Een op ferric ammonium citraat gebaseerd model van ijzeroverbelasting met ferroptose-geassocieerde uitlezingen in C2C12-myoblasten

Samenvatting

Hier presenteren we een snel ijzeroverbelastingmodel op basis van ferric ammoniumcitrat in C2C12-myoblasten dat ijzerbelasting, ferroptose-geassocieerde moleculaire veranderingen en vroege ferrostatine-gevoelige levensvatbaarheid veroorzaakt.

Samenvatting

Ferroptose is een ijzerafhankelijke vorm van gereguleerde celdood die betrokken is bij veroudering en degeneratieve ziekten. We hebben eerder vastgesteld dat verouderde spierstamcellen intracellulair ijzer ophopen en ferroptotisch sterven bij activatie. Hier beschrijven we een eenvoudig in vitro model dat ferricammoniumcitraat gebruikt om ijzeroverbelasting te genereren in muisachtige C2C12-myoblasten. De behandeling met ferricammoniumcitraat verhoogde de intracellulaire ijzerbelasting, zoals blijkt uit verhoogde ferritine-zware en lichte keten transcripten, verhoogd ferritine-eiwit en versterkte signalen van een levende-cel labiele ijzerkleurstof. Blootstelling aan ferricammoniumcitraat (FAC) veroorzaakte ook moleculaire veranderingen die geassocieerd zijn met ferroptose, waaronder verhoogde expressie van Slc40a1 en Hmox1 en een verminderd glutathionperoxidase 4-eiwit. De FAC-geassocieerde afname van glutathionperoxidase 4 werd gedeeltelijk teruggedraaid door deferoxamine. Na 12 uur verminderde het cytotoxische ferric ammoniumcitraat de levensvatbaarheid van de cel, en dit effect werd gered door ferrostatine-1, wat overeenkomt met een ferroptose-gevoelige component van celdood. Op latere tijdstippen beperken verhoogde variabiliteit en een verminderd assay-dynamisch bereik de interpreteerbaarheid van levensvatbaarheidsmetingen. Dit protocol biedt dus een snel en schaalbaar model van ijzerbelasting door ferricammoniumcitraat, dat kan worden gebruikt om ferroptose-geassocieerde responsen te bestuderen en ijzer- of ferroptose-modificerende interventies in spiercellen te testen.

Inleiding

Ferroptose is een vorm van gereguleerde celdood (RCD), moleculair verschillend van andere RCD's. Het werd voor het eerst ontdekt met erastine, een dodelijk klein molecuul dat selectief is voor RAS (rattensarcoom), en waarvan werd aangetoond dat het niet-apoptotische celdood^veroorzaakt. In hun baanbrekende werk beschreven Dixon et al. het mechanisme als ijzerafhankelijk, en zo bedachten zij de term ferroptosis, wat "val (dood) door ijzer¹" betekent. Moleculair gezien presenteert ferroptose zich als overmatige ijzerophoping, verhoogde lipideveroxidatie en een ophoping van reactieve zuurstofcomponenten, wat leidt tot celdood². Het is uniek te onderscheiden van oxidatieve stress en andere vormen van RCD door zijn onafhankelijkheid van caspase-activatie, een kenmerk van apoptose, en het ontbreken van fosforyler-receptorinteractieve eiwitkinase 3 (RIPK3) en gemengde lijn-kinase domeinachtige pseudokinase (MLKL), die alleen voorkomen bij necroptose³. Bovendien kan ferroptose ook worden verlicht met de lipidenantioxidanten ferrostatine-1 en liproxstatine-1, en de ijzerchelator deferoxamine⁴. Hoewel ferroptose vergelijkbaar is met andere typen RCD doordat ze uiteindelijk allemaal tot cellendood leiden, maakt de presentatie het mechanistisch verschillend van andere vormen van RCD.

De studie van ferroptose heeft het afgelopen decennium aan populariteit gewonnen, voornamelijk dankzij voortdurende inspanningen in het veld om nieuwe kenmerken te identificeren en nieuwe hulpmiddelen te ontwikkelen om de onderliggende mechanismen en bijdrage aan menselijke ziekten te bestuderen⁵. Recent bewijs suggereert dat ijzeroverbelasting en ferroptose onderbelichte bijdragers zijn aan leeftijdsgebonden zwakte en sarcopenie ^6,7,8. We hebben onlangs aangetoond dat verouderde spierstamcellen (MuSC's) uniek vatbaar zijn voor ferroptotische dood als gevolg van chronische ontsteking, waarbij een antioxidatief genetisch programma wordt onderdrukt door epigenetische stilte⁹. We ontdekten dat oudere MuSC's een abnormale hoeveelheid intracellulair elementair ijzer ophopen, ongeveer 30 keer hoger dan hun volwassen tegenhangers. Hoewel ferroptosis in verband is gebracht met ziekten in meerdere organen en weefsels—voornamelijk die gerelateerd aan veroudering—blijft de fysiologische rol ervan onduidelijk en vereist verder onderzoek.

Hoewel onze vorige studie liet zien dat verouderde MuSC's gevoelig zijn voor ferroptotische dood bij activatie, moet de specifieke bijdrage van ijzerbelasting aan dat fenotype nog worden opgehelderd. Hier stellen we een eenvoudig ijzeroverbelastingmodel vast in C2C12-myoblasten behandeld met ferricammoniumcitraat (FAC) en vragen we of een overschot aan ijzer voldoende is om ferroptose-geassocieerde moleculaire veranderingen en ferrostatine-gevoelige levensvatbaarheidsverlies te veroorzaken. C2C12-cellen bieden een onderhoudsarm, schaalbaar en gemakkelijk beschikbaar muisspier-voorlopersysteem¹⁰. We verwachten dat deze aanpak een praktisch platform zal bieden voor het bestuderen van door ijzer aangedreven stressreacties in spiercellen en voor het testen van interventies die ferroptose-geassocieerde fenotypes veranderen.

