Methodenartikel

Licht- en röntgenactiverende liposomen voor gecontroleerde genbewerking en geneesmiddelentoediening

92 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/71788

⸱

14 augustus 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1EosGene Therapeutics Pty Ltd, 2School of Biomedical Engineering, University of New South Wales, 3Biomedical AI Centre, Centenary Institute and Faculty of Medicine and Health, The University of Sydney, 4Centre for Vision Research, Department of Ophthalmology, and Westmead Institute for Medical Research, The University of Sydney, 5Department of Ophthalmology, Westmead Hospital, 6School of Biomedical Engineering, Faculty of Engineering and Information Technology (FEIT), University of Technology Sydney

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft methoden voor het vervaardigen van met verteporfine geïntegreerde lipide nanodeeltjes die worden geactiveerd door zichtbaar licht of röntgenstraling voor spatiotempeel gecontroleerde afgifte van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïnen en chemotherapeutische middelen, met potentiële translationele relevantie voor oftalmologische en oncologische toepassingen.

Samenvatting

Fotodynamische therapie (PDT) maakt gebruik van de activering van fotosensibilisatoren om reactieve zuurstofverbindingen (ROS) te genereren, hoofdzakelijk singletzuurstof. Naast directe cytotoxiciteit kan deze fotochemie worden ingezet voor cargo-vrijgave op aanvraag uit lipide nanocarriersystemen, waardoor ruimtelijke en temporele controle over de therapeutische toediening mogelijk wordt die met conventionele lipidenanodeeltjes niet te bereiken is. Dit protocol presenteert methoden voor de fabricage en karakterisering van twee verschillende lipidenanodeeltjesformuleringen geïntegreerd met verteporfine (VP): (1) lichtgeactiveerde liposomen bestaande uit DOTAP, DOPE, cholesterol en VP voor de aflevering van CRISPR-Cas9 ribonucleoproteïne (RNP)-complexen; en (2) röntgengeactiveerde liposomen bestaande uit DOTAP, DOPC, VP en goudnanodeeltjes voor gecontroleerde vrijgave van chemotherapeutica. Na activering bij 690 nm (zichtbaar licht) of door klinische röntgenstraling (6 MeV), genereert VP singletzuurstof dat onverzadigde lipidecomponenten oxideert, waardoor het membraan van het nanodeeltje destabiliseert en de ingekapselde cargo wordt vrijgegeven. Protocollen worden verstrekt voor liposoomformulering via dunne-filmhydratatie en membraanextrusie, fysisch-chemische karakterisering, beoordeling van licht- en röntgengestuurde cargo-vrijgave, in vitro gen-knockout in menselijke cellen en in vivo validatie met behulp van een kwantitatief visueel reportersysteem in zebravissen en een muis-xenograft tumormodel. Representatieve resultaten tonen een knockout van tot ongeveer 326 langzame spiervezels per zebravissenembryo via lichtactivering en een significante onderdrukking van tumorgroei via röntgengeactiveerde vrijgave van doxorubicine. Het klinische precedent voor verteporfine-activering bij 689–690 nm in het oog motiveert de evaluatie van dit platform voor oftalmologische toediening, hoewel de biodistributie in het netvlies, de farmacokinetiek en de veiligheid in grote dieren nog moeten worden vastgesteld. Deze methoden bieden een experimentele benadering met translationeel potentieel voor extern gecontroleerde vrijgave van therapeutische cargo. 

Inleiding

Lipiden-nanodeeltjes (LNPs) zijn ontstaan als het meest klinisch gevalideerde non-virale afleveringsplatform voor therapeutische nucleïnezuren, zoals aangetoond door hun inzet in mRNA-vaccins tegen COVID-191. Conventionele LNPs laten hun lading echter vrij na cellulaire opname via endosomale ontsnapping, waardoor er geen externe controle is over de timing, locatie of omvang van de aflevering van de lading2. Dit gebrek aan spatiotemporele controle beperkt hun bruikbaarheid in toepassingen waar een nauwkeurige, on-demand afgifte therapeutisch voordelig is, waaronder site-specifieke genbewerking, gerichte chemotherapie bij heterogene tumoren en getitreerde gene silencing in anatomisch toegankelijke organen zoals het oog3,4.

Fotodynamische therapie (PDT) biedt een goed vastgesteld mechanisme voor extern getriggerde biologische effecten. Na activering bij specifieke golflengten genereren fotosensitizers singlet zuurstof (1O2) en andere ROS die nabijgelegen biomoleculen kunnen oxideren5. Verteporfine (VP), een benzoporfyrine-derivaat dat klinisch is goedgekeurd als Visudyne voor de fotodynamische behandeling van subfoveale choroidale neovascularisatie bij maculadegeneratie (AMD), is bijzonder geschikt als component voor fotosensitizer-nanodeeltjes6. VP wordt klinisch geactiveerd bij 689 nm voor oftalmische fotodynamische therapie, wat een vastgesteld precedent biedt voor de toediening van licht aan het oog6,7,8. VP is bij weefselpenetrerende golflengten ongeveer vier keer fotodynamisch actiever dan eerste-generatie hematoporfyrine-derivaten6.

Deze dubbele functionaliteit, waarbij VP gelijktijdig dient als een klinisch goedgekeurde fotosensibilisator en als een lichtgevoelige trigger voor de vrijgave van de lading uit nanodeeltjes, vormt de mechanistische basis van de hier beschreven protocollen. Wanneer VP in lage molaire ratio's in de lipide dubbellaag wordt geïntegreerd, genereert het bij belichting 1O2, wat, in overeenstemming met eerdere literatuur, waarvan wordt voorgesteld dat het onverzadigde fosfolipide acylketens oxideert, de membraan destabiliseert en de ingekapselde ladingen vrijgeeft9. De korte diffusiestraal van 1O2 (~20 nm in biologische omgevingen) beperkt de membraandestabilisatie tot de directe omgeving van de fotosensibilisator, waardoor schade aan de lading wordt geminimaliseerd terwijl de dubbellaag efficiënt wordt verstoord9,10. Bovendien overwint de röntgenactivatie-modaliteit de beperking van de penetratiediepte van zichtbaar licht in weefsels. Wanneer gouden nanodeeltjes (3–5 nm) samen in de lipide dubbellaag zijn ingebed, versterkt klinische röntgenbestraling (6 MeV) de activatie van VP via Auger-elektron-gemedieerde energietransfer, waardoor de toepasbaarheid wordt uitgebreid naar dieper gelegen tumoren11,12. Directe metingen van singlet zuurstof met behulp van Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) bevestigen dat de generatie van 1O2 toeneemt met de röntgendosis en ongeveer 1,4-voudig wordt versterkt door co-loading van gouden nanodeeltjes vergeleken met VP alleen11.

Dit platform heeft een bijzondere translationele relevantie voor oogheelkundige gentherapie. Huidige anti-VEGF-behandelingen voor neovasculaire AMD vereisen frequente intravitreale injecties, waarbij de resultaten in de praktijk afnemen bij chronische onderbehandeling13,14, terwijl opkomende AAV-gentherapieën deze last verminderen maar anti-VEGF constitutief tot expressie brengen15,16 en daarom niet getitreerd of gestaakt kunnen worden; een zorg gezien de link tussen aanhoudende VEGF-onderdrukking en geografische atrofie, retinale ischemie en fibrose17,18. Een licht-getriggerde, CRISPR-gebaseerde aanpak met behulp van VP-liposomen zou in plaats daarvan een door de clinicus gecontroleerde, ruimtelijk begrensde VEGF-A-knock-out mogelijk kunnen maken, waardoor een door de clinicus gecontroleerde ruimtelijke en temporele gating van het initiële editing-event wordt geboden, terwijl de duurzaamheid van gene editing behouden blijft. Ditzelfde principe van triggered-release is uitbreidbaar naar retinale dystrofieën met grote genen, zoals de ziekte van Stargardt (ABCA4)19,20, en naar uveaal melanoom, waarbij de convergente mechanismen van VP goed aansluiten bij de biologie van de tumor21,22.

