Sorafenib plus gemcitabine vertoont preliminaire bewijzen van additieve remming van de proliferatie van HepG2-cellen, vertoont correlerende veranderingen in de expressie van p-ERK en VEGF, en onderdrukt de groei van levertumoren in NOD/SCID-muizen.
Onderzoeksartikel
Evaluatie van de gecombineerde behandeling met sorafenib en gemcitabine in HepG2-cellen en een NOD/SCID-muis xenograftmodel: een pilotstudie
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Leverkanker blijft een belangrijke doodsoorzaak door medicatieresistentie en beperkte behandelopties. Er is een dringende behoefte aan het onderzoeken van therapeutische strategieën om de resultaten te verbeteren. Deze pilotstudie presenteert een protocol voor het beoordelen van de potentiële effecten en onderliggende mechanismen van de combinatie van sorafenib en gemcitabine bij leverkanker. De leverkanker-cellijn HepG2 werd gebruikt en er werd een xenograftmodel in non-obese diabetische/ernstig gecombineerd immuundeficiënte (NOD/SCID) muizen opgezet. Belangrijke procedurele stappen worden gedemonstreerd, waaronder: (1) HepG2-celkweek en medicatiebehandeling; (2) MTT-assay opstelling, incubatie en absorptiemeting; (3) eiwitextractie, SDS-PAGE, transfer en immunoblotting voor ERK en p-ERK; (4) vestiging van subcutane xenografts in NOD/SCID-muizen; (5) tumormeting en volumeberekening; en (6) VEGF-immunohistochemie op tumorsneden. Kritieke stappen, tips voor probleemoplossing en apparatuurspecificaties worden verstrekt. De combinatie van sorafenib (3 µmol/L) en gemcitabine (10 µmol/L) bereikte een inhibitiesnelheid van 71,23% ± 6,76% na 72 h, met een q-waarde van 1,35, wat wijst op een synergistisch effect bij dit specifieke dosispaar onder de geteste condities. In vergelijking met de controlegroep was de combinatietherapie geassocieerd met een verminderde p-ERK-expressie, een afgenomen tumorvolume en kwalitatief lagere VEGF-immunokleuring. Deze gegevens tonen een correlatieve associatie aan tussen verminderde p-ERK-expressie en het waargenomen antiproliferatieve effect, zonder causaliteit vast te stellen. In HepG2-cellen en een NOD/SCID-muis xenograftmodel vertoont de combinatie van sorafenib en gemcitabine preliminair bewijs van antiproliferatief potentieel en is geassocieerd met een verminderde VEGF-expressie; deze bevinding vormt echter geen direct bewijs voor anti-angiogene activiteit, aangezien er geen analyses van de microvasculaire dichtheid of functionele vasculaire analyses zijn uitgevoerd. Dit reproduceerbare protocol biedt een nuttig kader voor het evalueren van medicatiecombinaties in HCC-modellen en kan worden aangepast voor andere schema's van doelgerichte therapie en chemotherapie, hoewel verdere mechanistische studies en dosisvalidaties vereist zijn voordat er klinische conclusies kunnen worden getrokken.
Inleiding
Leverkanker is een van de meest voorkomende en dodelijkste vormen van kanker, en is bovendien een van de snelst groeiende maligne tumoren1,2. Hoewel de incidentie van leverkanker is afgenomen, is de totale ziektelast van leverkanker blijven toenemen. De wereldwijde epidemiologische gegevens van 2022 onthulden dat de leeftijdgestandaardiseerde incidentie van leverkanker in de online database van het Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022 15,0 per 100.000 inwoners bedroeg, terwijl de leeftijdgestandaardiseerde mortaliteit van leverkanker 26,7 per 100.000 inwoners was, waardoor het de op één na belangrijkste doodsoorzaak door kanker is3. Momenteel overlijden de meeste patiënten binnen één jaar na de diagnose vanwege het gebrek aan effectieve behandelingen voor leverkanker, in combinatie met het sluipende begin van de ziekte. Sorafenib is de eerste multi-target kinase-remmer die is goedgekeurd voor klinisch gebruik, waarbij receptor-tyrosinekinasen zoals de epidermale groeifactorreceptor (EGFR), de platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) en serine/threonine-kinasen worden getarget4,5. Sorafenib, een orale multikinase-remmer, oefent anti-proliferatieve en anti-angiogene effecten uit bij leverkanker door meerdere groeifactorpaden te targeten. Historisch gezien was sorafenib de eerste door de FDA goedgekeurde eerstelijns systemische therapie voor patiënten met gevorderde of niet-resecteerbare leverkanker6. Het huidige landschap van eerstelijnsbehandelingen voor gevorderd hepatocellulair carcinoom (HCC) is echter aanzienlijk uitgebreid. Aanbevolen opties omvatten nu onder meer de immuuncheckpointremmer-combinatie atezolizumab plus bevacizumab, lenvatinib en de dubbele immunotherapie-combinatie durvalumab plus tremelimumab. Ondanks deze vooruitgang blijft sorafenib een belangrijke eerstelijnsoptie, vooral in regio's waar immunotherapie-combinaties niet gemakkelijk beschikbaar zijn of gecontra-indiceerd zijn. Gezien het uitgebreide gebruik bij leverkanker is er bezorgdheid ontstaan over geneesmiddelgerelateerde bijwerkingen7. In de analyse van de FDA Adverse Event Reporting System (FAERS) database van 2006 tot 2023 betroffen de bijwerkingen van sorafenib voornamelijk het spijsverteringsstelsel, de huid en het subcutane weefsel, alsmede aspecifieke fysieke ongemakken zoals infecties en letsel7. Hoewel sommige patiënten met gevorderde leverkanker baat kunnen hebben bij een behandeling met sorafenib, ontwikkelen de meeste patiënten uiteindelijk resistentie of treedt er therapiefalen op, wat leidt tot een slechte prognose8,9,10. Ondanks het gebruik profiteert slechts ongeveer 30% van de HCC-patiënten van sorafenib; bovendien ontwikkelen responders vaak resistentie binnen 6 maanden11. De moleculaire paden die betrokken zijn bij sorafenib-resistentie omvatten extracellular signal-regulated kinase (ERK)/gefosforyleerd ERK (p-ERK), proteïnekinase B (Akt), fosfoïnositide 3-kinase (PI3K)/AKT/mammalian target of rapamycin (mTOR), hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α)/HIF-2α en autofagie-gerelateerde paden, waarbij ERK/p-ERK specifiek is uitgelicht en geselecteerd in dit onderzoek11. Gemcitabine is een cytidine-analogon dat het lichaam binnendringt om difluorcytidine-difosfaat en difluorcytidine-trifosfaat te produceren, welke verschillende inhiberende effecten hebben op de DNA-synthese12. Bij hepatobiliaire maligniteiten is gemcitabine geëvalueerd als onderdeel van combinatiechemotherapie. Er is echter klinisch ook gerapporteerd dat gemcitabine een grotere geneesmiddelresistentie vertoont, wat de effectiviteit van gemcitabine beperkt12,13. Het is daarom uiterst uitdagend om effectief en efficiënt het optimale medicijnregime te bepalen. Recente studies hebben aangetoond dat gemcitabine in combinatie met sorafenib een verbeterde therapeutische effectiviteit kan hebben op basis van een nieuwe voorspelling van tumorstamcel-biomarkers14. Naar ons weten is er echter geen studie geweest die deze combinatie specifiek bij leverkanker heeft onderzocht met behulp van HepG2-cellen en een non-obese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) muis-xenograftmodel van hepatocellulair carcinoom. Er is dus een gebrek aan experimenteel bewijs dat direct de additieve effecten van sorafenib en gemcitabine bij leverkanker valideert.