Protocol

1. Bereiding van C2C12-cellen

1. Ontdooicellen
   OPMERKING: Alle cellulaire kweekstappen moeten worden uitgevoerd in een steriele bioveiligheidskast.
   1. Bereid een kegelvormige buis voor met 9 mL warm volledig medium (Dulbecco's aangepaste Eagle-medium met hoge glucose en pyruvaat + 10% foetaal rundserum + 1% pen/streptokokken).
   2. Ontdooi één buisje bevroren C2C12-cellen (~1 miljoen) door 800 μL voorverwarmd volledig medium toe te voegen aan het flesje van het hoofdmediamateriaal. Pipet langzaam omhoog en omlaag.
   3. Zodra het medium dat aan het ontdooiflesje is toegevoegd koud is, verwijder je het en voeg je het toe aan de kegelvormige buis. Vervang het met hetzelfde volume warm medium uit de buis. Blijf pijpen op en neer en wissel het medium totdat de bevroren cellen weer zijn opgehangen.
   4. Pipeper de inhoud van het flesje in de conische buis met media. Draai om om te mengen en voeg de inhoud toe aan een 10 cm groot, met celkweek behandeld schaaltje. Broei 4 uur op 37 °C.
   5. Controleer de cellen onder een microscoop om zeker te zijn dat ze zich hebben vastgezet. Vastgehechte cellen lijken langwerpig, terwijl zwevende cellen cirkelvormig zijn en bewegen wanneer de plaat beweegt.
      OPMERKING: Als de platen gezond zijn, zouden de meeste ervan gehecht moeten zijn.
   6. Aspiraat van het medium om dode cellen en vuil te verwijderen. Vervang door 10 mL warm volledig medium en breng het terug naar de broedmachine. Laat het een nacht incuberen, of totdat de plaat 80% confluentie bereikt.
2. Het zaaien van C2C12-cellen voor ijzerbehandeling
   1. Zodra de gewenste confluentie is bereikt, aspireer je van het celmedia. Voeg 2 mL PBS druppelgewijs toe aan de plaat, zodat het hele oppervlak bedekt is; aspireren.
   2. Voeg 2 ml 0,25% trypsine toe aan de cellen. Incubeer bij 37 °C gedurende 5–10 minuten, of totdat de cellen loskomen. Eenmaal losgekoppeld lijken de cellen cirkelvormig onder een microscoop, en de trypsine en celsuspensie zullen troebel en verdik zijn.
   3. Neutraliseer de trypsine door 8 mL warme complete DMEM toe te voegen. Gebruik een serologische pipet om de oplossing grondig te mengen en de plaat af te wassen. Breng de celsuspensie over naar een kegelvormige buis.
   4. Draai de buis voorzichtig 3–5 keer om. Verwijder het juiste volume en tel de cellen met de voorkeursmethode (celteller, hemocytometer, enz.).
   5. Maak een suspensie van cellen die voldoende is om het gewenste aantal putten/platen voor n = 3 voor elke conditie te zaaien: 10 cm plaat (voor western blot): 100.000 cellen/plaat, 6-put plaat (voor qPCR): 50.000 cellen per put, 96-put plaat (voor labiel ijzer en luminescentiekleuring): 1.000 cellen per put. Laat de cellen 's nachts incuberen bij 37 °C.
3. Ijzerbehandeling aanbrengen op zaadcellen
   1. Voeg op de dag van de behandeling ferrikammoniumcitraat toe (FAC; formule = C₆H₁₁FeNO₇⁺³; MW = 265 g/mol) om DMEM te voltooien bij de volgende concentraties onder steriele omstandigheden: Ernst: 180 μM (0,0477 mg/mL), Cytotoxisch: 1.800 μM (0,477 mg/mL).
      OPMERKING: Overweeg ook controles toe te voegen, waaronder, maar niet beperkt tot, het gemiddeldeferoxamine + 150 μM deferoxamine (een ijzerchelator), het gezamenlijk + 150 μM deferoxamine, en/of het geweer + RSL3 (een ferroptose-inducer; positieve controle). Daarnaast is het vermeldenswaard dat DMEM bij de basislijn een kleine hoeveelheid ijzer (III) nitraatnonahydraat, een bron van ferri-ijzer, kan bevatten. De lezer moet de hierboven aanbevolen FAC-concentraties interpreteren als aanvulling op eventueel bestaand ijzer dat al aanwezig is in het voertuigkweekmedium.
   2. Draai om te mengen totdat de FAC oplost in volledige media.
      OPMERKING: Omdat FAC wateroplosbaar is, is geen DMSO of extra oplosmiddel nodig. Toevoeging van FAC kan de pH van de oplossing veranderen, dus als er een drastische kleurverandering in het medium wordt waargenomen, wordt aanbevolen de pH te meten om de levensvatbaarheid van cellen te waarborgen wanneer behandeld medium aan de kweek wordt toegevoegd.
   3. Aspireer het medium van de cellen. Voeg hetzelfde volume aan ijzeraangevuld volledig medium toe aan de behandelingsomstandigheden, en onbehandeld volledig medium aan de voertuigputten/platen. Incubeer bij 37 °C gedurende de gewenste behandelduur voordat je doorgaat met de gekozen assay: Labile ijzerassay: 2 uur FAC-behandeling, qPCR en western blot: 12–24 uur FAC-behandeling, luminescentie-assay: 12 uur FAC-behandeling.

