Gestandaardiseerd Multicolor Flow Cytometrieprotocol voor meetbare residuele ziektebeoordeling bij acute leukemie

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een gestandaardiseerde meerkleurige flowcytometrieworkflow voor meetbare residuele ziektebeoordeling bij acute leukemie, waarbij gecontroleerde monsterverwerking, geharmoniseerde acquisitieparameters, sequentiële gatingstrategieën en door de noemer aangepaste interpretatie worden geïntegreerd om de analytische reproduceerbaarheid in routinematige klinische laboratoria te verbeteren.

Samenvatting

Meetbare restziekte (MRD) is een belangrijke prognostische indicator bij de behandeling van acute leukemie. Routinematige multicolor flowcytometrische (MFC) beoordeling blijft echter kwetsbaar voor pre-analytische en analytische variabiliteit, waaronder hemodilutie, inconsistente acquisitiediepte en subjectieve interpretatie. Dit artikel presenteert een gestandaardiseerde operationele workflow voor routinematige MRD-evaluatie bij B-cel acute lymfoblastische leukemie (B-ALL) en acute myeloïde leukemie (AML). Het protocol bevat strikte criteria voor het toepassen van monsters, met geïntegreerde hemodilusiebeoordeling, en maakt gebruik van een bulk-methode voor rode bloedcellen voor beenmerg- en perifere bloedmonsters. Analytische standaardisatie wordt bereikt door ziekte-specifieke tweebuis-, achtkleurige antilichaampanelen, geharmoniseerde acquisitiedoelen die minstens 500.000 CD45-positieve gebeurtenissen vereisen, en vaste sequentiële gatingstrategieën. Daarnaast past de workflow noemer-gecorrigeerde detectielimieten (LOD) en kwantificatie (LOQ) toe om een objectief drielaags rapportagesysteem te ondersteunen. Validatie bij 197 klinische monsters toonde sterke herhaalbaarheid, robuuste verdunningslineariteit en hoge overeenstemming met gekoppelde orthogonale moleculaire assays. Gezamenlijk biedt dit protocol een praktisch kader voor gestandaardiseerde MRD-monitoring. voor gestandaardiseerde MRD-monitoring in routinematige klinische laboratoria door het integreren van gecontroleerde pre-analytische behandeling en geharmoniseerde analytische parameters.

Inleiding

Zelfs na het bereiken van morfologische remissie hebben patiënten met acute leukemie voortdurende monitoring nodig op meetbare restziekte (MRD) om het terugvalrisico nauwkeurig te beoordelen. Conventionele morfologische en cytopathologische onderzoeken missen de gevoeligheid die nodig is om laag-niveau restleukemische populaties te detecteren. Daarom is MRD-beoordeling een essentieel onderdeel geworden van ziektemonitoring bij zowel acute myeloïde leukemie (AML) als B-cel acute lymfoblastische leukemie (B-ALL). Recente aanbevelingen van het European LeukemiaNet benadrukken dat betrouwbare MRD-beoordeling in AML afhankelijk is van technische standaardisatie en reproduceerbaarheid van interobservers in plaats van eenvoudige assaybeschikbaarheid ^1,2. In B-ALL blijft multicolor flowcytometrie (MFC) bijzonder belangrijk voor patiënten zonder stabiele moleculaire doelen. Eerdere studies hebben aangetoond dat gestandaardiseerde meerkleurige flowcytometrische benaderingen met gestructureerde antilichaampanelontwerpen reproduceerbare en gevoelige detectie van residuele ziekten kunnen^bieden. Flowcytometrie wordt veel gebruikt vanwege de brede toepasbaarheid, snelle doorlooptijd en kosteneffectiviteit. De assayprestaties blijven sterk afhankelijk van gestandaardiseerde monstervoorbereiding, acquisitieparameters en data-interpretatie⁴.

Een van de grootste technische uitdagingen bij de beoordeling van flowcytometrische MRD is de detectie van zeldzame gebeurtenissen, die sterk wordt beïnvloed door de diepte van de acquisitie en het totale aantal gebeurtenissen. Identieke antilichaampanelen kunnen verschillende analytische gevoeligheden veroorzaken als monsters worden verkregen met inconsistente noemergroottes⁵. Standaardisatie gaat daarom verder dan antistofselectie en vereist geharmoniseerde monsterverwerking, bulk-rode bloedcel-lyse, instrumentcompensatie, acquisitiedoelen en gatingstrategieën. In beenmergmonsters is hemodilusie ook een belangrijke pre-analytische variabele, omdat perifere bloedverontreiniging de schijnbare resterende leukemische last kunstmatig kan verminderen ^6,7. Daarnaast vereist de interpretatie van laagfrequente gebeurtenissen duidelijk gedefinieerde rapportagedrempels op basis van specimenspecifieke verwervingsdiepte. Recente studies hebben het belang benadrukt van door de noemer aangepaste detectielimieten (LOD) en kwantificatie (LOQ) voor het verbeteren van de consistentie van flowcytometrische MRD-interpretatie⁸.