De in dit manuscript beschreven procedures worden veelvuldig gebruikt, maar zelden gepresenteerd in een gedetailleerd, visueel stappenplan dat geschikt is voor replicatie door beginnende onderzoekers. Wij stelden als hypothese dat de combinatie van sorafenib en gemcitabine de proliferatie van leverkankercellen en tumorstijging additief zou remmen, en dat dit effect geassocieerd zou zijn met een downregulatie van het ERK/p-ERK-pad en een verminderde angiogenese gemedieerd door de vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF). Deze studie beoogt in eerste instantie het remmende effect van sorafenib in combinatie met gemcitabine op de proliferatie van de HepG2-leverkankercellijn in vitro en in vivo en het bijbehorende mechanisme te onderzoeken (Supplementary Figure 1). De nieuwheid van deze studie ligt in drie aspecten: (1) het is de eerste studie die de sorafenib-gemcitabine-combinatie specifiek bij leverkanker test met gebruik van de veelgebruikte HepG2-cellijn en een corresponderend NOD/SCID-muismodel; (2) het onderzoekt het onvoldoende bestudeerde ERK/p-ERK-pad als potentieel mechanisme; en (3) het biedt direct experimenteel bewijs — in plaats van computationele voorspellingen — voor het additieve effect van deze combinatie bij leverkanker. Deze kenmerken onderscheiden dit werk van eerdere rapporten over combinatietherapie die zijn uitgevoerd bij andere tumortypen of met behulp van andere experimentele modellen, in het bijzonder in de context van sorafenib-gebaseerde schema's.
Protocol
Ethische goedkeuring is verleend door de Zhejiang University-Laboratory Animal Welfare and Ethics Review (Goedkeuringsnr. ZJU20250049).
Dieren en groepering
In totaal 40 vrouwelijke NOD/SCID-muizen, 4–5 weken oud met een gewicht van 18–20 g, werden gekocht bij een erkende commerciële leverancier (Licentienr. SCXK (Shanghai) 2013-0006) en gehuisvest in dierkamers van SPF-kwaliteit (specific pathogen-free). Alle dierprotocollen volgden de standaardrichtlijnen. Tijdens het experiment kregen de dieren onbeperkt toegang tot voedsel en water en werden ze in groepen (5 muizen/kooi) gehuisvest in een goed gecontroleerde SPF-kamer, waarbij de kamertemperatuur werd gehandhaafd op 22 ± 2 °C, een luchtvochtigheid van 50%–60% en een licht/donkercyclus van 12/12 u. De dieren kregen ad libitum voedsel en water, en hun lichaamsgewicht werd elke 2 weken gecontroleerd. Wanneer muizen aanhoudende pijn, cachexie, tumorzweren vertoonden, de tumoromvang een maximale dimensie van 2 cm bereikte, of wanneer er andere onomkeerbare gezondheidsproblemen optraden, werd euthanasie uitgevoerd via intraperitonele injectie van 0,45% pentobarbitalnatrium bij ≥150 mg/kg lichaamsgewicht, gevolgd door bevestiging van het staken van de ademhaling en hartslag, het verlies van de corneale reflex, of de toepassing van een secundaire fysieke methode indien nodig, in overeenstemming met de humane beëindigingscriteria goedgekeurd door de Dierethische Commissie. De steekproefomvang (n = 10 per groep) werd bepaald op basis van een poweranalyse uitgaande van een effectgrootte van 1,2 (afgeleid uit pilotexperimenten), α = 0,05 en β = 0,20 (80% power), plus een uitvaltoeslag van 20%. De procedures voor tumorimplantatie werden uitgevoerd vóór de toewijzing van de behandeling (zie hieronder voor de vestiging van de xenograft).
Na tumorimplantatie en bevestiging van de tumorname werden de muizen met behulp van een randomisatietabel willekeurig verdeeld over 4 groepen: de controlegroep, de sorafenibgroep, de gemcitabinegroep en de groep met een combinatie van sorafenib en gemcitabine, met 10 muizen (5 muizen/kooi) per groep, om het NOD/SCID-muistransplantatietumormodel te construeren. Omdat tumorgeweefsels tijdens het modelleringsproces kunnen leiden tot een slechte algemene conditie of zelfs de dood bij NOD/SCID-muizen, en aangezien statistische analyse doorgaans een effectieve steekproefomvang vereist, werden er ten minste 10 muizen per groep opgenomen. De willekeurige groepsindeling werd uitgevoerd door onafhankelijke technici en de kooien werden gelabeld; blindering werd niet toegepast tijdens de toediening van medicijnen of de tumormeting, wat een belangrijke beperking is. De overige weefselafname, biochemische en pathologische evaluaties werden allemaal uitgevoerd door geblindeerd laboratoriumpersoneel. De gegevens werden eveneens blind geanalyseerd door statistici die alleen toegang hadden tot gecodeerde bestanden totdat de statistieken waren voltooid en de gegevens waren ontblind. Alle dieren werden opgenomen in de uiteindelijke analyse. Voor beide geneesmiddelen werd de intraperitoneale route gekozen om systemische absorptie en een consistente biologische beschikbaarheid te waarborgen; de dosering één keer per dag was gebaseerd op eerdere farmacokinetische studies die aantoonden dat dit regime leidde tot aanhoudende plasmaconcentraties. De vehikelcontrolegroep kreeg een intraperitoneale injectie van 0,2 mL steriele normale zoutoplossing. In de sorafenibgroep werd 0,2 mL sorafenib (40 mg/kg) intraperitoneaal geïnjecteerd. In de gemcitabinegroep werd 0,2 mL gemcitabine (100 mg/kg) intraperitoneaal geïnjecteerd. Combinatiebehandelingsgroep: 0,2 mL van elk van 40 mg/kg sorafenib en 100 mg/kg gemcitabine werd intraperitoneaal toegediend. Elke groep kreeg dit één keer per dag gedurende 20 opeenvolgende dagen. Alle dieren werden opgenomen in de uiteindelijke analyse en geen enkele muis werd uit de studie uitgesloten. Er werd geen mortaliteit waargenomen in enige groep tijdens de behandelperiode van 20 dagen. Het schema en de doses werden gekozen op basis van gepubliceerde studies in hepatobiliaire kankermodellen. Er moet worden opgemerkt dat dagelijkse intraperitoneale toediening van gemcitabine toxiciteit kan veroorzaken. De lengte en breedte van de getransplanteerde tumoren werden dagelijks gemeten en het volume van de getransplanteerde tumoren werd berekend. Na 20 dagen werden de dieren geëuthanaseerd door cervicale dislocatie onder diepe anesthesie, en de getransplanteerde tumorgeweefsels werden gefixeerd in formaline. Het lichaamsgewicht werd elke 2 dagen gedurende de gehele studie gemeten. Muizen werden dagelijks gemonitord op klinische tekenen van toxiciteit, waaronder piloerectie, een gebogen houding, verminderde mobiliteit, diarree en lethargie. Serumbiochemie (bijv. alanine aminotransferase, aspartaat aminotransferase en creatinine) en histopathologisch onderzoek van belangrijke organen werden echter niet uitgevoerd. Daarom kan subklinische toxiciteit niet worden uitgesloten.
Medicijnen en reagentia
Sorafenib werd opgelost in 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaard bij -20 °C. Voor gebruik werd de oplossing ontdooid en verdund tot een uiteindelijke DMSO-concentratie van minder dan 0,5%, wat geen effect had op de celgroei. Gemcitabine werd verkregen van een commerciële leverancier. Radioimmunoprecipitatie-assay (RIPA) lysisbuffer, thiazolylblauw, primaire antilichamen tegen glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH), ERK, p-ERK en VEGF, secundaire antilichamen, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high-glucose medium, foetaal runder serum en de HepG2-cellijn werden verkregen van commerciële leveranciers.
