatform voor beeldanalyse bij een vergroting van 200×. Voor elke experimentele groep werden in totaal 15 willekeurige microscopische velden gefotografeerd om de ruwe waarden te verkrijgen. De gegevens van elke drie velden werden gemiddeld om één onafhankelijk datapunt te verkrijgen, wat resulteerde in een uiteindelijke steekproefomvang van n = 5 replica's per groep voor statistische analyse. De scoring werd uitgevoerd door twee geblindeerde waarnemers.
Western blot (WB)
Voor de monsterbereiding werden longweefsels van muizen (ongeveer 30 mg) fijngehakt en gehomogeniseerd in 300 µL voorkoelde RIPA-lysebuffer aangevuld met 1% protease/fosfatase-inhibitorcocktail. De homogenisatie werd uitgevoerd met een weefselhomogenisator op 60 Hz gedurende vier cycli (60 s per cyclus). De lysaten werden vervolgens gecentrifugeerd bij ongeveer 13.400 × g gedurende 15 min bij 4 °C om het supernatant te verzamelen. Totale proteïneconcentraties werden bepaald via een standaard BCA-proteïne-assaykit. De monsters werden vervolgens genormaliseerd, gemengd met 5x laadbuffer in een volumeverhouding van 4:1 en gedenatureerd bij 95 °C gedurende 7 min. Voor SDS-PAGE werden proteïnemonsters (20 µg per lane) geladen naast een vooraf gekleurde proteïnemolecuulgewichtmarker, gescheiden bij een constant voltage van 80 V gedurende 20 min, en vervolgens aangepast naar 120 V gedurende 70 min. De proteïnen werden daarna via wet-transfer overgebracht naar 0,22 µm PVDF-membranen bij een constante stroom van 300 mA gedurende 120 min in een ijsbad. De membranen werden geblokkeerd met 5% BSA in TBST gedurende 1 u bij kamertemperatuur en overnacht (tot 18 u) geïncubeerd bij 4 °C met primaire antilichamen tegen CGRP (1:500) en GAPDH (1:2000). Na drie keer wassen met TBST (elk 10 min) werden de membranen 1–2 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met mierikswortelperoxidase-geconjugeerde secundaire antilichamen (1:10000). Na nog eens drie wasbeurten werden de proteïnebanden gevisualiseerd met een enhanced chemiluminescent (ECL) substraat in een VILBER Fusion FX imaging-systeem. Bandintensiteiten werden gekwantificeerd met ImageJ 1.8, en de expressie van het doeleiwit werd genormaliseerd ten opzichte van de GAPDH-interne controle.
Statistische analyse
Alle experimentele gegevens worden uitgedrukt als het gemiddelde ± standaarddeviatie (SD). De data-analyse en statistische weergave zijn uitgevoerd met behulp van een gespecialiseerd statistisch softwareplatform. Voorafgaand aan de vergelijkingen tussen groepen zijn de datasets systematisch onderworpen aan normaliteitstests. Voor normaal verdeelde gegevens met homogene varianties is een gewone eenweg- of tweeweg-variantieanalyse (ANOVA) toegepast, gevolgd door post-hoc tests van Tukey, Šídák, Holm-Šídák of Fisher's LSD voor meervoudige paarsgewijze vergelijkingen. Bij het vergelijken van meerdere groepen met één controlegroep is de toets van Dunnett toegepast. Voor datasets met heterogene varianties is de Brown-Forsythe ANOVA gebruikt, gevolgd door de Dunnett's T3 post-hoc test. Voor datasets die niet aan de normaliteit voldeden, is de non-parametrische Kruskal-Wallis test gebruikt, gevolgd door de post-hoc test van Dunn voor meervoudige vergelijkingen. Een P-waarde < 0,05 werd beschouwd als indicatie voor statistisch significante verschillen. Verschillende significantieniveaus worden dynamisch aangeduid als *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 en ****p < 0,0001. Alle beoordelingen van de experimentele uitkomsten, inclusief histologische scoring, flowcytometrie-analyse en beeldkwantificatie, zijn strikt geblindeerd uitgevoerd.
