Sorafenib plus gemcitabine vertoont preliminaire bewijzen van additieve remming van de proliferatie van HepG2-cellen, vertoont correlerende veranderingen in de expressie van p-ERK en VEGF, en onderdrukt de groei van levertumoren in NOD/SCID-muizen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Onderzoeksartikel
* These authors contributed equally
Sorafenib plus gemcitabine vertoont preliminaire bewijzen van additieve remming van de proliferatie van HepG2-cellen, vertoont correlerende veranderingen in de expressie van p-ERK en VEGF, en onderdrukt de groei van levertumoren in NOD/SCID-muizen.
Leverkanker blijft een belangrijke doodsoorzaak door medicatieresistentie en beperkte behandelopties. Er is een dringende behoefte aan het onderzoeken van therapeutische strategieën om de resultaten te verbeteren. Deze pilotstudie presenteert een protocol voor het beoordelen van de potentiële effecten en onderliggende mechanismen van de combinatie van sorafenib en gemcitabine bij leverkanker. De leverkanker-cellijn HepG2 werd gebruikt en er werd een xenograftmodel in non-obese diabetische/ernstig gecombineerd immuundeficiënte (NOD/SCID) muizen opgezet. Belangrijke procedurele stappen worden gedemonstreerd, waaronder: (1) HepG2-celkweek en medicatiebehandeling; (2) MTT-assay opstelling, incubatie en absorptiemeting; (3) eiwitextractie, SDS-PAGE, transfer en immunoblotting voor ERK en p-ERK; (4) vestiging van subcutane xenografts in NOD/SCID-muizen; (5) tumormeting en volumeberekening; en (6) VEGF-immunohistochemie op tumorsneden. Kritieke stappen, tips voor probleemoplossing en apparatuurspecificaties worden verstrekt. De combinatie van sorafenib (3 µmol/L) en gemcitabine (10 µmol/L) bereikte een inhibitiesnelheid van 71,23% ± 6,76% na 72 h, met een q-waarde van 1,35, wat wijst op een synergistisch effect bij dit specifieke dosispaar onder de geteste condities. In vergelijking met de controlegroep was de combinatietherapie geassocieerd met een verminderde p-ERK-expressie, een afgenomen tumorvolume en kwalitatief lagere VEGF-immunokleuring. Deze gegevens tonen een correlatieve associatie aan tussen verminderde p-ERK-expressie en het waargenomen antiproliferatieve effect, zonder causaliteit vast te stellen. In HepG2-cellen en een NOD/SCID-muis xenograftmodel vertoont de combinatie van sorafenib en gemcitabine preliminair bewijs van antiproliferatief potentieel en is geassocieerd met een verminderde VEGF-expressie; deze bevinding vormt echter geen direct bewijs voor anti-angiogene activiteit, aangezien er geen analyses van de microvasculaire dichtheid of functionele vasculaire analyses zijn uitgevoerd. Dit reproduceerbare protocol biedt een nuttig kader voor het evalueren van medicatiecombinaties in HCC-modellen en kan worden aangepast voor andere schema's van doelgerichte therapie en chemotherapie, hoewel verdere mechanistische studies en dosisvalidaties vereist zijn voordat er klinische conclusies kunnen worden getrokken.