Het algemene doel van dit protocol is het bieden van een gestandaardiseerde workflow voor routinematige MFC-gebaseerde MRD-beoordeling in B-ALL en AML. Het protocol integreert criteria voor het toepassen van monsters, hemodilusiebeoordeling, ontwerp van ziektespecifieke antistoffenpanelen, bulk-lysismonstervoorbereiding, geharmoniseerde acquisitiedoelen, vaste sequentiële gatingstrategieën en door de noemer aangepaste rapportagecriteria in één operationeel kader ^9,10. Door gestandaardiseerde pre-analytische en analytische procedures te combineren, biedt deze methode een praktische en reproduceerbare benadering voor routinematige klinische laboratoriumimplementatie van MRD-monitoring. Figuur 1 illustreert de algemene gestandaardiseerde pre-analytische en analytische workflow die in deze studie is geïmplementeerd. Tabel 1 vat de cohort- en monsterkenmerken samen van de patiënten met B-cel acute lymfoblastische leukemie (B-ALL) en acute myeloïde leukemie (AML) die tijdens de validatieperiode over vooraf gedefinieerde monitoringsvensters (Einde van Inductie, Consolidatie en Pre-HSCT) zijn opgenomen.

Figuur 1: Gestandaardiseerde workflow voor routinematige multicolor flowcytometrische MRD-beoordeling. (A) Pre-analytische workflow met monsterscreening en kwaliteitsbeoordeling over vooraf gedefinieerde monitoringsintervallen. (B) Analytische workflow van bulk-rode bloedcel-lyse en antilichaamkleuring via sequentiële gating, noemer-aangepaste interpretatie en definitieve MRD-rapportage. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Geconsolideerde patiëntdemografie, klinische specimenkenmerken en routinematige acquisitiemetrieken. Deze enkele herziene tabel vat de klinische basiskenmerken samen van de ingeschreven cohort, bestaande uit B-cel acute lymfoblastische leukemie (B-ALL) en acute myeloïde leukemie (AML) gevallen en combineert patiëntniveau-demografische gegevens met specimenniveau-kenmerken, behandelingsmonitoringsintervallen, levensvatbaarheid, hemodilusiescores, acquisitiedieptes en door de noemer aangepaste meetbare residuele ziekteclassificaties. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Protocol

Alle procedures waarbij menselijke monsters betrokken zijn, werden uitgevoerd volgens de institutionele richtlijnen en goedgekeurd door de Ethische Commissie van het Tweede Volksziekenhuis van Neijiang (Goedkeuringsnummer PXTS887192). De studie maakte gebruik van gedeidentificeerde resterende klinische monsters die waren verkregen na routinematige diagnostische tests. Geïnformeerde toestemming werd opgegeven omdat de studie geen invloed had op de patiëntenzorg, de toewijzing van behandelingen of de procedures voor het verzamelen van monsters. De chemicaliën, reagentia en apparatuur die in het protocol worden gebruikt, zijn vermeld in de Materiaaltabel.

1. Monsterverzameling en pre-analytische beoordeling

1. Verzamel beenmergaspiraten als het voorkeurstype voor meetbare restziekte (MRD) beoordeling. Gebruik perifere bloedmonsters alleen wanneer beenmergaspiratie klinisch gecontra-indiceerd is of tijdens geselecteerde surveillance- en vergelijkingsanalyses.
2. Verzamel het beenmergmonster tijdens de eerste aspiratie-trek wanneer mogelijk. Vermijd latere aspiratie-extracties om perifere bloedbesmetting en onderschatting van laag-niveau restziekte te minimaliseren.
3. Onmiddellijk na de verzameling worden monsters overgebracht in dikaliumethyleendiaminetetraazijnzuur (K2-EDTA) of natriumheparine-anticoagulantiebuizen. Bewaar en vervoer de exemplaren op kamertemperatuur (18–25 °C) en bescherm ze tegen direct zonlicht.
   VOORZICHTIG: Bewaar de monsters niet in de koelkast.
4. Verwerk alle monsters binnen 24 uur na de verzameling. Voor stabiliteitsstudies bewaar aliquots voor herhaalde analyse op 24 en 48 uur, terwijl de opslagomstandigheden op kamertemperatuur behouden blijven.
5. Controleer de patiëntidentificatie, het type antistollingsmiddel, de integriteit van het monster en de verzameltijd bij ontvangst van het monster. Afstoten exemplaren die uitgebreide stolling, ernstige hemolyse of duidelijke cellulaire degeneratie vertonen
6. Beoordeel beenmergmonsters op hemodilusie voordat je definitief wordt geïnterpreteerd. Bereken een semi-kwantitatieve hemodilusiescore van 0,00 tot 1,00 om perifere bloedverontreiniging te schatten.
7. Bepaal deze waarde door het aandeel volwassen lymfocyten te delen door de som van CD34-positieve voorgangers, onrijpe granulocyten en rijpe lymfocyten, waarbij een hoger quotiënt wijst op een groter verdunningseffect.
   OPMERKING: Bereken de score met de volgende formule:
    