2. qPCR

1. Isoleren van mRNA voor qPCR
   VOORZICHTIG: Het RNA-extractiereagens en chloroform vormen ademhalingsgevaren. Kun je hem gebruiken met een dampkap en het juiste PBM (labjas, chemisch resistente wegwerphandschoenen en oogbescherming).
   1. Aan de bank aspireer je media uit de cellen. Was cellen twee keer met steriele PBS en aspiraat grondig de resterende vloeistof.
   2. Voeg in een dampkap het RNA-extractiereagens toe aan de cellen in de volgende volumes: 6-wellplaat: 250 μL/put, 10 cm schotel: 1 mL/schotel.
   3. Werk op ijs in de afzuigkap, gebruik een celschraper om gelyseerde cellen voorzichtig af te schrapen. Zorg ervoor dat je alle delen van de plaat grondig schraapt om het RNA-resultaat te maximaliseren.
   4. Pipet het lysaat in steriele, voorgekoelde, RNAse-vrije microfugebuizen. Laat ze 5 minuten op kamertemperatuur staan.
   5. Voor elke mL extractie-reagens voeg je 200 μL chloroform BINNEN EEN DAMPKAP TOE . Schud monsters krachtig gedurende minstens 30 seconden om het extractie-reagens en chloroform te combineren. Laat ze 5 minuten op kamertemperatuur staan.
      OPMERKING: Nadat de tijd is verstreken, vindt fase-scheiding plaats, met de heldere waterige fase (die het RNA bevat) bovenop.
   6. Centrifugemonsters gedurende 15 minuten bij 12.000 × g bij 4 °C. Label ondertussen nieuwe autoclaveerde buizen en voeg 500 μL (per mL extractie-reagens) isopropanol toe aan buizen op ijs.
   7. Breng alleen de waterige fase over in elke overeenkomstige buis. Meng voorzichtig door de omkering en laat het dan 10 minuten op kamertemperatuur staan. Als een lage opbrengst wordt verwacht, voeg dan 2 μL GlycoBlue toe om de pellet te visualiseren.
   8. Centrifugeer 15 minuten op 12.000 × g bij 4 °C.
      OPMERKING: Precipitated RNA kan zichtbaar zijn aan de onderkant van de buis.
   9. Giet voorzichtig overtollige isopropanol in een speciaal afvalbeker. Voeg 1 ml moleculaire, 100% ethanol druppelgewijs toe aan de buis, waarbij je oplet dat de pellet niet losraakt. Centrifugeer 5 minuten op 7.500 × g bij 4 °C.
   10. Giet ethanol eraf. Keer de buisjes om en laat de dop open boven een keukenpapier. Laat de pellet drogen tot het druppelvrij is (~15–30 min).
       OPMERKING: De pellet kan doorschijnend worden als GlycoBlue niet is toegevoegd.
   11. Suspendeer de pellet opnieuw in 25 μL steriel, RNAse-vrij water. Kwantificeer RNA-concentratie met UV-zichtbare spectrofotometrie. Normaliseer tot een uniforme concentratie over monsters die maximaal 1 μg RNA per 16 μL per monster toelaat.
2. CDNA synthetiseren voor qPCR
   OPMERKING: Voltooi alle stappen op het ijs om de RNA/cDNA-opbrengst te maximaliseren.
   1. Ontdooimonsters. Was het werkgebied met een RNAse-reiniger.
   2. Voeg 1 μg RNA van elk monster toe aan een bijbehorende PCR-stripbuis.
   3. Voeg 4 μL van het cDNA-mengsel toe aan elke buis. Voeg indien nodig steriel water toe om een totaalvolume van 20 μL te bereiken. Voer de mengsels uit onder de volgende thermocycler-parameters: 25 °C voor 5 minuten, 42 °C voor 30 minuten, 85 °C voor 5 minuten, 4 °C voor oneindig.
3. QPCR draaien
   1. Verdun cDNA 1:10 in steriel water voordat je verdere reacties uitvoert.
      OPMERKING: cDNA kan worden ingevroren bij -20 °C gedurende 1 maand of -80 °C gedurende 6 maanden.
   2. Verdun primers tot een concentratie van 10 μM met steriel water. Bevat de juiste controles en/of huishoudgenen (bijv. B2M, TBP1).
   3. Maak mastermixen voor elk huishoudelijk gen en gen van interesse, zodat er genoeg reactiemix is om elke DNA-conditie drievoud te laten draaien. Het hoofdmixrecept (per reactie) is als volgt: 2x PCR-mix: 10 μL, Forward primer (10 μM): 1 μL, Reverse primer (10 μM): 1 μL, Steriel water: 8 μL.
   4. Plaats een qPCR-reactieplaat in een 96-goed gekoeld metalen blok. Voeg 5 μL verdund cDNA toe aan elke monsterput en 20 μL van de reactie-mastermix aan elke put. Inspecteer elke put om te zorgen dat ze allemaal hetzelfde volume krijgen, bedek de plaat met een plaatsealer en gebruik een plat randgereedschap om de bellen glad te strijken.
   5. Centrifugeer de plaat op 1.000 × g en 4 °C gedurende 1 minuut. Plaats de plaat in een qPCR-machine en zorg dat deze in de juiste oriëntatie wordt geladen.
   6. Op de qPCR-software wijs je monster- en genidentiteiten aan voor elke put. Overweeg een sjabloon te maken als je van plan bent meerdere replicates met dezelfde setup te draaien.
   7. Voer het qPCR-programma uit (duur: ~1:36 uur) dat in Tabel 1 wordt weergegeven.
   8. Exporteer de resultaten als een . CSV of . XLSX-bestand. Als de gebruikte qPCR-machine de gebruiker toestaat te kiezen welke waarden geëxporteerd worden, controleer dan of de CT-waarden in het geëxporteerde bestand zijn opgenomen.
   9. Gebruik de gemiddelde CT-waarden voor elke aandoening en gen van interesse—vergeleken met de CT-waarden van de huishoudgenen in de overeenkomstige conditie—om de vouwverandering van elk gen te berekenen. Normaliseer de vouwverandering van de voertuigconditie naar 1,0.