Sorafenib en gemcitabine zijn cytotoxische middelen. Alle procedures voor het bereiden en hanteren van geneesmiddelen moeten worden uitgevoerd in een aangewezen biologische veiligheidskabinet met het dragen van passende persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, nitrilhandschoenen en veiligheidsbril). DMSO, methanol, xyleen en andere organische oplosmiddelen die in dit protocol worden gebruikt, zijn gevaarlijk en moeten in een zuurkast worden gehanteerd om inademing of huidcontact te vermijden. De veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor alle reagentia moeten vóór gebruik worden geraadpleegd.
Celkweek
De HepG2-cellijn werd gereanimeerd en geënt in kweekflessen met 10 mL DMEM high-glucose medium (aanvullend met 10% foetaal runderserum, 100 U/mL penicilline-streptomycine en 4 mmol/L glutamine). De cellen werden geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂. Het kweekmedium werd elke 2 dagen vervangen en de cellen werden elke 4 dagen gepassaged om logaritmische groei te behouden. De HepG2-cellijn werd verkregen van een commerciële leverancier; onafhankelijke authenticatie van de cellijn (bijv. short tandem repeat-profilering) en mycoplasmatesten werden echter niet uitgevoerd in deze studie.
MTT-methode voor het bepalen van de remming van de proliferatiesnelheid
De 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-methode werd gebruikt om de remmingsgraad van de proliferatie door sorafenib en gemcitabine in de HepG2-cellijn te bepalen. Cellen in de logaritmische groeifase werden gedurende 2 minten gedigesteerd met 0,25% trypsine, waarna de digestie werd beëindigd door het toevoegen van een gelijk volume compleet medium. Na centrifugatie bij 1000 × g gedurende 10 min werden de cellen geresuspendeerd in compleet medium. De celdichtheid werd aangepast naar 1 × 105 cellen/ml, en 200 µL van de cel-suspensie werd in elke put van een 96-wellplaat gezaaid. Deze zaaidichtheid werd gekozen op basis van voorafgaande optimalisatie-experimenten waarin celdichtheden variërend van 5 × 103 tot 5 × 104 cellen/putje werden getest. De dichtheid van 2 × 104 cellen/putje resulteerden in een lineaire toename van de absorptie over 96 uur en hielden de confluentie onder de 80% aan bij het eindpunt, wat werd bevestigd door visuele inspectie onder een omgekeerde microscoop. Om ervoor te zorgen dat de MTT-metingen binnen het lineaire bereik bleven, werden bij elk tijdspuntstip pilotexperimenten uitgevoerd met controleputjes behandeld met het vehikel. Het medium werd elke 48 uur vervangen om nutriëntendepletie en accumulatie van metabole bijproducten te voorkomen. De confluentie werd dagelijks gemonitord met een omgekeerde microscoop. Na 96 uur bereikten de controleputjes ongeveer 75%–80% confluentie en werden er geen duidelijke tekenen van nutriëntendepletie waargenomen. Na celadhesie werd het medium verwijderd en werd het medium met het geneesmiddel toegevoegd. Een geneesmiddelvrij medium werd toegevoegd aan de onbehandelde controlegroep (vehikelcontrole voor in vivo experimenten). Het experiment werd onderverdeeld in een onbehandelde controlegroep, een sorafenib-groep, een gemcitabine-groep en een combinatiebehandelingsgroep. De doses sorafenib waren 1.5 µmol/L, 3 µmol/L, 4.5 µmol/Len 6 µmol/L, en de doses gemcitabine waren 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/Len 20 µmol/LDe doses sorafenib in combinatie met gemcitabine waren 1.5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4.5 µmol/L + 15 µmol/Len 6 µmol/L + 20 µmol/LDe cellen in elke groep werden gedurende 24 u, 48 u, 72 u en 96 u gekweekt. Na de kweek, 20 µL werd 5 mg/mL MTT aan elke put toegevoegd en werden de cellen 4 uur lang in een celincubator geïncubeerd. Het supernatant werd voorzichtig afgegoten en vervolgens 150 µL er werd DMSO toegevoegd aan elke well en de plaat werd 10 min geschud om het formazan volledig op te lossen, waarna de optische dichtheid (OD) van elke well werd gemeten bij 490 nm met een multifunctionele microplate-reader. Het experiment werd drie keer herhaald, waarbij elke groep vijf replica-wells bevatte. De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van de drie biologische replica's. De remming van de celgroei (%) = (1 - OD experimentele groep /OD onbehandelde groep）× 100%. De interactie tussen de twee geneesmiddelen werd beoordeeld door de q-waarde, die is berekend met de formule: q = EAB / (EA + EB - EA × EB). Hierbij zijn EA en EB de inhibitiegraden van geneesmiddel A en B wanneer deze afzonderlijk worden gebruikt, en EAB is de inhibitiegraad wanneer de twee geneesmiddelen samen worden gebruikt. Wanneer q is groter dan 1,15, duidt dit op een synergistisch effect tussen de twee geneesmiddelen; 0,85–1,15 duidt op een additief effect; en q minder dan 0,85 duidt op een antagonistisch effect. De q-waardemethode is een eenvoudige screeningsmethode en is geen vervanging voor rigoureuzere synergie-analyses. Er zijn slechts enkele dosisparen met een vaste ratio getest, wat de robuustheid van de claim over synergie beperkt. Daarom is de term "synergie" verwijst in deze studie naar q > 1,15 bij specifieke dosiscombinaties en tijdspunten, en niet naar een gevalideerde additieve interactie over de volledige dosis-responsmatrix.
Western blot-analyse van de eiwitexpressie van ERK en p-ERK
Celkweek en de indeling van de experimentele groepen werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Voor de detectie van ERK en p-ERK via Western Blotting bedroeg de dosis sorafenib 3 µmol/L; de dosis gemcitabine was 10 µmol/L; en de gecombineerde dosis was 3 µmol/L + 10 µmol/L. Na 72 u behandeling werden de cellen gelyseerd met RIPA-lysisbuffer en werd het totale eiwit uit elke experimentele groep geëxtraheerd. De eiwitconcentratie werd bepaald met de bicinchonininezuur-methode (BCA). Gelijke hoeveelheden eiwit (30 µg per lane) werden geladen en gescheiden via 10% sodium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) bij 120 V gedurende 90 min. Eiwitten werden overgebracht op polyvinylideenfluoride-membranen (PVDF, poriegrootte 0,45 µm) bij 300 mA gedurende 90 min bij 4 °C. Na blokkeren met 5% vetvrije melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST) gedurende 1 u bij kamertemperatuur, werden de membranen overnacht geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 °C onder zachte agitatie. Na drie wasbeurten met TBST (elk 10 min) werden de membranen 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundaire antilichamen. Eiwitbanden werden gevisualiseerd met behulp van een enhanced chemiluminescence (ECL) substraat en gefotografeerd met een digitaal gel-beeldingsysteem. De belichtingstijden werden voor elk antilichaam geoptimaliseerd om verzadiging te voorkomen. Densitometrische kwantificering werd uitgevoerd met ImageJ-software via de gel-analysetool. Alle intensiteiten van de doeleiwitbanden werden genormaliseerd aan GAPDH als loading control, en de expressie van p-ERK werd verder genormaliseerd aan de totale ERK-expressie. Er werden geen aanvullende blokkeringsstappen uitgevoerd buiten de 5% vetvrije melk. Kwantificeringsresultaten werden weergegeven als fold change ten opzichte van de controlegroep, die op 1,0 werd gesteld. Elk experiment werd drie keer onafhankelijk herhaald. Representatieve immunoblots worden getoond.
