Generatie van GABAerge neuronen uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen met behulp van doxycycline-induceerbare ASCL1/DLX2-expressie bij AAVS1

Samenvatting

Dit protocol beschrijft een methode om GABAerge neuronen te genereren uit menselijk geïnduceerde pluripotente stamcellen door doxycycline-induceerbare transgenen te integreren in de AAVS1 safe harbor locus. De stabiele, homogene transgenexpressie biedt een efficiënte methode voor directe differentiatie in GABAerge neuronen, terwijl transgen-silencing wordt beperkt, een veelvoorkomend probleem bij lentivirale benaderingen.

Samenvatting

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) bieden een ongekende kans om menselijke neurologische ziekten in vitro te modelleren. Betrouwbare generatie van gedefinieerde neuronale populaties, zoals gamma-aminoboterzuur (GABAerge) neuronen, is essentieel voor deze studies. Dit protocol beschrijft een robuuste methode om hiPSC's te differentiëren in GABAerge neuronen met behulp van een doxycycline-induceerbaar systeem. De benadering is gebaseerd op de stabiele integratie van transgenen die de transcriptiefactoren ASCL1 en DLX2 coderen in de safe-harbor adeno-geassocieerde virusintegratieplaats 1 (AAVS1.) locus via CRISPR/Cas9-gemedieerde knock-in. Deze gerichte integratie voorkomt de transgen-silencing die vaak wordt waargenomen bij willekeurige lentivirale integratie. Het protocol omvat het behoud van hiPSC's, het nucleofectieproces voor transgenintegratie, puromycineselectie om succesvol gemanipuleerde cellen te verrijken, en de stapsgewijze differentiatieprocedure. Bij inductie met doxycycline verlaten de gemanipuleerde hiPSC's snel de celcyclus, nemen ze neuronale morfologie over en drukken GABAerge lijnmarkers binnen 21 dagen tot expressie. Belangrijke stappen zijn neuro-inductie en daaropvolgende rijping met behulp van specifieke groeifactoren, evenals mogelijke benaderingen om de cellulaire adhesie tijdens de rijping te verbeteren. Deze gestandaardiseerde methode levert verrijkte populaties van geïnduceerde neuronen op die GABAerge afstammingsmarkers tot expressie brengen, wat een waardevol hulpmiddel biedt voor neurowetenschappelijk onderzoek en cellulaire modellering.

Inleiding

Menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) bieden een uniek platform om menselijke neurologische ziekten in vitro te modelleren. en om de complexe moleculaire mechanismen te onderzoeken die ontwikkeling en^degeneratie aandrijven. Deze technologie maakt het mogelijk om patiëntspecifieke cellulaire modellen te genereren om een breed scala aan aandoeningen te onderzoeken, variërend van vroege neuro-ontwikkelingsafwijkingen in syndromische ciliopathieën² tot subtiele epigenomische veranderingen waargenomen bij sporadische Alzheimerziekte³. Daardoor is gerichte differentiatie van hiPSC's een hoeksteen geworden van de moderne moleculaire neurowetenschap.

Om de nuances van menselijke neurologische processen effectief vast te leggen, is het genereren van zeer specifieke en zuivere neuronale subtypes essentieel. Zo zijn gedefinieerde neuronale populaties vereist om de specifieke transcriptierollen van eiwitten zoals MECP2 in menselijke neuronen⁴ te verduidelijken, of om de gerichte kwetsbaarheden van perifere sensorische neuronen voor virale infecties, zoals SARS-CoV-2⁵, te beoordelen. Bovendien is het construeren van complexe, fysiologisch relevante microomgevingen, zoals het integreren van functionele microglia in 3D-cerebrale organoïden, fundamenteel afhankelijk van de robuuste, voorspelbare generatie van verschillende neurale en gliale lijnen⁶. Onder deze subtypes zijn GABAerge neuronen van bijzonder belang vanwege hun cruciale remmende rol in het centrale zenuwstelsel en hun betrokkenheid bij diverse neurologische en psychiatrische aandoeningen⁷. Het algemene doel van deze methode is het bieden van een betrouwbaar, efficiënt en reproduceerbaar protocol voor de gerichte differentiatie van hiPSC's in geïnduceerde neuronen die GABAerge afstammingsmarkers uitdrukken. Traditionele gerichte differentiatieprotocollen voor GABAerge neuronen, die afhankelijk zijn van extrinsieke signaalmoleculen, kunnen tijdrovend en zeer variabel zijn en resulteren in heterogene celpopulaties⁸.