   waarbij een hogere score wijst op een grotere perifere bloedbesmetting.
8. Classificeer hemodilusiescores als volgt: <0,20, acceptabel; 0,20–0,39, licht gehemodilud; en ≥0,40, aanzienlijk gehemodiludeerd.
   OPMERKING: Ken geen definitieve MRD-negatieve interpretaties toe aan duidelijk gehemodiluteerde exemplaren tenzij een adequate noemergrootte en de structuur van de bewaard geconserveerde mergvoorloper zijn bevestigd.

2. Voorbereiding van ziekte-specifieke antistoffenpanelen

1. Bereid gestandaardiseerde, ziekte-specifieke tweebuis-, achtkleurige antistofpanelen voor B-ALL en AML-analyse. Bereik panelstandaardisatie door strikt vast te houden aan vaste ruggengraatmarkers over alle buizen voor stabiele populatiegating.
2. Gebruik consistente fluorochroomconjugaten voor overeenkomstige antigenen en volg strikt de door de fabrikant aanbevolen titratievolumes om de fluorescentievariabiliteit per batch te minimaliseren.
3. Raadpleeg aanvullende tabel 1 voor markercombinaties, fluorochroomtoewijzingen, antistofklonen, kleuringsvolumes en verwervingsparameters.
4. Voor B-ALL-beoordeling gebruik CD19, CD45, CD34, CD10 en CD20 als ruggengraatmarkers in beide buisjes om precursorpopulaties en rijpingspatronen te definiëren. Voeg CD38, CD58 en CD81 toe aan buis 1.
5. Voeg CD66c, CD123 en CD73 of CD304 toe aan buis 2 volgens het diagnostische leukemie-geassocieerde immunofenotype dat bij de basisbeoordeling is vastgesteld.
6. Voor AML-beoordeling gebruik CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 en HLA-DR als ruggengraatmarkers in beide buizen om blast- en onvolwassen myeloïde populaties te definiëren.
7. Voeg CD7 en CD56 toe aan buis 1 om cross-lineage antigeenexpressie te evalueren. Voeg CD11b en CD15 toe aan buis 2 om myeloïde rijpingsafwijkingen te evalueren.

3. Bulk-lysis voorbereiding en kleuring

1. Breng 2,0 mL goed gemengd beenmerg of perifere bloedmonster over in een 15 mL polypropyleen buis. Als het monstervolume beperkt is, gebruik dan een minimaal ingangsvolume van 1,0 mL.
2. Voeg 10 ml voorverwarmde ammoniumchloride-lysebuffer toe aan het monster. Incubeer de suspensie 10 minuten op kamertemperatuur om rode bloedcellen te lyseren.
3. Centrifugeer het monster op 500 × g gedurende 5 minuten. Gooi het supernatant voorzichtig weg zonder de genucleeerde celpellet te verstoren.
4. Suspendeer de pellet opnieuw in 2 mL fosfaatgeborrelde zoutoplossing (PBS) met 0,5% rundserumalbumine (BSA) en 2 mM ethylenediaminetetraazijnzuur (EDTA). Herhaal de wasstap één keer als er nog rester van hemoglobinebesmetting zichtbaar is.
5. Bepaal de concentratie van genucleeerde cellen met behulp van een geautomatiseerde hematologie-analyzer of handmatige hemocytometertelling met trypanblauwe uitsluiting. Beschouw een minimale nucleaire celconcentratie van 5 × 10⁶ cellen/mL als optimaal voor standaardverwerving.
   OPMERKING: Als de cellulaire opbrengst onder deze drempel valt, concentreer je het monster door een extra centrifugatie op 500 × g gedurende 5 minuten, en verminder je zorgvuldig het volume van de resuspendeerbuffer om de cellulaire dichtheid te maximaliseren.
6. Aliquot 5 × 10^{à 6} gekernde cellen per buis voor routinematige kleuring. Verhoog de invoer tot maximaal 1 × 10^{7 cellen} per buis voor een analyse met hoge gevoeligheid wanneer het monsterherstel ^6,7 toelaat.
7. Voeg de individueel getitreerde antilichaamcocktail en de in de Table of Materials gespecificeerde fixeerbare kleurstof toe aan elke tube volgens de gevalideerde kleurpaneelconfiguratie. Het routinematig gevalideerde paneel gebruikt 5 μL per fluorochroom-geconjugeerd antilichaam, tenzij de door de fabrikant aanbevolen titratie een ander antistofspecifiek volume aangeeft.
8. Zorg ervoor dat het uiteindelijke kleuringsreactievolume strikt wordt gehandhaafd op 100 μL per test om de optimale antilichaam-naar-antigeen stoichiometrie te behouden. Breng de exemplaren 15 minuten uit op kamertemperatuur in het donker.
9. Was de gekleurde cellen één keer met washbuffer en suspendeer de uiteindelijke pellet opnieuw in 500 μL opnamebuffer.
10. Bereid single-stained compensatiecontroles voor met compensatiekralen op dezelfde dag als de proefverwerving.