Immunohistochemische detectie van VEGF-expressie in HepG2 xenograft-tumoren in NOD/SCID-muizen
Voor het vestigen van de xenograft: HepG2-cellen in de logaritmische groeifase werden geoogst door trypsinisatie, tweemaal gewassen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en resuspendeerd in serumvrij DMEM. In totaal 2 × 106 cellen in 0,2 mL serumvrij DMEM (zonder Matrigel) werden subcutaan geïnjecteerd in de rechter okselegaal (een gebied met een rijke bloedvoorziening) van elke NOD/SCID-muis met behulp van een 1 mL spuit om een subcutaan HepG2-xenograftmodel in NOD/SCID-muizen te vestigen. De tumorontwikkeling werd elke 2 dagen gecontroleerd. De grootte van de tumor werd elke twee dagen gemeten, en wanneer de tumordiameter 0,3–0,5 cm bereikte (ongeveer 7–10 dagen na injectie, gedefinieerd als het startpunt van de behandeling), werden de muizen willekeurig verdeeld over 4 groepen voor het experiment. De lengte (L) en breedte (W) van de subcutane xenograft werden elke dag gemeten met digitale schuifmaten, en het tumorvolume (V) werd berekend volgens de formule: V = (L × W2) / 2. Alle metingen werden uitgevoerd door een onderzoeker die niet op de hoogte was van de groepsindeling. Na 20 dagen werden de dieren geëuthanaseerd door cervicale dislocatie onder diepe anesthesie, en het xenograftweefsel werd gedurende 24 u bij kamertemperatuur gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline en vervolgens in paraffine ingebed. Weefselcoupes (5 µm dik) werden gesneden met een rotatiemicrotoom en gemonteerd op met poly-L-lysine gecoate glasplaatjes. Voor immunohistochemie werden de coupes gedeparaffiniseerd in xyleen (drie keer wisselen, telkens 5 min) en gerehydrateerd via een reeks oplopend ethanol (100%, 95%, 70%, 50%; telkens 3 min). Antigeenherstel werd uitgevoerd door de coupes 15 min in een magnetron te verhitten in 10 mM natriumcitraatbuffer, gevolgd door 20 min afkoelen bij kamertemperatuur. Endogene peroxidase-activiteit werd geblokkeerd met 3% waterstofperoxide in methanol gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Aspecifieke binding werd geblokkeerd met 5% normaal geiten serum in PBS gedurende 1 u bij kamertemperatuur. De coupes werden vervolgens overnight bij 4 °C in een bevochtigingskamer geïncubeerd met primaire anti-VEGF antistoffen (verdunning 1 : 200). Na het wassen met PBS (drie keer, telkens 5 min) werden de coupes 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met een met mierikwortelperoxidase (HRP) geconjugeerd geiten anti-konijn secundair antilichaam (1 : 500). Het signaal werd gedetecteerd met behulp van 3,3′-diaminobenzidine (DAB) substraat. De coupes werden 30 s tegengekleurd met hematoxiline, gedehydrateerd, geklaard en met dekglas gemonteerd met een permanent montagemedium. Beeldbestemming werd uitgevoerd met een fluorescentie-inverted microscoop met brightfield-instellingen bij ×100 vergroting. Representatieve afbeeldingen worden getoond voor kwalitatieve illustratie.
Alle besmette tips, buizen en celkweekafval zijn verzameld als biologisch gevaarlijk afval en vóór verwijdering geautoclaveerd. Chemisch afval, inclusief drugbevattende oplossingen, DMSO, xyleen en methanol, werd verzameld in gescheiden, gelabelde afvalcontainers en afgevoerd volgens de lokale institutionele voorschriften voor gevaarlijk chemisch afval.
Statistische analyse
SPSS 19.0 software werd gebruikt voor de statistische analyse. Experimentele gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische replica's voor in vitro experimenten, en als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van n = 10 muizen per groep voor in vivo experimenten. Voor vergelijkingen tussen twee groepen werden tweezijdig ongepaarde t-toetsen gebruikt. Voor vergelijkingen tussen meerdere groepen werd eenweg-variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de post hoc-toets van Tukey gebruikt. p < 0,05, p < 0,01 en p < 0,001 werden gerapporteerd.
Resultaten
Het remmende effect van sorafenib en gemcitabine op de proliferatie van HepG2-cellen
Sorafenib en gemcitabine remden de proliferatie van HepG2-cellen dosisafhankelijk, zoals weergegeven in Tabel 1. De combinatietherapie vertoonde significant hogere remmingspercentages op alle tijdstippen in vergelijking met monotherapie. MTT meet de metabole activiteit, wat correleert met het aantal cellen, maar meet proliferatie of cytotoxiciteit niet direct. Daarom moet de term "remming van proliferatie" worden geïnterpreteerd als een afname in de MTT-conversie. Opmerkelijk is dat de combinatie van sorafenib bij 3 µmol/L en gemcitabine bij 10 µmol/L het meest uitgesproken remmende effect bereikte, wat het potentieel als effectief behandelingsregime tegen leverkanker onderstreept. Verder onderzoek toonde een additief effect van sorafenib en gemcitabine op HepG2-cellen aan. Tabel 2 presenteert de q-waarden, die wijzen op potentiële synergetische interacties tussen de twee geneesmiddelen. Met name de combinatie van 3 µmol/L sorafenib plus 10 µmol/L gemcitabine vertoonde q-waarden boven 1,15 op meerdere tijdstippen, wat suggereert dat er een verband bestaat tussen de verminderde p-ERK-expressie en het waargenomen antiproliferatieve effect, hoewel causaliteit door deze gegevens niet wordt aangetoond. Deze bevindingen geven aan dat verder onderzoek in aanvullende leverkankermodellen gerechtvaardigd is voordat conclusies kunnen worden getrokken over het therapeutische potentieel. De synergie werd niet waargenomen bij alle dosisparen; deze was beperkt tot één specifieke concentratiecombinatie.
Figuur 1 illustreert dat de remmingsgraad van de celproliferatie in de sorafenibgroep en de combinatietherapiegroep een piek bereikte na 72 h. De combinatietherapie, in het bijzonder bij een dosering van 3 µmol/L sorafenib en 10 µmol/L gemcitabine, resulteerde in een merkbaar hogere remmingsgraad vergeleken met monotherapies.
Het effect van sorafenib en gemcitabine op de expressie van ERK en p-ERK
Figuur 2A laat geen significante verandering zien in de ERK-proteinexpressie in alle groepen. De expressie van p-ERK was echter significant verlaagd in de sorafenib-groep en de combinatiebehandelingsgroep, waarbij de grootste afname werd waargenomen in de combinatiegroep. Deze gegevens tonen een associatie aan tussen verlaagde p-ERK-niveaus en de combinatiebehandeling, maar bewijzen niet dat de verlaagde p-ERK direct het antiproliferatieve effect medieert. Densitometrische kwantificering, normalisatie van p-ERK ten opzichte van totaal ERK en GAPDH, informatie over biologische replica's en statistische vergelijkingen zijn niet uitgevoerd. De gepresenteerde immunoblots zijn daarom uitsluitend representatief en kwalitatief.
Het effect van sorafenib en gemcitabine op het volume van subcutane xenotransplantaten bij getransplanteerde leverkanker in NOD/SCID-muizen
Er was geen significant verschil in het volume van de subcutane xenografts tussen de groepen vóór de behandeling (p = 0,367). Na de behandeling was het tumorvolume significant verminderd in vergelijking met de controlegroep, en de combinatiebehandelingsgroep was significant kleiner dan de sorafenib- en gemcitabinegroepen (p < 0,001), zoals weergegeven in Figuur 2B. Deze resultaten moeten met voorzichtigheid worden geïnterpreteerd, omdat er geen toxiciteits- of farmacokinetische gegevens zijn verzameld om te bevestigen dat de waargenomen verschillen niet worden beïnvloed door medicijngerelateerde morbiditeit of verschillen in systemische blootstelling.