Leverkanker is een van de meest voorkomende en dodelijkste vormen van kanker, en is bovendien een van de snelst groeiende maligne tumoren1,2. Hoewel de incidentie van leverkanker is afgenomen, is de totale ziektelast van leverkanker blijven toenemen. De wereldwijde epidemiologische gegevens van 2022 onthulden dat de leeftijdgestandaardiseerde incidentie van leverkanker in de online database van het Global Cancer Observatory (GLOBOCAN) 2022 15,0 per 100.000 inwoners bedroeg, terwijl de leeftijdgestandaardiseerde mortaliteit van leverkanker 26,7 per 100.000 inwoners was, waardoor het de op één na belangrijkste doodsoorzaak door kanker is3. Momenteel overlijden de meeste patiënten binnen één jaar na de diagnose vanwege het gebrek aan effectieve behandelingen voor leverkanker, in combinatie met het sluipende begin van de ziekte. Sorafenib is de eerste multi-target kinase-remmer die is goedgekeurd voor klinisch gebruik, waarbij receptor-tyrosinekinasen zoals de epidermale groeifactorreceptor (EGFR), de platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) en serine/threonine-kinasen worden getarget4,5. Sorafenib, een orale multikinase-remmer, oefent anti-proliferatieve en anti-angiogene effecten uit bij leverkanker door meerdere groeifactorpaden te targeten. Historisch gezien was sorafenib de eerste door de FDA goedgekeurde eerstelijns systemische therapie voor patiënten met gevorderde of niet-resecteerbare leverkanker6. Het huidige landschap van eerstelijnsbehandelingen voor gevorderd hepatocellulair carcinoom (HCC) is echter aanzienlijk uitgebreid. Aanbevolen opties omvatten nu onder meer de immuuncheckpointremmer-combinatie atezolizumab plus bevacizumab, lenvatinib en de dubbele immunotherapie-combinatie durvalumab plus tremelimumab. Ondanks deze vooruitgang blijft sorafenib een belangrijke eerstelijnsoptie, vooral in regio's waar immunotherapie-combinaties niet gemakkelijk beschikbaar zijn of gecontra-indiceerd zijn. Gezien het uitgebreide gebruik bij leverkanker is er bezorgdheid ontstaan over geneesmiddelgerelateerde bijwerkingen7. In de analyse van de FDA Adverse Event Reporting System (FAERS) database van 2006 tot 2023 betroffen de bijwerkingen van sorafenib voornamelijk het spijsverteringsstelsel, de huid en het subcutane weefsel, alsmede aspecifieke fysieke ongemakken zoals infecties en letsel7. Hoewel sommige patiënten met gevorderde leverkanker baat kunnen hebben bij een behandeling met sorafenib, ontwikkelen de meeste patiënten uiteindelijk resistentie of treedt er therapiefalen op, wat leidt tot een slechte prognose8,9,10. Ondanks het gebruik profiteert slechts ongeveer 30% van de HCC-patiënten van sorafenib; bovendien ontwikkelen responders vaak resistentie binnen 6 maanden11. De moleculaire paden die betrokken zijn bij sorafenib-resistentie omvatten extracellular signal-regulated kinase (ERK)/gefosforyleerd ERK (p-ERK), proteïnekinase B (Akt), fosfoïnositide 3-kinase (PI3K)/AKT/mammalian target of rapamycin (mTOR), hypoxia-inducible factor 1α (HIF-1α)/HIF-2α en autofagie-gerelateerde paden, waarbij ERK/p-ERK specifiek is uitgelicht en geselecteerd in dit onderzoek11. Gemcitabine is een cytidine-analogon dat het lichaam binnendringt om difluorcytidine-difosfaat en difluorcytidine-trifosfaat te produceren, welke verschillende inhiberende effecten hebben op de DNA-synthese12. Bij hepatobiliaire maligniteiten is gemcitabine geëvalueerd als onderdeel van combinatiechemotherapie. Er is echter klinisch ook gerapporteerd dat gemcitabine een grotere geneesmiddelresistentie vertoont, wat de effectiviteit van gemcitabine beperkt12,13. Het is daarom uiterst uitdagend om effectief en efficiënt het optimale medicijnregime te bepalen. Recente studies hebben aangetoond dat gemcitabine in combinatie met sorafenib een verbeterde therapeutische effectiviteit kan hebben op basis van een nieuwe voorspelling van tumorstamcel-biomarkers14. Naar ons weten is er echter geen studie geweest die deze combinatie specifiek bij leverkanker heeft onderzocht met behulp van HepG2-cellen en een non-obese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) muis-xenograftmodel van hepatocellulair carcinoom. Er is dus een gebrek aan experimenteel bewijs dat direct de additieve effecten van sorafenib en gemcitabine bij leverkanker valideert.