Het algemene doel van dit protocol is om uitgebreide, reproduceerbare methoden te bieden voor het vervaardigen van VP-geïntegreerde lipide nanodeeltjes met behulp van twee verschillende formuleringen, waarvan één wordt geactiveerd door zichtbaar licht (690 nm) en één door röntgenstraling, en voor het beoordelen van de afleveringsefficiëntie in zowel in vitro als in vivo modelsystemen. Omdat deze formuleringen verschillen in hun lipidecompositie, strategie voor het laden van de lading en activatiemodaliteit, worden ze als afzonderlijke protocollen gepresenteerd. Dit protocol is bedoeld voor onderzoekers die getriggerde-release nanodeeltjesplatforms, PDT-gebaseerde afleveringsstrategieën, spatiotemporeel gecontroleerde genbewerking of lichtgeactiveerde oftalmologische en oncologische geneesmiddelentoediening onderzoeken.

Protocol

Alle dierproeven met zebravis zijn uitgevoerd onder standaardcondities volgens protocollen die zijn goedgekeurd door de Animal Research Ethics Committee van de Macquarie University (ARA: 2015-034). Muis-xenograftexperimenten zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Ethics Committee van de Macquarie University (goedkeuringsnummer 2017/001). Alle procedures zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Animal Research Act 1985 en de Animal Research Regulation 2010.

Deel A: Lichtgeactiveerde VP-liposomen voor CRISPR-Cas9-aflevering (gebaseerd op Aksoy et al.9)

1. Bereiding van lichtgeactiveerde VP-liposomen die CRISPR-Cas9 RNP inkapselen

  1. Los DOTAP, DOPE, cholesterol (Chol) en VP op in 500 µL chloroform in een glazen rondbodemkolf bij een molaire ratio van 1:0,94:1:0,069.
    WAARSCHUWING: Chloroform is toxisch en vluchtig. Voer alle stappen waarbij chloroform wordt gebruikt uit in een chemische zuurkast met passende persoonlijke beschermingsmiddelen, waaronder nitrilhandschoenen en een veiligheidsbril.
  2. Verdampt het chloroform onder een stroom argongas totdat er een dunne lipidefilm op de wand van de kolf ontstaat.
  3. Plaats de kolf gedurende de nacht (≥12 h) onder vacuüm (bijv. in een vriesdroger of desiccator die is aangesloten op een vacuümpomp) om resterend oplosmiddel volledig te verwijderen.
  4. Bereid de hydratatie-oplossing voor door sgRNA (0,01 µM eindconcentratie) en Cas9-proteïne (0,1 mg/mL eindconcentratie) te combineren in 500 µL nucleasevrij water. Pre-incubeer het sgRNA en Cas9 gedurende 5 min bij kamertemperatuur om de vorming van het ribonucleoproteïne (RNP)-complex mogelijk te maken vóór de hydratatie.
    OPMERKING: Het RNP-complex wordt tijdens de hydratatiestap geladen en niet na de vorming toegevoegd. Dit garandeert inkapseling binnen de waterige kern van het liposoom.
  5. Hydrateer de gedroogde lipidefilm door de 500 µL RNP-oplossing direct op de film toe te voegen en meng tot de suspensie is gehomogeniseerd. Laat de gehydrateerde lipidesuspensie 2 h bij kamertemperatuur staan om volledige hydratatie van de lipiden mogelijk te maken.
  6. Extrudeer de resulterende multilamellaire suspensie 11 keer door een 200 nm polycarbonaatmembraan met behulp van een mini-extruder om unilamellaire liposomen van uniforme grootte te produceren9.
    OPMERKING: Extrusie, en niet sonicatie, is de methode voor groottereductie bij deze formulering. Laat de suspensie een oneven aantal keer (11) door het membraan gaan om ervoor te zorgen dat het eindproduct zich aan de tegenovergestelde zijde van het membraan bevindt ten opzichte van het startmateriaal, waardoor contaminatie met niet-geextrudeerde vesikels wordt verminderd.
  7. Bewaar VP-liposomen bij 4°C, beschermd tegen licht. Gebruik ze binnen 48 h na bereiding voor optimale activiteit. Deze werklimiet van 48 h is conservatief: de VP-vrijgave blijft onder de 3% gedurende 96 h in 10% FBS9.
    OPMERKING: Voor in vitro- en in vivo-toepassingen dienen liposomen te worden bereid en behandeld volgens standaard aseptische technieken, en moet de uiteindelijke suspensie vóór gebruik worden gesteriliseerd door passage door een 0,22 µm filter.

2. Fysisch-chemische karakterisering van VP-liposomen

  1. Verdun de liposoomsuspensie 1:100 in nucleasevrij water. Meet de hydrodynamische diameter, de polydispersiteitsindex (PDI) en het zetapotentieel via dynamische lichtverstrooiing (DLS). Voer alle DLS-metingen in triplikaat uit (n = 3 technische herhalingen) per monster en rapporteer de waarden als gemiddelde ± standaarddeviatie.
    OPMERKING: De verwachte kenmerken van een succesvolle formulering van Deel A zijn een hydrodynamische diameter van 167,5 ± 1,9 nm, PDI < 0,3, een zetapotentieel van +28 ± 1,1 mV en een Cas9-inkapselingsrendement van ongeveer 75,09%. Representatieve fysisch-chemische kenmerken van succesvolle formuleringen zijn samengevat in Tabel 1.9
  2. Voor transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) wordt 10 µL van de verdunde liposoomsuspensie op een met koolstof gecoat kopergrid aangebracht. Kleur dit 20 s lang met 2% uranylacetaat. Maak afbeeldingen bij 100 kV9, waarbij ten minste 10 representatieve afbeeldingen per batch worden vastgelegd.
ParameterDeel A: VP-liposoom
(lichtgeactiveerd)		Deel B: VP/AuNP-liposoom
(röntgengeactiveerd)
Hydrodynamische diameter167.5 ± 1.9 nm~100–150 nm
Polydispersiteitsindex (PDI)<0.3< 0.3 (typisch)
Zetapotentiaal+28 ± 1.1 mVPositief (op basis van DOTAP)
InkapselingsefficiëntieCas9 RNP: 75.09%Doxorubicine: remote loading met ammoniumsulfaat; gekwantificeerd na lyse met 0.1% Triton X-100
Goudnanodeeltjes-beladingNiet van toepassing156 ± 24 AuNPs per liposoom (ICP-MS)
Stabiliteit van cargo-vrijgave<3% VP-vrijgave gedurende 96 h in 10% FBSStabiel gedurende 48 h bij 0%, 10%, 25% en 50% FBS en bij pH 7.4, 6.0 en 5.0
Activatieconditie690 nm, 0.15 mW/cm² LED-bestraling6 MeV klinische röntgenbestraling
Primaire cargoCRISPR-Cas9 RNP-complexDoxorubicine
ActivatiemodaliteitZichtbaar lichtRöntgenstraling
Beoogde toepassingGeactiveerde genbewerkingGeactiveerde vrijgave van chemotherapeutica

Tabel 1: Fysisch-chemische karakteriseringsbenchmarks en stabiliteitsprofielen van de twee verteporfine (VP)-liposoomformuleringen. Representatieve formulatiekenmerken, laadparameters, stabiliteitsprofielen en activeringscondities voor de lichtgeactiveerde VP-liposoomformulering (Deel A) en de röntgengeactiveerde VP/AuNP-liposoomformulering (Deel B). Deze waarden bieden verwachte kwaliteitscontrolebenchmarks voor een succesvolle formulatiebereiding en karakterisering en kunnen worden gebruikt als referentiecriteria bij het reproduceren van de hierin beschreven protocollen.