Resultaten
KAST vermindert pulmonale ILC2's en verlicht type 2 luchtweginflammatie
Om de therapeutische effecten van KAST te onderzoeken, werd een OVA-geïnduceerd AA-muismodel opgezet en behandeld met pleisters aangebracht op de acupunten Feishu (BL13), Geshu (BL17), Pishu (BL20) en Shenshu (BL23) (Figuur 1A). Na het modelleren vertoonden AA-muizen een afname in lichaamsgewicht, terwijl KAST-muizen een significant hoger lichaamsgewicht vertoonden in vergelijking met de modelgroep (Figuur 1B). De longcoëfficiënt, een indicator voor pulmonale ontsteking, was verhoogd bij AA-muizen, maar aanzienlijk verminderd na KAST (Figuur 1C). Gedragsbeoordelingen onthulden een toename van neuskrabben en niezen bij AA-muizen, wat significant werd verlicht door KAST (Figuur 1D–E). Whole-body plethysmografie demonstreerde dat Penh-waarden, indicatief voor hyperresponsiviteit van de luchtwegen, verhoogd waren bij AA-muizen maar afnamen na behandeling, wat wijst op een verbeterde longfunctie (Figuur 1F). Histopathologische analyse met HE-kleuring onthulde peribronchiale en perialveolaire infiltratie van ontstekingscellen in de modelgroep vergeleken met normale controles. In contrast hiermee was de ontstekinginfiltratie verminderd in de KAST-groep (Figuur 2A–B). Immunohistochemie toonde aan dat IL-4, IL-5 en IL-13 primair gelokaliseerd waren in het cytoplasma van infiltrerende ontstekingscellen en sommige epitheelcellen, met mogelijke accumulatie in interstitiële ruimten. Vergeleken met normale controles vertoonde de modelgroep duidelijk verhoogde positieve signalen en gemiddelde optische densiteitswaarden, die significant waren verminderd in de KAST-groep (Figuur 2C–H). Flowcytometrie demonstreerde verder dat ILC2-aantallen significant waren toegenomen in de longen van AA-muizen vergeleken met normale controles, terwijl KAST de ILC2-aantallen aanzienlijk reduceerde (Figuur 2I–J).
KAST verlicht type 2 luchtweginflammatie door de CGRP/RAMP1-as te onderdrukken
De hyperactivatie van ILC2 wordt gereguleerd door meerdere factoren. RNA-seq-analyse wees uit dat de expressie van CGRP significant was verhoogd in AA-muizen, en KAST verlaagde de pulmonale CGRP-niveaus merkbaar (Figuur 3A). Western blot en ELISA bevestigden verhoogde CGRP-proteineniveaus in de modelgroep vergeleken met de controles, die werden verlaagd door KAST (Figuur 3B–D). Deze resultaten suggereren dat KAST de expressie van CGRP in AA-longen vermindert, waardoor de immuunrespons van ILC2 wordt gemoduleerd. Gezameld suggereren deze variaties in high-throughput sequencing en proteïnescreening een sterk verband tussen de therapeutische interventie met KAST en de downregulatie van pulmonale CGRP-niveaus in AA-muizen.
Om de rol van CGRP verder te onderzoeken, werden AA-muizen behandeld met exogeen CGRP, de CGRP-receptorantagonist BIBN-4096, of KAST in combinatie met CGRP. ELISA-resultaten toonden significant verlaagde CGRP-proteineniveaus aan in de KAST- en BIBN-4096-groepen, verhoogde niveaus in de CGRP-groep, en hogere niveaus in de KAST + CGRP-groep vergeleken met KAST alleen (Figuur 4A). Flowcytometrie onthulde dat het aantal ILC2's verminderd was in de KAST- en BIBN-4096-groepen, maar toenam in de CGRP- en KAST + CGRP-groepen ten opzichte van de modelgroep (Figuur 4B–C). HE-kleuring toonde een verminderde infiltratie van ontstekingscellen rond de luchtwegen en alveoli aan in de KAST- en BIBN-4096-groepen, terwijl de infiltratie verergerde in de CGRP- en KAST + CGRP-groepen (Figuur 4D–E). ELISA bevestigde verder verlaagde niveaus van IL-4, IL-5 en IL-13 in de KAST- en BIBN-4096-groepen, maar verhoogde niveaus in de CGRP- en KAST + CGRP-groepen (Figuur 4F–H).
Het aantal pulmonale RAMP1+ILC2's in verschillende groepen werd geëvalueerd via meerkleurige immunofluorescentiekleuring. De resultaten toonden aan dat, vergeleken met de normale controlegroep, het aantal totale RAMP1+ILC2's in de longweefsels van de modelgroep significant was toegenomen. Vergeleken met de modelgroep nam het aantal pulmonale RAMP1+ILC2's in de CGRP-groep verder significant toe, terwijl deze prominent waren afgenomen in zowel de BIBN-4096-groep als de KAST-groep. Opmerkelijk is dat de KAST + CGRP-groep, vergeleken met de KAST-groep, een significante stijging vertoonde in de aantallen pulmonale RAMP1+ILC2's, wat aangeeft dat exogene CGRP-suppletie de remmende effecten van KAST op de populaties van totale RAMP1+ILC2's succesvol heeft omgekeerd (Figuur 5A–B).
BESCHIKBAARHEID VAN GEGEVENS:
De volledige ruwe datasets die tijdens de huidige studie zijn gegenereerd en geanalyseerd, zijn ondergebracht in een openbaar toegankelijke repository. Specifiek omvatten deze uitgebreide materialen alle volledige, originele membraanscans voor Western blot (WB)-assays, alle volledige, ruwe, hoge-resolutie microscopische beelden voor histologie (HE en IHC) en immunofluorescentie (IF)-assays, evenals individuele replicatiedatasets en Excel-sheets voor kwantificatie. Alle ruwe data zijn openbaar beschikbaar via de volgende persistente DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.32979065. De gating-volgorde voor flowcytometrie is weergegeven in Aanvullende Figuur 1. Twee volledige blot-afbeeldingen zijn ingediend als Aanvullende Figuren 2–3, en de kwantitatieve gegevens zijn ingediend in Aanvullende Tabel 1.