Het effect van sorafenib en gemcitabine op de VEGF-expressie in getransplanteerd leverkanker bij NOD/SCID-muizen
Figuur 2C toont de immunohistochemische analyse van de VEGF-expressie in tumorweefsels. De sorafenib- en combinatiegroepen vertoonden een verminderde bruingele immunokleuring en een zwakkere VEGF-expressie bij kwalitatieve immunohistochemie. Deze bevinding wijst op een verminderd angiogeen potentieel, maar demonstreert angiogenese niet direct, aangezien er geen analyses van endotheelcelmarkers of microvatdichtheid zijn uitgevoerd. De gemcitabine- en controlegroepen vertoonden kwalitatief gezien een sterkere VEGF-expressie. Deze kwalitatieve VEGF-bevindingen zijn uitsluitend correlatief en dienen enkel ter generering van hypothesen. Zonder kwantitatieve analyse of directe vasculaire markers kan er geen conclusie worden getrokken over angiogenese of synergie in angiogenese.
DATABESCHIKBAARHEID
De ruwe gegevens die tijdens deze studie zijn gegenereerd en geanalyseerd, zijn opgenomen in de aanvullende materialen (Aanvullend bestand 1)).
Figuur 1: Effecten van verschillende interventies op de remming van de proliferatie van HepG2-cellen. (A) Remmingspercentage (%) van sorafenib op verschillende tijdstippen bij HepG2-cellen. (B) Remmingspercentage (%) van gemcitabine op verschillende tijdstippen bij HepG2-cellen. (C) Remmingspercentage (%) van sorafenib in combinatie met gemcitabine bij HepG2-cellen. (D) Remmingspercentage (%) van sorafenib (3 µmol/L) en gemcitabine (10 µmol/L) afzonderlijk, en in combinatie na 72 h behandeling van HepG2-cellen. *p < 0.05, **p < 0.01 vs. controlegroep. Alle gegevens over het remmingspercentage zijn verkregen met de MTT-assay zoals beschreven in het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: ERK/p-ERK expressie, tumorvolume en VEGF-expressie in behandelde groepen. (A) Expressie van ERK en p-ERK in HepG2-cellen bij verschillende behandelingen; (B) Volume (mm3) van tumoren in vier groepen voor en na behandeling (n = 10 per groep). **p < 0,01 vs. controlegroep na behandeling. Statistische vergelijkingen werden uitgevoerd met behulp van eenweg ANOVA op de eindvolumes. (C) Representatieve immunohistochemische beelden (schaalbalk = 100 µm) van VEGF-expressie in tumorweefsels van elke groep (n = 10 per groep). Deze beelden worden getoond ter kwalitatieve illustratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Groep（μmol/L） | Behandelingstijd（h） | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | ||
| Sorafenib | 1.5 | 12.41 ± 3.37 | 22.74 ± 4.57 | 29.76 ± 3.48 | 15.77 ± 3.18 |
| 3 | 26.37 ± 6.14 | 33.10 ± 4.39 | 44.71 ± 5.49 | 38.63 ± 5.68 | |
| 4.5 | 34.42 ± 5.26 | 58.91 ± 4.67 | 67.85 ± 5.20 | 54.26 ± 6.07 | |
| 6 | 46.88 ± 6.61 | 67.48 ± 5.70 | 73.57 ± 7.07 | 61.73 ± 6.10 | |
| Gemcitabine | 5 | 3.56 ± 1.41 | 6.17 ± 1.73 | 9.31 ± 1.76 | 11.35 ± 1.95 |
| 10 | 5.89 ± 2.47 | 9.62 ± 2.15 | 14.57 ± 1.94 | 16.58 ± 2.31 | |
| 15 | 14.57 ± 3.38 | 19.53 ± 2.27 | 22.43 ± 2.13 | 24.75 ± 3.25 | |
| 20 | 22.36 ± 4.46 | 28.76 ± 3.92 | 33.18 ± 3.19 | 38.49 ± 4.28 | |
| Sorafenib + Gemcitabine | 1.5 + 5 | 14.13 ± 2.16 | 26.41 ± 3.43 | 37.75 ± 4.75 | 22.04 ± 2.84 |
| 3 + 10 | 38.69 ± 3.94 | 46.26 ± 4.06 | 71.23 ± 6.76 | 62.47 ± 7.20 | |
| 4.5 + 15 | 40.89 ± 4.21 | 74.30 ± 6.98 | 84.82 ± 9.17 | 66.89 ± 7.16 | |
| 6 + 20 | 64.05 ± 6.54 | 80.67 ± 9.79 | 92.22 ± 10.24 | 81.05 ± 9.87 | |
Tabel 1: Remmingspercentage (%) van sorafenib en gemcitabine op HepG2-cellen. Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten.
| Groepμmol/L） | Behandelingstijd (u) | ||||
| 24 | 48 | 72 | 96 | ||
| Sorafenib+Gemcitabine | 1.5 + 5 | 0.91 | 0.96 | 1.04 | 0.87 |
| 3 + 10 | 1.26 | 1.17 | 1.35 | 1.28 | |
| 4.5 + 15 | 0.93 | 1.11 | 1.13 | 1.02 | |
| 6 + 20 | 1.09 | 1.05 | 1.12 | 1.06 | |
Tabel 2: q-waarde van het synergetische effect van sorafenib en gemcitabine op HepG2-cellen. q > 1,15 duidt op synergie; 0,85–1,15 duidt op additiviteit; q < 0,85 duidt op antagonisme. Gegevens zijn afgeleid van drie onafhankelijke experimenten.
Aanvullende figuur 1: De studie werd uitgevoerd in twee hoofdfasen: in vitro experimenten met de HepG2-cellijn en in vivo experimenten met een NOD/SCID-muis xenograftmodel. In vitro werden HepG2-cellen behandeld met sorafenib, gemcitabine of een combinatie hiervan in verschillende concentraties. De celproliferatie werd beoordeeld met de MTT-assay, en de expressie van ERK en p-ERK werd geanalyseerd via Western blotting. In vivo werd een xenograftmodel vastgesteld door subcutane injectie van HepG2-cellen in NOD/SCID-muizen. De muizen werden verdeeld over vier behandelingsgroepen en kregen dagelijks intraperitoneale injecties. Het tumorvolume werd gedurende de behandelingsperiode gemeten. Na euthanasie werden de tumorweefsels geoogst en onderworpen aan immunohistochemische kleuring voor VEGF. Alle gegevens werden statistisch geanalyseerd met SPSS 19.0 software.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 1: Raw data.rar.Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussie
Leverkanker heeft een hoge mortaliteitsgraad vanwege het sluipende begin, de snelle progressie en de weinige effectieve behandelingen3,15. Gevorderde leverkanker vertoont vaak resistentie tegen chemotherapie en bestraling, en huidige opties, waaronder chirurgische resectie en levertransplantatie, blijven onvoldoende15,16. De combinatie van twee of meer chemotherapeutische geneesmiddelen met verschillende werkingsmechanismen is goed ontwikkeld en wordt geacht de efficiëntie aanzienlijk te verhogen, wat een alternatieve strategie voor de behandeling kan zijn15,16. Doelgerichte geneesmiddelen voor leverkankeronderzoek omvatten monoklonale antilichamen (anti-VEGF en anti-EGFR), tyrosinekinase-remmers en mTOR-remmers, waarbij een belangrijke uitdaging de optimale integratie van bestaande geneesmiddelen is om een verbetering van de algehele overleving en de kwaliteit van leven te bereiken17. Indien een combinatie van efficiënte en weinig toxische geneesmiddelen wordt onderzocht, zou dit kunnen helpen de huidige beperkingen in de behandeling van leverkanker te overwinnen. Een recent celmodel dat chemoresistentie tegen gemcitabine vertoonde, suggereerde dat het opnieuw gesensitiseerd zou kunnen worden voor gemcitabine/sorafenib (EGFR-remmers)14. Deze bevinding is voor ons van groot belang omdat het een nog niet verkend wetenschappelijk onderwerp is. Een fractioneel factorieel ontwerp identificeerde de optimale combinatie van drie geneesmiddelen bestaande uit gemcitabine (1,4 mmol/L), sorafenib (0,03 mmol/L) en S-1 (0,185 mmol/L), die de proliferatie van cholangiocarcinoom (CCA) en tumorgroei significant remt door de AKT/mTOR-route te onderdrukken en apoptose te induceren18. Awasthi en collega's toonden aan dat sorafenib de fosforylering van mitogeen-geactiveerd proteïnekinase (MEK), ERK1/2, 70 kDa ribosomaal eiwit S6-kinase (p70S6K) en 4E-bindend eiwit 1 (4EBP-1) in cellen van pancreasductaal adenocarcinoom (PDAC), alsmede de celproliferatie, remde; in combinatie met gemcitabine vertoonde het additieve antiproliferatieve en pro-apoptotische effecten in diverse cellen, waardoor de overlevingstijd van tumor dragende dieren significant werd verlengd19. De gecombineerde behandeling met gemcitabine en sorafenib remt het proces van epitheliale-mesenchymale transitie, onderdrukt bovendien de proliferatie, migratie en invasie van niet-kleincellige longkankercellen (NSCLC) en induceert celcyclusstop en apoptose20. Voor zover wij weten is deze studie echter de eerste die deze combinatie specifiek test in een HepG2-gebaseerd in vitro model en een subcutaan xenograft-model van hepatocellulair carcinoom.