3. Lichtgestuurde afgifte van vracht en meting van singlet zuurstof

  1. Bereid voor assays voor lichtgeactiveerde afgifte VP-liposomen voor met behulp van dezelfde lipidformulering en hetzelfde hydratie-/extrusieprotocol. Breng 100 µL van de liposoomsuspensie in PBS over in een dialyseapparaat dat is opgehangen in 12 mL PBS en wordt geroerd bij 80 rpm.
  2. Bestraal de monsters met een 690 nm LED-lichtbron bij 0,15 mW/cm2 gedurende gedefinieerde intervallen (2, 4 en 6 min)9.
  3. Neem monsters van het externe dialysaat na 0, 1, 3, 6 en 24 u en kwantificeer de vrijgekomen VP via fluorescentie; bepaal de totale hoeveelheid VP door een equivalent aliquot te lyseren met 0,1% Triton X-100.
  4. Bereken de VP-afgifte als Rvp (%) = (Ft − F0)/(Fmax − F0) × 100, waarbij Ft, F0 en Fmax respectievelijk de fluorescentiewaarden zijn op tijdstip t, de basislijn en na Triton-lyse (n = 3).
  5. Bevestig de destabilisatie van het membraan door de verandering in hydrodynamische diameter via DLS te meten vóór en na bestraling.
    OPMERKING: Bescherm alle VP-bevattende monsters tegen omgevingslicht tijdens de bereiding en opslag. Gebruik amberkleurige buisjes of wikkel ze in aluminiumfolie.

4. In vitro transfectie en gene knockout assay

  1. Zaai HEK293-GFP-cellen (of een equivalente reporterlijn) uit in 96-wells-platen met een dichtheid die geschikt is voor ~70% confluentie op het moment van behandeling. Kweek de cellen in compleet medium (DMEM + 10% FBS + 1% penicilline–streptomycine) bij 37°C en 5% CO2.
  2. Voeg VP-liposomen die anti-GFP sgRNA/Cas9 RNP inkapselen toe aan de wells in een concentratie van 50 ug/mL. Voor analyse via fluorescentiemicroscopie incuberen gedurende 2 u; voor analyse via flowcytometrie incuberen gedurende 1 u.
  3. Vervang het medium door vers compleet medium. Bestraal de behandelde wells met 690 nm LED-licht bij 0,15 mW/cm2. Voor analyse via fluorescentiemicroscopie bestralen gedurende 2, 4 of 6 min; voor analyse via flowcytometrie bestralen gedurende 4 min. Neem donkercontroles (liposomen zonder bestraling) en enkel-lichtcontroles (bestraling zonder liposomen) op.
  4. Beoordeel de GFP-knockout 48 u na de behandeling via fluorescentiemicroscopie of flowcytometrie.
    OPMERKING: Guide RNA's moeten vóór gebruik worden gevalideerd. In de bronstudie werden kandidaat eGFP-guides gescreend op knippeficiëntie via restriction fragment length polymorphism (RFLP)-analyse, waarbij de geselecteerde guide (sg_eGFP_06) een knippeficiëntie van 88,24% behaalde. Het risico op off-target effecten werd in silico geminimaliseerd door de uniciteit van de guide te bevestigen (BLASTN tegen het referentiegenoom met Bowtie/Bowtie2, waarbij geen mismatches werden getolereerd in de eerste tien 3’-basen). Genoombrede off-target sequencing is niet uitgevoerd en is een aanbevolen stap voor therapeutische translatie9.
  5. Om de inkapselingsefficiëntie te meten, centrifugeert een monster liposomen bij 15.000 rpm gedurende 1 u bij 4 °C, gevolgd door filtratie van het supernatant door een 20 nm Whatman Anotop 10 spuitfilter.
  6. Kwantificeer vrij (niet-ingekapseld) Cas9 in het filtraat met een BCA-proteïne-assay.
  7. Bereken de inkapselingsefficiëntie als EE (%) = [(Ctot − Csup) / Ctot] × 100, waarbij Ctot de totale toegevoegde hoeveelheid Cas9 is en Csup het niet-ingekapselde Cas9 is dat is teruggewonnen in het supernatant. Zie Tabel 1 voor representatieve prestatiegegevens van de formulering en verwachte inkapselingsefficiënties.

5. In vivo validatie: visuele reporter-assay in zebravis

  1. Bereid de injectie MasterMix voor door VP-liposomen die eGFP-targeting sgRNA en Cas9-proteïne inkapselen te combineren in de verhoudingen die zijn gespecificeerd in het oorspronkelijke protocol9. De uiteindelijke 8 uL MasterMix bevat 3,5 uL sgRNA (75 ng/uL), 1,0 uL Cas9-proteïne (500 ng/uL), 2,5 uL VP-liposomen en 1,0 uL fenolrood. Vervang voor de controle MasterMix de liposomen door 2,5 uL nucleasevrij water.
  2. Microinjecteer 2 nL MasterMix in de cel (niet in de dooier) van zebravisembryo's in het één-celstadium met behulp van een gekalibreerd micro-injectiesysteem9.
    WAARSCHUWING: Voer alle werkzaamheden met zebravissen uit onder goedgekeurde dierethische protocollen. Behandel embryo's voorzichtig om mechanische schade tijdens de injectie te minimaliseren.
  3. Bestraal de geïnjecteerde embryo's 2 uur na bevruchting (hpf) met 690 nm LED-licht bij 0,15 mW/cm2 gedurende gedefinieerde tijdsintervallen (bijv. 0, 1, 2 en 5 min) om de vrijgave van de lading te activeren9.
  4. Anestheseer de embryo's na 72 hpf in Tricaine en monteer ze in 1% low-melting-point agarose. Kwantificeer met behulp van de smyhc1:eGFP transgene reporterlijn de knockout van langzame spiervezels als het verlies van eGFP-fluorescentie met een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop en een confocale microscoop.
  5. Verwerf focus-stacked beelden en tel de eGFP-negatieve (knocked-out) langzame spiervezels per embryo, waarbij doorgaans 16 embryo's per groep worden geanalyseerd (bijv. in Imaris)9.
    OPMERKING: Deze assay biedt een kwantitatieve, visuele readout van de efficiëntie van de gen-knockout. In de smyhc1:eGFP reporterlijn zijn langzame spiervezels normaal gesproken eGFP-positief; een succesvolle knockout wordt gescoord als het verlies van eGFP-fluorescentie in deze vezels9.

Deel B: X-straal-geactiveerde VP-liposomen voor de toediening van chemotherapeutica (gebaseerd op Deng et al.11)

6. Bereiding van röntgenstralings-getriggerde VP/AuNP-liposomen geladen met doxorubicine

  1. Combineer 350 µL DOTAP (100 mg/mL in chloroform) en 370 µL DOPC (100 mg/mL in chloroform) in een glazen rondbodemkolf en vul aan tot een totaalvolume van 1,0 mL met chloroform11.
    OPMERKING: Deel B maakt gebruik van DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) en niet van DOPE. De twee formuleringen verschillen in hun helperlipid, en dit onderscheid is cruciaal voor de reproduceerbaarheid.
  2. Voeg 50 µL VP (2,3 mg/mL in DMSO) en 40 µL van een gouden nanodeeltjessuspensie (3–5 nm diameter) toe aan het lipidmengsel. Dit levert ongeveer 156 ± 24 gouden nanodeeltjes per liposoom op, zoals gekwantificeerd via ICP-MS11.
    OPMERKING: De gouden nanodeeltjes moeten een diameter van 3–5 nm hebben om in de lipide dubbellaag te kunnen worden ingebed. Grotere deeltjes (bijv. 50 nm) zullen niet in het membraan worden opgenomen en zullen de Auger-elektronenergieoverdracht die nodig is voor röntgenactivatie niet bemiddelen11.
    OPMERKING: De hier beschreven basisformulering is niet-doelgericht. In de oorspronkelijke studie werd een optionele actieve targetingsmodificatie geïntroduceerd door post-insertie van DSPE-PEG2000-Folaat om de liposomen naar folaatreceptor-expresserende tumorcellen te leiden; deze stap kan worden toegevoegd zonder het kernmechanisme voor de afgifte van VP/AuNP te wijzigen11.
  3. Verdampt het chloroform onder argon en droog onder vacuüm gedurende de nacht, zoals beschreven in stappen 1.2–1.3.
  4. Hydrateer de lipidfilm met 1,0 mL ammoniumsulfaatbuffer 250 mM (pH 5,5). Vortex, laat de gehydrateerde suspensie gedurende de nacht staan en extrudeer vervolgens 11 keer door een polycarbonaatmembraan van 200 nm11.
  5. Verwijder vrij ammoniumsulfaat door dialyse tegen PBS (pH 7,4) bij 4 C met vier bufferwisselingen, om een transmembraan ammoniumsulfaatgradiënt te creëren.
  6. Laad doxorubicine (Dox) door de gedialyseerde liposomen te incuberen bij een gewichtsverhouding tussen drug en lipid van 1:10 bij 60°C gedurende 1 u11. De ammoniumsulfaatgradiënt drijft de accumulatie van Dox in het binnenste van het liposoom aan.
  7. Verwijder niet-ingekapselde Dox door dialyse tegen PBS bij 4 C met vier bufferwisselingen.
  8. Karakteriseer de geladen liposomen via DLS (verwachte grootte: ~100–150 nm) en meet de inkapselingsefficiëntie  door de liposomen te lyseren met 0,1% Triton X-100 en de Dox-fluorescentie te kwantificeren (excitatie 485 nm, emissie 590 nm).
    OPMERKING: Succesvolle formuleringen van deel B vertonen doorgaans een hydrodynamische diameter van ongeveer 100–150 nm, PDI < 0,3, en incorporatie van ongeveer 156 ± 24 gouden nanodeeltjes per liposoom. Representatieve fysisch-chemische eigenschappen zijn samengevat in Tabel 1.11