Figuur 1: Effecten van KAST op symptomen en longfunctie bij AA-muizen. (A) Protocol voor het induceren van allergische astma met behulp van OVA. (B) Statistieken van het lichaamsgewicht van muizen in elke groep, n = 5. (C) Longcoëfficiënt van muizen in elke groep, n = 5. (D) Aantal neuswrijfbewegingen binnen 10 min na de laatste challenge, n = 5. (E) Frequentie van niezen binnen 10 min na de laatste challenge, n = 5. (F) Penh-waarden van muizen in elke groep na stimulatie met verschillende concentraties acetylcholine, n = 5. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Statistische vergelijkingen zijn uitgevoerd met behulp van eenweg-ANOVA of tweeweg-ANOVA, gevolgd door een post hoc meervoudige vergelijkingstest waar van toepassing. n = biologische replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Regulatie van ILC2-aantallen en type 2 luchtwegontsteking door KAST in AA-muizen. (A) Morfologische veranderingen van de longen onderzocht via HE-kleuring. Schaalbalk = 50 µm. Vergroting: 200×. De ontstekingsscore werd op een geblindeerde manier beoordeeld. (B) Statistische analyse van ontstekingsscores tussen verschillende groepen, n = 5. (C–H) Representatieve IHC-beelden en gemiddelde optische dichtheidswaarden van IL-4 (C, D), IL-5 (E, F) en IL-13 (G, H) eiwitexpressie in longweefsels van verschillende groepen, n = 5. Schaalbalk = 50 µm. Vergroting: 200×. (I) Representatieve flowcytometrie-plots die de uiteindelijke gating van pulmonale ILC2's tonen over de Normal-, Model- en KAST-groepen. Singlets, levensvatbare cellen werden sequentieel gegated als CD45+ Lineage- (CD3ε, CD4, CD8a, CD11b, CD11c, CD49b, TER-119, Ly-6G, CD19), gevolgd door CD90.2+, en pulmonale ILC2's werden uiteindelijk geïdentificeerd door de positieve expressie van KLRG1+. Gegevens werden verkregen op een high-performance flowcytometrieplatform en geanalyseerd met een gespecialiseerd softwarepakket voor flowcytometrieanalyse. (J) Analyse van ILC2's aangegeven door het percentage CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ cellen te midden van levende cellen, n = 5. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van eenweg-ANOVA gevolgd door geschikte post-hoc meervoudige vergelijkingstesten. n = biologische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: KAST remt de expressie van CGRP in de longweefsels van AA-muizen. (A) Heatmap van genexpressie tussen verschillende groepen, n = 4. (B) Representatieve WB-afbeeldingen van CGRP (10 kDa) en GAPDH (37 kDa) expressie in longweefsels van elke groep. (C) WB-analyse van CGRP-eiwitexpressie in longweefsels, weergegeven als relatieve CGRP-expressie (CGRP/GAPDH-ratio), n = 3. (D) ELISA-analyse van CGRP-eiwitexpressie in longweefsels, n = 4. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Statistische vergelijkingen zijn uitgevoerd met behulp van eenweg-ANOVA gevolgd door een post hoc toets voor meervoudige vergelijkingen. n = biologische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Effecten van KAST op ILC2-aantallen en type 2 luchtweginflammatie via CGRP in AA-muizen. (A) ELISA-analyse van CGRP-proteïne-expressie in longweefsels van verschillende groepen, n = 4. (B) Representatieve flowcytometrie-plots van ILC2's (CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺) in elke groep. (C) Analyse van ILC2's, weergegeven als het percentage CD45⁺ Lineage⁻ CD90.2⁺ KLRG1⁺ cellen onder de levende cellen, n = 5. (D) Morfologische veranderingen van de longen onderzocht via HE-kleuring. Schaalbalk = 50 µm. Vergroting: 200×. (E) Statistische analyse van inflammatiescores tussen verschillende groepen, n = 5. (F–H) ELISA-analyse van IL-4 (F), IL-5 (G) en IL-13 (H) proteïne-expressie in longweefsels van verschillende groepen, n = 4. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Statistische vergelijkingen zijn uitgevoerd met behulp van eenweg-ANOVA, gevolgd door passende post hoc meervoudige vergelijkingstests. n = biologische replicaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Effecten van KAST op het aantal ILC2's in longweefsels via de CGRP/RAMP1-route. (A) Celgetallen van RAMP1⁺ ILC2's (gedefinieerd als KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺ triple-positieve cellen) per 400× veld in longweefsels, n = 5. (B) Representatieve fluorescentiekleuring van longweefsels. Kernen werden gekleurd met DAPI (blauw), en immunostaining werd uitgevoerd voor KLRG1 (paars), GATA3 (rood) en RAMP1 (groen). Schaalbalk = 50 µm. Kwantificering: handmatige telling van RAMP1⁺ ILC2's (KLRG1⁺GATA3⁺RAMP1⁺ cellen) op een geblindeerde manier met behulp van een gespecialiseerd platform voor beeldanalyse. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van eenweg-ANOVA gevolgd door een post hoc multiple comparisons-test. n = biologische replica's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Representatieve flowcytometrie-plots die de sequentiële gating-strategie voor de isolatie van pulmonale ILC2s tonen. Allereerst werden de totale events ge-gatet met behulp van forward scatter (FSC-A) en side scatter (SSC-A). Doublets werden uitgesloten via FSC-A vs. FSC-H om enkelcellen te verkrijgen. Levende cellen werden geïdentificeerd als Ghost Dye Red 780⁻ om dode celpopulaties te elimineren. Leukocyten werden vervolgens ge-gatet op CD45⁺, gevolgd door de selectie van lineage-negatieve (Lin⁻) cellen. Binnen de CD45⁺ Lin⁻ subset werden cellen verder ge-gatet op CD90.2⁺, en pulmonale ILC2s werden uiteindelijk gedefinieerd door de positieve expressie van KLRG1 (KLRG1⁺).Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Representatieve Western blot-afbeelding van de interne referentie GAPDH (37 kDa) uit longweefselmonsters van muizen. De geïntegreerde optische dichtheid van de banden werd gekwantificeerd met ImageJ-software voor daaropvolgende normalisatie.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 3: Representatieve Western blot-afbeelding van het doeleiwit CGRP (10 kDa) uit longweefselmonsters van muizen. De relatieve CGRP-expressie werd berekend door de geïntegreerde optische dichtheid van de CGRP-banden te delen door de overeenkomstige geïntegreerde optische dichtheidswaarden van GAPDH.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 1: Ruwe datawaarden. Ruwe datawaarden die zijn gebruikt om de grafieken te plotten.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
De behandeling van AA kent verschillende beperkingen, waaronder bijwerkingen geassocieerd met langdurig medicatiegebruik, onvolledige symptoomcontrole en frequente recidieven. Hoewel conventionele farmacotherapie effectief is, gaat dit vaak gepaard met ongewenste uitkomsten zoals steroidafhankelijkheid26,27. In tegenstelling hiertoe biedt KAST een veilig, economisch en handig alternatief voor het beheer van AA. Klinisch bewijs heeft aangetoond dat KAST astmasymptomen effectief kan verlichten door de pulmonale immuunfunctie te moduleren28. In deze studie hebben we verder aangetoond dat KAST type 2 luchtwegontsteking bij AA-muizen vermindert door de CGRP/RAMP1-route te onderdrukken en het aantal ILC2's te verlagen.
Aangeboren immuniteit, en in het bijzonder ILC2's, speelt een onmisbare rol bij de initiatie, amplificatie en instandhouding van type 2 luchtweginflammatie bij AA29. Na blootstelling aan allergenen reageren ILC2's snel op epitheliale alarminen en scheiden ze binnen enkele uren grote hoeveelheden IL-5 en IL-13 uit, waardoor type 2 inflammatoire responsen worden getriggerd30,31. Bovendien bevorderen ILC2's de Th2-differentiatie en IgE-synthese, wat adaptieve immuunresponsen verder amplificeert en de luchtweginflammatie verergert32. Studies hebben aangetoond dat genetische ablatie van ILC2's de duur van de luchtweginflammatie in AA-modellen significant verkort, wat hun centrale rol bij het in stand houden van type 2 inflammatie benadrukt18. ILC2's worden gereguleerd door cytokinen (bijv. IL-25, IL-33, TSLP), inflammatoire mediatoren (bijv. leukotriënen) en neuropeptiden (bijv. CGRP, VIP, NMU)33. Hiervan spelen neuropeptiden een cruciale rol bij de regulatie van de aangeboren immuniteit. Neuromedine U (NMU) versterkt direct de ILC2-activiteit en induceert snel de afgifte van IL-5 en IL-1334. Vasoactief intestinaal peptide (VIP) draagt bij aan de nutriëntenopname en circadiane regulatie, bevordert de productie van IL-5 door ILC2's en handhaaft de eosinofielen-homeostase33. CGRP vergroot de afgifte van IL-5 vanuit ILC2's aanzienlijk, waardoor de luchtweginflammatie bij AA wordt bevorderd. Opvallend is dat RAMP1, de receptoreenheid voor CGRP, in veel hogere mate tot expressie komt op ILC2's vergeleken met receptoren voor andere neuropeptiden, wat suggereert dat CGRP de meest potente ligand is voor ILC2-activatie35. In deze studie identificeerde transcriptomische analyse CGRP als een van de meest differentieel tot expressie gebrachte neuropeptiden in AA-muizen, en assays op eiwitniveau bevestigden de upregulatie in longweefsels. Exogene toediening van CGRP verhoogde het aantal ILC2's en de afgifte van type 2 cytokinen verder, waardoor de luchtweginflammatie verergerde.