Deze studie was erop gericht dit gat te vullen door de effecten van de combinatie van sorafenib, een multi-target kinase-remmer, en gemcitabine, een cytidine-analoog, op leverkanker zowel in vitro als in vivo te onderzoeken. In deze studie hadden sorafenib en gemcitabine afzonderlijk beide remmende effecten op de proliferatie van HepG2-cellen, en het remmende effect van de combinatie van de twee geneesmiddelen is significant sterker dan dat van een enkel geneesmiddel, wat wijst op een additief effect. Echter, MTT alleen kan geen onderscheid maken tussen cytostatische (groeistop) en cytotoxische (celdood) effecten, noch biedt het direct bewijs voor anti-proliferatieve mechanismen. Hierbij was de q-waarde van de combinatiegroep met sorafenib 3 µmol/L + gemcitabine 10 µmol/L op elk tijdstip groter dan 1,15, wat wijst op een synergetisch effect. Sorafenib en gemcitabine, alleen of in combinatie, veranderden de expressie van ERK in HepG2-cellen niet significant, maar sorafenib alleen en in combinatie remden de expressie van p-ERK significant. De combinatie van de twee geneesmiddelen remde de fosforylering van ERK in HepG2-cellen additief. Deze gegevens wijzen op een associatie tussen verminderde p-ERK en het anti-proliferatieve effect van de combinatie, hoewel causaliteit niet is vastgesteld. De synergie was geen algemene eigenschap van de combinatie onder alle geteste condities, maar werd alleen waargenomen bij één specifieke concentratieverhouding. De immunohistochemische resultaten van het NOD/SCID-muisleverkanker-xenograftmodel toonden aan dat de combinatie van sorafenib en gemcitabine de expressie van VEGF significant kon verlagen en het tumorvolume kon reduceren. Omdat er echter geen toxiciteits- of lichaamsgewichtsgegevens systematisch zijn verzameld, kunnen we de mogelijkheid niet uitsluiten dat het verminderde tumorvolume gedeeltelijk toe te schrijven is aan door geneesmiddelen veroorzaakte morbiditeit in plaats van specifieke anti-tumor-effecten. De combinatie van sorafenib en gemcitabine werd ook geassocieerd met een verminderde VEGF-expressie in tumorweefsels, zoals aangetoond door immunohistochemie. Deze observatie suggereert een potentieel anti-angiogeen effect, maar direct bewijs van verminderde vascularisatie (bijv. analyse van de microvatdichtheid) ontbreekt. Daarom blijft de bijdrage van VEGF-downregulatie aan het waargenomen anti-proliferatieve effect correlatief. Dit synergetische effect suggereert dat de combinatietherapie de beperkingen van monotherapieën kan overwinnen, die vaak leiden tot geneesmiddelresistentie en behandelingsfalen. De identificatie van een optimale combinatiedosis van sorafenib en gemcitabine is een cruciale stap richting de klinische toepassing van dit behandelingsregime.
De moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het additieve effect van sorafenib en gemcitabine kunnen gerelateerd zijn aan de inhibitie van de ERK-route, zoals gesuggereerd door de significante afname van de p-ERK-expressie in de combinatiebehandelingsgroep. De ERK-route staat erom bekend een cruciale rol te spelen bij celproliferatie, overleving en angiogenese, waardoor het een belangrijk doelwit is voor kankertherapie. De resultaten suggereren dat de combinatiebehandeling de ERK-route effectiever kan verstoren dan monotherapieën, wat correleert met een grotere reductie in p-ERK-expressie vergeleken met monotherapie. In vivo-studies in een NOD/SCID-muismodel ondersteunen verder de potentiële therapeutische voordelen van de combinatiebehandeling. We observeerden een significante reductie van het tumorvolume en een verminderde VEGF-expressie in de combinatiebehandelingsgroep. VEGF is een belangrijke drijver van angiogenese bij HCC, en de inhibitie ervan is geassocieerd met verminderde tumorgroei en metastase. De downregulatie van VEGF als reactie op de combinatiebehandeling is consistent met de hypothese dat dit regime angiogene processen kan moduleren; directe bewijzen voor anti-angiogene activiteit zijn echter niet beoordeeld in deze studie. De geobserveerde associatie tussen verminderde p-ERK-expressie en het antiproliferatieve effect van de combinatie is suggestief, maar stelt geen causaal mechanisme vast. Omdat de Western blot-analyse slechts op één tijdstip na langdurige blootstelling aan het geneesmiddel werd uitgevoerd, kunnen vroege, dynamische veranderingen in de ERK-fosforylering niet worden vastgelegd. Bovendien beperken het gebrek aan densitometrische kwantificering, statistieken op replica-niveau en normalisatie ten opzichte van totaal ERK en loading controls de interpreteerbaarheid. Hoewel verminderde p-ERK dus correleert met de combinatiebehandeling, blijft het onbewezen op basis van de huidige gegevens of inhibitie van de ERK-route het additieve effect direct medieert. Dit mechanistische inzicht is consistent met opkomende strategieën die zich richten op parallelle of compensatoire routes om resistentie bij HCC te overwinnen.