7. Door röntgenstraling getriggerde geneesmiddelvrijgave en in vitro cytotoxiciteit

  1. Bestraal calceïne-geladen VP/AuNP-liposomen met een klinische lineaire versneller (6 MeV fotonenbundel) bij gedefinieerde doses (1, 2 en 4 Gy)11. Kwantificeer de vrijgave van de lading door de calceïne-fluorescentie te meten (excitatie 485 nm, emissie 510 nm) en bepaal de totale vrijgave na disruptie met 0,1% Triton X-100."
  2. Zaai voor cytotoxiciteitsassays HCT116 humane colorectale kankercellen in 96-wells platen (bijv. 2 × 104 cellen/mL in 10% FBS).
  3. Behandel de cellen met Dox-geladen VP/AuNP-liposomen en bestraal deze met röntgenstraling zoals hierboven beschreven, inclusief controles met alleen LipoDox, alleen röntgenstraling en onbehandelde cellen. Beoordeel de celviabiliteit via een MTS-assay op 0, 2, 4 en 24 u na bestraling met 4 Gy11.

8. In vivo validatie: muizenxenograft-tumormodel

  1. Inoculeer 6–7 weken oude vrouwelijke BALB/c-nude muizen subcutaan in de flank met 5 × 106 HCT116-cellen in 100 µL serumvrij McCoy’s 5A-medium11.
  2. Wanneer tumoren een grootte van ~100 mm bereiken3injecteer intratumoraal Dox-geladen VP/AuNP-liposomen (10 mg/kg Dox-equivalent) in een volume van 20 µL11.
  3. Bestraal 24 uur na injectie de tumoren met 4 Gy röntgenstraling (6 MeV) met een klinische lineaire versneller, waarbij het niet-doelweefsel adequaat wordt afgeschermd.
  4. Controleer het tumorvolume elke 2 dagen met digitale schuifmaatjes. Bereken het tumorvolume als V = (π/6) × L × W2, waarbij L de grootste dimensie is en W de loodrechte breedte11.
  5. Snij aan het einde van het experiment de tumoren uit, fixeer deze in 10% neutraal gebufferde formaline en bereid cryosneden van 6 µm voor voor histologische analyse (H&E-kleuring)11.

9. Statistische analyse

  1. Kwantitatieve gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD), tenzij anders vermeld.
  2. Statistische analyses voor de gene-knockout-studies bij zebravis werden uitgevoerd met een eenweg-ANOVA, terwijl vergelijkingen tussen twee groepen werden geanalyseerd met een tweezijdige Student's t-toets, zoals gerapporteerd in de bronstudies. Statistische significantie werd gedefinieerd als p < 0,05.
  3. Voor de studies naar röntgenstraling-getriggerde liposomen werden datasets van tumorgroei, lichaamsgewicht, vrachtvrijgave en histologie geanalyseerd met Student's t-toetsen, zoals beschreven in de oorspronkelijke publicatie.
  4. De definitie van n voor elk experiment wordt gegeven in de bijbehorende bijschriften van de figuren.
  5. Statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism versie 7.0 (GraphPad Software).
    OPMERKING: Dit protocol reproduceert experimentele workflows en representatieve datasets uit eerder gepubliceerde studies. Lezers kunnen voor volledige details over de statistische analyse, waar van toepassing, refereren naar de oorspronkelijke publicaties9,11.

Resultaten

Lichtgestuurde genbewerking (Deel A):

Volgens het protocol van Deel A vertoonden VP-liposomen die CRISPR-Cas9 RNP inkapselden een lichtafhankelijke afgifte van de vracht. Er werd een minimale afgifte waargenomen onder donkere omstandigheden, terwijl bestraling bij 690 nm (0,15 mW/cm2) een dosisafhankelijke afgifte produceerde die toenam met de belichtingstijd (Figuur 1A)9. De eGFP-reporterassay in zebravis bood een kwantitatieve visuele uitlezing van de efficiëntie van de gen-knock-out. Lichtgeactiveerde embryo's vertoonden een knock-out van 308,37 ± 40,21 eGFP-positieve langzame spiervezels per embryo, vergeleken met 53,15 ± 35,38 vezels in donkere controles (n = 80), wat toenam tot 326,12 ± 36,55 vezels na 5 min bestraling (n = 60) (Figuur 1B,C)9. In vitro bereikten lichtgeactiveerde VP-liposomen een GFP-knockdown die vergelijkbaar was met die van Lipofectamine 2000 (ongeveer 53% tegenover 50% reductie), terwijl ze uniek waren in het bieden van lichtgestuurde spatiotemporele controle (Figuur 1C)9. Deze bevindingen tonen spatiotemporele controle aan, aangezien dezelfde nanodeeltjesformulering merkbaar verschillende knock-out-efficiënties produceerde afhankelijk van de blootstelling aan licht (Figuur 1A–C).

Fotochemische genbewerkingsmethode; CRISPR-Cas9, LED-geïnduceerd, fluorescentiemicroscopie, experimentele resultaten, intensiteitsmeting.
Figuur 1. Lichtgetriggerde CRISPR-Cas9-aflevering en spatiotemporele gen-knock-out in zebravisembryo's. (A) Schematische illustratie van verteporfine (VP)-liposomen (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06) die Cas9/sgRNA ribonucleoproteïne (RNP)-complexen inkapselen. Bij bestraling met 690 nm licht genereert VP reactieve zuurstofsoorten die het liposomale membraan destabiliseren en de intracellulaire afgifte van de CRISPR-Cas9-lading triggeren. (B) Representatieve fluorescentiebeelden van smyhc1:eGFP zebravisembryo's op 72 uur na bevruchting (hpf) na behandeling met VP-liposomen en toenemende blootstellingsduuren aan licht (0, 1, 2 en 5 min; 690 nm, 0,15 mW/cm2). Verlies van eGFP-fluorescentie duidt op knock-out van langzame spiervezels. Insets tonen vergrote weergaven van de omkaderde regio's. (C) Kwantificering van de fluorescentie-intensiteit en het aantal geknokte-out langzame spiervezels per embryo, wat de lichtafhankelijke CRISPR-Cas9-activatie en gen-knock-out aantoont. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD. Zebravisexperimenten werden geanalyseerd via eenweg-ANOVA (n = 80 embryo's voor fluorescentie-intensiteitsmetingen en n = 60 embryo's voor vezeltelling-analyse; p < 0,0001). HEK293-GFP validatie-experimenten werden geanalyseerd met een tweezijdige t-toets (n = 4). Schaalbalken = 500 µm (overzichtsbeelden) en 100 µm (vergrote beelden). Aangepast met toestemming van Aksoy et al.9 Copyright © 2020 American Chemical Society. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Suboptimale resultaten in de zebravisassay kunnen inhouden: (a) minder dan 50 verstoorde vezels per embryo, wat duidt op een slechte liposoomkwaliteit, onvoldoende Cas9-activiteit of een suboptimale lichtdosis; (b) embryonale mortaliteit die 20% overschrijdt, wat wijst op mechanische schade tijdens microinjectie of overmatige VP-fototoxiciteit; of (c) verstoorde vezels in niet-bestraalde controles, wat duidt op voortijdige lekkage van de lading uit de liposoomformulering.