Om deze beperkingen te overwinnen, is transcriptiefactor-gemedieerde voorwaartse programmering naar voren gekomen als een krachtig alternatief⁹. Dit protocol gebruikt een doxycycline-induceerbaar expressiesysteem om de expressie van de proneurale transcriptiefactoren ASCL1 en DLX2¹⁰ aan te sturen. Door deze transgenen te richten op de adeno-geassocieerde virusintegratieplaats 1 (AAVS1.) safe-harbor locus met behulp van CRISPR/Cas9, omzeilt deze methode het veelvoorkomende probleem van transgen-silencing die geassocieerd wordt met willekeurige lentivirale integratie¹⁰. De donorconstructie bevat een fluorescerende reporter, zoals mCherry, om transgen-positieve cellen na selectie te monitoren. Deze strategie is bedoeld om meer homogene transgenexpressie te ondersteunen dan willekeurige integratiemethoden, hoewel expressiestabiliteit en differentiatiereproduceerbaarheid voor elke gemodificeerde lijn moeten worden gevalideerd. Deze gestandaardiseerde methode genereert verrijkte populaties van geïnduceerde neuronen die GABAerge afstammingsmarkers uitdrukken in ongeveer 21 dagen, een tijdsbestek korter dan traditionele kleinmolecuul-benadering ^8,10. Dit protocol is zeer geschikt voor onderzoekers die schaalbare, consistente neuronale populaties nodig hebben voor downstreamtoepassingen zoals high-content microscopie, single-cell transcriptomics of functionele fysiologische assays.

Protocol

WAARSCHUWING: Menselijke hiPSC-kweek moet worden behandeld als potentieel biologisch gevaarlijk materiaal volgens institutionele bioveiligheidsprocedures. Voer alle menselijke hiPSC-kweekprocedures uit in een gecertificeerde biologische veiligheidskast van klasse II met behulp van steriele techniek. Al het afval dat menselijke cellen, media die aan menselijke cellen zijn blootgesteld, en CRISPR/Cas9-plasmidemateriaal bevat, moet worden gedesinfecteerd volgens lokale bioveiligheidsrichtlijnen voordat het wordt afgevoerd. Doxycycline, puromycine, DMSO en andere chemische reagentia moeten met handschoenen en passende bescherming van ogen en huid worden behandeld, en afval moet worden afgevoerd volgens institutionele procedures voor chemisch afval. Basement membrane extract (BME) moet worden behandeld met een steriele techniek en vóór gebruik op ijs worden opgeslagen om voortijdige polymerisatie te voorkomen. Opslag van vloeibare stikstof en cryoviale behandeling moeten worden uitgevoerd met geschikte cryogene handschoenen, gezichtsbescherming en voorzichtigheid om koude brandwonden of een explosie van het buisje tijdens het ontdooien te voorkomen.

OPMERKING: Voor CRISPR/Cas9-gemedieerde bewerking en neuronale differentiatie moeten hiPSC-culturen voldoen aan vooraf gedefinieerde kwaliteitscontrolecriteria. Cellen moeten negatief zijn bevestigd voor mycoplasma, een normaal karyotype of acceptabel genomisch integriteitsprofiel vertonen, en robuuste expressie van pluripotentiemarkers behouden, waaronder OCT4, SOX2, NANOG, TRA-1-60 en/of SSEA4. De culturen moeten een typische compacte hiPSC-koloniemorfologie vertonen, met een hoge nucleaire-cytoplasmatische verhouding, duidelijke koloniegrenzen en minimale spontane differentiatie. Alleen actief prolifererende culturen binnen het aanbevolen passagebereik mogen worden gebruikt, en cellen mogen het door het laboratorium gedefinieerde maximale passageaantal, meestal onder passage 40, niet overschrijden, tenzij anders gevalideerd. Culturen die abnormale morfologie, overmatige spontane differentiatie, slechte groei, bevestigde besmetting of bewijs van genomische instabiliteit vertonen, moeten worden uitgesloten van bewerkings- en differentiatie-experimenten. Alle benodigde materialen voor dit protocol, inclusief mediarecepten, staan vermeld in de Materiaaltabel.