Mechanistisch gezien bindt CGRP aan RAMP1 op ILC2's om hun downstream immuunresponsen te reguleren. Hoewel sommige bestaande literatuur CGRP karakteriseert als een negatieve regulator die de expansie van ILC2's beperkt om hyperinflammatie te voorkomen20,21, wijzen tegenbewijzen erop dat CGRP kan samenwerken met alarmines om groep 2 aangeboren immuniteit robuust op te wekken binnen specifieke pathologische micro-omgevingen. Onze experimentele eindpunten sluiten specifiek aan bij deze laatste cascade, waarbij een door CGRP gedreven opregulering van pulmonale ILC2-infiltratie in de OVA-geïnduceerde allergische micro-omgeving wordt aangetoond. Omgekeerd vermindert blokkade van de CGRP-route met de receptorantagonist BIBN-4096 de door ILC2's gemedieerde luchtweginflammatie significant. In plaats van direct bewijs via genetische ablatie te leveren, maken onze bevindingen gebruik van associatieve transcriptomische variaties en parallelle farmacologische interventie-experimenten (met gebruik van exogeen CGRP en de antagonist BIBN-4096) om aan te tonen dat de therapeutische bescherming van KAST nauw gecorreleerd is met de onderdrukking van CGRP/RAMP1-signaleringsclusters op ILC2's.
Ondanks deze veelbelovende resultaten moeten verschillende inherente beperkingen worden erkend. Ten eerste kan het OVA-geïnduceerde muismodel, hoewel het waardevolle mechanistische inzichten biedt, het complexe pathofysiologische en immunologische landschap van menselijk allergisch astma mogelijk niet volledig reproduceren vanwege soortspecifieke verschillen. Ten tweede vereist de relatief kleine steekproefomvang in bepaalde verkennende assays grotere cohorten om een bredere statistische generalisatie te bereiken. Ten derde heeft deze studie primair prioriteit gegeven aan de CGRP/RAMP1/ILC2-signaleringsas, wat betekent dat andere potentieel relevante neuro-immuuncross-talkpaden en overlappende cytokinenetwerken in de toekomst nader onderzoek verdienen. Meest opvallend is een belangrijke technische beperking: de afwezigheid van een specifieke sham-acupunt-controle groep die gebruikmaakt van niet-medicinale pleisters of niet-acupuntlocaties. Bijgevolg kunnen potentiële niet-specifieke storende factoren — zoals mechanische stress door scheren, experimentele behandeling en de adhesieve stimulatie van de pleister zelf — niet volledig worden gescheiden van de specifieke therapeutische eigenschappen van KAST. Om deze kanttekeningen op te lossen, zullen onze toekomstige onderzoekspijplijnen strikt gebruikmaken van rigoureus ontworpen sham-controles en validaties van meerdere pathways om de specificiteit en reproduceerbaarheid van deze bevindingen verder te consolideren. Met betrekking tot de geobserveerde afname van CGRP-proteineniveaus na interventie met BIBN-4096, is het essentieel om te verduidelijken dat hoewel BIBN-4096 primair functioneert als een competitieve antagonist die zich richt op het RAMP1/CRLR-receptorcomplex en niet als een directe remmer van de CGRP-synthese, de in vivo toediening de lokale accumulatie van liganden in het weefsel kan downreguleren. Dit secundaire fenomeen wordt waarschijnlijk gemedieerd via de verstoring van de positieve neuro-immuun-feedbackloop. Door RAMP1 te blokkeren op doelgerichte immuuncellen zoals ILC2s, onderdrukt BIBN-4096 de downstream afgifte van effectorcytokinen, wat op zijn beurt de retrograde inflammatoire activatie van sensorische zenuwuiteinden en pulmonale neuroendocriene cellen (PNECs) vermindert, waardoor de downstream CGRP-synthese en weefselretentie indirect worden afgezwakt.
Samenvattend tonen onze empirische bevindingen aan dat KAST de pulmonale aangeboren immuunmicro-omgeving effectief hervormt door de neurale CGRP/RAMP1-as te targeten. Hoewel we erkennen dat directe klinische extrapolatie behoedt om voorzichtige optimalisatie gezien de biologische verschillen tussen knaagdieren en mensen, bieden deze eindpunten een cruciale, voorheen ontbrekende mechanistische basis die de traditionele "Fei Wai He Pi Mao" (Longen in combinatie met huid en haar) theorie onderbouwt. Door een verfijnd neuro-immuunperspectief te bieden, stelt dit protocol een betrouwbare wetenschappelijke basis vast om toekomstige prospectieve, multicentrische klinische vertalingen van traditionele kruidige acupuntplaktherapieën voor het beheer van allergisch astma te begeleiden en te ondersteunen.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om te verklaren.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (No. 82274632), het Jiangsu Province Leading Talents Cultivation Project voor Traditionele Chinese Geneeskunde (No. SLJ0309), de Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20231381), het Jiangsu Province Traditional Chinese Medicine Science and Technology Development Plan Project (No. ZT202205) en het Key Laboratory of Acupuncture and Medicine Research van het Ministerie van Onderwijs aan de Nanjing University of Chinese Medicine (No. AML202304).