3. Western blot

1. Eiwit isoleren voor western blot
   OPMERKING: Voer alle stappen op ijs uit om de eiwitopbrengst te maximaliseren.
   1. In een bioveiligheidskast aspireer je kweekmedia. Spoel de cellen af met genoeg koude PBS om de onderkant van de kweekplaat te bedekken. Aspireer, en dan herhaal.
   2. Voeg RIPA-buffer toe aangevuld met proteaseremmer- en fosfataseremmercocktails om afbraak van eiwitten te voorkomen. Gebruik 75 μL RIPA-oplossing voor het cultiveren in een 6-well plaat, of 200 μL RIPA-oplossing in een 10 cm plaat.
   3. Gebruik bij het werken op ijs een celschraper om de gelyseerde cellen voorzichtig van de plaat los te maken. Let extra goed op het verwijderen van cellen uit alle delen van de plaat, inclusief de randen. De oplossing zal helder en enigszins stroperig lijken.
   4. Pipeer de RIPA-cel suspensie in gekoelde microfugebuizen. Centrifugemonsters gedurende 10 minuten op maximale snelheid bij 4 °C. Breng het supernatant (het eiwitlysaat) over in een voorgekoelde buis. Gooi het pelletje weg.
   5. Kwantificeer de eiwitconcentratie door een Bradford- of BCA-assay uit te voeren. Normaliseer monsters tot 1 μg/μL in puur water met protease- en fosfataseremmers verrijkt op ijs.
   6. Verdun lysaten in Laemmli-buffer, zodat de uiteindelijke eiwitconcentraties uniform blijven over de monsters. Kook lysaten op 95 °C gedurende 10 minuten om het eiwit te denatureren. Voor het beste resultaat gebruik je direct na voorbereiding western blotting. Anders bewaar je eiwitten in Laemmli bij -20 °C op korte termijn (≤ 1 maand) of -80 °C op de lange termijn.
2. Acrylamide gels voorbereiden voor SDS-PAGE
   VOORZICHTIG: Acrylamide is een neurotoxine en mag alleen worden gebruikt met het juiste PBM (labjas, chemisch bestendige handschoenen en oogbescherming).
   1. Bepaal de eiwitten van belang en de grootte van deze eiwitten door de website van het bedrijf te raadplegen van de te gebruiken antistoffen. Gebruik de voorspelde grootte van het eiwit(ten) van belang om te bepalen welk percentage acrylamide de gel(en) moet zijn.
      OPMERKING: 10%-15% acrylamide werkt goed voor de meeste molecuulgewichten.
   2. Stel de gelgietstandaard en het frame samen volgens de instructies van de fabrikant.
   3. Voor de oplossende gel combineert u acrylamide, steriel water, 1,5 M Tris/HCl pH8,8 buffer en 10% natriumdodecylsulfaat in een conische buis in de juiste volumes voor het aantal en percentage acrylamide van de gels die bereid moeten worden, volgens Tabel 2, waarin de benodigde componenten voor 2 gels worden vermeld. Mix via inversie.
   4. Voeg een oplossing van 10% ammoniumpersulfaat toe en TEMED aan het mengsel toe. Invert om te mixen.
   5. Voeg de oplossing direct toe aan het gelgietframe en vul het totdat het volume van de oplossing net onder de hoeveelheid is die nodig is om de onderkant van de kam te bereiken als de kam wordt ingebracht.
   6. Voeg direct 100–200 μL pure ethanol druppelgewijs toe bovenop de hardingsgel. Als eiwitlysaten ontdooid en/of gedenatureerd moeten worden, voltooi dit dan tijdens deze incubatieperiode. Ontdooi eiwitten op ijs.
      OPMERKING: Dit verspreidt de oplossing zodat de gel niet ongelijkmatig uithardt.
   7. Als het gehard is, giet je de ethanol eraf. Voor de stapelgel combineert u acrylamide, steriel water, 0,5 M Tris/HCl pH6,8 buffer en 10% natriumdodecylsulfaat in een conische buis in de juiste volumes voor het aantal en het percentage acrylamide van de gels die bereid moeten worden, volgens Tabel 2, waarin de benodigde componenten voor twee gels worden vermeld. Mix via inversie.
   8. Voeg de 10% ammoniumpersulfaatoplossing toe en TEMED aan het mengsel. Mix via inversie.
   9. Voeg onmiddellijk de stapeloplossing toe aan het gelgietframe totdat het volume de bovenkant bereikt. Voeg de gelkam direct toe nadat je de gel hebt ingegoten. Laat het ~1 uur rusten of totdat de vorm van de putten niet verandert wanneer de gelgietstandaard licht wordt gewiegd.
3. Laadgels
   1. Vul de elektroforesekamer(s) met een run buffer tot de juiste vullijn voor het aantal gels dat gebruikt moet worden.
   2. Breng het gelframe met de kammen nog erin over naar de elektroforesekamer. Voeg meer loopbuffer toe aan de ruimte tussen de gels totdat dat reservoir vol is. Haal de kammen voorzichtig uit de ondergedompelde gels.
   3. Pipet 5–10 μL van de ladder in één put van elke gel.
   4. Pipet 5–20 μL geëxtraheerd eiwit en Laemmli-buffermonsters in elke put. Voeg 5–10 μL van een 1x Laemmli-buffer toe aan lege putten.
      OPMERKING: Het volume dat je toevoegt kan optimalisatie vereisen op basis van de prevalentie van de eiwit(zen) van belang en/of de effectiviteit van de antilichamen.
4. SDS-PAGE draaien
   1. Sluit de elektroforesekamer aan op een stroompakket. Ingesteld op 150 V gedurende 45 minuten.
      OPMERKING: Afhankelijk van de opstelling kan meer tijd of een hogere spanning nodig zijn voor volledige migratie, dus pas het indien nodig aan.
   2. Zodra het eiwit naar het uiteinde van de gel is gemigreerd (waar de gelcaster en het gelframe onderaan het apparaat samenkomen), stop dan de run en zet het power pack uit.
5. Voltooiing van eiwitoverdracht
   OPMERKING: Deze sectie is ontwikkeld met behulp van een apparaat voor snelle eiwitoverdracht.
   1. Giet de transferbuffer in een gelbak. Voeg een transferstapel toe, gevolgd door een nitrocellulosemembraan en nog een transferstapel aan de vloeistof om een sandwich te vormen met het membraan in het midden. Zorg ervoor dat de sandwichstapel volledig in de transferbuffer is ondergedompeld.
   2. Zet het apparaat voor snelle eiwitoverdracht in en kies het juiste protocol voor het aantal gels en de grootte van het eiwit(ten) van belang.
      OPMERKING: 1,3 A en 25 V voor 10 minuten zijn goed gebleken, maar optimalisatie kan nodig zijn.
   3. Verwijder de bovenste transferstack met een pincet en laat overtollig vocht in de geltray lopen. Verplaats de stapel naar het eiwitoverdrachtsapparaat en leg het zo plat en recht mogelijk; Gebruik een roller of kegelvormige buis om eventuele rimpels glad te strijken. Herhaal met het membraan.
   4. Gebruik een bot gereedschap om de bovenste en onderste helft van het gietframe voorzichtig te scheiden. Breng de gel over naar het membraan in het eiwittransferapparaat.
   5. Gebruik een tang om de resterende transferstack van de geltray te tillen. Laat overtollig vocht af, leg het dan bovenop het membraan en de andere stapel. Sluit de gelbox en start het programma.
6. Blokkeren en kleuren met antilichamen
   1. Open de geldoos en gebruik een tang om de bovenste stapel te verwijderen, til dan de gel eraf. Controleer of er banden van de ladder op het membraan zitten. Snijd het membraan zo dat het alleen het gewenste groottebereik omvat.
   2. Breng het membraan over in een schone vlekdoos. Voeg 5 ml blokkeringsbuffer toe, of genoeg om het membraan te bedekken. Blokk onder kamertemperatuur schudding gedurende 1 uur.
   3. Bereid je ondertussen voor op antilichaamkleuring door de aanbevolen concentratie primaire antilichamen(en) toe te voegen aan 5 mL 2% runderserumalbumine in een wasbuffer per membraan. Kleuring ook voor huishoudelijke eiwitten (bijv. GAPDH, β-actine).
   4. Haal het uit het roeren en giet het blokkeerdemper af. Voeg 5 ml van de primaire antistofoplossing toe. Broeden in het donker onder agitatie bij 4 °C 's nachts (~12–16 uur).
      OPMERKING: Voortaan moeten alle stappen in het donker worden voltooid.
   5. Was het membraan 3 x 5 minuten onder kamertemperatuur met een wasbuffer.
   6. Voeg de aanbevolen concentratie secundair antilichaam toe aan 5% BSA in wash buffer. Bereid 5 ml oplossing voor elk membraan.
   7. Giet overtollige wasbuffer eraf. Voeg 5 ml secundaire antistofoplossing toe aan elke blek. Broed 1 uur in het donker onder kamertemperatuur.
   8. Was het membraan 3 x 10 minuten onder kamertemperatuur met een wasbuffer. Beeld direct.
7. Het detecteren en analyseren van eiwitten van belang
   1. Beeld eiwitten op met het platform van keuze.
   2. Gebruik ImageJ of een ander platform om de intensiteit van elke band van interesse te kwantificeren.