1. Bereiding van reagentia en kweekplaten

1. Bereid het vriesmedium voor door 40 mL knock-out serum vervanging (KOSR) en 10 mL dimethylsulfoxide (DMSO) te combineren in een 50 mL conische buis.
2. Homogeniseer het vriesmedium door tien keer omhoog en omlaag te pipetten. Bewaar de oplossing tot 1 maand op 4 °C.
3. Verdun het basementmembraanextract (BME) in Dulbecco's Modified Eagle Medium/F12 (DMEM/F12) medium bij een eindconcentratie van 80 μg/mL.
   OPMERKING: Controleer vóór verdunning de concentratie van de ontvangen BME-oplossing met behulp van het batchnummer op de website van de leverancier.
4. Voeg per put 1 ml van de verdunde BME toe aan een 6-put plaat. Zet de aandelen BME onmiddellijk terug naar 4 °C voor maximaal 1 maand.
5. Kantel de plaat zodat de oplossing gelijkmatig over het gehele oppervlak van de putten wordt verdeeld. Zorg ervoor dat er geen ongecoate plekken zijn.
6. Incubeer de plaat minimaal 30 minuten bij 37 °C voordat je hem gebruikt.
   OPMERKING: Er is geen maximale incubatietijd. Als je langer dan 1 dag incubeert, zorg er dan voor dat de DMEM/F-12 niet verdampt. De BME-oplossing die voor één put wordt gebruikt, kan slechts één keer worden hergebruikt om een tweede put te coaten. De manipulatie van BME bij kamertemperatuur moet kort zijn vanwege de snelle polymerisatie.

2. Onderhoud en doorgang van hiPSC's

OPMERKING: In dit protocol verwijst hiPSC onderhoudsmedium naar mTeSR plus. mTeSR plus is het aanbevolen medium voor routinematig onderhoud, passaging, herstel na nucleofectie en puromycineselectie.

1. Voer ongeveer elke 4–6 dagen hiPSC-passaging uit wanneer de cellen 60% samenvloeiing bereiken.
2. Aspiratief het kweekmedium uit de putten met behulp van een aspirerende pipet.
3. Voeg 1 ml ReLeSR toe aan de put en incubeer 30 seconden bij kamertemperatuur.
4. Aspireer het dissociatiereagens en incubeer de plaat 8 minuten bij 37 °C.
5. Voeg voorzichtig 1 ml hiPSC onderhoudsmedium toe met een 5 ml pipet. Verzamel de celsuspensie in een buis van 50 mL.
6. Meng 10 μL celsuspensie met 10 μL trypanblauw in een microcentrifugebuis. Laad 10 μL van het mengsel op een celteller-glijbaan om de levensvatbare celconcentratie te bepalen.
7. Aspiraat de BME-coating uit een eerder voorbereide put. Voeg 2 mL hiPSC onderhoudsmedium toe, aangevuld met een Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) remmer (Y-27632; 10 μM final).
8. Zaad 100.000 hiPSC's in de put, met als doel een levensvatbaarheid van >90%. Beweeg de plaat in een achtvormige beweging om een homogene verdeling van cellen te garanderen.
9. Incubeer de cellen bij 37 °C met 5%_CO2.
10. Na 24 uur vervang je het medium door 2 ml verse mTeSR plus medium zonder ROCK-inhibitor.
    OPMERKING: Een tijdelijke verandering in celmorfologie (celverlenging) wordt verwacht in aanwezigheid van de ROCK-inhibitor. Controleer of cellen hun karakteristieke morfologie terugkrijgen na het verwijderen.