Door röntgenstraling getriggerde geneesmiddelafgifte (Deel B):

VP/AuNP-liposomen die volgens het protocol in Deel B zijn bereid, vertoonden een dosisafhankelijke calceïnevrijgave bij 1–4 Gy (Figuur 2A,B)11. In het HCT116-xenograftmodel vertoonden muizen die Dox-geladen VP/AuNP-liposomen ontvingen, gevolgd door 4 Gy röntgenbestraling, een significante onderdrukking van de tumorgroei in vergelijking met vrije Dox, alleen röntgenstraling en niet-bestraalde liposoomcontroles (Figuur 2C)11. Histologische analyse van tumorsecties onthulde grotere necrotische gebieden in de groep met de gecombineerde behandeling, zoals beoordeeld via H&E-kleuring (Figuur 2D).

Kankertherapie met röntgenstralingsdoelgerichte liposomen; grafieken over calceïnevrijgave, tumorgrootte, necrose-analyse.
Figuur 2. Röntgenstralings-getriggerde doxorubicine-vrijgave en onderdrukking van tumorgroei. (A) Schematische illustratie van liposomen geïntegreerd met verteporfine (VP)/goudnanodeeltjes (AuNP) die doxorubicine (Dox) bevatten. Blootstelling aan röntgenstraling activeert VP via AuNP-gemedieerde energietransfer, waardoor singulet zuurstof wordt gegenereerd die de lipide dubbellaag destabiliseert en de vrijgave van de lading triggert. (B) Calceïnevrijgaveprofielen van liposomen blootgesteld aan toenemende röntgendoses (0–4 Gy), wat dosisafhankelijke vrijgave van de lading uit VP/AuNP-liposomen aantoont. Foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviatie van vier metingen. (C) Metingen van het tumorvolume (links) en het lichaamsgewicht (rechts) bij HCT116 xenograft-dragende muizen behandeld met PBS, LipoDox, alleen röntgenstraling of röntgenstralings-getriggerde LipoDox. Gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SD (n = 4 muizen per groep). Statistische significantie werd geëvalueerd met de t-test (P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001). (D) Representatieve met hematoxyline en eosine (H&E) gekleurde tumorsneden en morfometrische analyse van het gemiddelde necrotische tumoroppervlak. Pijlen geven representatieve necrotische regio's aan. Boxplots tonen de mediaan en het interkwartielbereik, waarbij de whiskers zich uitstrekken tot 1,5 × IQR. Gegevens werden geanalyseerd met de t-test (n = 5). Schaalbalk = 50 µm. Aangepast van Deng et al.11 onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution 4.0 International License. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Suboptimale resultaten in het xenograftmodel kunnen inhouden: (a) geen verschil in tumorgroei tussen bestraalde en niet-bestraalde liposoomgroepen, wat wijst op onvoldoende VP-gemedieerde afgifte of inadequate incorporatie van goudnanodeeltjes; of (b) systemische toxiciteit (gewichtsverlies > 15%), wat suggereert dat er Dox-lekkage uit de liposomen plaatsvond voorafgaand aan de röntgenactivatie.

Discussie

Verschillende stappen in deze protocollen zijn cruciaal voor het succes. In Deel A moet de molaire lipidenverhouding (DOTAP:DOPE:Chol:VP = 1:0,94:1:0,06) nauwkeurig worden gehandhaafd, aangezien de VP-concentratie direct de omvang van de 1O2-generatie en bijgevolg de efficiëntie van de ladingvrijgave bepaalt9. Het laden van het Cas9/sgRNA RNP tijdens de hydratatiestap, in plaats van door complexatie na vorming, is essentieel voor inkapseling in de waterige kern. Extrusie door een polycarbonaatmembraan van 200 nm (11 passages) produceert uniforme unilamellaire vesicles; sonicatie mag niet als alternatief worden gebruikt, omdat dit het Cas9-eiwit kan denatureren. Voor Deel B is de grootte van de goudnanodeeltjes (3–5 nm) kritiek, aangezien de deeltjes klein genoeg moeten zijn om in de lipiden-dubbellaag te worden ingebed voor een effectieve Auger-elektron-gemedieerde energieoverdracht naar VP onder röntgenbestraling11. De methode met de ammoniumsulfaatgradiënt die wordt gebruikt voor het laden van Dox vereist volledige dialyse van extern ammoniumsulfaat vóór de toevoeging van het geneesmiddel; onvolledige dialyse zal de laadefficiëntie verminderen.

De lipidecompositie kan worden aangepast voor verschillende toepassingen, terwijl het VP-gemedieerde afgifte-mechanisme behouden blijft. Zo kan het vervangen van een fractie DOTAP door een PEGyleerd lipide (bijv. DSPE-PEG2000 op 5 mol%) de circulatietijd bij systemische toediening verbeteren, hoewel dit de positieve oppervlaktelading zal verminderen en de cellulaire opname in vitro kan verlagen2. Indien DLS-metingen een PDI > 0,3 tonen, dient het aantal extrusie-passages te worden verhoogd of de integriteit van het membraan te worden geverifieerd. Als de generatie van singlet zuurstof laag is ondanks een correcte VP-incorporatie, verifieer dan de golflengte en vermogensdichtheid van de LED-lichtbron met een gekalibreerde vermogensmeter, aangezien VP-activatie golflengte-specifiek is (piekexcitatie bij 425 nm voor de Soret-band en therapeutische activatie bij 689–690 nm voor de Q-band)9. Voor de zebravis-assay: als de embryonale mortaliteit in de behandelde groepen 20% overschrijdt, verminder dan het injectievolume of de liposoomconcentratie om VP-geassocieerde fototoxiciteit te minimaliseren. Een gestructureerd kader voor probleemoplossing, gekoppeld aan de referentiewaarden in Tabel 1, is als volgt. PDI > 0,3: verhoog het aantal extrusie-passages en verifieer de membraanintegriteit. Lage of afwezige getriggerde afgifte ondanks correcte VP-incorporatie: bevestig de output van 690 nm met een gekalibreerde vermogensmeter en verifieer de molaire VP-verhouding. Minder dan ~50 uitgeschakelde langzame spiervezels per embryo: maak de liposomen opnieuw, bevestig de RNP-activiteit of verhoog de bestralingstijd. Verlies van eGFP-signaal in niet-bestraalde controles: controleer de bewaarcondities door liposomen binnen 48 u na bereiding te gebruiken en ze op 4°C in het donker te bewaren, en bevestig de membraanstabiliteit. In het xenograft-model wijst het ontbreken van een verschil tussen de bestraalde en niet-bestraalde liposoomgroepen op de noodzaak om de embedding van 3–5 nm goudnanodeeltjes te bevestigen en de toegediende röntgendosis te verifiëren.

De belangrijkste beperking van de lichtgeactiveerde modaliteit (Deel A) is de penetratiediepte van 690 nm licht, waardoor directe activering beperkt is tot oppervlakkig toegankelijke weefsels of weefsels die geschikt zijn voor lichttoediening via glasvezels5. De röntgengeactiveerde modaliteit (Deel B) overwint deze dieptelimiet, maar vereist toegang tot een klinische lineaire versneller en stelt het omliggende weefsel bloot aan ioniserende straling, zij het in therapeutische doses11,12. Beide formuleringen zijn momenteel afhankelijk van DOTAP, een kationisch lipide dat geassocieerd wordt met dosisafhankelijke cytotoxiciteit, wat het therapeutische venster voor systemische toediening kan beperken2. Het transiënte karakter van RNP-gemedieerde genbewerking is gunstig voor de veiligheid, maar betekent dat een onvolledige knockout in een doelcelpopulatie niet kan worden uitgebreid door herhaalde dosering op dezelfde plek zonder hernieuwde toediening van nanodeeltjes. Bovendien zijn deze protocollen gevalideerd in cellijnen en kleine diermodellen; translatie naar grotere diermodellen en, uiteindelijk, naar menselijke klinische toepassing zal optimalisatie van de formulering, farmacokinetische studies en een formele toxicologische beoordeling onder GLP-condities vereisen. In het bijzonder bevat dit protocol geen farmacokinetische, biodistributie- of retina-penetratiegegevens. Hoewel lichtpenetratie door okulair en ander weefsel in de literatuur goed is gekarakteriseerd als golflengte-, pigmentatie- en weefselafhankelijk (en kan worden versterkt met optische clearing-middelen), blijven kwantitatieve farmacokinetische, biodistributie- en retina-toedieningsstudies belangrijke volgende stappen voordat translationele claims kunnen worden onderbouwd.