4. Labiele ijzerkleurstoftest

1. Labiele ijzerkleurstof kleuring
   1. Voltooi volledige sectie 1, waarbij cellen worden gezaaid in een 96-wells plaat onder ijzerbehandeling gedurende 2 uur. Zorg ervoor dat er minstens drie putten zijn voor elke ijzerbehandelingsconditie, evenals negatieve (vehicle; kweekmedium + 150 μM van het ijzerchelator deferoxamine) en positieve (kweekmedium + 180 μM FAC + labiel ijzerkleurstof co-behandeling) controles.
   2. Bereid een voldoende verdunning van 1:200 voor van de 1 mM lageroplossing van labiele ijzerkleurstof in serumvrij medium om 200 μL per monsterput te bereiken.
   3. Aspireer via het kweekmedium. Was 2x met PBS.
   4. Voeg de kleuroplossing toe aan elke put en incubeer 1 uur bij 37 °C.
   5. Was één keer met PBS. Vervang door PBS.
   6. Maak beeld van de cellen met het ver-rode kanaal van een fluorescentiemicroscoop (646/662 nm). Sla de afbeeldingen op en exporteer ze als . TIF-bestanden.
2. Kleuringsanalyse
   1. Open de afbeeldingen in ImageJ.
   2. Open het meetvenster door op m te drukken. Binnen het meetvenster, onder Resultaten | Stel metingen in, selecteer gebied, geïntegreerde dichtheid en gemiddelde grijswaarde. Selecteer OK.
   3. Gebruik de Polygon Tool om rond elke cel in de afbeelding te tekenen. Druk op m na elke cel om de metingen aan het meetvenster toe te voegen.
   4. Zodra alle cellen in de afbeelding gekwantificeerd zijn, kopieer en plak je alle waarden in een spreadsheet. Gebruik het cirkelgereedschap om minstens drie achtergrondmetingen te maken in gebieden die niet door cellen worden bezet.
   5. Gebruik de volgende formule om de gecorrigeerde totale celfluorescentie (CTCF) voor elke cel te berekenen:
      CTCF = geïntegreerde dichtheid – (gebied van geselecteerde cel x gemiddelde grijswaarde van achtergrondmetingen)
   6. Vergelijk de CTCF-waarden van de ijzerbehandelde cellen met die van de voertuigcellen. Verhoogde CTCF duidt op verhoogde labiele ijzerspiegels.

5. Celluminescentie-assay

1. Cellen behandelen voor luminescentietest
   1. Voltooi sectie 1, waarbij het aantal putten overeenkomt met n = 3 voor elke voorwaarde die u wilt opnemen. Voeg minstens drie celvrije (alleen volledige media) controleputten toe. 100 μL cellen en media in totaal moet aan elke put worden toegevoegd.
   2. Na een nacht te hebben geïncubeerd met onbehandelde cellen, pas behandelingen en controles toe naar wens. Zorg ervoor dat je een voertuig (onbehandelde) aandoening opneemt, aandoeningen met alleen FAC, cytotoxisch + 10 μM ferrostatine-1 (een anti-ferroptotisch middel), voertuig + 1 μM RSL3, en/of voertuig + 10 μM ferrostatine-1 + 1 μM RSL3. Incubeer gedurende de gewenste duur (12–24 uur om de behandelingseffecten te maximaliseren en overmatige celdood te voorkomen).
2. Afronding van de luminescentietest
   1. Na het behandelen van de cellen ontdooi je de luminescentiebuffercomponenten tot kamertemperatuur. Combineer de benodigde componenten en bewaar ze in het donker tot ze klaar zijn om te gebruiken. Zie de instructies van de kit voor temperatuuropslagvereisten.
   2. Zodra de cellen de behandeling hebben afgerond, volg je de instructies van de kit voor de behandeling van cellen.
      OPMERKING: Dit zal waarschijnlijk kamertemperatuurevenwicht omvatten, gevolgd door de toevoeging van de luminescentiebuffer en een laatste, korte incubatieperiode bij kamertemperatuur. Zodra de luminescentiebuffer is toegevoegd, moeten alle stappen in het donker worden uitgevoerd.
   3. Maak de luminescentie volledig en registreer met een plaatlezer of een vergelijkbaar instrument.
      OPMERKING: Voor dit protocol werd een integratietijd van 0,3 s gebruikt.
   4. Normaliseer de luminescentiewaarden van de experimentele putten naar de gemiddelde luminescentie van de celvrije controleputten.
      OPMERKING: Hogere luminescentiewaarden duiden op een hoger aantal levende cellen.

Resultaten

Op basis van eerder werk van ons en anderen stelden we de hypothese op dat het verhogen van extracellulair ijzer intracellulaire ijzeroverbelasting in muisspiercellen zou veroorzaken en ons in staat zou stellen downstream ferroptose-gerelateerde responsen te monitoren. Daarom ontwikkelden we de C2C12-workflow zoals beschreven in Figuur 1, waarbij cellen gedurende 2–24 uur werden blootgesteld aan gedefinieerde concentraties ferricammoniumcitraat, afhankelijk van de downstream assay.