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3M Medical Ademend Plakband | 3M, USA | 1530C | Fixatie van patches |
| Acetylcholinechloride | Sigma-Aldrich, USA | A6625 | Bronchiale provocatie |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies, VS | G2939BA | Evaluatie van RNA-kwaliteit en -integriteit |
| Alexa Fluor 488 geit anti-konijn IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific, USA | (maatwerkbestelling) | Immunofluorescentie (secundair) |
| Aluminiumhydroxide | Sigma-Aldrich, USA | 239186 | Adjuvans |
| Anti-CGRP-antilichaam (konijn) | Abcam, UK | ab81887 | Western blot / IF |
| BALB/c-muis (vrouwtje, SPF, 8–10 weken, 18–22 g) | Sibelfu (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd. | B202407260106 | Diermodel |
| BB700 rat anti-muis CD90.2 (kloon 53-2.1) | BD Biosciences, USA | 566465 | Flowcytometrie |
| BD FACSCanto II flowcytometer | BD Biosciences, USA | FACSCanto II | Flowcytometrie |
| BIBN-4096 (Olcegepant hydrochloride) | MedChemExpress LLC, USA | HY-10095A | CGRP-receptorantagonist |
| Biotine-lineagecocktail | BD Biosciences, USA | (Aangepast, klonen zoals beschreven) | Flowcytometrie |
| Brilliant Violet 605 Streptavidine | BD Biosciences, USA | 563260 | Flowcytometrie |
| BSA Albumine Fractie V | BioFroxx (neoFroxx GmbH), Duitsland | 4240GR100 | Blokkering |
| Calcitonine/CALCA-eiwit | MedChemExpress LLC, USA | HY-P77587 | CGRP-interventie |
| CD11c/ITGAX-antilichaam (konijn) | Abmart, Shanghai, China | MU115408S | Immunofluorescentie |
| Citraat-antigeenherstelbuffer | Boster, China | AR0024 | Immunohistochemie |
| DAPI-kleuringsoplossing | Beyotime, Shanghai, China | C1006 | Kernkleuring |
| ddH2O (dubbel gedestilleerd water) | Sigma-Aldrich, USA | 10977015 | Eiwitreconstitutie en poederoplossing |
| DESeq2 | Bioconductor (R-pakket) | Versie 1.42.0 | Software voor differentieel expressie-analyse |
| DNase I | Roche Diagnostics, Duitsland | 10104159001 | Vertering van longweefsel |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam, UK | ab150106 | Immunofluorescentie (secundair) |
| ECL-substraat (Super Femto) | Nanjing Lanken Biotech, China | – | Chemiluminescentie bij Western blotting |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime, Shanghai, China | P0010 | Proteïnekwantificering |
| Eosine Y-kleuringsoplossing | Sigma-Aldrich, VS | HT110216 | Histologie (HE-kleuring) |
| Ethanol (absoluut, analytische kwaliteit) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10009218 | Weefseldehydratie en histologie |
| F4/80-antilichaam (muis, kloon C-7) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-377009 | Immunofluorescentie |
| fastp | Open source (GitHub) | Versie 0.23.4 | Software voor kwaliteitscontrole van ruwe RNA-seq-gegevens |
| FITC anti-muis CD45 (kloon 30-F11) | BD Biosciences, USA | 553080 | Flowcytometrie |
| FlowJo | BD Biosciences, USA | 10 | Flowcytometrie-analyse |
| GAPDH monoklonaal antilichaam (muis) | Proteintech, Wuhan, China | 60004-1-Ig | Western blot |
| GATA3-antilichaam (muis, kloon L50-823) | Santa Cruz Biotechnology, USA | sc-268 | Immunofluorescentie |
| Ghost Dye Red 780 | Tonbo Biosciences, USA | 13-0865-T100 | Uitsluiting van dode cellen |
| Geit anti-konijn IgG (H+L) kruisadsorberend secundair antilichaam | Thermo Fisher Scientific, USA | A11008 | Immunofluorescentie (secundair) |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, USA | 10.1.2 | Statistische analyse |
| Hematoxyline-oplossing (Harris) | Sigma-Aldrich, USA | HHS16 | Histologie (HE-kleuring) |
| HISAT2 | Johns Hopkins University (Open Source) | Versie 2.2.1 | Software voor alignment van RNA-seq aan referentiegenomen |
| HRP-geconjugeerde geit anti-muis IgG (H+L) | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-1 | Western blot (secundair) |
| HRP-geconjugeerde geit anti-konijn IgG (H+L) | Proteintech, Wuhan, China | SA00001-2 | Western blot (secundair) |
| HTSeq-count | EMBL (Python-hulpprogramma) | Versie 2.0.3 | Utility voor het tellen van reads van genomische kenmerken bij RNA-seq |
| Waterstofperoxide (H2O2, 3% oplossing) | Sigma-Aldrich, USA | H1009 | Blokkeren van endogene peroxidase |
| iFluor™ 488-geconjugeerd geit anti-konijn IgG-antilichaam | Huabio, China | HA1121 | Immunofluorescentie (secundair) |
| IL-4 monoklonaal antilichaam | Proteintech, Wuhan, China | 66142-1-Ig | Western blot |
| IL13-antilichaam | Affinity Biosciences, USA | DF6813 | Western blot |
| IL5-antilichaam | Affinity Biosciences, USA | AF5123 | Western blot |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina, VS | – | RNA-sequencing |