Conventionele LNP-systemen, waaronder die in mRNA-vaccins worden gebruikt, laten hun lading passief vrij na cellulaire opname via endosomale ontsnapping en bieden geen temporele of ruimtelijke controle over de afgifte1,2. Virale vectoren zoals AAV zorgen voor een efficiënte genoverdracht, maar worden beperkt door de verpakkingscapaciteit (~4,7 kb), immunogeniciteit bij herhaalde dosering en constitutieve expressie vanHet transgen die na toediening niet kan worden gemoduleerd3. Het VP-liposoomplatform pakt deze beperkingen aan door een extern regelbaar afgifte mechanisme te bieden dat onafhankelijk is van het type lading, compatibel is met grote payloads (eiwitten, RNP-complexen en kleine moleculen), en non-viraal is en potentieel geschikt voor herhaalde toediening, mits onderworpen aan immunogeniciteits- en toxiciteitsstudies bij herhaalde dosering. In tegenstelling tot optogenetische of thermisch responsieve systemen maakt de VP-gebaseerde benadering gebruik van een klinisch goedgekeurde photosensitisator met vastgestelde veiligheidsgegevens en bestaande klinische laserinfrastructuur, met name in de oogheelkunde, waar de 689 nm Visudyne-laser al standaardapparatuur is6. Sang et al. demonstreerden verder dat lipide-polymeer hybride nanodeeltjes die VP bevatten de effectiviteit van radiodynamische therapie in colorectale kankermodellen verbeteren, wat de aanpasbaarheid van VP-gemedieerde ROS-generatie over verschillende nanodeeltjesarchitecturen bevestigt12.

De hier beschreven methoden zijn bijzonder relevant voor driest ophthalmologische aandoeningen. Bij neovasculaire AMD blijft de last van anti-VEGF-injecties een kritieke barrière voor optimale resultaten. Real-world registry-data tonen een aanzienlijke onderbehandeling aan in vergelijking met klinische studieprotocollen (een gemiddelde van 7,3 tegenover 12 injecties in het eerste jaar, waarbij 38,8% van de patiënten de behandeling staakte en er een minimale winst in visuele Scherpte was)14, evenals een visuele achteruitgang op lange termijn ondanks frequente dosering23. AAV-gentherapieën die worden ontwikkeld om deze last te verminderen — ixoberogene soroparvovec15, ABBV-RGX-31416 en de RMAT-aangeduide 4D-150 (83% reductie in injecties)24 — brengen anti-VEGF-transgenen echter constitutief tot expressie en kunnen niet worden getitreerd of gestaakt. Dit is een potentiële zorg gezien bewijzen die continue VEGF-suppressie koppelen aan geografische atrofie (CATT17; een meta-analyse van 4.609 ogen18; en een prevalentie van atrofie die over acht jaar stijgt tot 78,3%25). Een door licht geactiveerd VP-liposoom-systeem met CRISPR-Cas9 gericht op VEGF-A zou in plaats daarvan ruimtelijk begrensde gene knockout kunnen mogelijk maken, waardoor de clinicus controle krijgt over de ruimtelijke en temporele gating van het initiële editings-event, terwijl de duurzaamheid van gene editing behouden blijft. Preklinische studies ondersteunen de haalbaarheid van deze aanpak. LNP co-delivery van Cas9 mRNA en sgRNA gericht op VEGFA verminderde laser-geïnduceerde choroïdale neovascularisatie (CNV) bij muizen26, PEG-variant LNPs bereikten genoomediting in het retinaal pigmentepitheel (RPE)27, en peptide-gestuurde LNPs leverden mRNA af aan fotoreceptoren in niet-menselijke primaten28. Tot begin 2026 is er echter geen LNP-gebaseerde retinale gentherapie in klinische studies terechtgekomen29, wat de translationele kans onderstreept. Bij de ziekte van Stargardt overschrijdt de coderende sequentie van ABCA4 van ongeveer 6,8 kb de verpakkingscapaciteit van AAV, waardoor dual-vector-strategieën met een verminderde transductie-efficiëntie noodzakelijk zijn19. Klinische kandidaten omvatten de dual-AAV platforms SB-007 en VG80130, naast de gen-agnostische modifier-therapie OCU410ST31. Niet-virale aflevering van nucleïnezuren kan de verpakkingsbeperkingen van AAV omzeilen. PEG-ECO nanodeeltjes met een ABCA4-plasmide verminderden de A2E-accumulatie in Abca4-/- muizen20, terwijl afzonderlijke studies de aflevering van grote retinale DNA-constructen32 en LNP-gemedieerde mRNA-expressie in occulaire weefsels hebben aangetoond33. Omdat gelokaliseerde behandeling van de macula en fovea voldoende is om het centrale zicht te behouden, zijn VP-liposomen zeer geschikt voor het afleveren van hoge concentraties gentherapie-cargo precies in deze regio's. Voor uveaal melanoom werkt verteporfine via drie complementaire mechanismen: PDT-gemedieerde cytotoxiciteit, inhibitie van het YAP/TAZ-pad (waarbij YAP1-expressie correleert met de sterkste metastatische markers, monosomie 3 en BAP1-verlies)21, en immunogene celdood via cGAS-STING-activatie. De combinatie van VP-gemedieerde YAP-inhibitie en PDT met anti-PD-L1-therapie zette immunologisch 'koude' tumoren om in immunologisch actieve tumoren, waardoor de tumorgroei aanzienlijk werd onderdrukt en de overleving in orthotope modellen werd verlengd22. Deze bevindingen zijn consistent met de gerapporteerde respons rate van 80% voor verteporfine-gebaseerde PDT als primaire behandeling voor choroïdaal melanoom34. De optische toegankelijkheid van het oog voor 689 nm activatie, samen met de goed gedefinieerde locatie van de meeste uveale melanomen, positioneert VP-liposomen als een veelbelovend platform voor het afleveren van gelokaliseerde behandeling, terwijl de morbiditeit geassocieerd met huidige brachytherapie- en protonstraalbenaderingen mogelijk wordt verminderd.

Naast de hierboven besprokenst ophthalmologische en oncologische toepassingen is het VP-liposoomplatform toepasbaar in elke therapeutische context waarin een extern gecontroleerde, on-demand afgifte van de payload vereist is. Potentiële toepassingen omvatten lichtgetriggerde genbewerking bij dermatologische aandoeningen die toegankelijk zijn voor transcutane illuminatie, röntgenstraalgetriggerde afgifte van chemotherapie gesynchroniseerd met klinische radiotherapie-fractioneringsschema's, en ruimtelijk gepatteerde gene knockout voor studies in de ontwikkelingsbiologie. Verschillende fotoactiveerbare systemen voor genbewerking zijn aangetoond in niet-retinale weefsels, waaronder de Mag-ABE fotoactiveerbare base editor voor spatiotemporeel gecontroleerde genoombewerking in vivo35 en een NIR-geactiveerd upconversion-nanopartikelsysteem voor spatiotemporeel gecontroleerde CRISPR-Cas9-bewerking en fotodynamische therapie36. In de ophthalmologie benadrukt de toenemende belangstelling voor duurzame VEGF-suppressiestrategieën verder de behoefte aan afgiftesystemen die langdurige therapeutische effectiviteit combineren met externe controle over het tijdstip en de locatie van de biologische activiteit37. De integratie van deze fabricagemethoden met opkomende LNP-afgifte-technologieën voor het netvlies en fotoactiveerbare systemen voor genbewerking vertegenwoordigt een convergentie van individueel gevalideerde componenten waarvan de gecombineerde toepassing in het oog een open en potentieel hoog-impact onderzoeksfront blijft. Lopend werk in onze groep is gericht op het optimaliseren van formuleringen voor subretinale en intravitreale toedieningswegen, het evalueren van veiligheidsprofielen in oculaire modellen bij grote dieren en het aanpassen van de röntgenstraalgetriggerde modaliteit voor gelijktijdig gebruik met standaard radiotherapieprotocollen in de klinische oncologie.