De eerste stap bij het valideren van ons model was bevestigen dat FAC de cellen kon binnendringen. Met behulp van de gevalideerde primers beschreven in Tabel 3 voerden we qPCR uit voor zowel de zware als de lichte ketens van ferritine en bepaalden we dat een toename van ijzerinput correleerde met verhoogde ferritine-mRNA-niveaus (Figuur 2A,B). Op eiwitniveau was een vergelijkbare toename van ferritineniveaus zichtbaar met een toenemende FAC-concentratie, hoewel dit niet dosisafhankelijk leek te zijn (Figuur 2C). Evenzo toonde het kleuren van levende, met FAC behandelde C2C12-cellen aan dat degenen die werden behandeld met een cytotoxische dosis ijzer—evenals cellen die met de ernstige dosis en labiele ijzerkleuring gelijktijdig als positieve controle werden behandeld—visueel en kwantitatief een verhoogde ijzeropslag vertonen vertonen vergeleken met onbehandelde cellen en degenen die alleen aan de ijzerchelator deferoxamine (DFO; Figuur 2D). Al met al suggereren deze resultaten dat het ijzer dat via FAC in het celmedium is geïntroduceerd, in feite de cellen binnendringt.

Nadat we hadden vastgesteld dat FAC de intracellulaire ijzerlast verhoogde, probeerden we vervolgens te bepalen of ijzeroverbelasting gepaard ging met moleculaire en functionele veranderingen die samenhangen met ferroptose. FAC verhoogde de expressie van Slc40a1 (ferroportine) (Figuur 3A) en verhoogde Hmox1 (Figuur 3B). FAC verlaagde ook het GPX4-eiwit, en deze vermindering werd gedeeltelijk teruggedraaid door deferoxamine (Figuur 3C). Behandeling met RSL3 veroorzaakte een vergelijkbare vermindering van GPX4, waardoor de FAC-respons binnen een bredere ferroptose-geassocieerde moleculaire context werd geplaatst. Functioneel verminderde een cytotoxische FAC-dosis de luminescentie-gebaseerde levensvatbaarheid na 12 uur, en dit vroege verlies van levensvatbaarheid werd gered door ferrostatine-1 (Figuur 3D). Daarentegen wordt bij 24 uur de scheiding tussen omstandigheden minder uitgesproken en variabeler (Figuur 3E). Hoewel met ferrostatine 1 behandelde monsters verhoogd blijven ten opzichte van alleen cytotoxische FAC, is het totale dynamisch bereik van de assay op dit latere punt verminderd. Samen tonen deze gegevens aan dat FAC-behandeling ijzeroverbelasting, ferroptose-geassocieerde moleculaire veranderingen en een tijdsafhankelijke ferrostatine-gevoelige vermindering van levensvatbaarheid in C2C12-cellen veroorzaakt.

Figuur 1: Grafische samenvatting van het ijzeroverbelastingmodel. In dit model worden C2C12-cellen gezaaid en mogen ze een nacht incuberen voordat ze worden behandeld met verschillende fysiologisch significante doses ijzergeïnfuseerd kweekmedium en directe moleculaire analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Verhoogde labiele ijzeropslag en ferritinesynthese na toevoeging van ferric ammoniumcitraat. mRNA-niveaus van (A) ferritine heavy chain en (B) ferritine light chain nemen toe met de toevoeging van ferric ammoniumcitraat aan het systeem. (C) FTH1-eiwitniveaus nemen toe met toevoeging van ijzer aan het systeem. (D) Toename van de lapile ijzerspiegels in C2C12-cellen die vóór en gelijktijdig met kleuring met een verrood labiel ijzer zijn behandeld, vergeleken met de controle van voertuig + deferoxamine. De co-behandelingsconditie duidt gelijktijdige behandeling met kweekmedia + 180 μM FAC + labiele ijzerkleurstof. Foutbalken zijn +/- SD. Afkortingen: FTH1 = ferritine-zware keten; FTL1 = ferritinelichte keten; DFO = deferoxamine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Moleculaire veranderingen geassocieerd door ferroptosis en een tijdsafhankelijke vermindering van cellevensvatbaarheid na toevoeging van FAC. mRNA-niveaus van (A) ferroportine (Slc40a1) en (B) Hmox1 nemen toe na FAC-behandeling. (C) GPX4-eiwit neemt af na FAC-behandeling en in aanwezigheid van de positieve controle-RSL3; deferoxamine keert gedeeltelijk de FAC-geassocieerde afname van GPX4 om. (D) Luminescentie van C2C12-cellen na 12 uur behandeling met FAC, RSL3 en/of ferrostatine-1, genormaliseerd naar celvrije (alleen media) putten. (E) Genormaliseerde luminescentie van behandelde C2C12-cellen na 24 uur behandeling met FAC, RSL3 en/of ferrostatine-1. Foutbalken zijn +/- SD. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Wacht de fase
1	Verhoog naar 50 °C bij 1,6 °C/s, houd het 2 minuten vast
2	Verhoog naar 95 °C bij 1,6 °C/s, houd het 10 minuten vast
PCR-fase (Run x 40)
1	Houd het 15 seconden op 95 °C
2	Verlaag tot 60 °C bij 1,6 °C/s, houd het 1 minuut vast
Smeltcurvestadium
1	Verhoog naar 95 °C bij 1,6 °C/s, houd 15 seconden vast
2	Verlaag tot 60 °C bij 1,6 °C/s, houd het 1 minuut vast
3	Verhoog tot 95 °C bij 0,15 °C/s, houd 1 s vast

Tabel 1: qPCR-programma (duur: ~1:36 uur) in protocolsectie 2.

	Oplossende gel			Stapelgel
Component	10%	12.50%	15%
Acrylamide (mL)	5.6	6.9	8.3	0.65
Steriel water (mL)	6.9	5.3	3.9	3.05
Tris/HCl, 1,5 M pH 8,8 (mL)	4.2			-
Tris/HCl, 0,5 M pH 6,8 (mL)	-			1.25
10% natriumdodecylsulfaat (μL)	166			50
0,1 g/mL Ammoniumpersulfaat (μL)	80			25
TEMED	8.3			5

Tabel 2: Samenvatting van componenten en volumes die nodig zijn voor een succesvolle opstelling van het oplossen en stapelen van gels voor western blot. De geleverde volumes zijn voldoende voor twee gels en kunnen dienovereenkomstig worden geschaald. Percentages geven de hoeveelheid acrylamide in het mengsel aan.  OPMERKING: APS en TEMED moeten als laatste worden toegevoegd en alleen wanneer ze klaar zijn om te gieten, omdat ze het gelpolymerisatieproces in gang zetten.