| ImageJ | NIH, USA | 1.8 | Kwantificering van Western blot |
| Image-Pro Plus | Media Cybernetics, USA | Versie 6.0 | Kwantificering van de optische dichtheid van afbeeldingen |
| KAST kruidenformulering | Afdeling Farmacie, Gelieerd Ziekenhuis van de Nanjing University of Chinese Medicine | – | Interventie |
| KLRG1 monoklonaal antilichaam (2F1) | Thermo Fisher Scientific, USA | 58-5893-82 | Immunofluorescentie |
| Leica LAS X | Leica Microsystems, Duitsland | 4.5 | Kwantificering van immunofluorescentie |
| Leica STELLARIS 8 DIVE confocale microscoop | Leica Microsystems, Duitsland | STELLARIS 8 | Immunofluorescentie-beeldvorming |
| Liberase TM | Roche Diagnostics, Duitsland | 5401119001 | Vertering van longweefsel |
| Marker (voorgekleurde eiwitladder) | NCM Biotech, Suzhou, China | P9001 | Western blot |
| Muis CGRP ELISA-kit | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF2491-A | ELISA |
| Muis IL-13 ELISA-kit | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02456M1 | ELISA |
| Muis IL-4 ELISA-kit | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-02448M1 | ELISA |
| Muis IL-5 ELISA-kit | Aifang Biotechnology, Hunan, China | AF-11729M1 | ELISA |
| Neutraal balsam montagemedium | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10014061 | Het monteren van histologische coupes |
| Normaal geiten serum (voor blokkering) | Abcam, VK | ab7481 | Immunohistochemie/IF-blokkering |
| OCT-inbeddingsmedium | Sakura, VS | 4583 | Inbedding voor cryosecties |
| One-Step PAGE-gel snelle preparatiekit | Vazyme, Nanjing, China | E303-01 | SDS-PAGE gelbereiding |
| Ovalbumine (OVA) | Sigma-Aldrich, USA | A5503 | Sensibilisering/provocatie |
| Paraformaldehyde (4% in PBS) | Biosharp, China | BL539A | Weefselfixatie |
| PE anti-muis/mens KLRG1 (kloon 2F1) | BD Biosciences, USA | 564022 | Flowcytometrie |
| Fosfataseremmer-cocktail (50×) | Beyotime, Shanghai, China | P1092 | Proteïne-extractie |
| Poly-L-lysine-oplossing | Boster, China | AR0003 | Coating van histologische coupes |
| Proteïnase- en fosfataseremmer | NCM Biotech, Suzhou, China | P002 | Proteïne-extractie |
| PVDF-membraan (0.22 μm) | Merck Millipore, USA | ISEQ00010 | Western blot |
| RAMP1 polyklonaal antilichaam (konijn) | Proteintech, Wuhan, China | 10327-1-AP | Immunofluorescentie |
| Lysisbuffer voor rode bloedcellen (RBC) | Beyotime, Shanghai, China | C3702 | Monsterbereiding voor flowcytometrie |
| RIPA-lysisbuffer (sterk) | Beyotime, Shanghai, China | P0013B | Proteïne-extractie |
| RPMI-1640-medium | Thermo Fisher Scientific, VS | 11875093 | Basis voor weefselceldigestie |
| SuperKine™ Verbeterd antifade-montagemedium | Wuhan Yakeyin Biotechnology Co., Ltd. | BMU104 | Montage van immunofluorescentie |
| Triton X-100 (detergens) | Sigma-Aldrich, USA | T8787 | Permeabilisatie voor immunofluorescentie |
| TRIzol-reagens | Thermo Fisher Scientific, USA | 15596026 | RNA-extractie |
| VAHTS Universal V10 RNA-seq Library Prep Kit | Vazyme, Nanjing, China | NR605-01 | Constructie van RNA-seq-bibliotheken |
| Whole-body plethysmografiesysteem | Guangyuanda, Peking, China | WBP-4 | Longfunctie (Penh) |
| Xyleen (analytische zuiverheid) | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10023418 | Deparaffinering en klaring |
Referenties
- Chinese guidelines for the diagnosis and treatment of allergic asthma (2019, the first edition). Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2019;58(9):636-55.
- Huang K, et al. Prevalence, risk factors, and management of asthma in China: a national cross-sectional study. LANCET. 2019;394(10196):407-18.
- Zhou J, et al. Characteristics of different asthma phenotypes associated with cough: a prospective, multicenter survey in China. Respir Res. 2022;23(1):243.
- Venkatesan P. 2023 GINA report for asthma. Lancet Respir Med. 2023;11(7):589.
- Schatz M, Rosenwasser L. The allergic asthma phenotype. J Allergy Clin Immunol Pract. 2014;2(6):645-8; quiz 9.
- Reddel HK, et al. Global Initiative for Asthma Strategy 2021: executive summary and rationale for key changes. Eur Respir J. 2022;59(1).
- Smith SG, et al. Increased numbers of activated group 2 innate lymphoid cells in the airways of patients with severe asthma and persistent airway eosinophilia. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(1):75-86.e8.
- Mu JX, et al. Effects of fermented white mustard seed plaster on airway immune balance and its inflammatory response mechanism in bronchial asthma rats. Zhen Ci Yan Jiu. 2025;50(3):287-94.