Hoewel deze studie waardevolle inzichten biedt in de potentiële additieve effecten van sorafenib en gemcitabine op leverkanker, moeten enkele beperkingen van dit onderzoek worden erkend. Ten eerste is de steekproefomvang in deze studie relatief klein, wat de generaliseerbaarheid van de bevindingen kan beperken. Een grotere cohortstudie zou noodzakelijk zijn om de effectiviteit en veiligheid van de combinatietherapie bij een diversere patiëntenpopulatie te bevestigen. Ten tweede is in deze studie gebruikgemaakt van de HepG2-cellijn; dit is een gevestigd model voor leverkankeronderzoek, maar het weerspiegelt mogelijk niet volledig de heterogeniteit van leverkanker bij patiënten. Verschillende subtypes van leverkanker en genetische achtergronden zouden mogelijk anders kunnen reageren op de combinatietherapie. Daarom zijn de hier gerapporteerde bevindingen mogelijk niet generaliseerbaar naar alle typen leverkanker, en is validatie met aanvullende cellijnen (bijv. Huh7 [menselijke hepatocellulaire carcinoom-cellijn] en PLC/PRF/5 [menselijke hepatocellulaire carcinoom-cellijn, ook bekend als Alexander-cellen], of patiëntafgeleide xenografts) noodzakelijk voordat bredere conclusies kunnen worden getrokken. Ten derde zijn de in vivo experimenten uitgevoerd met een NOD/SCID-muismodel, dat geen immuunsysteem heeft en daarmee de complexe tumor-immuunmicro-omgeving bij menselijke leverkanker niet volledig representeert. Toekomstige studies zouden immuuncompetente muismodellen of gehumaniseerde systemen moeten bevatten om de immunologische aspecten van de behandeling beter te begrijpen. Vierdens heeft deze studie de toxiciteit of het veiligheidsprofiel van de sorafenib-gemcitabine-combinatie niet beoordeeld. Er zijn geen gegevens verzameld over veranderingen in het lichaamsgewicht, organtoxiciteit (bijv. lever- en nierfunctietests) of bijwerkingen bij de NOD/SCID-muizen. Daarom kunnen op basis van de huidige gegevens geen conclusies worden getrokken over de veiligheid of tolerantie van deze combinatie. Vijfde is de bewering over anti-angiogenese preliminair en mag deze niet worden overgeïnterpreteerd. Hoewel de VEGF-expressie kwalitatief was verminderd, hebben we geen kwantitatieve immunohistochemische (IHC) analyse uitgevoerd (bijv. H-score, percentage positief gebied, kleuringsintensiteit of geblindeerde digitale beeldanalyse over meerdere velden per tumor). Bovendien hebben we de microvatdensiteit niet beoordeeld met endotheliale markers zoals Cluster of Differentiation 31 (CD31) of endomucine, noch hebben we functionele vasculaire assays uitgevoerd. Daarom tonen de huidige VEGF-gegevens geen directe vermindering van angiogenese aan; ze tonen enkel een correlatieve afname van de VEGF-proteineniveaus. Zesde heeft de statistische analyse verschillende beperkingen. Het tumorvolume werd herhaaldelijk gemeten bij dezelfde muizen over een periode van 20 dagen, maar we hebben enkel eenweg-ANOVA gebruikt op de eindvolumes in plaats van een ANOVA voor herhaalde metingen of een mixed-effects model dat rekening houdt met temporele correlatie. Normaliteit en homogeniteit van de variantie zijn niet formeel getest. Bovendien kan, hoewel deze studie een associatie heeft vastgesteld tussen een verminderde p-ERK-expressie en het additieve antiproliferatieve effect van sorafenib en gemcitabine, uit deze gegevens geen causaliteit worden afgeleid. De Western blot-analyse kent enkele aanvullende beperkingen: (i) er werd slechts één enkel, laat tijdstip (72 h) onderzocht, terwijl ERK-fosforylering een vroege en transiënte signaleringsgebeurtenis is; (ii) er worden representatieve blots getoond zonder densitometrische kwantificering of statistische analyse over onafhankelijke biologische replica's; (iii) p-ERK werd niet genormaliseerd ten opzichte van totaal ERK, noch werd totaal ERK consistent en kwantitatief genormaliseerd naar een loading control. Bijgevolg zijn deze gegevens primair kwalitatief en dienen ze ter genereren van hypothesen. Definitieve mechanistische validatie zou rescue-experimenten vereisen (bijv. constitutieve activatie van ERK via mutant MEK of gebruik van ERK-activatoren) om te testen of het herstel van p-ERK-niveaus het antiproliferatieve effect van de combinatie vermindert. Een belangrijke beperking is het gebrek aan diepgaande moleculaire validatie. We hebben p-VEGFR, p-AKT of apoptotische markers niet onderzocht. De gegevens over de ERK-route zijn kwalitatief en stellen geen causaliteit vast. Verdere studies, specifiek ontworpen om het onderliggende mechanisme te ontrafelen, zijn vereist voordat mechanistische conclusies kunnen worden getrokken. Evenzo zouden siRNA-gemedieerde knockdown van ERK of farmacologische inhibitoren gericht op stroomopse regulatoren (bijv. MEK-inhibitoren) kunnen helpen vaststellen of het waargenomen effect inderdaad ERK-afhankelijk is. Deze validatie-experimenten vielen buiten de reikwijdte van deze initiële studie, maar vormen een kritieke richting voor toekomstig onderzoek. Andere belangrijke routes die betrokken zijn bij tumorproliferatie en overleving, zoals PI3K/AKT of gerelateerde downstreamfactoren, zijn niet onderzocht en kunnen mogelijk ook bijdragen aan de waargenomen effecten. De bevindingen met betrekking tot VEGF-expressie in deze studie zijn preliminair en dienen ter genereren van hypothesen. De verminderde VEGF-immunokleuring biedt een belangrijke aanwijzing voor potentiële modulatie van angiogene routes, maar is geen concluderend bewijs voor een anti-angiogeen mechanisme. We waarschuwen lezers expliciet dat VEGF IHC alleen, vooral zonder kwantificering of corroborerende vasculaire markers, geen anti-angiogeen mechanisme kan vaststellen. Het ontbreken van analyse van endotheliale celmarkers en vasculaire functie is een van de belangrijkste beperkingen van deze studie. Daarom is een uitgebreidere analyse van de betrokken signaleringsroutes, inclusief de potentiële rol van andere kinasen en angiogene factoren, nodig om de werkingswijze van de combinatietherapie volledig te begrijpen.
De hier beschreven procedures zijn geoptimaliseerd voor HepG2-cellen en NOD/SCID-muizen. De reproduceerbaarheid kan variëren bij verschillende cellijnen of muizenstammen. Belangrijke factoren die de reproduceerbaarheid beïnvloeden zijn: (1) het passagenummer van de cellen (gebruik passages lager dan 20); (2) de MTT-incubatietijd (standaardiseren op precies 4 h); (3) de lotnummers van antilichamen (registreren voor elk experiment); en (4) de training van de operator van de schuifmaatschroef (gebruik gedurende het gehele proces dezelfde geblindeerde operator). Wij raden gebruikers aan om positieve controle-experimenten uit te voeren (bijv. sorafenib alleen bij 6 µmol/L) om hun opstelling te valideren voordat combinaties worden getest.
Deze studie toonde via Western blotting aan dat de combinatietherapie van sorafenib en gemcitabine de expressie van p-ERK in HepG2-cellen significant verminderde, wat wijst op modulatie van de ERK-signaleringsroute; deze gegevens zijn echter kwalitatief en stellen geen causaal verband vast. p-ERK wordt op grote schaal gebruikt als functionele marker voor de activering van de ERK-route, en de downregulatie ervan wordt gewoonlijk geïnterpreteerd als een indicator van verminderde routeactiviteit(11). Hoewel we de transcriptionele veranderingen van downstream doelgenen (zoals c-Fos, c-Myc) niet verder hebben gedetecteerd via RT-PCR, biedt de waargenomen vermindering van p-ERK correlatieve ondersteuning voor de betrokkenheid van de ERK-route, in plaats van direct mechanisch bewijs. Toekomstige studies kunnen de regulatoire details van het ERK-downstreamnetwerk verder onthullen via transcriptoomanalyse of gerichte qPCR, waardoor het begrip van het mechanisme van de gecombineerde behandeling wordt verbeterd. Daarnaast richtte deze studie zich op de kortetermijneffecten van de combinatietherapie. Langetermijnstudies zijn noodzakelijk om de duurzaamheid van de respons, de mogelijke ontwikkeling van resistentie en vertraagde toxiciteiten geassocieerd met de behandeling te beoordelen. Ten slotte is in dit onderzoek niet onderzocht naar de potentie van het combineren van sorafenib en gemcitabine met andere opkomende strategieën, zoals immunotherapie of andere gerichte therapieën, die de behandelingseffecten potentieel zouden kunnen versterken. Toekomstig onderzoek dient multi-drugcombinaties te onderzoeken om effectievere behandelingsregimes voor leverkanker te ontwikkelen. Samenvattend suggereert deze studie een veelbelovend additief effect van sorafenib en gemcitabine bij leverkanker, maar deze bevindingen moeten worden geïnterpreteerd binnen de context van de beperkingen van de studie. Verder onderzoek is nodig om deze resultaten te valideren en deze inzichten te vertalen naar verbeterde klinische uitkomsten en potentiële bijwerkingen bij patiënten met leverkanker.