3. Nucleofectie van hiPSC's

1. De cellen passeren wanneer de samenvloeiing ongeveer 60% bereikt.
   OPMERKING: In dit protocol komt ongeveer 60% confluence overeen met actief groeiende hiPSC-kolonies die iets meer dan de helft van het putoppervlak beslaan, met zichtbare ruimte tussen kolonies en minimale spontane differentiatie. Kolonies mogen niet overwoekerd, uitgebreid samengevoegd zijn of op het moment van nucleofectie dichte, meerlaagse centra vertonen.
2. Zorg ervoor dat het nucleofectieapparaat is ingeschakeld en dat het nucleofectiesupplement wordt toegevoegd aan de nucleofectieoplossing P3. Maak een ijsemmer klaar.
3. Voeg 110 μL van de nucleofectieoplossing P3 toe aan een microcentrifugebuis die op ijs is geplaatst.
4. Voeg 1 μg van het CRISPR/Cas9-plasmide en 1 μg van het donorplasmide met de doxycycline-induceerbare ASCL1-P2A-DLX2. cassette, fluorescentiereporter en puromycine-resistente cassette toe aan de buis. Meng voorzichtig zonder bellen toe te voegen.
5. Bereid de bestemmingsplaat voor door de BME uit twee gecoate putten te aspireren. Voeg 2 mL hiPSC-onderhoudsmedium met een ROCK-remmer toe aan elke put en incubeer de plaat bij 37 °C.
6. Dissocieer hiPSC's bij 60% confluentie van een put van een 6-wellplaat zoals beschreven in stappen 2.2 tot 2.5. Breng de suspensie over in een steriele buis en centrifugeer 5 minuten op 500 x g bij kamertemperatuur.
7. Verwijder het supernatant en suspendeer de celpellet opnieuw in de 110 μL nucleofectieoplossing P3 die de plasmiden bevat. Pipetteer voorzichtig om bellenvorming te voorkomen.
8. Overbreng 100 μL van de celsuspensie naar een nucleofectiecuvet die op ijs wordt geplaatst.
9. Plaats de cuvette in het nucleofectorapparaat en voer het CB-150-programma uit voor hiPSC's.
10. Haal de cellen onmiddellijk terug met een plastic Pasteur-pipet. Breng gelijke volumes van de celsuspensie over in de twee eerder voorbereide putten.
11. Verdeel de cellen met een achtvormige beweging en incubeer bij 37 °C.
12. Na 24 uur vervang je het medium door mTeSR plus medium zonder ROCK-remmer. Controleer de efficiëntie van de nucleofectie door fluorescentie te observeren indien van toepassing.

4. Antibioticaselectie

VOORZICHTIG: Puromycine is giftig. Behandel met passende persoonlijke beschermingsmiddelen en voer afval af volgens de richtlijnen van de instelling.

OPMERKING: Bepaal voordat je bewerkte hiPSC's selecteert de optimale puromycineconcentratie voor elke hiPSC-lijn. Zaad onbewerkte hiPSC's bij 100.000 cellen per put in een BME-gecoate 6-wellplaat in een hiPSC-onderhoudsmedium aangevuld met ROCK-inhibitor. Na 24 uur vervang je het medium door een nieuw hiPSC-onderhoudsmedium met puromycine op 0, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 en 1,5 μg/mL. Vervang dagelijks het puromycine-bevattende medium en monitor de celmorfologie en overleving met brightfield-microscopie gedurende 5 dagen. De geselecteerde concentratie moet alle niet-bewerkte hiPSC's binnen 3–5 dagen elimineren, terwijl overmatige toxiciteit wordt geminimaliseerd. In dit protocol is de optimale puromycineconcentratie typisch 0,4–0,6 μg/mL.

1. Wacht 3 passages na de nucleofectie, meestal ongeveer 1–2 weken afhankelijk van herstel en groeisnelheid, om rekening te houden met het verlies van niet-geïntegreerde plasmiden voordat de selectie begint.
2. Voer een celpassage uit en zaad 100.000 cellen per put.
3. Na 24 uur voeg puremycine toe bij de concentratie bepaald door de killcurve, meestal 0,4–0,6 μg/mL.
4. Houd de puromycineselectie vast gedurende de vooraf bepaalde duur, meestal ongeveer 5 dagen.
5. Valideer de geselecteerde populatie met fluorescentiemicroscopie of flowcytometrie om het aandeel rapporterende positieve cellen te schatten.
   OPMERKING: Ga alleen door met gepoolde populaties die grofweg-homogene verslaggeverexpressie vertonen, bij voorkeur >80–90% verslaggever-positieve cellen. Als de expressie van de verslaggever mozaïek blijft, breid dan de selectie uit, herhaal verrijking, of overweeg klonale isolatie vóór differentiatie.
6. Bevestig correcte AAVS1. targeting via junction PCR voordat je neuronale differentiatie start.
7. Wanneer rigoureuze validatie vereist is, verifieer dan PCR-producten met Sanger-sequencing en beoordeel het transgenkopienummer met qPCR, ddPCR of een andere geschikte kopienummerassay.
8. Evalueer willekeurige integratie met behulp van PCR-gebaseerde assays voor plasmid-backbonesequenties of bredere genoom-brede integratieanalyse, afhankelijk van de beoogde downstream-toepassing.
9. Bevestig dat de geselecteerde hiPSC-populatie mycoplasma-negatief blijft, de typische hiPSC-koloniemorfologie behoudt en een robuuste groei behoudt na puromycineselectie.
10. Herbeoordeel genomische integriteit door middel van karyotypering, SNP-array of een andere gevalideerde assay, vooral wanneer bewerkte cellen worden gebruikt voor ziektemodellering, functionele assays of langetermijnstudies.
11. Beoordeel potentiële CRISPR/Cas9 off-target effecten door gerichte sequencing van voorspelde off-target locaties of, indien nodig, bredere genomische benaderingen.
    OPMERKING: Gebruik geen culturen voor differentiatie als ze abnormale morfologie, slechte herstel na selectie, persistente expressie van mozaïekreporters, bevestigde genomische afwijkingen of mislukte AAVS1-integratie vertonen. In dit protocol worden geselecteerde gemodificeerde hiPSC's gebruikt als een gepoolde populatie en kunnen ze worden gecryoppreserve vóór doxycycline-inductie, zodra de expressie van de reporter, AAVS1. Targeting, morfologie en groei zijn gevalideerd. Cryopreservatie na doxycycline-inductie of tijdens neuronale rijping maakt geen deel uit van de standaardworkflow en moet empirisch worden gevalideerd vóór gebruik.