4. Instrumentopstelling en gegevensverzameling

1. Voer dagelijkse kwaliteitscontrole uit voor de opstart van de flowcytometer voordat patiëntmonsters worden genomen. Controleer de fluidica, laseruitlijning, detectorprestaties en fluorescentiedoelwaarden met kalibratiekralen, volgens de instructies van de fabrikant.
2. Bereid enkelvoudige gekleurde compensatiecontroles voor met dezelfde fluorochroomen die in de antilichaampanelen zijn opgenomen. Pas de compensatiematrix aan vóór de patiëntovername en bevestig dat de ruggengraatmarkers binnen de vooraf gedefinieerde fluorescentiedoelwaarden blijven.
3. Gebruik dezelfde acquisitietemplate, detectorinstellingen, compensatiestrategie en gatinghiërarchie voor alle monsters die tijdens de validatieperiode worden geanalyseerd.
   OPMERKING: Zorg voor een juiste harmonisatie tussen instrumenten door gestandaardiseerde mediane fluorescentieintensiteitswaarden vast te stellen voor alle detectoren met gespecialiseerde kalibratiekorrels, en bevestig dat identieke monsters vergelijkbare fluorescentieprofielen leveren over platforms heen vóór klinische gegevensverzameling.
4. Verzamel gegevens met een lage tot matige stroomsnelheid om gelijktijdige gebeurtenissen te verminderen en de nauwkeurigheid van zeldzame gebeurtenisdetectie te behouden. Monitor de gebeurtenisfrequentie continu tijdens de verwerving.
5. Verkrijg minstens 500.000 CD45-positieve genucleeerde gebeurtenissen voor elk rapporteerbaar MRD-resultaat. Wanneer de kwaliteit van het monster en de stabiliteit van het evenement het toelaten, wordt de verwerving verlengd tot 1,0–1,5 miljoen totale gebeurtenissen, vooral wanneer laag-niveau restziekte wordt vermoed.
6. Stop of stop de verwerving als er vloeistoffen instabiliteit zijn, monsterverstoppingen, plotselinge veranderingen in de gebeurtenissnelheid of zichtbare verslechtering van de verstrooiingskwaliteit optreden. Filter of mix het monster opnieuw wanneer dat nodig is, en neem het monster pas opnieuw op nadat de stabiele stroming is hersteld.

5. Sequentiële gating en noemer-gecorrigeerde interpretatie

1. Analyseer de flowcytometriegegevens met gevalideerde flowcytometrie-analysesoftware. Gebruik dezelfde sequentiële gatingstrategie voor alle monsters om de variabiliteit tussen operators te verminderen.
2. Stel normale en regenererende rijpingspatronen vast door onafhankelijk een referentiebank van ten minste 20 normale of regenererende beenmergmonsters te verzamelen en te analyseren als basiswijzer-expressietemplates.
3. Sluit puin uit met behulp van voorste verstrooiing en zijverstrooiingsparameters. Isoleer enkele cellen door voorwaartse verstrooiingsgebied versus voorwaartse verstrooiingshoogte toe te passen.
4. Sluit niet-levensvatbare cellen uit met behulp van de levensvatbaarheidskleurpoort die in de Materiaaltabel is vermeld. Elimineer deze niet-levensvatbare cellen routinematig omdat ze niet-specifieke antistofbinding vertonen en kunstmatig achtergrondgeluid kunnen verhogen of zeldzame abnormale populaties kunnen nabootsen.
   OPMERKING: Vereist een minimale levensvatbaarheidsdrempel van 75% voor optimale downstream-analyse, met de vermelding dat exemplaren die onder deze waarde vallen zorgvuldige interpretatie vereisen met betrekking tot potentiële zeldzame artefacten. Definieer de leukocytennoemer door te gaten op levensvatbare CD45-positieve gebeurtenissen met geschikte zijverstrooiingskenmerken.
5. Voor B-ALL monsters beperkt de analyse zich tot het CD19-positieve precursorcompartiment. Een alternatief gating-kader implementeren voor patiënten die anti-CD19 gerichte therapieën ontvangen.
6. Verplaats de primaire evaluatie naar CD22-, CD24- of CD34-positieve compartimenten om de leukemische populatie onafhankelijk van CD19-expressie te bereiken. Evalueer de rijpingspatronen van CD34, CD10 en CD20 en identificeer afwijkende populaties met behulp van CD38, CD58, CD81, CD66c, CD123 en CD73 of CD304 expressiepatronen.
7. Voor AML-monsters definieer je het blast- of precursorgebied met behulp van CD45, zijverstrooiing, CD34 en CD117-expressie.
8. Evalueer abnormale of asynchrone expressie van myeloïde en cross-lineage markers, waaronder CD13, CD33, HLA-DR, CD7, CD56, CD11b en CD15.
9. Bereken de specimen-specifieke detectielimiet (LOD) en kwantificatielimiet (LOQ) met het totale aantal verkregen levensvatbare CD45-positieve gebeurtenissen als noemer:
    