Openbaarmakingen

Y.A.A. is een directeur en medeoprichter van EosGene Therapeutics Pty Ltd, dat patenten bezit met betrekking tot de hierin beschreven lichtgeactiveerde lipidnanodeeltjestechnologie. E.M.G. en W.D. zijn medeoprichters van EosGene Therapeutics.

Dankbetuigingen

De auteurs erkennen de faciliteiten en technische ondersteuning verstrekt door de Macquarie University Zebrafish Facility (zebravissenwerk) en het Macquarie University Animal Ethics Committee. Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het ARC Centre of Excellence for Nanoscale BioPhotonics (CE140100003). De auteurs erkennen tevens de ondersteuning van EosGene Therapeutics Pty Ltd.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Filtratiemembraan van 20 nm (Anotop 10 of gelijkwaardig)Whatman (Cytiva)N/AGebruikt voor scheiding van vrij Cas9 tijdens metingen van de encapsulatie-efficiëntie
690 nm LED-lichtbronThorlabsM690L4Lichtbron voor het triggeren van VP-gemedieerde cargo-vrijgave uit liposomen; instelbare vermogensdichtheid
Antibioticum–Antimycoticum (100X)Thermo Fisher Scientific15240062Supplement voor celkweek; eindconcentratie 1%
Argongascilinder en regelaarN/AN/AGebruikt voor verdampen van oplosmiddel tijdens de bereiding van de lipidefilm
Avanti Mini ExtruderAvanti Polar Lipids610000Handmatig extrusiesysteem gebruikt met 200 nm polycarbonaatmembranen voor standaardisatie van de liposoomgrootte
BALB/c naaktmuizen (vrouwelijk, 5–6 weken)Animal Resources CentreN/AImmunodeficiënte muizen gebruikt voor HCT116 xenograft-tumormodel
BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificN/AGebruikt voor kwantificatie van vrij Cas9 en metingen van de encapsulatie-efficiëntie
Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging SystemBio-Rad Laboratories12003154Beeldvormingssysteem voor gels en western blots
CalceïneSigma-AldrichC0875Fluorescente kleurstof voor vrijgave-assays; zelf-quenching bij hoge concentraties
Cary 5000 UV-Vis-NIR SpectrofotometerAgilent TechnologiesN/AUV-Vis absorptiespectroscopie van liposomen en verteporfine
CCD841 CoN-cellen (normale menselijke colon-epitheelcellen)ATCCCRL-1790Normale colon-epitheelcellijn; gebruikt als niet-kankercontrole
ChloroformSigma-Aldrich288306Organisch oplosmiddel voor bereiding van de lipidefilm
CholesterolSigma-AldrichC8667Liposoommembraancomponent gebruikt in de licht-getriggerde formulering
Klinische lineaire versneller (6 MeV fotonenbundel)Varian Medical SystemsN/AKlinische röntgenbron voor bestralingsstudies
Digitale schuifmaatN/AN/AGebruikt voor metingen van het xenograft-tumorgrootte
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich472301Oplosmiddel voor de bereiding van de verteporfine-stockoplossing
DOPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine)Avanti Polar Lipids850375PLipidecomponent gebruikt in de röntgen-getriggerde formulering
DOPE (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine)Sigma-AldrichP1223Hulp-lipide gebruikt in de licht-getriggerde formulering
DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propaan)Avanti Polar Lipids890890PKationisch lipide gebruikt in beide formuleringen
DoxorubicinehydrochlorideSigma-AldrichD1515Chemotherapeutisch geneesmiddel geladen in röntgen-getriggerde liposomen
DSPE-PEG2000Avanti Polar Lipids880120PGe-PEGyleerd lipide gebruikt in de röntgen-getriggerde formulering
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific11965092Celkweekmedium voor HEK293- en PC12-cellen
Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS)Thermo Fisher Scientific14190144Wasbuffer
Fetaal runderserum (FBS)Thermo Fisher Scientific10099141Supplement voor celkweek; eindconcentratie 10%
Fluorolog-Tau3 SpectrofluorometerHORIBA ScientificN/AFluorescentiespectroscopie voor karakterisering van verteporfine
Focus-stacking software (bijv. Zerene Stacker)N/AN/AGebruikt voor het genereren van focus-stacked beelden bij zebrafish-imaging
Vriesdroger (Alpha 1-4 LDplus)Martin Christ / John Morris ScientificN/AGebruikt voor vacuümdrogen en verwijderen van oplosmiddel
GFP sgRNAThermo Fisher ScientificA35943Single-guide RNA gericht op eGFP; gebruikt voor knockout-validatie
Goudnanodeeltjes (3–5 nm, citraat-gestabiliseerd)NanoComposixN/ARadiosensitizer gebruikt in de röntgen-getriggerde formulering
GraphPad PrismGraphPad Software7.0Statistische analyse en datavisualisatie
HCT116-cellen (menselijk colorectaal carcinoom)ATCCCCL-247Colorectale kankercellijn gebruikt voor in vitro en in vivo studies
HEK293/GFP-cellenGenTargetSC001Stabiele GFP-exprimerende cellijn gebruikt voor CRISPR-knockout-validatie
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH3570Kernkleuring; werkconcentratie 5 µg/mL
Beeldanalyse-software (bijv. Imaris)Bitplane (Oxford Instruments)N/AGebruikt voor kwantificatie van knocked-out slow-muscle vezels
ImageJ/FijiNational Institutes of Health (NIH)Open sourceBeeldanalyse-software
Inverteerde fluorescentiemicroscoopLeica MicrosystemsDMi3000Gebruikt voor zebrafish-reporter-imaging en GFP-fluorescentiebeoordeling
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging SystemPerkinElmer128201In vivo fluorescentie-beeldvormingssysteem
JEOL JEM-1400 Transmissie ElektronenmicroscoopJEOLJEM-1400TEM-imaging van liposomen
Leica SP2 Confocale MicroscoopLeica MicrosystemsN/AConfocale imaging van cellulaire opname
Laagsmeltende agaroseN/AN/AGebruikt voor het monteren van zebrafish-embryo's tijdens imaging
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668019Transfectiereagens gebruikt als positieve controle
Living Image SoftwarePerkinElmerN/ASoftware voor beeldacquisitie en -analyse
McCoy's 5A MediumThermo Fisher Scientific16600082Celkweekmedium voor HCT116-cellen
Micro-injectiesysteemN/AN/AGebruikt voor micro-injectie in zebrafish-embryo's in het één-celstadium
MTS Celproliferatie-assayPromegaG3582Celviabiliteitsassay
NanoDrop SpectrofotometerThermo Fisher ScientificND-2000Metingen van RNA-zuiverheid en -concentratie
Nuclease-vrij waterThermo Fisher ScientificR0582Gebruikt voor CRISPR-Cas9 RNP-bereiding
Opti-MEM Reduced Serum MediumThermo Fisher Scientific31985070Transfectiemedium
Paraformaldehyde (4%)Sigma-AldrichP6148Fixeermiddel voor histologische analyse
PC12-cellen (rat feochromocytoom)ATCCCRL-1721Neuronale-achtige cellijn gebruikt voor opnamestudies
Polycarbonaat membraanfilters (200 nm)Avanti Polar Lipids610006Extrusiemembranen voor liposoom-sizing
RNeasy Plus Mini KitQIAGEN74134RNA-extractiekit
Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG)Thermo Fisher ScientificS36002Fluorescente probe voor detectie van singlet zuurstof
Slide-A-Lyzer MINI Dialyseapparaten (10 kDa MWCO)Thermo Fisher Scientific69570Dialyseapparaten voor liposoombereiding en drug-loading
SYBR Gold Nucleic Acid Gel StainThermo Fisher ScientificS11494Kleurstof voor nucleïnezuurgels
Tg(ubi:EGFP) zebrafishZebrafish International Resource CenterZDB-GENO-080606-2Transgene zebrafish gebruikt voor in vivo CRISPR-validatie
TNF-α (menselijk recombinant)Life TechnologiesRTNFAICytokine gebruikt in TNFAIP3-inductiestudies
TNFAIP3 sgRNAThermo Fisher ScientificN/AsgRNA gericht op TNFAIP3
Tricaine methansulfonaat (MS-222)N/AN/AAnesthesicum voor zebrafish gebruikt voorafgaand aan imaging
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Detergens gebruikt voor liposoomlyse en vrijgave-assays
TrueCut Cas9 Protein v2Thermo Fisher ScientificA36498Cas9-nuclease gebruikt voor CRISPR-Cas9 RNP-bereiding
Trypsine-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Scientific25200056Reagens voor cel-dissociatie
Uranylacetaat (2%)Electron Microscopy Sciences22400Negatieve kleuring voor TEM-imaging
VerteporfineSigma-AldrichSML0534-5MGFotosensibilisator geïncorporeerd in liposoomformuleringen
Zetasizer Nano ZSMalvern PanalyticalZEN3600Dynamic light scattering en zeta-potentiaalmetingen