De in dit manuscript beschreven procedures worden veelvuldig gebruikt, maar zelden gepresenteerd in een gedetailleerd, visueel stappenplan dat geschikt is voor replicatie door beginnende onderzoekers. Wij stelden als hypothese dat de combinatie van sorafenib en gemcitabine de proliferatie van leverkankercellen en tumorstijging additief zou remmen, en dat dit effect geassocieerd zou zijn met een downregulatie van het ERK/p-ERK-pad en een verminderde angiogenese gemedieerd door de vasculaire endotheelgroeifactor (VEGF). Deze studie beoogt in eerste instantie het remmende effect van sorafenib in combinatie met gemcitabine op de proliferatie van de HepG2-leverkankercellijn in vitro en in vivo en het bijbehorende mechanisme te onderzoeken (Supplementary Figure 1). De nieuwheid van deze studie ligt in drie aspecten: (1) het is de eerste studie die de sorafenib-gemcitabine-combinatie specifiek bij leverkanker test met gebruik van de veelgebruikte HepG2-cellijn en een corresponderend NOD/SCID-muismodel; (2) het onderzoekt het onvoldoende bestudeerde ERK/p-ERK-pad als potentieel mechanisme; en (3) het biedt direct experimenteel bewijs — in plaats van computationele voorspellingen — voor het additieve effect van deze combinatie bij leverkanker. Deze kenmerken onderscheiden dit werk van eerdere rapporten over combinatietherapie die zijn uitgevoerd bij andere tumortypen of met behulp van andere experimentele modellen, in het bijzonder in de context van sorafenib-gebaseerde schema's.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Ethische goedkeuring is verleend door de Zhejiang University-Laboratory Animal Welfare and Ethics Review (Goedkeuringsnr. ZJU20250049).
Dieren en groepering
In totaal 40 vrouwelijke NOD/SCID-muizen, 4–5 weken oud met een gewicht van 18–20 g, werden gekocht bij een erkende commerciële leverancier (Licentienr. SCXK (Shanghai) 2013-0006) en gehuisvest in dierkamers van SPF-kwaliteit (specific pathogen-free). Alle dierprotocollen volgden de standaardrichtlijnen. Tijdens het experiment kregen de dieren onbeperkt toegang tot voedsel en water en werden ze in groepen (5 muizen/kooi) gehuisvest in een goed gecontroleerde SPF-kamer, waarbij de kamertemperatuur werd gehandhaafd op 22 ± 2 °C, een luchtvochtigheid van 50%–60% en een licht/donkercyclus van 12/12 u. De dieren kregen ad libitum voedsel en water, en hun lichaamsgewicht werd elke 2 weken gecontroleerd. Wanneer muizen aanhoudende pijn, cachexie, tumorzweren vertoonden, de tumoromvang een maximale dimensie van 2 cm bereikte, of wanneer er andere onomkeerbare gezondheidsproblemen optraden, werd euthanasie uitgevoerd via intraperitonele injectie van 0,45% pentobarbitalnatrium bij ≥150 mg/kg lichaamsgewicht, gevolgd door bevestiging van het staken van de ademhaling en hartslag, het verlies van de corneale reflex, of de toepassing van een secundaire fysieke methode indien nodig, in overeenstemming met de humane beëindigingscriteria goedgekeurd door de Dierethische Commissie. De steekproefomvang (n = 10 per groep) werd bepaald op basis van een poweranalyse uitgaande van een effectgrootte van 1,2 (afgeleid uit pilotexperimenten), α = 0,05 en β = 0,20 (80% power), plus een uitvaltoeslag van 20%. De procedures voor tumorimplantatie werden uitgevoerd vóór de toewijzing van de behandeling (zie hieronder voor de vestiging van de xenograft).