    
10. Classificeer de definitieve MRD-interpretatie in een van drie categorieën: MRD-positief, onder LOD, of analytisch beperkt.
    1. Wijs het resultaat toe als MRD-positief wanneer een duidelijke, aaneengesloten cluster van afwijkende gebeurtenissen de specimenspecifieke LOD overschrijdt en een intern consistent immunofenotype vertoont dat verschilt van normale of regenererende hematopoëtische populaties.
       OPMERKING: Classificeer verspreide, niet-geclusterde gebeurtenissen niet als MRD-positief. Gebruik een geïntegreerde analysemethode waarbij zowel het leukemie-geassocieerde immunofenotype (LAIP) dat is gevolgd uit de basisdiagnostische steekproef als verschillende-van-normaal (DfN) patroonherkenningsstrategieën wordt gecombineerd.
    2. Ken het resultaat toe als volgt LOD wanneer zeldzame verdachte gebeurtenissen aanwezig zijn maar de specimenspecifieke meldbare drempel niet bereiken.
    3. Ken het resultaat toe als analytisch beperkt wanneer de noemer onvoldoende is, de hemodilusie aanzienlijk is, de kwaliteit van het monster slecht is, of pre-analytische of analytische beperkingen een betrouwbare negatieve interpretatie verhinderen.
11. Bekijk alle MRD-positieve en borderline laag-niveau gevallen onafhankelijk door een tweede gekwalificeerde analist.
12. Rondt de interpretatie van de flowcytometrie af voordat je gepaarde moleculaire vergelijkingsgegevens beoordeelt, inclusief kwantitatieve polymerasekettingreacties of next-generation sequencingresultaten.

6. Analytische validatiemethodologie

1. Beoordeel de analytische herhaalbaarheid door dubbele aliquots te bereiden uit dezelfde post-lyse celsuspensie. Verzamel en analyseer onafhankelijk minstens 30 gepaarde exemplaren.
2. Evalueer de verdunningslineariteit door seriële verdunningen voor te bereiden over zes niveaus binnen het verwachte laag-lastbereik. Vergelijk waargenomen MRD-waarden met verwachte MRD-waarden over de verdunningsreeks.
3. Beoordeel de reproduceerbaarheid tussen operators en instrumenten door referentiemonsters te analyseren over meerdere gekwalificeerde operatoren en geharmoniseerde flowcytometers.
4. Transformeer flowcytometrische en gepaarde moleculaire MRD-percentages met log10-transformatie voordat statistische vergelijking wordt gemaakt. Evalueer kwantitatieve overeenstemming met behulp van correlatieanalyse en Bland-Altman-analyse.

Resultaten

Kenmerken van de routinematige implementatiedataset

Tijdens de studieperiode doorstonden 197 opeenvolgende exemplaren de geschiktheidsscreening en pre-analytische kwaliteitsbeoordeling en kwamen ze in de rapportageworkflow terecht. De studiecohort omvatte 98 patiënten, 62 (63,3%) met B-cel acute lymfoblastische leukemie (B-ALL) en 36 (36,7%) met acute myeloïde leukemie (AML). De cohort bestond uit 64 mannen (65,3%) en 34 vrouwen (34,7%), met een mediane leeftijd van 32 jaar (interkwartielbereik [IQR], 13–49 jaar; bereik 2–73 jaar). Het mediane basispercentage blasts was 67,2% (IQR, 56,9% – 80,2%).

De meeste geanalyseerde monsters waren beenmergaspiraten (174/197, 88,3%), terwijl perifere bloedmonsters 23/197 (11,7%) uitmaken. Volgens de vooraf gedefinieerde monitoringsintervallen werden 86 monsters (43,7%) verzameld aan het einde van de inductietherapie, 65 (33,0%) tijdens consolidatietherapie en 46 (23,4%) vóór hematopoëtische stamceltransplantatie (HSCT) (Tabel 1).