Gendoel	Gensymbool	Functie	Soorten	Vooropvolgende sequentie	Omgekeerde Sequentie
Beta-2-microglobuline	B2m	Huishoudelijk gen	Muis	TCACACTGAA TTCACCCCCA	TCACATGTCT CGATCCCAGT
TATA-boxbindend eiwit	Tbp	Huishoudelijk gen	Muis	CAGATGTGC GTCAGGCGTT	CCATGAAATAGT GATGCTGGGCAC
Ferritine-zware keten	Fth1	Subeenheid van het ijzeropslageiwit ferritine	Muis	TGGCTCTGAA GAACTTTGCCA	TCATCACGGTC TGGTTTCTTTA
Ferritine lichte keten	FTL1	Subeenheid van het ijzeropslageiwit ferritine	Muis	AATGGGGTAAA ACCCAGGAGG	AGGAAGTCACA GAGATGAGGGT
Heemoxygenase 1	Hmox1	Zet biliverdin om in bilirubine in aanwezigheid van heem, CO2 en ijzer; Hoge niveaus zijn aanwezig bij ferroptose	Muis	CTAGCCTGGT GCAAGATACTG	TGTCTGGGAT GAGCTAGTGC
Ferroportine 1	SLC40a1	Transporteert overtollig ijzer uit cellen	Muis	GCTGCTAGAA TCGGTCTTTGG	TGGAGTTCTG CACACCATTGA

Tabel 3: Lijst van gevalideerde qPCR-primers voor ijzertransport en ferroptosegenen van interesse. Primers zijn muisspecifiek vanwege hun gebruik in mRNA afkomstig uit C2C12-cellen.

Discussie

Het doel van deze studie was om een praktisch in vitro model van ijzeroverbelasting in muisspiervoorlopers op te stellen en voorwaarden te definiëren waaronder ferroptose-geassocieerde responsen betrouwbaar kunnen worden gedetecteerd. Met deze workflow tonen we aan dat de behandeling met ferricammoniumcitraat leidt tot robuuste intracellulaire ijzerophoping, vergezeld van verhoogde ferritine-expressie en een verhoogd labiel ijzersignaal. Ijzerbelasting wordt verder geassocieerd met moleculaire veranderingen die consistent zijn met stress gerelateerd aan ferroptose, waaronder verhoogde expressie van Slc40a1 en Hmox1 en een verminderd GPX4-eiwit. Functioneel veroorzaakt cytotoxische FAC-blootstelling een vermindering van de cellevensvatbaarheid die op vroege tijdstippen wordt gered door ferrostatine-1, wat de aanwezigheid ondersteunt van een ferroptose-gevoelige component die bijdraagt aan de waargenomen celdood.

De ijzerdosis en de duur van de behandeling zijn cruciale parameters die direct invloed hebben op de interpreteerbaarheid van dit systeem. In onze handen bieden vroege tijdstippen (ongeveer 12 uur) de duidelijkste scheiding tussen de omstandigheden, waardoor ferrostatine-1 FAC-geïnduceerde cytotoxiciteit op een reproduceerbare manier kan redden. Op latere tijdstippen (bijv. 24 uur) neemt de algehele levensvatbaarheid af en neemt de variabiliteit toe onder de omstandigheden, waardoor het dynamisch bereik van de assay afneemt. Dit komt overeen met cumulatief celverlies en aanpassing van de overlevende populatie, zoals een verhoogde antioxidantcapaciteit of veranderde ijzerbehandeling.

De toediening van ijzer (Fe³⁺) in plaats van ferro-ijzer (Fe²⁺), evenals de concentratie van toegediend ijzer en de duur van de behandeling, zijn ook cruciale aspecten van het protocol. Het gebruik van ijzer is essentieel omdat ijzer gemakkelijk wordt opgenomen door transferrine, de belangrijkste transporteur die verantwoordelijk is voor de import^{van ijzer 11}. Hoewel ferro-ijzer ook door andere transporters kan worden opgenomen (vooral door de divalente metaaltransporter DMT1), leek ferri-ijzer in deze context effectiever te worden ingebouwd dan^{ferro-ijzer 12}. De concentraties FAC die voor dit protocol zijn gekozen, zijn gekozen vanwege hun fysiologische relevantie en gebruik in eerdere vergelijkbare modellen^13,14. De duur van ijzerbehandeling, namelijk 24 uur, was ook gebaseerd op soortgelijke modellen van ons en anderen. In sommige contexten (met name de labiele ijzerkleuring en celluminescentietests) bleek 24 uur echter een te lange behandelingsduur. In deze gevallen resulteerde een 24-uurs behandeling in zo'n significante celdood dat er geen conclusies konden worden getrokken vanwege de vernietiging van cellulair materiaal. Zo is RSL3 zo'n krachtig lipideperoxidatiemiddel dat een behandelingsduur van 12 uur voldoende was om lipidevereifenoxidatie te induceren, terwijl tegelijkertijd de effecten van ijzeroverbelasting zichtbaar waren (Figuur 3C-E). Daarnaast werden voor de labile ijzerkleurstof de cellen slechts 2 uur met FAC behandeld voordat ze werden gekleurd (na poging tot kleuring na 2, 4 en 24 uur ijzerbehandelingen) om de initiële reactie op ijzeroverbelasting vast te leggen voordat overmatige celvernietiging kon plaatsvinden (Figuur 2D). Over het algemeen lijkt het erop dat veranderingen in gen- en eiwitniveau het beste werden gemeten na 12–24 uur ijzerbehandeling, waarschijnlijk omdat deze veranderingen langer duren voordat de cellen zich inzetten, terwijl kleuring het beste na een kortere behandeltijd werd uitgevoerd.

Anderen hebben vergelijkbare modellen ontwikkeld. Een groep genereerde een met ferric ijzer behandeld C2C12-model om de rol van de p53-Slc7a11-as bij ferroptose te bestuderen. Zij ontdekten dat behandeling met ferri-ijzer gedurende 48 uur de lipideveroxidatie verhoogde en de Slc7a11-niveaus verlaagde, wat wijst op ferroptose¹³. Een ander vergelijkbaar model—ditmaal met ferrosulfaat-behandelde C2C12-cellen om de relatie te bestuderen tussen de Akt-FoxO3-E3 ubiquitine-ligaseroute en ferroptose—betrof behandeling met ijzer over 4 uur^{en 14} uur. Een gemeenschappelijke factor tussen deze is dat ze ijzerbehandeling van C2C12-cellen betreffen die zijn gedifferentieerd tot myotubes, in plaats van in hun meer stamcelachtige myoblasttoestand te blijven. Dit maakt ons systeem bijzonder relevant voor de eerder waargenomen ijzerophoping in MuSC's.

Hoewel het een eenvoudige manier is om de effecten van ijzeroverbelasting op spier in vitro te bestuderen, heeft de methode beperkingen omdat deze alleen is gebruikt in de context van C2C12-cellen. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat spierstamcellen gevoelig zijn voor ijzeroverbelasting tijdens het ouder worden, wat suggereert dat een vergelijkbare methode in die context geldig kan zijn⁹.