Concluderend levert deze studie preliminaire bewijzen dat de combinatie van sorafenib en gemcitabine antiproliferatieve activiteit vertoont en geassocieerd is met een verminderde VEGF-expressie in HepG2-cellen en een NOD/SCID-muis xenograft-model. Echter zijn de VEGF-gegevens kwalitatief en tonen zij geen directe anti-angiogene effecten aan; daarom blijft elke claim over anti-angiogene activiteit in dit stadium ongefundereerd. Hoewel de gegevens een associatie laten zien tussen een verminderde p-ERK-expressie en het antiproliferatieve effect van de combinatie, moeten de causale mechanismen nog worden vastgesteld. Gezien de hier genoemde beperkingen van de Western blot blijft de mechanistische rol van de ERK-route in deze combinatie in dit stadium speculatief. De combinatie van sorafenib en gemcitabine rechtvaardigt verder onderzoek, inclusief pathway rescue-experimenten en testen in aanvullende leverkankermodellen, om te bepalen of ERK-route-inhibitie inderdaad een belangrijke mediator is van de waargenomen synergie. De klinische relevantie van sorafenib plus gemcitabine zou in toekomstige preklinische en klinische studies moeten worden geëvalueerd ten opzichte van de moderne standaarden, in het bijzonder in de context van sorafenib-resistente tumoren of in situaties waarin sorafenib een klinische optie blijft.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te verklaren.
Dankbetuigingen
De auteurs hebben geen dankwoord.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Digitaal gel-imagingsysteem | Bio-Rad Laboratories, Inc., VS | 1708280 | |
| DMEM medium met hoog glucosegehalte | HyClone, USA | SH30243.01 | |
| ERK konijn monoklonaal antilichaam | Santa Cruz, USA | sc-94 | |
| Foetaal runderserum | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., China | 11011-8611/11011-8615 | |
| Inverteerde fluorescentiemicroscoop | Olympus, Japan | IX73 | |
| GAPDH konijn polyklonaal antilichaam | Santa Cruz, VS | sc-25778 | |
| Gemcitabine | Eli Lilly and Company | 95058-81-4 | |
| Geiten anti-konijn secundair antilichaam | Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., China | D111018 | |
| ImageJ-software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Versie 1.8.0_112 | |
| Microplatelezer | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | MK3 | |
| p-ERK konijn monoklonaal antilichaam | Santa Cruz, USA | 9106 | |
| Gekoelde centrifuge | Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd. | DL-5M | |
| RIPA-lysisbuffer | Biyuntian Biological Technology Research Institute, China | P0013B | |
| Rotatiemicrotoom | Leica, Duitsland | CM3050 | |
| Sorafenib | Bayer Company, Duitsland | 284461-73-0 | |
| Thiazolylblauw (MTT) | Sigma, USA | M5655 | |
| Drie-gasincubator | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | 51026402 | |
| VEGF konijn monoklonaal antilichaam | BioLegend, USA | B199116 |
Referenties
- Fujii T, Kuzuya T, Kondo N, Funasaka K, Ohno E, Hirooka Y, et al. Altered intestinal Streptococcus anginosus and 5α-reductase gene levels in patients with hepatocellular carcinoma and elevated Bacteroides stercoris in atezolizumab/bevacizumab non-responders. J Med Microbiol. 2024;73(9):001878.
- Gay MD, Drda JC, Chen W, Huang Y, Yassin AA, Duka T, et al. Implicating the cholecystokinin B receptor in liver stem cell oncogenesis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2024;326(3):G291-g309.
- Diao X, Guo C, Jin Y, Li B, Gao X, Du X, et al. Cancer situation in China: an analysis based on the global epidemiological data released in 2024. Cancer Commun (Lond). 2025;45(2):178-97.
- Yokota S, Yonezawa T, Momoi Y, Maeda S. Sorafenib inhibits tumor cell growth and angiogenesis in canine transitional cell carcinoma. J Vet Med Sci. 2022;84(5):666-74.
- Nassar-Reis JP, Umeta PF, Stefano JT, Longatto-Filho A, Carrilho FJ, Alves VAF, et al. P53 and VEGF are promising biomarkers for sorafenib efficacy in an experimental model of NASH-related HCC. J Mol Histol. 2023;54(5):473-88.
- Taha AM, Aboulwafa MM, Zedan H, Helmy OM. Ramucirumab combination with sorafenib enhances the inhibitory effect of sorafenib on HepG2 cancer cells. Sci Rep. 2022;12(1):17889.
- Ning L, Tian Y, Chen D, Han J, Xie G, Sun J. Sorafenib safety evaluation: Real-world analysis of adverse events from the FAERS database. Heliyon. 2024;10(18):e37348.
- Vij P, Hussain MS, Satapathy SK, Cobos E, Tripathi MK. The emerging role of long noncoding RNAs in sorafenib resistance within hepatocellular carcinoma. Cancers (Basel). 2024;16(23):3904.
- Lu X, Chen Z, Mi W, Zheng J, Liu Y. MARK1 suppress malignant progression of hepatocellular carcinoma and improves sorafenib resistance through negatively regulating POTEE. Open Med (Wars). 2024;19(1):20241060.
- Lee HJ, Lee JS, So H, Yoon JK, Choi JY, Lee HW, et al. Comparison between nivolumab and regorafenib as second-line systemic therapies after sorafenib failure in patients with hepatocellular carcinoma. Yonsei Med J. 2024;65(7):371-9.
- Tang W, Chen Z, Zhang W, Cheng Y, Zhang B, Wu F, et al. The mechanisms of sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma: theoretical basis and therapeutic aspects. Signal Transduct Target Ther. 2020;5(1):87.
- Lin Q, Guan S, Peng M, Yu H. A mesoporous silica-based nano-drug co-delivery system with gemcitabine for targeted therapy of pancreatic cancer. J Coll Physicians Surg Pak. 2024;34(12):1456-63.
- Tang J, Liu Z, Xie G, Wang C, Jiang Y. POU4F1 enhances lung cancer gemcitabine resistance by regulating METTL3-dependent TWF1 mRNA N6 adenosine methylation. 3 Biotech. 2025;15(1):7.
- Cheng J, Zhu T, Liu S, Zhou J, Wang X, Liu G. Prediction of synergistic gemcitabine-based combination treatment through a novel tumor stemness biomarker NANOG in pancreatic cancer. RSC Med Chem. 2024;15(11):3853-61.
- Man S, Luo C, Yan M, Zhao G, Ma L, Gao W. Treatment for liver cancer: From sorafenib to natural products. Eur J Med Chem. 2021;224:113690.
- Llovet JM, Pinyol R, Kelley RK, El-Khoueiry A, Reeves HL, Wang XW, et al. Molecular pathogenesis and systemic therapies for hepatocellular carcinoma. Nat Cancer. 2022;3(4):386-401.
- Bronte F, Bronte G, Cusenza S, Fiorentino E, Rolfo C, Cicero G, et al. Targeted therapies in hepatocellular carcinoma. Curr Med Chem. 2014;21(8):966-74.
- Li H, Zhang Z, Zhou Z, Ding X, Zhou G. Optimal combination of gemcitabine, sorafenib, and S-1 shows increased efficacy in treating cholangiocarcinoma in vitro and in vivo. Anticancer Drugs. 2016;27(7):600-8.
- Awasthi N, Zhang C, Hinz S, Schwarz MA, Schwarz RE. Enhancing sorafenib-mediated sensitization to gemcitabine in experimental pancreatic cancer through EMAP II. J Exp Clin Cancer Res. 2013;32(1):12.
- Jiang S, Wang R, Zhang X, Wu F, Li S, Yuan Y. Combination treatment of gemcitabine and sorafenib exerts a synergistic inhibitory effect on non-small cell lung cancer in vitro and in vivo via the epithelial-to-mesenchymal transition process. Oncol Lett. 2020;20(1):346-56.