5. Differentiatie in GABAerge neuronen

1. Bereid het benodigde aantal BME-gecoate putten voor. Let op dat één goed ingezaaide op dag 0 één put met GABAerge neuronen oplevert.
2. Bereid 6,9 mL neuro-inductiemedium per put voor, en vul dit aan met doxycycline (1 μg/mL). Neem een overtollig volume van 15% op om verdampings- of pipetfouten te compenseren.
   OPMERKING: Doxycycline wordt gebruikt bij een uiteindelijke concentratie van 1 μg/mL, beginnend op dag 0, en wordt gehandhaafd gedurende de differentiatie en rijping. Bij elke mediumwissel wordt een vers doxycycline-bevattend medium bereid om een consistente transgeninductie te behouden. Deze dosis werd gekozen omdat het robuuste rapportageexpressie en efficiënte neuronale conversie in onze handen produceerde. Een formele doxycycline-dosisrespons werd in dit protocol niet uitgevoerd; daarom kunnen laboratoria die de methode aanpassen empirisch 0,1–2 μg/mL doxycycline testen als transgeninductie suboptimaal lijkt.
3. Op dag 0 dissocieer je de gemodificeerde hiPSC's en zaad je 200.000 cellen in de voorbereide BME-gecoate wells. Incubeer bij 37 °C.
4. Op dag 1, 2 en 3 aspireer je het medium en voeg je 2 ml vers neuro-inductiemedium toe met doxycycline.
   OPMERKING: Vanaf dag 3 zou de celgroei aanzienlijk moeten afnemen en kunnen dendritische structuren beginnen te verschijnen. Als experimentele bevestiging van celcyclusuitgang nodig is, kan Ki-67 immunokleuring of EdU/BrdU-incorporatie worden uitgevoerd op dag 3–4.
5. Bereid op dag 4 een neuro-rijpingsmedium voor met hersen-afgeleide neurotrofe factor (BDNF), gliacellijn-afgeleide neurotrofe factor (GDNF) en neurotrofine-3 (NT-3), elk met een uiteindelijke concentratie van 10 ng/mL, doxycycline bij 1 μg/mL en PluriSln bij 20 μM.
6. Aspireer het neuro-inductiemedium. Voeg voorzichtig druppel voor druppel 2 ml van het neuro-rijpingsmedium toe langs de wand van de put om te voorkomen dat de nieuw gevormde neuronen worden verstoord.
7. Op dag 7 aspireer je het medium en voeg je voorzichtig 2 mL neuro-rijpingsmedium toe dat de neurotrofinen en doxycycline bevat, maar de pluripotente celoverlevingsremmer weglaat.
8. Voor langdurig onderhoud vervang je het neuro-rijpingsmedium volledig elke 3 tot 4 dagen, waarbij de frequentie wordt aangepast aan de celdichtheid.
   OPMERKING: Dag 21 is het standaardeindpunt voor het beoordelen van de GABAerge neuronale identiteit. Op dag 21 zouden cellen GABAerge neuronale kenmerken moeten vertonen, waaronder DLX1.expressie, en hun axonale netwerken blijven rijpen. Een zaaidichtheid van 200.000 cellen per put werd empirisch geselecteerd om goed verspreide kolonies te produceren, terwijl overbevolking en celdood door rijping werden voorkomen. Dichtheden van 150.000–300.000 cellen/put zijn compatibel, waarbij lagere dichtheden worden geprefereerd voor morfologie en hogere dichtheden voor materiaalterugwinning. Om loslating te verminderen, voer u vaker half-medium wisselingen uit met een 1.000 μL pipet bij lage debiet zonder de plaat te kantelen. Indien nodig kunnen cellen één keer worden herplateerd na de 3-daagse doxycycline-inductie, vóór de toevoeging van het rijpingsmedium, met behulp van verbeterde coatings zoals poly-L-lysine/laminine of laminine-521. Verdere overlijden na het begin van de rijping moet worden vermeden.
9. Kulturen kunnen na dag 21 worden onderhouden voor langdurige rijping als netwerken verbonden, levensvatbaar en vrij van zich voortplantende hiPSC-achtige kolonies blijven. Na dag 21 voert u elke 3–4 dagen half-medium veranderingen uit met een vers neurorijpingsmedium dat doxycycline en neurotrofische factoren bevat.
   OPMERKING: Gebruik culturen voor downstream assays zodra de neuronale morfologie en neurietnetwerken stabiel zijn, loskoppeling minimaal is en er geen ongedifferentieerde kolonies zichtbaar zijn. In onze handen worden culturen meestal gebruikt tussen dag 21 en dag 35.