Na tumorimplantatie en bevestiging van de tumorname werden de muizen met behulp van een randomisatietabel willekeurig verdeeld over 4 groepen: de controlegroep, de sorafenibgroep, de gemcitabinegroep en de groep met een combinatie van sorafenib en gemcitabine, met 10 muizen (5 muizen/kooi) per groep, om het NOD/SCID-muistransplantatietumormodel te construeren. Omdat tumorgeweefsels tijdens het modelleringsproces kunnen leiden tot een slechte algemene conditie of zelfs de dood bij NOD/SCID-muizen, en aangezien statistische analyse doorgaans een effectieve steekproefomvang vereist, werden er ten minste 10 muizen per groep opgenomen. De willekeurige groepsindeling werd uitgevoerd door onafhankelijke technici en de kooien werden gelabeld; blindering werd niet toegepast tijdens de toediening van medicijnen of de tumormeting, wat een belangrijke beperking is. De overige weefselafname, biochemische en pathologische evaluaties werden allemaal uitgevoerd door geblindeerd laboratoriumpersoneel. De gegevens werden eveneens blind geanalyseerd door statistici die alleen toegang hadden tot gecodeerde bestanden totdat de statistieken waren voltooid en de gegevens waren ontblind. Alle dieren werden opgenomen in de uiteindelijke analyse. Voor beide geneesmiddelen werd de intraperitoneale route gekozen om systemische absorptie en een consistente biologische beschikbaarheid te waarborgen; de dosering één keer per dag was gebaseerd op eerdere farmacokinetische studies die aantoonden dat dit regime leidde tot aanhoudende plasmaconcentraties. De vehikelcontrolegroep kreeg een intraperitoneale injectie van 0,2 mL steriele normale zoutoplossing. In de sorafenibgroep werd 0,2 mL sorafenib (40 mg/kg) intraperitoneaal geïnjecteerd. In de gemcitabinegroep werd 0,2 mL gemcitabine (100 mg/kg) intraperitoneaal geïnjecteerd. Combinatiebehandelingsgroep: 0,2 mL van elk van 40 mg/kg sorafenib en 100 mg/kg gemcitabine werd intraperitoneaal toegediend. Elke groep kreeg dit één keer per dag gedurende 20 opeenvolgende dagen. Alle dieren werden opgenomen in de uiteindelijke analyse en geen enkele muis werd uit de studie uitgesloten. Er werd geen mortaliteit waargenomen in enige groep tijdens de behandelperiode van 20 dagen. Het schema en de doses werden gekozen op basis van gepubliceerde studies in hepatobiliaire kankermodellen. Er moet worden opgemerkt dat dagelijkse intraperitoneale toediening van gemcitabine toxiciteit kan veroorzaken. De lengte en breedte van de getransplanteerde tumoren werden dagelijks gemeten en het volume van de getransplanteerde tumoren werd berekend. Na 20 dagen werden de dieren geëuthanaseerd door cervicale dislocatie onder diepe anesthesie, en de getransplanteerde tumorgeweefsels werden gefixeerd in formaline. Het lichaamsgewicht werd elke 2 dagen gedurende de gehele studie gemeten. Muizen werden dagelijks gemonitord op klinische tekenen van toxiciteit, waaronder piloerectie, een gebogen houding, verminderde mobiliteit, diarree en lethargie. Serumbiochemie (bijv. alanine aminotransferase, aspartaat aminotransferase en creatinine) en histopathologisch onderzoek van belangrijke organen werden echter niet uitgevoerd. Daarom kan subklinische toxiciteit niet worden uitgesloten.