De mediane levensvatbaarheid van het monster was 88,3% (IQR, 84,4% – 92,6%). De acquisitieworkflow leverde een mediaan van 1.116.901 totale gebeurtenissen op (IQR, 908.521–1.258.946) voorafgaand aan het opschonen van de data. Na de sequentiële analytische uitsluiting van puin, coincident doublets en niet-levensvatbare cellen, behaalde de gatingstrategie een mediaan van 907.325 levensvatbare enkele CD45-positieve doelgebeurtenissen (IQR, 690.112–1.095.836), met een mediaan verwervingstijd van 11,9 minuten. De mediane hemodilusiescore was 0,20 (IQR, 0,14–0,28). Volgens de noemer-gecorrigeerde interpretatie werden 41 exemplaren (20,8%) geclassificeerd als MRD-positief, en 156 monsters (79,2%) werden geclassificeerd als onder de specimen-specifieke detectiegrens (LOD) (Tabel 1).

Analytische validatie: herhaalbaarheid, lineariteit en stabiliteit

De analytische prestaties van de gestandaardiseerde workflow werden geëvalueerd aan de hand van herhaalbaarheid, verdunningslineariteit en kortetermijnstabiliteitsstudies (Figuur 2). Dubbele aliquoten van dezelfde bulk-gelyseerde exemplaren toonden een sterke herhaalbaarheid, met een mediane dubbele variatiecoëfficiënt (CV) van 0,101% en een CV in het 95e percentiel van 0,222%.

Figuur 2: Analytische validatie van de gestandaardiseerde multicolor flowcytometrie MRD-workflow. (A) Verdeling van de levensvatbaarheid van het monster over geanalyseerde monsters. (B) Correlatie tussen verwachte en waargenomen MRD-waarden over seriële verdunningsexperimenten bij logaritmische analyse. (C) Overeenstemming tussen onafhankelijke replicatieve analyses tijdens herhaalbaarheidsbeoordeling. (D) Stabiliteit van MRD-metingen na opslag bij kamertemperatuur, 0 uur, 24 uur en 48 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om het detectiegedrag op laag niveau te evalueren, werden 12 seriële verdunningsexperimenten met in totaal 72 waarnemingen geanalyseerd over het verwachte lagere MRD-bereik. Waargenomen MRD-waarden toonden sterke overeenstemming met verwachte waarden in een logaritmische analyse (r = 0,999, gecorrigeerd R² = 0,998, helling = 1,009, intercept = 0,018), wat wijst op behouden lineariteit over laagfrequente gebeurtenisbereiken.

Kortetermijnstabiliteitstests toonden geleidelijke afnames in de levensvatbaarheid van het monster in de loop van de tijd, met een daling van de mediane levensvatbaarheid van 89,1% na 0 uur tot 84,9% na 24 uur en 80,6% na 48 uur. Daarentegen bleef de mediane absolute relatieve verandering in MRD-last beperkt op 24 uur (6,2%) en 48 uur (12,0%), wat routinematige verwerking binnen een interval van 24 uur na afname ondersteunde.

Interoperator- en inter-instrument reproduceerbaarheid

De reproduceerbaarheid tussen operators en instrumenten werd geëvalueerd met behulp van 24 referentiemonsters die over meerdere operatoren werden geanalyseerd en geharmoniseerde flowcytometers, wat in totaal 96 beoordelingen opleverde. De mediane absolute relatieve afwijking van de referentiewaarden was 13,7%. Deze bevindingen tonen consistente analytische prestaties na standaardisatie van monstervoorbereiding, acquisitie-instellingen en sequentiële gatingstrategieën (Tabel 2).

Tabel 2: Analytische validatie- en methodevergelijkingsprestatie-indicatoren voor de gestandaardiseerde meetbare residuele ziekteworkflow. Deze tabel is beperkt tot validatie-uitkomsten, waaronder herhaalbaarheid binnen de assay, verdunningslineariteit, kortetermijnstabiliteit, interoperator- en inter-instrument reproduceerbaarheid, en orthogonale moleculaire methodevergelijkingsmetrics; het dupliceert geen patiëntdemografie of specimenkenmerken zoals gerapporteerd in Tabel 1. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Klinische toepassing en vergelijking van orthogonale methoden

Een orthogonale vergelijking werd uitgevoerd met 117 gepaarde monsters, waarvan 75 geanalyseerd met kwantitatieve polymerasekettingreactie (qPCR) en 42 met next-generation sequencing (NGS). De qPCR-evaluaties volgden voornamelijk ziekte-specifieke fusietranscripties die bij diagnose waren vastgesteld, waaronder BCR::ABL1, RUNX1::RUNX1T1 en PML::RARA. De NGS-benaderingen beoordeelden herschikkingen van klonale immunoglobuline of T-celreceptorgenen voor lymfoblastische leukemie en volgden recidiverende somatische mutaties met behulp van gerichte myeloïde panelen voor acute myeloïde leukemie. Flowcytometrische MRD-waarden toonden een sterke correlatie met gepaarde moleculaire resultaten over meetbare ziekteniveaus (r = 0,893 bij logaritmische analyse).