Resultaten

Succesvolle toepassing van dit protocol resulteert in een verrijkte populatie van geïnduceerde neuronen met GABAerge moleculaire kenmerken. De strategie is gebaseerd op gerichte invoeging van een doxycycline-induceerbare ASCL1-P2A-DLX2-cassette in de AAVS1-locus (Figuur 1A). Na selectie van gemodificeerde hiPSC's wordt doxycycline-inductie gebruikt om GABAerge neuronale differentiatie te stimuleren, zoals weergegeven in de tijdlijn...

Discussie

De succesvolle generatie van GABAerge neuronen is sterk afhankelijk van verschillende kritieke stappen binnen dit protocol. Het handhaven van hoogwaardige, ongedifferentieerde hiPSC's is van groot belang; Spontane differentiatie vóór nucleofectie vermindert de integratie-efficiëntie en de downstream neuronale zuiverheid⁸ drastisch. Bovendien is nauwkeurige bepaling van de puromycine-killcurve essentieel om volledige eliminatie van niet-geïntegreerde cellen te waar...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
4D-Nucleofector™ Core Unit	Lonza	AAF-1002B	Voor elektroporatie/nucleofectie van hiPSC's.
6-well culture plates	Sarstedt	83.3920300	Op weefsel gekweekte platen voor het onderhoud en de differentiatie van hiPSC's.
BDNF (Brain-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78005	Recombinant humaan eiwit voor neuronale rijping; bereid volgens de instructies van de fabrikant en gebruik bij een eindconcentratie van 10 ng/mL.
Cell counter (Countess)	Thermo Fisher Scientific	C10283	Gebruikt voor celtelling.
Centrifuge	VWR	76468-134	Voor het pelletten van cellen.
CO2 incubator	Thermo Fisher Scientific	Heracell VIOS 160i of equivalent	Celcultuurincubator die 37 °C, bevochtigde atmosfeer en 5% CO2 handhaaft.
Cryotubes	Thermo Fisher Scientific	5000-0020	Steriele cryogenes flessen voor het invriezen van hiPSC's; equivalent extern draadgebonden 1,8–2,0 mL cryoflessen mag worden gebruikt.
Cultrex UltiMatrix Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract	Bio-Techne	BME001-05	Standaard BME-coatingmatrix gebruikt in het protocol. Controleer de lotspecifieke voorraadconcentratie uit het Bio-Techne-analysecertificaat en verdun in DMEM/F-12 tot 80 µg/mL werkconcentratie.
DMEM/F-12	Wisent	319-090-CL	Basismedium gebruikt voor het verdunnen van BME.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma-Aldrich	D2650	Cryoprotecteur gebruikt bij de bereiding van vriesmedium.
Donor plasmid: inducible ASCL1-P2A-DLX2 AAVS1 targeting cassette	Custom plasmid	Addgene accession in afwachting	Aangepast AAVS1 donorplasmide dat een doxycycline-induceerbare ASCL1-P2A-DLX2 cassette en selectie/reporter-elementen bevat. Zorg voor een plasmidekaart en volledige sequentie als aanvullend bestand of op verzoek.
Doxycycline hyclate	Sigma-Aldrich	D9891	Gebruikt om ASCL1-P2A-DLX2 expressie te induceren. Bereid steriele stockoplossing, verdeel in aliquoten, bescherm tegen licht, bewaar ingevroren en gebruik bij een eindconcentratie van 1 µg/mL.
Ethanol (70%)	Commercial Alcohols / Greenfield Global	P016EAAN	Voor sterilisatie binnen de biologische veiligheidskast; gebruik institutioneel goedgekeurde 70% ethanol of equivalent.