Medicijnen en reagentia
Sorafenib werd opgelost in 10% dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaard bij -20 °C. Voor gebruik werd de oplossing ontdooid en verdund tot een uiteindelijke DMSO-concentratie van minder dan 0,5%, wat geen effect had op de celgroei. Gemcitabine werd verkregen van een commerciële leverancier. Radioimmunoprecipitatie-assay (RIPA) lysisbuffer, thiazolylblauw, primaire antilichamen tegen glyceraldehyde-3-fosfaatdehydrogenase (GAPDH), ERK, p-ERK en VEGF, secundaire antilichamen, Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) high-glucose medium, foetaal runder serum en de HepG2-cellijn werden verkregen van commerciële leveranciers.
Sorafenib en gemcitabine zijn cytotoxische middelen. Alle procedures voor het bereiden en hanteren van geneesmiddelen moeten worden uitgevoerd in een aangewezen biologische veiligheidskabinet met het dragen van passende persoonlijke beschermingsmiddelen (labjas, nitrilhandschoenen en veiligheidsbril). DMSO, methanol, xyleen en andere organische oplosmiddelen die in dit protocol worden gebruikt, zijn gevaarlijk en moeten in een zuurkast worden gehanteerd om inademing of huidcontact te vermijden. De veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor alle reagentia moeten vóór gebruik worden geraadpleegd.
Celkweek
De HepG2-cellijn werd gereanimeerd en geënt in kweekflessen met 10 mL DMEM high-glucose medium (aanvullend met 10% foetaal runderserum, 100 U/mL penicilline-streptomycine en 4 mmol/L glutamine). De cellen werden geïncubeerd bij 37 °C in een bevochtigde incubator met 5% CO₂. Het kweekmedium werd elke 2 dagen vervangen en de cellen werden elke 4 dagen gepassaged om logaritmische groei te behouden. De HepG2-cellijn werd verkregen van een commerciële leverancier; onafhankelijke authenticatie van de cellijn (bijv. short tandem repeat-profilering) en mycoplasmatesten werden echter niet uitgevoerd in deze studie.
MTT-methode voor het bepalen van de remming van de proliferatiesnelheid
De 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-methode werd gebruikt om de remmingsgraad van de proliferatie door sorafenib en gemcitabine in de HepG2-cellijn te bepalen. Cellen in de logaritmische groeifase werden gedurende 2 minten gedigesteerd met 0,25% trypsine, waarna de digestie werd beëindigd door het toevoegen van een gelijk volume compleet medium. Na centrifugatie bij 1000 × g gedurende 10 min werden de cellen geresuspendeerd in compleet medium. De celdichtheid werd aangepast naar 1 × 105 cellen/ml, en 200 µL van de cel-suspensie werd in elke put van een 96-wellplaat gezaaid. Deze zaaidichtheid werd gekozen op basis van voorafgaande optimalisatie-experimenten waarin celdichtheden variërend van 5 × 103 tot 5 × 104 cellen/putje werden getest. De dichtheid van 2 × 104 cellen/putje resulteerden in een lineaire toename van de absorptie over 96 uur en hielden de confluentie onder de 80% aan bij het eindpunt, wat werd bevestigd door visuele inspectie onder een omgekeerde microscoop. Om ervoor te zorgen dat de MTT-metingen binnen het lineaire bereik bleven, werden bij elk tijdspuntstip pilotexperimenten uitgevoerd met controleputjes behandeld met het vehikel. Het medium werd elke 48 uur vervangen om nutriëntendepletie en accumulatie van metabole bijproducten te voorkomen. De confluentie werd dagelijks gemonitord met een omgekeerde microscoop. Na 96 uur bereikten de controleputjes ongeveer 75%–80% confluentie en werden er geen duidelijke tekenen van nutriëntendepletie waargenomen. Na celadhesie werd het medium verwijderd en werd het medium met het geneesmiddel toegevoegd. Een geneesmiddelvrij medium werd toegevoegd aan de onbehandelde controlegroep (vehikelcontrole voor in vivo experimenten). Het experiment werd onderverdeeld in een onbehandelde controlegroep, een sorafenib-groep, een gemcitabine-groep en een combinatiebehandelingsgroep. De doses sorafenib waren 1.5 µmol/L, 3 µmol/L, 4.5 µmol/Len 6 µmol/L, en de doses gemcitabine waren 