De Bland-Altman-analyse toonde een gemiddelde logaritmische differentiatie van −0,093 met overeenkomstlimieten variërend van −0,848 tot 0,663 (Figuur 3). Onder discordante gevallen werd één vals-negatief resultaat geïdentificeerd onder 25 moleculair positieve monsters. De workflow toonde een positieve procentuele overeenkomst van 78,1%, een negatieve overeenkomst van 97,6% en een algemeen concordantiepercentage van 92,3%.

Figuur 3: Klinische toepassing en orthogonale validatie van gestandaardiseerde MRD-beoordeling. (A) Verspreiding van MRD-positieve gevallen over ziektegroepen en monitoringsintervallen. (B) Correlatie tussen flowcytometrische MRD-waarden en gepaarde moleculaire vergelijkingsresultaten bij logaritmische analyse. (C) Bland-Altman-analyse die flowcytometrische en gepaarde moleculaire MRD-metingen vergelijkt, met horizontale lijnen die de gemiddelde bias en de 95% overeenkomstlimieten over het analytische bereik aangeven. (D) Verspreiding van MRD-positieve resultaten over behandelingsintervallen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Deze bevindingen tonen aan dat de gestandaardiseerde multicolor flowcytometrieworkflow sterke overeenstemming bereikte met orthogonale moleculaire MRD-assays over routinematige klinische monsters.

Aanvullende Tabel 1: Uitgebreide operationele parameters voor de gestandaardiseerde meerkleurige flowcytometrie-meetbare residuele ziekteworkflow. Deze uniforme tabel geeft de essentiële methodologische componenten uiteen, verdeeld in afzonderlijke secties. Sectie A beschrijft de ziekte-specifieke antilichaampanelconfiguraties, waarbij de selectie van CD73 of CD304 gebaseerd is op het basisdiagnostische leukemie-geassocieerde immunofenotype. Sectie B beschrijft de gestandaardiseerde pre-analytische monsterverwerking en flowcytometrische acquisitiedoelen. Sectie C definieert de door de noemer aangepaste rapportagedrempels naast de definitieve interpretatiecriteria. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Het primaire doel van deze studie was het opzetten van een gestandaardiseerde workflow voor multicolor flowcytometrische beoordeling van meetbare restziekte (MRD) bij acute leukemie. Betrouwbare MRD-evaluatie hangt niet alleen af van de selectie van het antilichaampaneel, maar ook van consistente behandeling van monsters, acquisitieparameters en interpretatie^{van gegevens 11}. De resultaten van deze studie tonen aan dat geharmoniseerde monsterverwerking, gecontroleerde acquisitiediepte en door de noemer aangepaste rapportagecriteria de analytische reproduceerbaarheid in routinematige klinische laboratoriumomgevingen kunnen verbeteren. Deze bevindingen zijn in overeenstemming met recente inspanningen om flowcytometrische MRD-beoordeling te standaardiseren bij verschillende instellingen en operators¹².

Een belangrijk onderdeel van deze workflow is de op ammoniumchloride gebaseerde bulk-rode bloedcel lyseprocedure. Detectie van zeldzame MRD-incidenten vereist het verkrijgen van grote cellulaire noemers om voldoende analytische gevoeligheid te bereiken. Gestandaardiseerde bulk-lysisvoorbereiding maakte consistente terugvinding van voldoende aantal genucleeerde cellen mogelijk, vaak meer dan 1,0–1,5 miljoen verworven gebeurtenissen, terwijl de levensvatbaarheid van het monster acceptabel bleef. Eerdere studies van het EuroFlow Consortium benadrukten eveneens dat hoge gebeurtenisverwerving noodzakelijk is om gevoelige en reproduceerbare MRD-detectie¹³ te ondersteunen. Bij monsters met suboptimale analytische gevoeligheid moet de probleemoplossing de evaluatie van het monstervolume, cellulaire terugwinning en acquisitiediepte omvatten.

Dit protocol omvat ook routinematige hemodilusiebeoordeling voordat laag-niveau MRD-negatieve resultaten worden geïnterpreteerd. Hemodilusie blijft een belangrijke pre-analytische beperking bij MRD-testen op basis van beenmerg, omdat perifere bloedbesmetting kunstmatig de schijnbare leukemische last kan verminderen. Het direct opnemen van een semi-kwantitatieve hemodilusjonscore in de rapportageworkflow biedt een extra bescherming tegen misinterpretatie als een vals negatief. Eerdere studies hebben aangetoond dat hemodilusie de betrouwbaarheid van flowcytometrische MRD-analyse bij acute myeloïde leukemie^significant beïnvloedt 7. Exemplaren die aanzienlijke hemodilusie vertonen (≥0,40) moeten daarom met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd, vooral wanneer de verwervingsdiepte of het behoud van mergprecursors onvoldoende is.