Fluorescence microscope	ECHO	Revolve R4	Microscoop gebruikt voor fasecontrast- en fluorescentiebeeldvorming van reporterexpressie en neuronale morfologie.
GDNF (Glial-Derived Neurotrophic Factor)	STEMCELL Technologies	78058	Recombinant humaan eiwit voor neuronale rijping; bereid volgens de instructies van de fabrikant en gebruik bij een eindconcentratie van 10 ng/mL.
hiPSC line PGP1	EditCo Bio	PGP1 human iPSC line	Commercieel verkrijgbare open-consent menselijke iPSC-lijn gebruikt in dit protocol; noteer passagenummer en QC-status vóór bewerking en differentiatie.
Image-analysis software	ImageJ/Fiji	Open-source; versie die wordt gebruikt, moet worden gerapporteerd	Voor fluorescentiekwantificering en representatieve beeldverwerking.
KnockOut™ Serum Replacement (KOSR)	Thermo Fisher Scientific	10828028	Gebruikt bij de bereiding van vriesmedium.
Laminin-521	STEMCELL Technologies	200-0117	Optionele troubleshooting reagent alleen. Niet onderdeel van het standaardcoatingprotocol; kan worden gebruikt als alternatief of dubbelcoatingmatrix als neuronale loslating aanhoudt.
Liquid nitrogen dewar	Thermo Fisher Scientific	Locator 6 Plus of equivalent	Langdurige opslag van ingevroren hiPSC's in vapor-fase of vloeibare stikstof volgens institutionele cryogeen veiligheidsprocedures.
Mr. Frosty™ Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	Voor gecontroleerd temperatuurverlagingsvriesproces van cellen bij -80 °C.
mTeSR™ Plus	STEMCELL Technologies	100-0276	Feeder-vrij onderhoudsmedium voor hiPSC's.
Neuro-induction medium	STEMCELL Technologies	08582	Commercieel neuro-inductiemedium gebruikt voor vroege neuronale inductie.
Neuro-maturation base medium (BrainPhys™ Neuronal Medium)	STEMCELL Technologies	05790	Basismedium voor neuronale rijping; suppleteer met BDNF, GDNF, NT-3, doxycycline en PluriSln-1 zoals beschreven in het protocol.
NT-3 (Neurotrophic Factor 3)	STEMCELL Technologies	78074	Recombinant humaan eiwit voor neuronale rijping; bereid volgens de instructies van de fabrikant en gebruik bij een eindconcentratie van 10 ng/mL.
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector™ X Kit	Lonza	V4XP-3024	Kit met oplossing P3 en cuvettes voor hiPSC nucleofectie.
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15140122	Optioneel antibioticum om het risico op bacteriële contaminatie te verminderen.
Plasmocin™ prophylactisch	InvivoGen	ant-mpp	Optioneel antibioticum om mycoplasmacontaminatie te voorkomen.
PluriSIn-1	STEMCELL Technologies	72822	Pluripotente celoverlevingsremmer om ongedifferentieerde hiPSC's te elimineren; bereid stock volgens de instructies van de fabrikant en gebruik bij een eindconcentratie van 20 µM.
Puromycin Dihydrochloride	Thermo Fisher Scientific	A1113803	Antibioticum gebruikt voor selectie; bereid steriele stockoplossing, verdeel in aliquoten, bewaar ingevroren en bepaal de eindwerkconcentratie door een killcurve, typisch 0,4–0,6 µg/mL.
pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9 AAVS1 gRNA plasmid	Addgene	85802	CRISPR/Cas9 plasmid gebruikt voor AAVS1 targeting; vermeld de AAVS1 gRNA-sequentie in de plasmidekaart of aanvullende informatie.