5 µmol/L, 10 µmol/L, 15 µmol/Len 20 µmol/LDe doses sorafenib in combinatie met gemcitabine waren 1.5 µmol/L + 5 µmol/L, 3 µmol/L + 10 µmol/L, 4.5 µmol/L + 15 µmol/Len 6 µmol/L + 20 µmol/LDe cellen in elke groep werden gedurende 24 u, 48 u, 72 u en 96 u gekweekt. Na de kweek, 20 µL werd 5 mg/mL MTT aan elke put toegevoegd en werden de cellen 4 uur lang in een celincubator geïncubeerd. Het supernatant werd voorzichtig afgegoten en vervolgens 150 µL er werd DMSO toegevoegd aan elke well en de plaat werd 10 min geschud om het formazan volledig op te lossen, waarna de optische dichtheid (OD) van elke well werd gemeten bij 490 nm met een multifunctionele microplate-reader. Het experiment werd drie keer herhaald, waarbij elke groep vijf replica-wells bevatte. De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD van de drie biologische replica's. De remming van de celgroei (%) = (1 - OD experimentele groep /OD onbehandelde groep）× 100%. De interactie tussen de twee geneesmiddelen werd beoordeeld door de q-waarde, die is berekend met de formule: q = EAB / (EA + EB - EA × EB). Hierbij zijn EA en EB de inhibitiegraden van geneesmiddel A en B wanneer deze afzonderlijk worden gebruikt, en EAB is de inhibitiegraad wanneer de twee geneesmiddelen samen worden gebruikt. Wanneer q is groter dan 1,15, duidt dit op een synergistisch effect tussen de twee geneesmiddelen; 0,85–1,15 duidt op een additief effect; en q minder dan 0,85 duidt op een antagonistisch effect. De q-waardemethode is een eenvoudige screeningsmethode en is geen vervanging voor rigoureuzere synergie-analyses. Er zijn slechts enkele dosisparen met een vaste ratio getest, wat de robuustheid van de claim over synergie beperkt. Daarom is de term "synergie" verwijst in deze studie naar q > 1,15 bij specifieke dosiscombinaties en tijdspunten, en niet naar een gevalideerde additieve interactie over de volledige dosis-responsmatrix.
Western blot-analyse van de eiwitexpressie van ERK en p-ERK
Celkweek en de indeling van de experimentele groepen werden uitgevoerd zoals hierboven beschreven. Voor de detectie van ERK en p-ERK via Western Blotting bedroeg de dosis sorafenib 3 µmol/L; de dosis gemcitabine was 10 µmol/L; en de gecombineerde dosis was 3 µmol/L + 10 µmol/L. Na 72 u behandeling werden de cellen gelyseerd met RIPA-lysisbuffer en werd het totale eiwit uit elke experimentele groep geëxtraheerd. De eiwitconcentratie werd bepaald met de bicinchonininezuur-methode (BCA). Gelijke hoeveelheden eiwit (30 µg per lane) werden geladen en gescheiden via 10% sodium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) bij 120 V gedurende 90 min. Eiwitten werden overgebracht op polyvinylideenfluoride-membranen (PVDF, poriegrootte 0,45 µm) bij 300 mA gedurende 90 min bij 4 °C. Na blokkeren met 5% vetvrije melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met 0,1% Tween-20 (TBST) gedurende 1 u bij kamertemperatuur, werden de membranen overnacht geïncubeerd met primaire antilichamen bij 4 °C onder zachte agitatie. Na drie wasbeurten met TBST (elk 10 min) werden de membranen 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met secundaire antilichamen. Eiwitbanden werden gevisualiseerd met behulp van een enhanced chemiluminescence (ECL) substraat en gefotografeerd met een digitaal gel-beeldingsysteem. De belichtingstijden werden voor elk antilichaam geoptimaliseerd om verzadiging te voorkomen. Densitometrische kwantificering werd uitgevoerd met ImageJ-software via de gel-analysetool. Alle intensiteiten van de doeleiwitbanden werden genormaliseerd aan GAPDH als loading control, en de expressie van p-ERK werd verder genormaliseerd aan de totale ERK-expressie. Er werden geen aanvullende blokkeringsstappen uitgevoerd buiten de 5% vetvrije melk. Kwantificeringsresultaten werden weergegeven als fold change ten opzichte van de controlegroep, die op 1,0 werd gesteld. Elk experiment werd drie keer onafhankelijk herhaald. Representatieve immunoblots worden getoond.