- Zhao SM, et al. Anti-asthma components and mechanism of Kechuanting acupoint application therapy: based on serum metabolomics and network pharmacology. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(24):6780-93.
- Hu J, et al. A systematic review and meta-analysis of acupoint application combined with western medicine therapy in the treatment of bronchial asthma. Ann Palliat Med. 2021;10(11):11473-81.
- Hu W, et al. Study on Raman spectroscopy evaluating the contact dermatitis produced by acupoint sticking during treating bronchial asthma. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2022;37(3):1830-3.
- Wang H, et al. Effect of Acupoint Application Induced Contact Dermatitis on Asthma Control and Serum IFN-gamma/IL-4 in Asthmatic Patients. Journal of Traditional Chinese Medicine. 2018;59(7):582-5.
- Yang Q, et al. Modulation of helper T cell 2 cytokines in asthmatic rats by acupoint application with ginger juice hydrogel. China Journal of Traditional Chinese Medicine and Pharmacy. 2024;39(6):3068-72.
- Wang Y, et al. Effects of Baijiezi Powder and Its Disassembled Formula on the Ig-E,IL-4,IFN-gamma and TNF-alpha in Allergic Asthmatic Rats. Chinese Pharmaceutical Journal. 2019;54(18):1491-6.
- Guidelines for the prevention and management of bronchial asthma (2024 edition). Zhonghua Jie He He Hu Xi Za Zhi. 2025;48(3):208-48.
- Boonpiyathad T, Sözener ZC, Satitsuksanoa P, Akdis CA. Immunologic mechanisms in asthma. Semin Immunol. 2019;46:101333.
- Klein Wolterink RG, et al. Pulmonary innate lymphoid cells are major producers of IL-5 and IL-13 in murine models of allergic asthma. Eur J Immunol. 2012;42(5):1106-16.
- Christianson CA, et al. Persistence of asthma requires multiple feedback circuits involving type 2 innate lymphoid cells and IL-33. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(1):59-68.e14.
- Kabata H, Artis D. Neuro-immune crosstalk and allergic inflammation. J Clin Invest. 2019;129(4):1475-82.
- Wallrapp A, et al. Calcitonin Gene-Related Peptide Negatively Regulates Alarmin-Driven Type 2 Innate Lymphoid Cell Responses. Immunity. 2019;51(4):709-23.e6.
- Nagashima H, et al. Neuropeptide CGRP Limits Group 2 Innate Lymphoid Cell Responses and Constrains Type 2 Inflammation. Immunity. 2019;51(4):682-95.e6.
- Shi K, et al. Optimization of acupoint application scheme in the treatment of bronchial asthma based on the orthogonal design method. Zhongguo Zhen Jiu. 2017;37(6):571-5.
- Hu J, et al. Components of drugs in acupoint sticking therapy and its mechanism of intervention on bronchial asthma based on UPLC-Q-TOF-MS combined with network pharmacology and experimental verification. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi. 2022;47(5):1359-69.
- Li Y, et al. Kinetics of the accumulation of group 2 innate lymphoid cells in IL-33-induced and IL-25-induced murine models of asthma: a potential role for the chemokine CXCL16. Cell Mol Immunol. 2019;16(1):75-86.
- Xu J, et al. Excess neuropeptides in lung signal through endothelial cells to impair gas exchange. Dev Cell. 2022;57(7):839-53.e6.
- Patel VH, et al. Current Limitations and Recent Advances in the Management of Asthma. Dis Mon. 2023;69(7):101483.
- Farinha I, Heaney LG. Barriers to clinical remission in severe asthma. Respir Res. 2024;25(1):178.
- Zhao SM, et al. Repeated Herbal Acupoint Sticking Relieved the Recurrence of Allergic Asthma by Regulating the Th1/Th2 Cell Balance in the Peripheral Blood. Biomed Res Int. 2020;2020:1879640.
- van Rijt L, von Richthofen H, van Ree R. Type 2 innate lymphoid cells: at the cross-roads in allergic asthma. Semin Immunopathol. 2016;38(4):483-96.
- Cortez VS, Robinette ML, Colonna M. Innate lymphoid cells: new insights into function and development. Curr Opin Immunol. 2015;32:71-7.
- Thio CL, Chang YJ. The modulation of pulmonary group 2 innate lymphoid cell function in asthma: from inflammatory mediators to environmental and metabolic factors. Exp Mol Med. 2023;55(9):1872-84.
- Kubo M. Innate and adaptive type 2 immunity in lung allergic inflammation. Immunol Rev. 2017;278(1):162-72.
- Kabata H, Moro K, Koyasu S, Asano K. Group 2 innate lymphoid cells and asthma. Allergology International. 2015;64(3):227-34.
- Cardoso V, et al. Neuronal regulation of type 2 innate lymphoid cells via neuromedin U. Nature. 2017;549(7671):277-81.
- Xie X, et al. Mediation of the JNC/ILC2 pathway in DBP-exacerbated allergic asthma: A molecular toxicological study on neuroimmune positive feedback mechanism. J Hazard Mater. 2024;465:133360.