De orthogonale vergelijking die in deze studie werd uitgevoerd, toonde een sterke algehele overeenstemming tussen flowcytometrische en moleculaire MRD-beoordelingsmethoden. De discordante gevallen benadrukken echter ook dat flowcytometrie en moleculaire assays verschillende biologische aspecten van residuele ziekte beoordelen. Eerdere studies hebben aangetoond dat fenotypische verschuivingen, klonale evolutie en regeneratieve hematopoëse kunnen bijdragen aan discrepanties tussen analytische platforms¹⁴. Bij B-ALL blijft het onderscheiden van resterende leukemische voorlopers van normale hematogonen bijzonder moeilijk bij lage ziektelasten en vereist het geïntegreerde interpretatie van multidimensionale immunofenotypische patronen in plaats van geïsoleerde antigeenafwijkingen¹⁵. Om deze reden werden alle borderline en laag-niveau MRD-gevallen in deze workflow onafhankelijk beoordeeld door een tweede analist.

Deze studie kent verschillende beperkingen. Ten eerste werd de validatie uitgevoerd bij één instelling met een beperkt aantal geharmoniseerde instrumenten. Ten tweede werden perifere bloedmonsters alleen opgenomen in geselecteerde klinische situaties omdat ze het beenmerg niet kunnen vervangen voor routinematige MRD-beoordeling na behandeling in de meeste acute leukemie-situaties. Daarnaast vereisen sommige analytische parameters, waaronder hemodilusie-scoring en low-level gebeurtenisinterpretatie, ondanks de gestandaardiseerde workflow nog steeds ervaren operatorbeoordeling. Desalniettemin biedt het protocol een praktisch kader voor routinematige klinische implementatie van gestandaardiseerde meerkleurige flowcytometrische MRD-beoordeling^16,17. Door pre-analytische kwaliteitsbeoordeling, geharmoniseerde acquisitiestrategieën en door de noemer aangepaste interpretatiecriteria te integreren, ondersteunt deze workflow een meer reproduceerbare en klinisch consistente MRD-rapportage binnen de routinematige laboratoriumpraktijk.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Acquisition buffer	Laboratory-prepared	PBS containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA; final resuspension volume 500 µL	Finale resuspensie vóór flow cytometrische acquisitie
AML Tube 1 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Vroege myeloide/blast identificatie
AML Tube 1 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Myeloïde lijn anker
AML Tube 1 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Myeloïde lijn anker
AML Tube 1 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Immaturiteitsmarker
AML Tube 1 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Leukeocyten ruggengraatmarker en noemerdefinitie
AML Tube 1 anti-CD56-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: NCAM16.2; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Aberrant blast-geassocieerd fenotype
AML Tube 1 anti-CD7-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: M-T701; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Detectie van kruis-lijn aberraties
AML Tube 1 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Maturatio- en subtype onderscheid
AML Tube 2 anti-CD117-APC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 104D2; fluorochrome: APC; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Vroege myeloide/blast identificatie
AML Tube 2 anti-CD11b-V450 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: ICRF44; fluorochrome: V450; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Beoordeling van maturatie-discordantie
AML Tube 2 anti-CD13-FITC antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: L138; fluorochrome: FITC; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Myeloïde lijn anker
AML Tube 2 anti-CD15-V500 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: HI98; fluorochrome: V500; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Beoordeling van ander-dan-normaal myeloïde patroon
AML Tube 2 anti-CD33-PE antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: P67.6; fluorochrome: PE; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Myeloïde lijn anker
AML Tube 2 anti-CD34-PerCP-Cy5.5 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 8G12; fluorochrome: PerCP-Cy5.5; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Immaturiteitsmarker
AML Tube 2 anti-CD45-APC-H7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: 2D1; fluorochrome: APC-H7; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Leukeocyten ruggengraatmarker en noemerdefinitie
AML Tube 2 anti-HLA-DR-PE-Cy7 antibody	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Clone: G46-6; fluorochrome: PE-Cy7; staining volume: 5 µL/test in de routine gevalideerde panel tenzij antilichaam-specifieke titratie verschilt	Maturatio- en subtype onderscheid
Ammoniumchloride-gebaseerde rode bloedcel lyseren buffer	Laboratory-prepared / commerciële leverancier	Ammoniumchloride-gebaseerde lyseer buffer; 10 mL/test; 10 min bij kamertemperatuur	Bulk rode bloedcel lyse
Analysesoftware	Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Kaluza 2.1	Data-analyse en sequentiële gating
Geautomatiseerde hematologie analyzer	Commerciële leverancier	Geautomatiseerde hematologie analyzer gebruikt voor geconcentreerde nucleaire cel en levensvatbaarheidsbeoordeling	Geconcentreerde nucleaire cel en levensvatbaarheidsbeoordeling
B-ALL Tube