Immunohistochemische detectie van VEGF-expressie in HepG2 xenograft-tumoren in NOD/SCID-muizen
Voor het vestigen van de xenograft: HepG2-cellen in de logaritmische groeifase werden geoogst door trypsinisatie, tweemaal gewassen met steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en resuspendeerd in serumvrij DMEM. In totaal 2 × 106 cellen in 0,2 mL serumvrij DMEM (zonder Matrigel) werden subcutaan geïnjecteerd in de rechter okselegaal (een gebied met een rijke bloedvoorziening) van elke NOD/SCID-muis met behulp van een 1 mL spuit om een subcutaan HepG2-xenograftmodel in NOD/SCID-muizen te vestigen. De tumorontwikkeling werd elke 2 dagen gecontroleerd. De grootte van de tumor werd elke twee dagen gemeten, en wanneer de tumordiameter 0,3–0,5 cm bereikte (ongeveer 7–10 dagen na injectie, gedefinieerd als het startpunt van de behandeling), werden de muizen willekeurig verdeeld over 4 groepen voor het experiment. De lengte (L) en breedte (W) van de subcutane xenograft werden elke dag gemeten met digitale schuifmaten, en het tumorvolume (V) werd berekend volgens de formule: V = (L × W2) / 2. Alle metingen werden uitgevoerd door een onderzoeker die niet op de hoogte was van de groepsindeling. Na 20 dagen werden de dieren geëuthanaseerd door cervicale dislocatie onder diepe anesthesie, en het xenograftweefsel werd gedurende 24 u bij kamertemperatuur gefixeerd in 10% neutraal gebufferde formaline en vervolgens in paraffine ingebed. Weefselcoupes (5 µm dik) werden gesneden met een rotatiemicrotoom en gemonteerd op met poly-L-lysine gecoate glasplaatjes. Voor immunohistochemie werden de coupes gedeparaffiniseerd in xyleen (drie keer wisselen, telkens 5 min) en gerehydrateerd via een reeks oplopend ethanol (100%, 95%, 70%, 50%; telkens 3 min). Antigeenherstel werd uitgevoerd door de coupes 15 min in een magnetron te verhitten in 10 mM natriumcitraatbuffer, gevolgd door 20 min afkoelen bij kamertemperatuur. Endogene peroxidase-activiteit werd geblokkeerd met 3% waterstofperoxide in methanol gedurende 10 min bij kamertemperatuur. Aspecifieke binding werd geblokkeerd met 5% normaal geiten serum in PBS gedurende 1 u bij kamertemperatuur. De coupes werden vervolgens overnight bij 4 °C in een bevochtigingskamer geïncubeerd met primaire anti-VEGF antistoffen (verdunning 1 : 200). Na het wassen met PBS (drie keer, telkens 5 min) werden de coupes 1 u bij kamertemperatuur geïncubeerd met een met mierikwortelperoxidase (HRP) geconjugeerd geiten anti-konijn secundair antilichaam (1 : 500). Het signaal werd gedetecteerd met behulp van 3,3′-diaminobenzidine (DAB) substraat. De coupes werden 30 s tegengekleurd met hematoxiline, gedehydrateerd, geklaard en met dekglas gemonteerd met een permanent montagemedium. Beeldbestemming werd uitgevoerd met een fluorescentie-inverted microscoop met brightfield-instellingen bij ×100 vergroting. Representatieve afbeeldingen worden getoond voor kwalitatieve illustratie.