Gezamenlijk toont dit model aan dat ijzeroverbelasting voldoende is om een reproduceerbare set ferroptose-geassocieerde moleculaire veranderingen te induceren en een ferrostatine-gevoelige vermindering van levensvatbaarheid in C2C12-cellen. Hoewel aanvullende orthogonale assays celsterfteclassificatie in specifieke contexten verder kunnen verfijnen, zijn de gecombineerde moleculaire en farmacologische responsen die hier worden waargenomen consistent met ferroptose-geassocieerde celstress. We verwachten dat deze aanpak mechanistische studies van ijzerontregeling bij spierveroudering en ziekte zal vergemakkelijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 kb Protein Ladder, 500 µL size	Bio-Rad	1610374	Bewaar bij -20 °C. Ontdooi op ijs.
15 mL Centrifuge Tubes CS500	Avantor/VWR	89039-664
30% Acrylamide/Bisphosphate solution, 29:1, 500 mL size	Bio-Rad	1610156	Is een neurotoxine. Alleen hanteren met geschikte PPA (laboratoriumjas, handschoenen, oogbescherming).
5425 / 5425 R Microcentrifuge	Eppendorf	05-414-052
5910 Ri centrifuge	Eppendorf	05-414-459PM2
96 Well Black/Clear Bottom Plate, TC Surface	Thermo Fisher Scientific	165305
Ammonium persulfate, 10 g	Bio-Rad	1610700	Polymerisatiemiddel voor het gieten van acrylamidegels als een 10% gewicht/volumeoplossing in steriel water. Het poeder is bij kamertemperatuur stabiel, maar de oplossing moet langdurig worden bewaard bij -20 °C en kortdurend bij 4 °C.
Anti-GAPDH, muis antilichaam, 100 µg size	Thermo Fisher Scientific	AM4300	Gebruik bij een 1:2000 concentratie in 2% BSA + wasbuffer. Loopt bij 37 kDa.
BCA Protein Assay Kit met verdunningsvrije BSA Protein Standards	Thermo Fisher Scientific	A55865	Volg de instructies van de fabrikant voor gebruik. Houd er rekening mee dat de standaarden na het eerste gebruik bij 4 °C moeten worden bewaard.
Beta Actin Loading Control Monoclonal Antibody (BA3R), DyLight 800 4X PEG	Thermo Fisher Scientific	MA515739D800	Gebruik bij een 1:1000 concentratie in 2% BSA + wasbuffer. Loopt bij 42 kDa.
BioLite 6 Well Multidish Cell Culture-Treated Surface	Thermo Fisher Scientific	130184
Blot Box, Zwart, 9x6.5 cm, 5/pk	Fisher Scientific	501870983
Bromofenolblauw	Sigma-Aldrich	B0126	Gebruik bij de bereiding van Laemmli buffer.
BSA, solid, 100 g	Fisher Scientific	BP9703100	Bewaar bij 4 °C.
C2C12 cellen	ATCC	CRL-1772	Bewaar in de dampfase van vloeibaar stikstof.
cDNA Supermix QScript 500 reacties	Avantor/VWR	101414-108	Bewaar bij -20 °C. Ontdooi op ijs.
Cell lifter, 100pk	Fisher Scientific	8100240	Aangezien deze groter zijn, gebruik voor het extraheren van cellen uit 10 cm en grotere schalen.
Cell scrapers, 10 inch handvat, 100pk	Fisher Scientific	08-100-241	Aangezien ze een klein hoofd hebben, zijn ze het meest geschikt voor het verwijderen van cellen uit multi-well platen.
CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Kit, 10 mL	Promega	G7570
Chloroform, 99.9%	Thermo Fisher Scientific	610281000	Gebruik alleen in een afzuiging en doe het afval in een aparte container.
COMPLETE EDTA-vrije protease inhibitor tabs	Sigma-Aldrich	4693132001	Los 1 tablet op in 500 µL steriel water om een 100× oplossing te maken.
CO2 100-120 V Incubator	Binder	9640-0002	Modelversie CBS 170-120 V. Gebruik voor celcultuur.
Deferoxamine mesylaat, 50 mg	Fisher Scientific	5764/50	DFO is een ijzerchelator, dus het toevoegen ervan aan cellen verlaagt het ijzergehalte. Los op in water voor een stockconcentratie van 1 M.
Dimethyl sulfoxide, 100 mL	Fisher Scientific	D5879-100ML	Gebruik bij labile ijzerkleuring en reconstitutie.
DMEM, hoge glucose, pyruvaat, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	11995065
Dylight 680 geconjugeerd Geit anti-Konijn IgG (H&L)	Thermo Fisher Scientific	35568	Voeg toe aan 5% BSA in wasbuffer in een verhouding van 1:5000.
DyLight 800 4× PEG geconjugeerd Geit anti-Muis IgG (H&L) Secundair Antilichaam	Thermo Fisher Scientific	SA535521	Voeg toe aan 5% BSA in wasbuffer in een verhouding van 1:5000.
Easypet 3 1-kanaals pipet aid	Eppendorf	4430000018
Far-red Labile Fe2+ Dye	Sigma-Aldrich	SCT037	Bereid de stockoplossing voor door 50 µL DMSO toe te voegen aan een roomtemperatuur aliquot. Lichtgevoelig. Stockconcentratie: 1 mM
Ferric Ammonium Citraat, 500 g	MP Biomedicals	158040
Ferrostatin 10 mg	Fisher Scientific	502259214	Sequestreert lipideperoxidatiebijproducten, remming van ferroptose in vitro. Los op in DMSO voor een stockconcentratie van 10 mM.
Fetaal bovien serum, Premium Plus, fles, 500 mL	Thermo Fisher Scientific	A5669701	Gebruik om DMEM aan te vullen voor C2C12 celcultuur. Toegevoegd bij 10% per volume.
Flex-Tube 1.5 mL PCR clean, kleurloos, 500 stuks.	Eppendorf	22364120
FTH1 (D1D4) Konijn mAb 100 µL	Cell Signaling Technology	4393	Gebruik bij een 1:1000 concentratie in 2% BSA + wasbuffer. Loopt bij ~20 kDa.
Glycerol, ultrapuur	Thermo Fisher Scientific	15514011	Gebruik bij de bereiding van 6x Laemmli buffer.
GlycoBlue Co