Referenties

  1. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med. 2020;383(27):2603-15.
  2. Cullis PR, Hope MJ. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies. Mol Ther. 2017;25(7):1467-75.
  3. Wang D, Tai PWL, Gao G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nat Rev Drug Discov. 2019;18(5):358-78.
  4. Kim S et al. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins. Genome Res. 2014;24(6):1012-19.
  5. Wilson BC, Patterson MS. The physics, biophysics and technology of photodynamic therapy. Phys Med Biol. 2008;53(9):R61-R109.
  6. Scott LJ, Goa KL. Verteporfin. Drugs Aging. 2000;16(2):139-46.
  7. Treatment of Age-related Macular Degeneration With Photodynamic Therapy (TAP) Study Group. Photodynamic therapy of subfoveal choroidal neovascularization in age-related macular degeneration with verteporfin: one-year results of 2 randomized clinical trials—TAP Report 1. Arch Ophthalmol. 1999;117(10):1329-45. doi:10.1001/archopht.117.10.1329.
  8. Boettner EA, Wolter JR. Transmission of the ocular media. Invest Ophthalmol. 1962;1(6):776–83.
  9. Aksoy YA et al. Spatial and temporal control of CRISPR-Cas9-mediated gene editing delivered via a light-triggered liposome system. ACS Appl Mater Interfaces. 2020;12(47):52433-44.
  10. Ogilby PR. Singlet oxygen: there is indeed something new under the sun. Chem Soc Rev. 2010;39(8):3181-209.
  11. Deng W et al. Controlled gene and drug release from a liposomal delivery platform triggered by X-ray radiation. Nat Commun. 2018;9(1):2713.
  12. Sang R et al. Unlocking the in vivo therapeutic potential of radiation-activated photodynamic therapy for locally advanced rectal cancer with lymph node involvement. EBioMedicine. 2025;116:105724.
  13. Fleckenstein M, Schmitz-Valckenberg S, Chakravarthy U. Age-related macular degeneration: a review. JAMA. 2024;331(2):147-57.
  14. Wykoff CC et al. Impact of anti-VEGF treatment and patient characteristics on vision outcomes in neovascular age-related macular degeneration: up to 6-year analysis of the AAO IRIS Registry. Ophthalmol Sci. 2024;4(2):100421.
  15. Khanani AM et al. Safety and efficacy of ixoberogene soroparvovec in neovascular age-related macular degeneration in the United States (OPTIC): a prospective, two-year, multicentre phase 1 study. EClinicalMedicine. 2024;67:102394.
  16. Campochiaro PA et al. Gene therapy for neovascular age-related macular degeneration by subretinal delivery of RGX-314: a phase 1/2a dose-escalation study. Lancet. 2024;403(10436):1563-73.
  17. Maguire MG et al. Five-year outcomes with anti-vascular endothelial growth factor treatment of neovascular age-related macular degeneration: the Comparison of Age-related Macular Degeneration Treatments Trials. Ophthalmology. 2016;123(8):1751-61.
  18. Eshtiaghi A et al. Geographic atrophy incidence and progression after intravitreal injections of anti-vascular endothelial growth factor agents for age-related macular degeneration: a meta-analysis. Retina. 2021;41(12):2424-35.
  19. Li R et al. Split AAV8 mediated ABCA4 expression for gene therapy of mouse Stargardt disease (STGD1). Hum Gene Ther. 2023;34(13-14):616-28.
  20. Sun D et al. Effective gene therapy of Stargardt disease with PEG-ECO/pGRK1-ABCA4-S/MAR nanoparticles. Mol Ther Nucleic Acids. 2022;29:823-35.
  21. Brouwer NJ et al. Targeting the YAP/TAZ pathway in uveal and conjunctival melanoma with verteporfin. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2021;62(4):3.
  22. Zhang S et al. Combination of YAP inhibition and photodynamic therapy induces dual DNA damage and activates STING pathway to enhance immunotherapy in uveal melanoma. Redox Biol. 2026;89:103965. doi:10.1016/j.redox.2025.103965.
  23. Cheema MR, DaCosta J, Talks J. Ten-year real-world outcomes of anti-vascular endothelial growth factor therapy in neovascular age-related macular degeneration. Clin Ophthalmol. 2021;15:279-87.
  24. Kay C et al. Interim results from the phase 2b population extension cohort in the PRISM clinical trial evaluating 4D-150 in adults with neovascular (wet) age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2025;66(8):1861.
  25. Vofo BN et al. Long-term macular atrophy growth in neovascular age-related macular degeneration: influential factors and role of genetic variants. Eye (Lond). 2025;39(9):1717-23.
  26. Cao D et al. Dynamically covalent lipid nanoparticles mediate CRISPR-Cas9 genome editing against choroidal neovascularization in mice. Sci Adv. 2025;11(28):eadj0006.
  27. Gautam M et al. Lipid nanoparticles with PEG-variant surface modifications mediate genome editing in the mouse retina. Nat Commun. 2023;14(1):6468.
  28. Herrera-Barrera M et al. Peptide-guided lipid nanoparticles deliver mRNA to the neural retina of rodents and nonhuman primates. Sci Adv. 2023;9(2):eadd4623.
  29. Wu H et al. Innovative gene delivery systems for retinal disease therapy. Neural Regen Res. 2026;21(2):542-52.
  30. Riedmayr LM et al. mRNA trans-splicing dual AAV vectors for (epi)genome editing and gene therapy. Nat Commun. 2023;14(1):6578.
  31. Khanani AM et al. A novel modifier gene therapy to treat Stargardt disease: Phase 1 GARDian1 Trial Insights. Eye (Lond). 2026;40:429–30.
  32. Goddaer S et al. Overcoming size barriers in retinal gene therapy via lipid nanoparticle-mediated delivery of full-length EYS DNA. Drug Deliv Transl Res. 2026;16(8):2921–36. doi:10.1007/s13346-025-02036-y.
  33. Chambers CZ et al. Lipid nanoparticle-mediated delivery of mRNA into the mouse and human retina and other ocular tissues. Transl Vis Sci Technol. 2024;13(7):7.
  34. Yordi S, Soto H, Bowen RC, Singh AD. Photodynamic therapy for choroidal melanoma: What is the response rate? Surv Ophthalmol. 2021;66(4):552-59.
  35. Zou Q et al. Photoactivatable base editors for spatiotemporally controlled genome editing in vivo. Biomaterials. 2023;302:122328.
  36. Zeng J et al. Near-infrared optogenetic nanosystem for spatiotemporal control of CRISPR-Cas9 gene editing and synergistic photodynamic therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2025;17(1):701-10.
  37. Campochiaro PA. Sustained suppression of VEGF for treatment of retinal and choroidal vascular diseases. Am J Ophthalmol. 2025;277:1-6.

Herprints en machtigingen

Tags

Lichtgeactiveerde liposomenfotodynamische therapielipidnanodeeltjesCRISPR Cas9 afleveringcargo vrijgaveverteporfine liposomengeneratie van singlet zuurstof

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.