Alle besmette tips, buizen en celkweekafval zijn verzameld als biologisch gevaarlijk afval en vóór verwijdering geautoclaveerd. Chemisch afval, inclusief drugbevattende oplossingen, DMSO, xyleen en methanol, werd verzameld in gescheiden, gelabelde afvalcontainers en afgevoerd volgens de lokale institutionele voorschriften voor gevaarlijk chemisch afval.
Statistische analyse
SPSS 19.0 software werd gebruikt voor de statistische analyse. Experimentele gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke biologische replica's voor in vitro experimenten, en als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van n = 10 muizen per groep voor in vivo experimenten. Voor vergelijkingen tussen twee groepen werden tweezijdig ongepaarde t-toetsen gebruikt. Voor vergelijkingen tussen meerdere groepen werd eenweg-variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door de post hoc-toets van Tukey gebruikt. p < 0,05, p < 0,01 en p < 0,001 werden gerapporteerd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Het remmende effect van sorafenib en gemcitabine op de proliferatie van HepG2-cellen
Sorafenib en gemcitabine remden de proliferatie van HepG2-cellen dosisafhankelijk, zoals weergegeven in Tabel 1. De combinatietherapie vertoonde significant hogere remmingspercentages op alle tijdstippen in vergelijking met monotherapie. MTT meet de metabole activiteit, wat correleert met het aantal cellen, maar meet proliferatie of cytotoxiciteit niet direct. Daarom moet de t...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Leverkanker heeft een hoge mortaliteitsgraad vanwege het sluipende begin, de snelle progressie en de weinige effectieve behandelingen3,15. Gevorderde leverkanker vertoont vaak resistentie tegen chemotherapie en bestraling, en huidige opties, waaronder chirurgische resectie en levertransplantatie, blijven onvoldoende15,16. De combinatie van twee of meer chemotherapeutische geneesmiddelen met verschillende ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
De auteurs hebben niets te verklaren.
De auteurs hebben geen dankwoord.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Digitaal gel-imagingsysteem | Bio-Rad Laboratories, Inc., VS | 1708280 | |
| DMEM medium met hoog glucosegehalte | HyClone, USA | SH30243.01 | |
| ERK konijn monoklonaal antilichaam | Santa Cruz, USA | sc-94 | |
| Foetaal runderserum | Zhejiang Tianhang Biotechnology Co., Ltd., China | 11011-8611/11011-8615 | |
| Inverteerde fluorescentiemicroscoop | Olympus, Japan | IX73 | |
| GAPDH konijn polyklonaal antilichaam | Santa Cruz, VS | sc-25778 | |
| Gemcitabine | Eli Lilly and Company | 95058-81-4 | |
| Geiten anti-konijn secundair antilichaam | Shanghai Shenggong Biological Engineering Co., Ltd., China | D111018 | |
| ImageJ-software | National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA | Versie 1.8.0_112 | |
| Microplatelezer | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | MK3 | |
| p-ERK konijn monoklonaal antilichaam | Santa Cruz, USA | 9106 | |
| Gekoelde centrifuge | Changsha Xiangyi Centrifuge Co., Ltd. | DL-5M | |
| RIPA-lysisbuffer | Biyuntian Biological Technology Research Institute, China | P0013B | |
| Rotatiemicrotoom | Leica, Duitsland | CM3050 | |
| Sorafenib | Bayer Company, Duitsland | 284461-73-0 | |
| Thiazolylblauw (MTT) | Sigma, USA | M5655 | |
| Drie-gasincubator | Thermo Fisher Scientific Inc., USA | 51026402 | |
| VEGF konijn monoklonaal antilichaam | BioLegend, USA | B199116 |
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.